发明内容
为了解决以上现有技术中未有使用多重荧光定量PCR方法来同时检测HER2 mRNA及环状RNA的记载,本发明以HER2 mRNA及环状RNA为研究对象,建立了多重荧光PCR检测方法。
本发明提供了一种HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物对及特异性探针。
本发明还提供了一种HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测试剂盒。该试剂盒具有高度的特异性与专一性,并且扩增效率高,灵敏度高,准确率高,重现性好,检测周期短,且能实时检测DNA扩增反应,具有很高的可行性与应用前景。
本发明的另一个目的是提供上述检测引物对及特异性探针或检测试剂盒的应用。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案:
本发明的第一个目的是提供一种HER2基因的mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物对及特异性探针,所述环状RNA包括环状RNA circ-HER2-676nt和环状RNA circ-HER2-565nt;
可根据NCBI数据库检测获得HER2基因的mRNA序列信息,序列链接可参考https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001005862;
所述HER2 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;GTTCTTTATTCTACTCTCCGCTGAAGTCCACACAGTTTAAATTAAAGTTCCCGGATTTTTGTGGGCGCCTGCCCCGCCCCTCGTCCCCCTGCTGTGTCCATATATCGAGGCGATAGGGTTAAGGGAAGGCGGACGCCTGATGGGTTAATGAGCAAACTGAAGTGTTTTCCATGATCTTTTTTGAGTCGCAATTGAAGTACCACCTCCCGAGGGTGATTGCTTCCCCATGCGGGGTAGAACCTTTGCTGTCCTGTTCACCACTCTACCTCCAGCACAGAATTTGGCTTATGCCTACTCAATGTGAAGATGATGAGGATGAAAACCTTTGTGATGATCCACTTCCACTTAATGAATGGTGGCAAAGCAAAGCTATATTCAAGACCACATGCAAAGCTACTCCCTGAGCAAAGAGTCACAGATAAAACGGGGGCACCAGTAGAATGGCCAGGACAAACGCAGTGCAGCACAGAGACTCAGACCCTGGCAGCCATGCCTGCGCAGGCAGTGATGAGAGTGACATGTACTGTTGTGGACATGCACAAAAGTGAGTGTGCACCGGCACAGACATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGCTGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCCACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACTTGCGAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGTGCCAATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGTGTGGGCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGGCACTGCTGGGGTCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGCCAGTTCCTTCGGGGCCAGGAGTGCGTGGAGGAATGCCGAGTACTGCAGGGGCTCCCCAGGGAGTATGTGAATGCCAGGCACTGTTTGCCGTGCCACCCTGAGTGTCAGCCCCAGAATGGCTCAGTGACCTGTTTTGGACCGGAGGCTGACCAGTGTGTGGCCTGTGCCCACTATAAGGACCCTCCCTTCTGCGTGGCCCGCTGCCCCAGCGGTGTGAAACCTGACCTCTCCTACATGCCCATCTGGAAGTTTCCAGATGAGGAGGGCGCATGCCAGCCTTGCCCCATCAACTGCACCCACTCCTGTGTGGACCTGGATGACAAGGGCTGCCCCGCCGAGCAGAGAGCCAGCCCTCTGACGTCCATCATCTCTGCGGTGGTTGGCATTCTGCTGGTCGTGGTCTTGGGGGTGGTCTTTGGGATCCTCATCAAGCGACGGCAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCGGGAAAACCGCGGACGCCTGGGCTCCCAGGACCTGCTGAACTGGTGTATGCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGATGTGCGGCTCGTACACAGGGACTTGGCCGCTCGGAACGTGCTGGTCAAGAGTCCCAACCATGTCAAAATTACAGACTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGACGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAGTGGATGGCGCTGGAGTCCATTCTCCGCCGGCGGTTCACCCACCAGAGTGATGTGTGGAGTTATGGTGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGGATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAAAAGGGGGAGCGGCTGCCCCAGCCCCCCATCTGCACCATTGATGTCTACATGATCATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGGCCAAGATTCCGGGAGTTGGTGTCTGAATTCTCCCGCATGGCCAGGGACCCCCAGCGCTTTGTGGTCATCCAGAATGAGGACTTGGGCCCAGCCAGTCCCTTGGACAGCACCTTCTACCGCTCACTGCTGGAGGACGATGACATGGGGGACCTGGTGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCCAGCAGGGCTTCTTCTGTCCAGACCCTGCCCCGGGCGCTGGGGGCATGGTCCACCACAGGCACCGCAGCTCATCTACCAGGAGTGGCGGTGGGGACCTGACACTAGGGCTGGAGCCCTCTGAAGAGGAGGCCCCCAGGTCTCCACTGGCACCCTCCGAAGGGGCTGGCTCCGATGTATTTGATGGTGACCTGGGAATGGGGGCAGCCAAGGGGCTGCAAAGCCTCCCCACACATGACCCCAGCCCTCTACAGCGGTACAGTGAGGACCCCACAGTACCCCTGCCCTCTGAGACTGATGGCTACGTTGCCCCCCTGACCTGCAGCCCCCAGCCTGAATATGTGAACCAGCCAGATGTTCGGCCCCAGCCCCCTTCGCCCCGAGAGGGCCCTCTGCCTGCTGCCCGACCTGCTGGTGCCACTCTGGAAAGGCCCAAGACTCTCTCCCCAGGGAAGAATGGGGTCGTCAAAGACGTTTTTGCCTTTGGGGGTGCCGTGGAGAACCCCGAGTACTTGACACCCCAGGGAGGAGCTGCCCCTCAGCCCCACCCTCCTCCTGCCTTCAGCCCAGCCTTCGACAACCTCTATTACTGGGACCAGGACCCACCAGAGCGGGGGGCTCCACCCAGCACCTTCAAAGGGACACCTACGGCAGAGAACCCAGAGTACCTGGGTCTGGACGTGCCAGTGTGAACCAGAAGGCCAAGTCCGCAGAAGCCCTGATGTGTCCTCAGGGAGCAGGGAAGGCCTGACTTCTGCTGGCATCAAGAGGTGGGAGGGCCCTCCGACCACTTCCAGGGGAACCTGCCATGCCAGGAACCTGTCCTAAGGAACCTTCCTTCCTGCTTGAGTTCCCAGATGGCTGGAAGGGGTCCAGCCTCGTTGGAAGAGGAACAGCACTGGGGAGTCTTTGTGGATTCTGAGGCCCTGCCCAATGAGACTCTAGGGTCCAGTGGATGCCACAGCCCAGCTTGGCCCTTTCCTTCCAGATCCTGGGTACTGAAAGCCTTAGGGAAGCTGGCCTGAGAGGGGAAGCGGCCCTAAGGGAGTGTCTAAGAACAAAAGCGACCCATTCAGAGACTGTCCCTGAAACCTAGTACTGCCCCCCATGAGGAAGGAACAGCAATGGTGTCAGTATCCAGGCTTTGTACAGAGTGCTTTTCTGTTTAGTTTTTACTTTTTTTGTTTTGTTTTTTTAAAGATGAAATAAAGACCCAGGGGGAGAATGGGTGTTGTATGGGGAGGCAAGTGTGGGGGGTCCTTCTCCACACCCACTTTGTCCATTTGCAAATATATTTTGGAAAACA(SEQ ID NO.1)可根据circbase(参见链接http://circrna.org/)数据库检测获得HER2基因产生的两个最高丰度的环状RNA,人circ-HER2-676nt(circRNA ID:hsa_circ_0007766)和人circ-HER2-565nt(circRNA ID:hsa_circ_0043469);
所述circ-HER2-676nt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
GATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGCTGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCCACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCT(SEQ ID NO.2)
所述circ-HER2-565nt的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
GAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCGGGAAAACCGCGGACGCCTGGGCTCCCAGGACCTGCTGAACTGGTGTATGCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGATGTGCGGCTCGTACACAGGGACTTGGCCGCTCGGAACGTGCTGGTCAAGAGTCCCAACCATGTCAAAATTACAGACTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGACGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAGTGGATGGCGCTGGAGTCCATTCTCCGCCGGCGGTTCACCCACCAGAGTGATGTGTGGAGTTATGGTGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGGATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAAAAGGGGGAGCGGCTGCCCCAGCCCCCCATCTGCACCATTGATGTCTACATGATCATGGTCAAAT(SEQ ID NO.3)
优选的,HER2 mRNA的特异检测引物对及特异性探针为:
HER2-mRNA-F:5’-GCCCTGGTCACCTACAACAC-3’;
HER2-mRNA-R:5’-ATCCTCTGCTGTCACCTCTT-3’;
HER2-mRNA-probe:5’-ACACAGCTGGCGCCGAATGTA-3’;
环状RNA circ-HER2-676nt的特异检测引物对及特异性探针为:
Circ-HER2-676nt-F:5’-GTGACTGCCTGTCCCTGATA-3’;
Circ-HER2-676nt-R:5’-TCGCACAATCCGCAGCCTCT-3’;
Circ-HER2-676nt-probe:5’-CTACGTGCTCATCGCTCACAAC-3’;
环状RNA circ-HER2-565nt的特异检测引物对及特异性探针为:
Circ-HER2-565nt-F:5’-AGATCCCTGACCTGCTGGAA-3’;
Circ-HER2-565nt-R:5’-CAGCCATCACGTATGCTTCA-3’;
Circ-HER2-565nt-probe:5’-CAGCCCCCCATCTGCACCAT-3’。
优选的,所述HER2 mRNA特异性探针、circ-HER2-676nt特异性探针和circ-HER2-565nt特异性探针的5’端带有荧光基团,3’端带有淬灭基团;
优选地,所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合,其中,
HER2 mRNA特异性探针的荧光基团优选为CY5;
circ-HER2-676nt特异性探针的荧光基团优选为VIC;
circ-HER2-565nt特异性探针的荧光基团优选为FAM;
优选地,所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种或至少两种的组合,其中,
HER2 mRNA特异性探针的淬灭基团优选为BHQ2;
circ-HER2-676nt特异性探针的淬灭基团优选为BHQ1;
circ-HER2-565nt特异性探针的淬灭基团优选为TAMRA。
本发明的第二个目的是提供一种用于同时检测HER2基因的mRNA及环状RNA的检测试剂盒;所述试剂盒包括上述方案中所述的HER2基因的mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物对及特异性探针。
本发明的第三个目的是提供一种上述方案中所述的HER2基因的mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物对及特异性探针或上述方案所述的检测试剂盒在检测HER2基因的mRNA及环状RNA单一表达或混合表达中的应用。
优选的,提取细胞来源样品中的RNA,去除提取RNA中的残留基因组DNA,将所述RNA反转录为cDNA,利用上述方案中所述HER2基因的mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物对及特异性探针对所述HER2基因的mRNA及环状RNA的cDNA进行扩增。
优选的,进行扩展时使用的荧光定量PCR反应体系总体积为20μL,其中:2×QPCRMIX 10μL;浓度为10μM的三对上下游引物各加0.4μL;三条浓度为10μM的特异性探针各加0.1μL;稀释5倍后的cDNA各加1μL;加灭菌水至总体积为20μL。
优选的,扩增反应条件为:扩增程序为95℃3min,95℃10s,60℃10s,60℃31s,40个循环。
优选的,采用Trizol法提取细胞来源样品中的总RNA;采用DNA酶消化法去除提取的RNA中基因组DNA的残留;用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA;
所述Trizol法提取细胞来源样品中的总RNA为:按照80万个左右细胞加入1mLtrizol,冰上吹打裂解5min,然后加入200μL三氯甲烷,涡旋振荡15秒,冰上放置15min,4℃,12000g离心10min,用枪头将上清液体取400μL到新的离心管中,加入1倍体积异丙醇,涡旋充分混匀;4℃条件下,12000g离心10min,用枪头将上清去掉保留沉淀;加入1mL 75%冰冷的乙醇,轻轻颠倒,然后4℃条件下12000g离心5min,弃去上清;室温晾干沉淀后,加入20μLDEPC水溶解RNA;
所述采用DNA酶消化法去除提取的RNA中基因组DNA的残留为:反应液总体积为10μL,具体包括总RNA 6μL、DNase酶Ⅰ1.5μL、10×buffer1μL和无酶水1.5μL,反应液中于37℃消化1个小时后,85℃5min灭活DNA消化酶;
所述用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA为:在总RNA 2μg、随机引物0.5μL的反应体系和条件下,首先将RNA和随机引物混合后,65℃5min变性,然后马上放在冰上;然后加入2×逆转录反应液10μL,无酶水补足至20μL,设置反应条件如下25℃10min,37℃10min,42℃10min,85℃5min。
