CN114182023B - 横纹肌肉瘤中F-circP3F的检测试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中融合基因相关环状RNA‑‑F‑circP3F的试剂盒，属于生物医学检验技术领域，包括检测横纹肌肉瘤的分子标志物F‑circP3F和融合基因PAX3‑FOXO1的试剂、引物组合物和探针；分子标志物F‑circP3F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供了基于一步法RT‑PCR和qRT‑PCR技术的检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F‑circP3F的试剂盒和方法，可实现对石蜡组织中F‑circP3F mRNA的绝对定量检测，可操作性及重复性强，能够用于批量检测，灵敏度和特异性均较高，有利于横纹肌肉瘤的诊断、分型及预后评估。

Description

横纹肌肉瘤中F-circP3F的检测试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物医学检验技术领域，尤其是涉及一种检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma, RMS）是儿童和青少年最常见的软组织恶性肿瘤，约占儿童所有软组织恶性肿瘤的50%。根据临床和组织形态特征可分为胚胎性（embryonal RMS，ERMS）、腺泡状（alveolar RMS，ARMS）、梭形细胞（spindle cell RMS，SRMS）和多形性（pleomorphic RMS，PRMS）等四个主要类型。它们不仅在发病年龄、部位、组织形态等方面有差异，而且在治疗、预后上也各不相同。
迄今的研究发现，不同亚型的RMS中存在两类不同的分子遗传学改变：腺泡状RMS（ARMS）存在特异性染色体易位t (2;13) (q35;q14)、t (1;13) (q36;q14)及其融合基因PAX3/7-FOXO1、PAX3-NCOA1/2和PAX3-FOXO4等；梭形/硬化型RMS（SRMS）中不仅存在VGLL2-NCOA2基因重排，而且40-50%有MyoD1基因突变。融合基因PAX-FOXO1及其产物主要通过阻滞细胞周期、抑制细胞肌分化、增加细胞增殖侵袭迁移能力，并增强其下游靶基因和特定miRNA的表达，促进ARMS的发生发展。与融合基因阴性者相比，融合基因阳性RMS是一种高危性疾病，它对化疗反应差，易转移和复发，总体5年存活率低于50%，而转移或复发患者的5年存活率低于20%，因此，确定有效的诊断和治疗方法，提高生存率是急需解决的关键问题。
环状RNA（circular RNA，circRNA）是1976年Sanger等人首先在植物感染的类病毒发现的闭合环状非编码RNA分子，具有环状共价键结构，对外切酶具有较高的耐受性。由于其保守性、丰富性和特异性，cicRNA在转录后水平具有多种生物学功能并参与肿瘤发生：（1）充当miRNA海绵；（2）调控基因转录；（3）与RNA结合蛋白（RBP）相互作用；（4）翻译成多肽。越来越多的证据表明，来自融合基因反剪接的环状RNA是除融合蛋白以外参与肿瘤发生发展的另一个途径。因此，检测融合基因相关环状RNA 作为分子标志物，有利于横纹肌肉瘤的诊断、分型及预后评估。
在本申请中，申请人在运用RT-PCR技术扩增腺泡状RMS中融合基因PAX3-FOXO1及其相关circ RNA时，通过优化引物设计和线性RNA消化，使用发散引物(Divergent primer)在腺泡状RMS细胞系中扩增到一个阳性目的片段，通过对PCR产物Sanger测序并使用NCBI数据库进行比对证实为融合基因PAX3-FOXO1相关环状RNA（Fusion gene PAX3-FOXO1related circ RNA），将其命名为F-circP3F。由于此F-circP3F为国内外首次发现，申请人又设计引物成功扩增并经测序验证了F-circP3F的全长核苷酸序列；circRNA-seq结果再次证实，PAX3-FOXO1阳性ARMS细胞中存在相同的F-circP3F。
目前，常用的检测circRNA的分子生物学方法包括Northern blot、RNA原位杂交(RNAscope与BaseScope)、circRNA测序（circRNA-seq）和逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)。Northern blot容易出现RNA的降解，虽然特异性较高能够降低假阳性率，但灵敏度要比RT-PCR低，且实验试剂对人体有害；RNAscope与BaseScope技术是一种新的RNA原位杂交技术，虽然具有独特的双Z探针设计、信号放大系统和胞内RNA定量等特点，可用于circRNA的组织原位检测，但技术要求高，价格昂贵；circRNA测序（circRNA-seq）需要构建文库，数据分析繁杂，价格昂贵，而且其结果需要RT-PCR进一步验证；RT-PCR实验方法简化实验步骤，尤其是一步法RT-PCR，反应速度快，降低实验污染的可能性，可操作性及重复性强，能够用于批量检测，灵敏度和特异性均较高，是目前国内外学者研究circRNA首选的检测手段。