本发明的又一个目的是提供一种如上述方案中所述的HER2基因的mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物对及特异性探针或上述方案中所述的检测试剂盒用于制备辅助临床诊断、肿瘤相关靶向药物选择或乳腺癌诊断试剂和/或药物中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明建立的多重荧光定量PCR特异检测引物对及特异性探针在一个反应体系中检测线性mRNA和环状RNA的表达量,具有高度的特异性与专一性,并且扩增效率高,灵敏度高,准确率高,重现性好,检测周期短,具有很高的可行性与应用前景。通过采用多重荧光定量PCR同时对HER2基因的mRNA以及两个环状RNA的检测,将为肿瘤的精准全面检测以及辅助用药指导提供一种更理想的检测方案。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
所述PCR标准品委托广州艾基公司进行合成;
所述核酸测定仪购自德国耶拿公司,型号ScanDrop 100;
所述荧光定量检测试剂2xQPCR反应液南京诺唯赞医疗科技有限公司,型号Q222-01;
所述乳腺细胞系MCF10A正常细胞、BT549(三阴性乳腺癌细胞)、MDA-MB-468(三阴性乳腺癌细胞)、MDA-MB-231(三阴性乳腺癌细胞)、MCF-7(HER2弱阳性乳腺癌细胞)、BT474(HER2强阳乳腺癌细胞)购自广州库基生物公司;
所述逆转录试剂盒购自南京诺唯赞医疗科技有限公司,型号RA103。
实施例1HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR标准曲线扩增
1.1PCR标准品的制备
根据荧光定量PCR扩增的详细序列区间信息,通过化学核酸基因合成的策略制备荧光定量PCR的标准品,具体是将标准品序列委托基因合成公司(广州艾基公司)进行合成,然后将序列连接到PMD20T质粒载体上,构建成标准品。标准品序列信息如下:
1.1.1用于检测HER2 mRNA的质粒标准品片段序列如SEQ ID NO.4所示,HER2-mRNA标准品片段序列信息具体如下:
GCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGAT(SEQ ID NO.4)
1.1.2用于检测环状RNA circ-HER2-676nt的质粒标准品片段序列如SEQ ID NO.5所示,circ-HER2-676nt标准品片段序列信息具体如下:
GTGACTGCCTGTCCCTGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGA(SEQ ID NO.5)
1.1.3用于检测检测环状RNA circ-HER2-565nt的质粒标准品片段序列如SEQ IDNO.6所示,circ-HER2-565nt标准品片段序列信息具体如下:
AGATCCCTGACCTGCTGGAAAAGGGGGAGCGGCTGCCCCAGCCCCCCATCTGCACCATTGATGTCTACATGATCATGGTCAAATGAAGCATACGTGATGGCTG(SEQ ID NO.6)
1.2首先将制备的标准品质粒用核酸测定仪测浓度,然后根据质粒标准品的浓度结合插入质粒片段的碱基数目及质粒骨架的碱基数目计算出标准品的copy数浓度,将每个质粒标准品按照滴度稀释:500万copy/μL、50万copy/μL、5万copy/μL、5000copy/μL、500copy/μL共5个梯度;将对应的探针及引物、标准品和QPCR试剂盒混和后进行荧光定量QPCR测试绘制扩增曲线及标准曲线,检测设计的引物及配套探针是否能很好的有梯度线性关系(每个梯度重复3个孔)。具体多重荧光定量PCR反应体系及反应条件如下:
1.2.1多重荧光定量PCR反应体系:三对上下游引物(10μM)各加0.4μL,三条探针(10μM)分别加0.1μL,三个质粒标准品模板各加0.3μL,探针法荧光定量检测试剂2xQPCR反应液(诺唯赞公司)加10μL,加水补足20μL总体积。
1.2.2多重荧光定量PCR反应条件:采用ABI7500荧光定量PCR仪器,对于每个反应孔同时设置三个荧光通道检测,同时检测CY5\VIC\FAM荧光信号,PCR反应程序设计为95℃预变性3min,循环内95℃变性10秒,60℃退火及延伸31秒,然后每个循环反应末端检测荧光信号,共计设计40个总反应循环。
1.3按照本项目的反应体系和条件进行对标准品的多重荧光定量PCR后,利用定量PCR仪器自带分析软件,分析HER2 mRNA及环状RNA的梯度扩增曲线以及绘制标准曲线。
实验结果如图1-6显示,图1-6分别为HER2 mRNA、环状RNA circ-HER2-676nt和环状RNA circ-HER2-565nt荧光定量标准品梯度检测扩增曲线图和标准曲线图;结果显示通过多重荧光PCR对制备的标准品检测,设计的多重荧光PCR能很好的检测梯度稀释的标准样品,梯度关系良好,绘制标准曲线后,结果显示各标准曲线线性关系良好,具体是检测HER2mRNA的引物和探针扩增标准品的相关系数R2=1.000,扩增效率E=94.008%,斜率S=-3.474;检测环状RNA Circ-HER2-676nt标准品的引物和探针扩增的相关系数R2=0.999,扩增效率E=94.001%,斜率S=-3.475;检测Circ-HER2-565nt标准品的引物和探针扩增的相关系数R2=0.996,扩增效率E=100.248%,斜率S=-3.316。
实施例2HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR应用方法
2.1选用实验室常用的乳腺细胞系MCF10A正常细胞、BT549(三阴性乳腺癌细胞)、MDA-MB-468(三阴性乳腺癌细胞)、MDA-MB-231(三阴性乳腺癌细胞)、MCF-7(HER2弱阳性乳腺癌细胞)、BT474(HER2强阳乳腺癌细胞),按照各个细胞的培养条件(37℃,5%的CO2浓度)在实验室中扩大培养细胞,等细胞长到80%密度,用经典的Trizol方法提取细胞中的总RNA,核酸浓度测定仪测定RNA的浓度后,取2μg的RNA,用逆转录试剂盒(诺唯赞公司产品)将RNA逆转录成cDNA,然后将cDNA稀释5倍,取1μL稀释后的cDNA进行多重荧光定量PCR检测HER2 mRNA及环状RNA在各个细胞系中的含量。
具体实验方法步骤:
2.1.1RNA提取(Trizol方法)
按照80万个左右细胞加入1mL trizol,冰上吹打裂解5min,然后加入200μL三氯甲烷,涡旋振荡15秒,冰上放置15min,4℃条件,12000g离心10min,用枪头将上清液体取400μL到新的离心管中,加入1倍体积异丙醇,涡旋充分混匀;4℃下,12000g离心10min,用枪头将上清去掉保留沉淀;加入1ml 75%冰冷的乙醇,轻轻颠倒,然后4℃条件下12000g离心5min,弃去上清;室温晾干沉淀后,加入20μL DEPC水溶解RNA
2.1.2提取RNA中残留的基因组DNA去除
去除提取的RNA中基因组DNA的残留,采用DNA酶消化法,反应体系和条件如下:
反应液总体积为10μL,如下组分组成:
表1酶消化法反应体系
组分 |
组分分量 |
总RNA |
6μL(10微克) |
DNase酶Ⅰ |
1.5μL |
10×buffer |
1μL |
无酶水 |
1.5μL |
反应液中于37℃消化1个小时后,85℃5min灭活DNA消化酶。
2.1.3RNA逆转录成cDNA
将RNA逆转录成cDNA反应体系和条件如下:
表2逆转录反应体系
组分 |
组分分量 |
总RNA |
2μg |
随机引物 |
0.5μL |
首先,将RNA和随机引物混合后,65℃5min变性,然后马上放在冰上;
然后加入2×逆转录反应液10μL,无酶水补足至20μL,设置反应条件如下25℃10min,37℃10min,42℃10min,85℃5min。
2.1.4多重荧光定量PCR检测
参考本项目前期绘制标准扩增曲线反应体系和条件检测细胞样品的多重荧光定量PCR反应体系及反应条件如下:
多重荧光定量PCR反应体系:三对上下游引物(10uM)各加0.4μL,三条探针(10uM)分别加0.1μL,稀释5倍后的cDNA 1μL,探针法荧光定量检测试剂2xQPCR反应液(诺唯赞公司)加10μL,加水补足20μL总体积。
2.1.5多重荧光定量PCR检测HER2 mRNA及环状RNA在多个细胞系中的含量
根据本项目前期绘制的标准曲线及多重荧光定量PCR检测的各个细胞系的CT值,根据标准曲线以及稀释的倍数计算HER2 mRNA及环状RNA在各个细胞系中的含量,结果以纵坐标(拷贝/纳克)表示。
检测结果如下如图7-9所示,图7-9为多重荧光定量PCR检测HER2 mRNA、环状RNAcirc-HER2-676nt和RNA circ-HER2-565nt的含量图,结果显示本项目设计的多重荧光定量PCR方法能有效检测细胞来源的样品中的HER2 mRNA以及环状RNA的含量。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 广州吉赛医疗科技有限公司
<120> HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物探针及其应用
<130> 2021.10.19
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4858
<212> DNA
<213> HER2 mRNA的核苷酸序列(Nucleotide sequence of HER2 mRNA)
<400> 1
gttctttatt ctactctccg ctgaagtcca cacagtttaa attaaagttc ccggattttt 60
gtgggcgcct gccccgcccc tcgtccccct gctgtgtcca tatatcgagg cgatagggtt 120
aagggaaggc ggacgcctga tgggttaatg agcaaactga agtgttttcc atgatctttt 180
ttgagtcgca attgaagtac cacctcccga gggtgattgc ttccccatgc ggggtagaac 240
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aaaagtgagt gtgcaccggc acagacatga agctgcggct ccctgccagt cccgagaccc 600
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gctacgtgct catcgctcac aaccaagtga ggcaggtccc actgcagagg ctgcggattg 780
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gctaccagga cacgattttg tggaaggaca tcttccacaa gaacaaccag ctggctctca 1020
cactgataga caccaaccgc tctcgggcct gccacccctg ttctccgatg tgtaagggct 1080
cccgctgctg gggagagagt tctgaggatt gtcagagcct gacgcgcact gtctgtgccg 1140
gtggctgtgc ccgctgcaag gggccactgc ccactgactg ctgccatgag cagtgtgctg 1200
ccggctgcac gggccccaag cactctgact gcctggcctg cctccacttc aaccacagtg 1260