本发明提供了基于一步法RT-PCR和qRT-PCR(real-time quantitative RT-PCR)技术检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中融合基因相关环状RNA--F-circP3F的检测试剂盒及方法，以实现对石蜡组织中F-circP3F mRNA的定性和绝对定量检测，从而利于横纹肌肉瘤的诊断、分型及预后评估。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的检测试剂盒，该试剂盒可实现对石蜡包埋组织中F-circP3F mRNA的绝对定量检测，可操作性及重复性强；
本发明的第二目的在于提供一种检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的检测方法，该检测方法能够用于批量检测，灵敏度和特异性均较高。
本发明提供一种检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的检测试剂盒，包括诊断横纹肌肉瘤的分子标志物F-circP3F和融合基因PAX3-FOXO1的试剂、引物组合物和探针；
所述分子标志物F-circP3F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述引物组合物包括F-circP3F的引物和PAX3-FOXO1的引物；
所述探针包括F-circP3F的探针和PAX3-FOXO1的探针；
优选地，所述F-circP3F的探针和所述PAX3-FOXO1的探针序列分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
本发明提供的一种检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的检测试剂盒，该试剂盒可实现对石蜡组织中F-circP3F mRNA的绝对定量检测，可操作性及重复性强。其具体包括诊断横纹肌肉瘤的分子标志物F-circP3F和融合基因PAX3-FOXO1的试剂、引物组合物和探针，并且F-circP3F的探针和融合基因PAX3-FOXO1的探针序列分别为FAM-5'-AGTGAGCAGCCTCAGCACCCCAATCAGAT-3'-TAMRA、FAM-5'- TTCGTCATAATCTGTCCCTACACAGCA -3'-TAMRA。使用该试剂盒进行一步法qRT-PCR反应时，逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，避免污染的同时提高了实验效率。
作为本技术方案优选地，所述F-circP3F的引物和所述PAX3-FOXO1的引物均包括正向引物和反向引物，
所述F-circP3F的正向引物的序列如SEQ ID No.4所示，所述F-circP3F的反向引物的序列如SEQ ID No.5所示；
所述PAX3-FOXO1的正向引物的序列如SEQ ID No.6所示，所述PAX3-FOXO1的反向引物的序列如SEQ ID No.7所示。
作为本技术方案优选地，还包括Ribonuclease R酶混合液、Probe One-step qRT-PCR Kit、阳性定量参考品、阳性对照和阴性对照。
作为本技术方案优选地，所述Ribonuclease R酶混合液包括：10x Reactionbuffer、Ribonuclease R (3U/ug RNA)和RNase-free water。
作为本技术方案优选地，所述Probe One-step qRT-PCR Kit包括：5X buffer、dNTP Mixture(10mM)、Enzyme Mixed、Forward Primer、Reverse Primer、TaqMan®probe。
作为本技术方案优选地，所述阳性定量参考品为含有F-circP3F接合位点片段的PESI-T质粒，且其浓度梯度为1×106 copies/ml、1×105 copies/ml、1×104 copies/ml、1×103 copies/ml、和1×102 copies/ml。
作为本技术方案优选地，所述阳性对照为PAX3-FOXO1融合基因阳性腺泡状横纹肌肉瘤细胞系RH30；所述阴性对照为融合基因阴性的胚胎型横纹肌肉瘤细胞系RD。
本发明还公开了一种使用上述检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的检测试剂盒检测石蜡包埋组织中F-circP3F的检测方法，包括以下步骤：
S1、肿瘤细胞RNA的抽提；
S2、石蜡包埋肿瘤组织RNA的抽提；
S3、Ribonuclease R酶消化线性RNA；
S4、一步法qRT-PCR扩增反应；
S5、数据读取、分析与结果计算
作为本技术方案优选地，步骤S3中，Ribonuclease R酶消化线性RNA的体系具体包括10x Reaction buffer、Ribonuclease R (3U/ug RNA)、RNase-free water和样本RNA。
作为本技术方案优选地，步骤S4中，一步法qRT-PCR扩增反应的体系具体包括：5Xbuffer、dNTP Mixture(10mM)、Enzyme Mixed、Forward Primer、Reverse Primer、TaqMan®probe和样本RNA。
本发明的检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的检测试剂盒，与现有技术相比，具有以下优点：
本发明基于一步法qRT-PCR技术的检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的检测试剂盒，通过把F-circP3F作为标志物，可实现对石蜡组织中F-circP3F mRNA的绝对定量检测，可操作性及重复性强，能够用于批量检测，灵敏度和特异性均较高，有利于横纹肌肉瘤的诊断、分型及预后评估。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的引物设计原理模式图；
图2为一步法RT-PCR检测ARMS细胞和组织中PAX3-FOXO1 mRNA表达并测序证实；
图3为一步法RT-PCR检测ARMS细胞中F-circP3F的Fusion位点并测序证实；
图4为一步法RT-PCR及测序验证ARMS细胞系中F-circP3F的junction 位点并测序证实；
图5为为circRNA-seq检测和分析ARMS细胞中F-circP3F表达；
图6为一步法RT-PCR检测ARMS组织中F-circP3F的Fusion位点并测序证实；
图7为一步法RT-PCR及测序验证ARMS组织中F-circP3F的junction 位点并测序证实；
图8为本发明提供的PAX3-FOXO1标准品的标准曲线，本实验标准曲线斜率为-3.344，效率值为1.991；
图9为本发明提供的PAX3-FOXO1标准品及ARMS样本的一步法qRT-PCR扩增曲线；
图10为本发明提供的F-circP3F标准品的标准曲线，本实验标准曲线斜率为-3.321，效率值为2.000；
图11为本发明提供的F-circP3F标准品及ARMS样本的一步法qRT-PCR扩增曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、实验材料
1、人横纹肌肉瘤细胞株与横纹肌肉瘤组织
人腺泡状横纹肌肉瘤细胞系RH30和人骨骼肌细胞（Human Skeletal MuscleCells，HSKMC）购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，人类胚胎型横纹肌肉瘤细胞系RD购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。5例腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS）为石蜡包埋组织，其基本信息和分子遗传学特点见表1。
表1. 人横纹肌肉瘤细胞系和组织样本信息表
Figure DEST_PATH_IMAGE001
2、融合基因PAX3-FOXO1及其环状RNA--F-circRNA引物序列
2.1、引物设计
由于 PAX3-FOXO1融合基因为2号染色体上PAX3基因7号外显子和13号染色体上FOXO1基因2号外显子之间发生易位融合，所以申请人在设计引物时，通过已知的PAX3-FOXO1基因的序列设计融合基因引物F1/R1。然后根据F-circRNA形成原理，在其接合位点（Junction site）的两侧，分别设计正向引物F2（位于PAX3基因的第7号外显子）和反向引物R2（位于FOXO1基因的2号外显子），扩增片段大小为131bp，内含有F-circP3F的接合位点序列。
为了明确扩增所得的F-circP3F为融合基因PAX3-FOXO1产生的环状RNA，申请者进一步设计了含融合位点和接合位点的左半环引物F4/R4，以及含接合位点的右半环引物F3/R3，PCR扩增后进行一代测序，然后拼接出F-circP3F的全长序列（图1）。
2.2、实验中各种PCR相关引物序列详见表2。
表2、各种PCR引物序列表
Figure 64794DEST_PATH_IMAGE002
3、主要试剂
1) Trizol试剂（Invitrogen）
2) Proteinase K (PK) Solution（Promega）
3) QIAGEN One Step RT-PCR Kit（Qiagen）
4) RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）
5) Ribonuclease R Kit（Lucigen）
二、实验方法与步骤
1、肿瘤细胞RNA的抽提
（1）从25cm2培养瓶中吸出所有培养基，弃之；PBS洗涤一次，加入1.0 mL Trizol液，室温孵育15min；将所有液体移入1mL离心管中，室温孵育5min后，加氯仿200μL 后用vortex剧烈混匀10秒，室温孵育2min；然后12000 rpm/4℃离心15min；
（2）移水相至另一1.5mL离心管中(约450μL) 按1:1体积(即450μL)加异丙醇，吹打后室温孵育10min；12000 rpm/4℃离心10min，弃上清；
（3）加75%酒精1.0mL，上下颠倒离心管数次；7500 rpm/4℃离心 5min；重复2次；弃上清，干燥；
（4）加无酶水50μL溶解RNA (30-60min)，使用Nanodrop测量RNA浓度及A260/A280和A260/A230比值并记录。
2、RNase R酶消化线性RNA
（1）取5μg样本RNA(体积=5μg /样本RNA浓度)加入200μL无酶EP管中；