gcatctgtga gctgcactgc ccagccctgg tcacctacaa cacagacacg tttgagtcca 1320
tgcccaatcc cgagggccgg tatacattcg gcgccagctg tgtgactgcc tgtccctaca 1380
actacctttc tacggacgtg ggatcctgca ccctcgtctg ccccctgcac aaccaagagg 1440
tgacagcaga ggatggaaca cagcggtgtg agaagtgcag caagccctgt gcccgagtgt 1500
gctatggtct gggcatggag cacttgcgag aggtgagggc agttaccagt gccaatatcc 1560
aggagtttgc tggctgcaag aagatctttg ggagcctggc atttctgccg gagagctttg 1620
atggggaccc agcctccaac actgccccgc tccagccaga gcagctccaa gtgtttgaga 1680
ctctggaaga gatcacaggt tacctataca tctcagcatg gccggacagc ctgcctgacc 1740
tcagcgtctt ccagaacctg caagtaatcc ggggacgaat tctgcacaat ggcgcctact 1800
cgctgaccct gcaagggctg ggcatcagct ggctggggct gcgctcactg agggaactgg 1860
gcagtggact ggccctcatc caccataaca cccacctctg cttcgtgcac acggtgccct 1920
gggaccagct ctttcggaac ccgcaccaag ctctgctcca cactgccaac cggccagagg 1980
acgagtgtgt gggcgagggc ctggcctgcc accagctgtg cgcccgaggg cactgctggg 2040
gtccagggcc cacccagtgt gtcaactgca gccagttcct tcggggccag gagtgcgtgg 2100
aggaatgccg agtactgcag gggctcccca gggagtatgt gaatgccagg cactgtttgc 2160
cgtgccaccc tgagtgtcag ccccagaatg gctcagtgac ctgttttgga ccggaggctg 2220
accagtgtgt ggcctgtgcc cactataagg accctccctt ctgcgtggcc cgctgcccca 2280
gcggtgtgaa acctgacctc tcctacatgc ccatctggaa gtttccagat gaggagggcg 2340
catgccagcc ttgccccatc aactgcaccc actcctgtgt ggacctggat gacaagggct 2400
gccccgccga gcagagagcc agccctctga cgtccatcat ctctgcggtg gttggcattc 2460
tgctggtcgt ggtcttgggg gtggtctttg ggatcctcat caagcgacgg cagcagaaga 2520
tccggaagta cacgatgcgg agactgctgc aggaaacgga gctggtggag ccgctgacac 2580
ctagcggagc gatgcccaac caggcgcaga tgcggatcct gaaagagacg gagctgagga 2640
aggtgaaggt gcttggatct ggcgcttttg gcacagtcta caagggcatc tggatccctg 2700
atggggagaa tgtgaaaatt ccagtggcca tcaaagtgtt gagggaaaac acatccccca 2760
aagccaacaa agaaatctta gacgaagcat acgtgatggc tggtgtgggc tccccatatg 2820
tctcccgcct tctgggcatc tgcctgacat ccacggtgca gctggtgaca cagcttatgc 2880
cctatggctg cctcttagac catgtccggg aaaaccgcgg acgcctgggc tcccaggacc 2940
tgctgaactg gtgtatgcag attgccaagg ggatgagcta cctggaggat gtgcggctcg 3000
tacacaggga cttggccgct cggaacgtgc tggtcaagag tcccaaccat gtcaaaatta 3060
cagacttcgg gctggctcgg ctgctggaca ttgacgagac agagtaccat gcagatgggg 3120
gcaaggtgcc catcaagtgg atggcgctgg agtccattct ccgccggcgg ttcacccacc 3180
agagtgatgt gtggagttat ggtgtgactg tgtgggagct gatgactttt ggggccaaac 3240
cttacgatgg gatcccagcc cgggagatcc ctgacctgct ggaaaagggg gagcggctgc 3300
cccagccccc catctgcacc attgatgtct acatgatcat ggtcaaatgt tggatgattg 3360
actctgaatg tcggccaaga ttccgggagt tggtgtctga attctcccgc atggccaggg 3420