（2）EP管加入按表3配置RNase R消化线性RNA体系20μL，混匀；
表3. RNase R消化线性RNA体系
Figure 331828DEST_PATH_IMAGE003
（3）EP管放入PCR仪，设置37℃/30min，65℃/20min后取出。
3、一步法RT-PCR
（1）样本RNA一步法RT-PCR扩增反应
①取标记好的200μL无酶EP管，按照表4配制一步法RT-PCR扩增反应体系，混匀，离心；
表4. 一步法RT-PCR扩增反应体系
Figure 530728DEST_PATH_IMAGE004
②将加入配置反应体系的EP管放入PCR仪，按如下设置的反应条件开始PCR扩增：
Figure 261923DEST_PATH_IMAGE005
（2）PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳
①制胶：按照琼脂糖2.5g，1×TAE100mL，Gelstain10μL配方制琼脂糖凝胶。
②电泳：将琼脂糖凝胶放入电泳槽，加满1×TAE，在每胶孔中加入8μL PCR产物、标准带孔加入2μL 50bp DNA marker，调节电压90V，持续30min。
③曝光：将琼脂糖凝胶放入曝光仪自动曝光并拍照保存。
三、结果
1、一步法ARMS细胞和组织中融合基因PAX3-FOXO1 mRNA的表达
选取5例腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS）的石蜡包埋组织，分别以融合基因阳性ARMS细胞系RH30和融合基因阴性的ERMS细胞系RD作为阳性和阴性对照，使用PAX3-FOXO1引物F1/R1进行一步法RT-PCR。凝胶电泳显示RH30细胞系和5例ARMS组织样本均扩增出PAX3-FOXO1目的条带，而RD细胞系和空白对照均为阴性。Sanger测序结果与NCBI数据库中的参考序列一致（图2）。
2、ARMS细胞和组织中PAX3-FOXO1相关环状RNA-F-circP3F的表达
2.1、一步法 RT-PCR技术检测ARMS细胞RH30中F-circP3F的表达
选取PAX3-FOXO1融合基因阳性ARMS细胞系RH30和融合基因阴性的ERMS细胞系RD和正常骨骼肌细胞系HSKMC进行总RNA的提取，并用RNase R酶消化线性RNA，然后使用F-circRNA引物F2/R2进行一步法RT-PCR扩增，凝胶电泳结果显示经RNase R酶消化后，RH30细胞系中扩增出131bp的目的片段。对PCR产物进行Sanger测序证实其序列为PAX3基因和FOXO1基因产生的F-circRNA，且其剪接位点位于PAX3基因5号外显子头部和FOXO1基因2号外显子尾部（图3、图4）。
2.2、RT-PCR检测ARMS细胞RH30中F-circP3F全长序列
由于F-circP3F为国内外首次发现，为了明确扩增所得的F-circP3F为融合基因PAX3-FOXO1产生的环状RNA，申请者使用含融合位点和接合位点的左半环引物F4/R4，以及含接合位点的右半环引物F3/R3，进行PCR扩增，凝胶电泳和Sanger测序结果与预测结果一致（图1），将测序产物中的序列拼接，发现实验所得F-circP3F全长序列与推断F-circP3F全长序列一致。进行一代测序，然后拼接出F-circP3F的全长序列。
2.3、circRNA-seq证实ARMS细胞中存在F-circP3F
选取PAX3-FOXO1融合基因阳性ARMS细胞系RH30和融合基因阴性的ERMS细胞系RD和正常骨骼肌细胞系HSKMC在广州吉赛生物科技公司进行circRNA测序。RNA提取和样品质检后进行文库构建，在保证文库质量合格的情况下上机测序，采用Fcirc软件进一步分析融合基因相关circRNA，结果显示共有65个融合基因相关circRNA，其中PAX3- FOXO1相关环状RNA共有9个，分别为：circPAX3-FOXO1_1、circPAX3-FOXO1_2、F-circP3F、circFOXO1-PAX3_1、circFOXO1-PAX3_2、circFOXO1-PAX3_3、circFOXO1-PAX3_4、circFOXO1-PAX3_5、circFOXO1-PAX3_6，经测序证实我们首次发现的F-circP3F仅在RH30细胞系中表达（图5黑色箭头示）。
2.4、一步法RT-PCR方法检测ARMS组织中F-circP3F的表达
选取5例腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS）的石蜡包埋组织样本，以RH30作阳性对照，RD作阴性对照，使用RNase R酶消化线性RNA，接着使用F-circP3F的引物，在组织和细胞中同时进行一步法RT-PCR检测F-circP3F的表达。琼脂糖凝胶电泳结果显示经RNase R酶消化后，在RH30细胞系和ARMS组织样本均扩增出131bp的F-circP3F目的条带，而RD细胞系未扩增出目的条带。Sanger测序结果证实ARMS显示细胞系和组织中的扩增产物序列与F-circP3F基因序列一致（图6、图7）。
实施例2
一、实验引物及试剂
1、引物及探针
实验中一步法qRT-PCR相关引物及探针序列详见表5。
表5. 一步法qRT-PCR引物及探针序列表
Figure 255287DEST_PATH_IMAGE006
2、阳性定量参考品的制备
1）通过F1/R1引物对RH30细胞总RNA进行扩增，得到含PAX3-FOXO1融合基因位点的片段产物，将其导入到PESI-T质粒中，转入大肠杆菌进行大量培养，提取纯化质粒，测定质粒浓度，计算出单位体积中的拷贝数，按比例稀释，得到阳性定量质粒参考品系列：1×106copies/ml、1×105 copies/ml、1×104 copies/ml、1×103 copies/ml、和1×102 copies/ml。
2）通过F2/R2引物对RH30细胞总RNA进行扩增，得到131bp的含F-circP3F接合位点的片段产物，将其导入到PESI-T质粒中，转入大肠杆菌进行大量培养，提取纯化质粒，测定质粒浓度，计算出单位体积中的拷贝数，按比例稀释，得到阳性定量质粒参考品系列：1×106 copies/ml、1×105 copies/ml、1×104 copies/ml、1×103 copies/ml、和1×102copies/ml。
3、主要试剂
1) Trizol试剂（Invitrogen）
2) Proteinase K (PK) Solution（Promega）
3) QIAGEN One Step RT-PCR Kit（Qiagen）
4) RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）
5) Ribonuclease R Kit（Lucigen）
4、样本临床病理信息
表6. 样本信息表及一步法qRT-PCR检测的组织中PAX3-FOXO1和F-circP3F的表达
Figure 9617DEST_PATH_IMAGE007
二、实验方法与步骤
1、肿瘤细胞RNA的抽提
（1）从25cm2培养瓶中吸出所有培养基，弃之；PBS洗涤一次，加入1.0 mL Trizol液，室温孵育15min；将所有液体移入1mL离心管中，室温孵育5min后，加氯仿200μL后用vortex剧烈混匀10秒，室温孵育2min；然后于12000 rpm/4℃离心15min；
（2）移水相至另一1.5mL离心管中(约450μL) 按1:1体积(即450μL)加异丙醇，吹打后室温孵育10min后；然后于12000 rpm/4℃离心10min，弃上清；
（3）加入75%酒精1.0mL，上下颠倒离心管数次；然后于7500 rpm/4℃离心 5min；重复2次；弃上清，干燥；
（4）加无酶水50μL溶解RNA (30-60min)，使用Nanodrop测量RNA浓度及A260/A280和A260/A230比值并记录。
2、石蜡包埋肿瘤组织RNA的抽提
（1）每例用新刀连续切取10μm蜡膜10张，置入1.5 mL消毒离心管中；加入1.0 mL二甲苯55℃孵育10min；于13000 rpm/4℃离心2min；重复一次；加100％酒精1.0mL室温孵育10min，于13000 rpm/4℃离心2min，弃上清；重复一次；加细胞裂解液（提前配置）250μL后于13000 rpm/4℃离心10秒后，混匀；加蛋白酶K（Protease K）（20mg/mL）50μL，55℃干式恒温器中过夜（12小时）。
（2）于95℃干式恒温器中灭活蛋白酶K 5min，13000 rpm/4℃离心2min，弃沉淀，收集上清液至2mL离心管中；加1.0 mL Trizol 液（购自Invitrogen）入离心管中，室温孵育5min；加氯仿200μL后用vortex剧烈混匀15秒，室温孵育5min；然后于13000 rpm/4℃离心10min；移水相至另一2.0 mL离心管中(约700μL) 按1:1体积(即700μL)加异丙醇，吹打后室温孵育10min，–25℃沉淀30min；13000 rpm/4℃离心10min，弃上清；加75%酒精1.0mL，上下颠倒离心管数次；13000 rpm/4℃离心 5min，弃上清，干燥；加无酶水50μL溶解RNA (30-60min)，使用Nanodrop测量RNA浓度及A260/A280和A260/A230比值并记录。
3、Ribonuclease R酶消化线性RNA
（1）取5μg样本RNA(体积=5μg /样本RNA浓度)加入200μL无酶EP管中；
（2）EP管加入按表7配置Ribonuclease R酶消化线性RNA体系20μL，混匀；
表7. Ribonuclease R酶消化线性RNA体系
Figure 746629DEST_PATH_IMAGE008
（3）EP管放入PCR仪，设置37℃/30min，65℃/20min后取出。
4、一步法qRT-PCR
（1）取标记96孔板，按表8配制一步法qRT-PCR扩增反应体系，混匀，离心；
表8.一步法qRT-PCR扩增反应体系
Figure 270014DEST_PATH_IMAGE009
（2）将加入配置反应体系的96孔板放入LightCycler 480 PCR仪，按设置反应条件开始PCR扩增（根据不同长度等设定退火温度、时间等）：
Figure 699858DEST_PATH_IMAGE010
（1）LightCycler 480 PCR仪根据标准品溶液系列浓度1×106、1×105、1×104、l×103、1×102 copies/mL，绘制标准曲线。
（2）LightCycler 480 PCR仪系统软件读取与分析PAX3-FOXO1 mRNA和F-circP3F的表达数据，并与标准曲线对比后，计算出组织样品中PAX3-FOXO1 mRNA和F-circP3F的含量（copies/mL）。