acccccagcg ctttgtggtc atccagaatg aggacttggg cccagccagt cccttggaca 3480
gcaccttcta ccgctcactg ctggaggacg atgacatggg ggacctggtg gatgctgagg 3540
agtatctggt accccagcag ggcttcttct gtccagaccc tgccccgggc gctgggggca 3600
tggtccacca caggcaccgc agctcatcta ccaggagtgg cggtggggac ctgacactag 3660
ggctggagcc ctctgaagag gaggccccca ggtctccact ggcaccctcc gaaggggctg 3720
gctccgatgt atttgatggt gacctgggaa tgggggcagc caaggggctg caaagcctcc 3780
ccacacatga ccccagccct ctacagcggt acagtgagga ccccacagta cccctgccct 3840
ctgagactga tggctacgtt gcccccctga cctgcagccc ccagcctgaa tatgtgaacc 3900
agccagatgt tcggccccag cccccttcgc cccgagaggg ccctctgcct gctgcccgac 3960
ctgctggtgc cactctggaa aggcccaaga ctctctcccc agggaagaat ggggtcgtca 4020
aagacgtttt tgcctttggg ggtgccgtgg agaaccccga gtacttgaca ccccagggag 4080
gagctgcccc tcagccccac cctcctcctg ccttcagccc agccttcgac aacctctatt 4140
actgggacca ggacccacca gagcgggggg ctccacccag caccttcaaa gggacaccta 4200
cggcagagaa cccagagtac ctgggtctgg acgtgccagt gtgaaccaga aggccaagtc 4260
cgcagaagcc ctgatgtgtc ctcagggagc agggaaggcc tgacttctgc tggcatcaag 4320
aggtgggagg gccctccgac cacttccagg ggaacctgcc atgccaggaa cctgtcctaa 4380
ggaaccttcc ttcctgcttg agttcccaga tggctggaag gggtccagcc tcgttggaag 4440
aggaacagca ctggggagtc tttgtggatt ctgaggccct gcccaatgag actctagggt 4500
ccagtggatg ccacagccca gcttggccct ttccttccag atcctgggta ctgaaagcct 4560
tagggaagct ggcctgagag gggaagcggc cctaagggag tgtctaagaa caaaagcgac 4620
ccattcagag actgtccctg aaacctagta ctgcccccca tgaggaagga acagcaatgg 4680
tgtcagtatc caggctttgt acagagtgct tttctgttta gtttttactt tttttgtttt 4740
gtttttttaa agatgaaata aagacccagg gggagaatgg gtgttgtatg gggaggcaag 4800
tgtggggggt ccttctccac acccactttg tccatttgca aatatatttt ggaaaaca 4858
<210> 2
<211> 676
<212> DNA
<213> circ-HER2-676nt的核苷酸序列(Nucleotide sequence of circ-HER2-676nt)
<400> 2
gatatccagg aggtgcaggg ctacgtgctc atcgctcaca accaagtgag gcaggtccca 60
ctgcagaggc tgcggattgt gcgaggcacc cagctctttg aggacaacta tgccctggcc 120
gtgctagaca atggagaccc gctgaacaat accacccctg tcacaggggc ctccccagga 180
ggcctgcggg agctgcagct tcgaagcctc acagagatct tgaaaggagg ggtcttgatc 240
cagcggaacc cccagctctg ctaccaggac acgattttgt ggaaggacat cttccacaag 300
aacaaccagc tggctctcac actgatagac accaaccgct ctcgggcctg ccacccctgt 360
tctccgatgt gtaagggctc ccgctgctgg ggagagagtt ctgaggattg tcagagcctg 420
acgcgcactg tctgtgccgg tggctgtgcc cgctgcaagg ggccactgcc cactgactgc 480
tgccatgagc agtgtgctgc cggctgcacg ggccccaagc actctgactg cctggcctgc 540
ctccacttca accacagtgg catctgtgag ctgcactgcc cagccctggt cacctacaac 600