三、结果
1、一步法qRT-PCR检测ARMS组织中PAX3-FOXO1 mRNA的表达
本实验标准曲线斜率为-3.344，效率值为1.991（图8）。14例腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS）石蜡包埋组织，成功抽提RNA，分别以RH30和RD细胞系作为阳性和阴性对照，一步法qRT-PCR检测ARMS样本中PAX3-FOXO1 mRNA，与标准曲线对比后，PAX3-FOXO1 mRNA的定量结果见表6和图9。
2、一步法qRT-PCR检测ARMS组织中F-circP3F的表达
本实验标准曲线斜率为-3.321，效率值为2.000（图10）。14例腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS）石蜡包埋组织，成功抽提RNA，分别以RH30和RD细胞系作为阳性和阴性对照，一步法qRT-PCR检测ARMS样本中F-circP3F表达，与标准曲线对比后，F-circP3F的定量结果见表6和图11。
上述试验表明：基于一步法RT-PCR和qRT-PCR技术的检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的检测试剂盒及检测方法，通过把F-circP3F作为标志物，可实现对石蜡组织中F-circP3F mRNA的绝对定量检测，可操作性及重复性强，能够用于批量检测，灵敏度和特异性均较高，有利于横纹肌肉瘤的诊断、分型及预后评估。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京朝阳医院
<120> 横纹肌肉瘤中F-circP3F的检测试剂盒及方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1939
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattcaattc gtcataatct gtccctacac agcaagttca ttcgtgtgca gaatgaagga 60
actggaaaaa gttcttggtg gatgctcaat ccagagggtg gcaagagcgg gaaatctcct 120
aggagaagag ctgcatccat ggacaacaac agtaaatttg ctaagagccg aagccgagct 180
gccaagaaga aagcatctct ccagtctggc caggagggtg ctggggacag ccctggatca 240
cagttttcca aatggcctgc aagccctggc tctcacagca atgatgactt tgataactgg 300
agtacatttc gccctcgaac tagctcaaat gctagtacta ttagtgggag actctcaccc 360
attatgaccg aacaggatga tcttggagaa ggggatgtgc attctatggt gtacccgcca 420
tctgccgcaa agatggcctc tactttaccc agtctgtctg agataagcaa tcccgaaaac 480
atggaaaatc ttttggataa tctcaacctt ctctcatcac caacatcatt aactgtttcg 540
acccagtcct cacctggcac catgatgcag cagacgccgt gctactcgtt tgcgccacca 600
aacaccagtt tgaattcacc cagcccaaac taccaaaaat atacatatgg ccaatccagc 660
atgagccctt tgccccagat gcctatacaa acacttcagg acaataagtc gagttatgga 720
ggtatgagtc agtataactg tgcgcctgga ctcttgaagg agttgctgac ttctgactct 780
cctccccata atgacattat gacaccagtt gatcctgggg tagcccagcc caacagccgg 840
gttctgggcc agaacgtcat gatgggccct aattcggtca tgtcaaccta tggcagccag 900
gcatctcata acaaaatgat gaatcccagc tcccataccc accctggaca tgctcagcag 960
acatctgcag ttaacgggcg tcccctgccc cacacggtaa gcaccatgcc ccacacctcg 1020
ggtatgaacc gcctgaccca agtgaagaca cctgtacaag tgcctctgcc ccaccccatg 1080
cagatgagtg ccctgggggg ctactcctcc gtgagcagct gcaatggcta tggcagaatg 1140
ggccttctcc accaggagaa gctcccaagt gacttggatg gcatgttcat tgagcgctta 1200
gactgtgaca tggaatccat cattcggaat gacctcatgg atggagatac attggatttt 1260
aactttgaca atgtgttgcc caaccaaagc ttcccacaca gtgtcaagac aacgacacat 1320
agctgggtgt caggctgagg gttagtgagc agcctcagca ccccaatcag atgaaggctc 1380
tgatattgac tctgaaccag atttaccact aaagaggaaa cagcgcagaa gccgaaccac 1440
cttcacagca gaacagctgg aggaactgga gcgtgctttt gagagaactc attaccctga 1500
catttatact agggaggaac tggcccagag ggcgaagctc accgaggccc gagtacaggt 1560
ctggtttagc aaccgccgtg caagatggag gaagcaagct ggggccaatc aactgatggc 1620
tttcaaccat ctcattcccg gggggttccc tcccactgcc atgccgacct tgccaacgta 1680
ccagctgtcg gagacctctt accagcccac atctattcca caagctgtgt cagatcccag 1740
cagcaccgtt cacagacctc aaccgcttcc tccaagcact gtacaccaaa gcacgattcc 1800
ttccaaccca gacagcagct ctgcctactg cctccccagc accaggcatg gattttccag 1860
ctatacagac agctttgtgc ctccgtcggg gccctccaac cccatgaacc ccaccattgg 1920
caatggcctc tcacctcag 1939
<210> 2
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtgagcagcctcagcaccccaatcagat 29
<210> 3
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcgtcataatctgtccctacacagca 27
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggtgtcaggctgagggtta 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acttgctgtgtagggacag 19
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggcctctcacctcagaattca 22
<210> 7
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggattgagcatccaccaag 20

Claims (3)

1.一种检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的检测试剂盒，其特征在于，包括诊断横纹肌肉瘤的分子标志物F-circP3F和融合基因PAX3-FOXO1的试剂、引物组合物和探针；
所述分子标志物F-circP3F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述引物组合物包括F-circP3F的引物和PAX3-FOXO1的引物；
所述探针包括F-circP3F的探针和PAX3-FOXO1的探针；
所述F-circP3F的探针和所述PAX3-FOXO1的探针序列分别如SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3所示；
所述F-circP3F的引物和所述PAX3-FOXO1的引物均包括正向引物和反向引物，
F-circP3F的正向引物的序列如SEQ ID No.4所示，F-circP3F的反向引物的序列如SEQID No.5所示；
PAX3-FOXO1的正向引物的序列如SEQ ID No.6所示，PAX3-FOXO1的反向引物的序列如SEQ ID No.7所示。
2.根据权利要求1所述的检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性定量参考品，所述阳性定量参考品为含有F-circP3F接合位点片段的PESI-T质粒。
3.根据权利要求1所述的检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F-circP3F的检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为PAX3-FOXO1融合基因阳性腺泡状横纹肌肉瘤细胞系RH30；所述阴性对照为融合基因阴性的胚胎型横纹肌肉瘤细胞系RD。
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