acagacacgt ttgagtccat gcccaatccc gagggccggt atacattcgg cgccagctgt 660
gtgactgcct gtccct 676
<210> 3
<211> 565
<212> DNA
<213> circ-HER2-565nt的核苷酸序列(Nucleotide sequence of circ-HER2-565nt)
<400> 3
gaagcatacg tgatggctgg tgtgggctcc ccatatgtct cccgccttct gggcatctgc 60
ctgacatcca cggtgcagct ggtgacacag cttatgccct atggctgcct cttagaccat 120
gtccgggaaa accgcggacg cctgggctcc caggacctgc tgaactggtg tatgcagatt 180
gccaagggga tgagctacct ggaggatgtg cggctcgtac acagggactt ggccgctcgg 240
aacgtgctgg tcaagagtcc caaccatgtc aaaattacag acttcgggct ggctcggctg 300
ctggacattg acgagacaga gtaccatgca gatgggggca aggtgcccat caagtggatg 360
gcgctggagt ccattctccg ccggcggttc acccaccaga gtgatgtgtg gagttatggt 420
gtgactgtgt gggagctgat gacttttggg gccaaacctt acgatgggat cccagcccgg 480
gagatccctg acctgctgga aaagggggag cggctgcccc agccccccat ctgcaccatt 540
gatgtctaca tgatcatggt caaat 565
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> HER2-mRNA-F
<400> 4
gccctggtca cctacaacac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> HER2-mRNA-R
<400> 5
atcctctgct gtcacctctt 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> ER2-mRNA-probe
<400> 6
acacagctgg cgccgaatgt a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Circ-HER2-676nt-F
<400> 7
gtgactgcct gtccctgata 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Circ-HER2-676nt-R
<400> 8
tcgcacaatc cgcagcctct 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Circ-HER2-676nt-probe
<400> 9
ctacgtgctc atcgctcaca ac 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Circ-HER2-565nt-F
<400> 10
agatccctga cctgctggaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Circ-HER2-565nt-R
<400> 11
cagccatcac gtatgcttca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Circ-HER2-565nt-probe
<400> 12
cagcccccca tctgcaccat 20
<210> 13
<211> 171
<212> DNA
<213> HER2-mRNA标准品片段序列信息(HER2-mRNA standard fragment sequenceinformation)
<400> 13
gccctggtca cctacaacac agacacgttt gagtccatgc ccaatcccga gggccggtat 60
acattcggcg ccagctgtgt gactgcctgt ccctacaact acctttctac ggacgtggga 120
tcctgcaccc tcgtctgccc cctgcacaac caagaggtga cagcagagga t 171
<210> 14
<211> 100
<212> DNA
<213> circ-HER2-676nt标准品片段序列信息(circ-HER2-676nt standard fragmentsequence information)
<400> 14
gtgactgcct gtccctgata tccaggaggt gcagggctac gtgctcatcg ctcacaacca 60
agtgaggcag gtcccactgc agaggctgcg gattgtgcga 100
<210> 15
<211> 103
<212> DNA
<213> circ-HER2-565nt标准品片段序列信息(circ-HER2-565nt standard fragmentsequence information)
<400> 15
agatccctga cctgctggaa aagggggagc ggctgcccca gccccccatc tgcaccattg 60
atgtctacat gatcatggtc aaatgaagca tacgtgatgg ctg 103