CN111876488B - 环状RNA标志物hsa_circ_0006670及其在前列腺癌诊断中的应用 - Google Patents
环状RNA标志物hsa_circ_0006670及其在前列腺癌诊断中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术、生物医药领域，特别是一种环状RNA标志物hsa_circ_0006670，及其前列腺癌诊断中的应用，该标志物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所述的hsa_circ_0006670在前列腺癌患者中表达上调，通过检测hsa_circ_0006670的表达，判断受试者是否有患前列腺癌的风险，使hsa_circ_0006670可作为前列腺癌临床诊断评估的重要指标。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术、生物医药领域，特别是一种环状RNA标志物 hsa_circ_0006670，及其前列腺癌诊断中的应用。
背景技术
前列腺癌（prostate cancer , PCa）发病率位于男性肿瘤首位，死亡率位居男性肿瘤第二位，近年来，我国前列腺癌的发病率呈逐年上升趋势。临床上诊断前列腺癌的金标准为前列腺穿刺活检，而初筛的方法主要有直肠指检及前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen, PSA）。目前前列腺癌诊断的方法应用较广泛的是血清 PSA 检测，但PSA 并非前列腺癌特异性抗原，在良性前列腺增生和前列腺炎患者血清中 PSA 水平也高。因此，筛选前列腺癌特异性标志物对前列腺癌早期诊断至关重要。
环状 RNA (circular RNA, circRNA) 是一种内源性的非编码RNA (noncodingRNA , ncRNA)，由下游 3’剪接供体与上游 5’剪接受体反向剪接形成的共价闭合单链RNA，具有较高的稳定性。CircRNA 序列在物种间高度保守、具有细胞及组织表达特异性。近年研究表明，circRNA 与 miRNAs、mRNAs 及蛋白质形成庞大而复杂的调控网络，参与诸多细胞生命进程及人类疾病的发生发展。现阶段研究表明，外显子成环的 circRNA 调控细胞生命活动的机制主要有：① CircRNA 与 mRNA 竞争结合 miRNA，减少 miRNA 对 mRNA 转录后抑制作用；② CircRNA 与 RNA 结合蛋白相互作用影响 mRNA 表达；③ CircRNA 编码蛋白，在细胞各项生命活动中发挥功能；④ CircRNA 与蛋白结合形成多元复合物，参与细胞生命进程。CircRNA 的生物学特性使其可以作为肿瘤诊断和预后的生物标志物及精准治疗的靶点。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术存在的不足，提供一种与前列腺癌相关的circRNA 生物标志物，所述circRNA在前列腺癌患者中存在差异表达，通过检测该 circRNA的表达水平，判断受试者是否患有前列腺癌，为临床上前列腺癌的早期诊断提供支持。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
提供一种环状RNA标志物，所述标志物为hsa_circ_0006670，核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示。
与良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH)相比，当hsa_circ_0006670表达水平显著上调时，受试者有患前列腺癌的风险。
作为本发明的优选方案，所述标志物为用于前列腺癌早期诊断中的标志物。
本发明的目的还在于，上述的环状RNA标志物，在前列腺癌早期诊断中的应用。
本发明还提供一种用于验证如上述标志物的试剂，所述试剂包括特异性扩增hsa_circ_0006670的背对背引物，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2-3所示。即核苷酸序列如SEQ IDNO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
作为本发明的优选方案，所述试剂包括特异性扩增hsa_circ_0006670的面对面引物，核苷酸序列如SEQ ID NO. 4-5所示。即核苷酸序列如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示。
本发明还提供一种用于检测上述标志物的试剂盒，包括反转录PCR和实时定量PCR检测hsa_circ_0006670表达的试剂，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2-3所示。即核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
作为本发明的优选方案，试剂盒还包括原位杂交检测hsa_circ_0006670的表达的试剂，核苷酸序列如如SEQ ID NO. 6所示。
作为本发明的优选方案，试剂盒还包括扩增GAPDH内参基因的引物，核苷酸序列如SEQ ID No. 7-8所示。即核苷酸序列如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示。
作为本发明的优选方案，所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如反转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明所述的hsa_circ_0006670在前列腺癌患者中表达上调，通过检测hsa_circ_0006670的表达，判断受试者是否有患前列腺癌的风险，使hsa_circ_0006670可作为前列腺癌临床诊断评估的重要指标。
附图说明
图1为hsa_circ_0006670来源于亲本基因的结构示意图及前列腺癌细胞株PC3中hsa_circ_0006670扩增后的接头位置测序结果。
图2为鉴定hsa_circ_0006670为环状RNA的PCR验证图，所用细胞株为PC3。
图3为鉴定hsa_circ_0006670在细胞中定位的PCR验证图及Q-PCR图，所用细胞株为PC3。
图4为hsa_circ_0006670在正常前列腺上皮细胞及前列腺癌细胞株中表达的检测结果PCR图及Q-PCR图。
图5为hsa_circ_0006670在前列腺增生和前列腺癌病人新鲜穿刺组织中表达的检测结果PCR图及Q-PCR图。
图6为hsa_circ_0006670在前列腺增生和前列腺癌病人新鲜穿刺组织中表达的原位杂交检测结果图，标尺为100μm。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
hsa_circ_0006670的引物设计与验证
1、hsa_circ_0006670引物的设计
在circBase上下载hsa_circ_0006670的fasta格式序列，如SEQ ID NO. 1所示：
GGGUUGGCCGGAGACCUACGACAUGAAUACCUCGGAGCCCAAGACGGAGCAGGAAAGCAUCACUCCUGGGGGCCGGCCCCCCUACCGCAGCAAUGCUCCCUGGCAGUGGAGCGGGCCCGCAUCCCAUAACUCUCUACCAGCCUCCAAGUGGGCCACUCCAACCACUCCCGGCCAUGCCCAGUCCCUGAGCCGGCCCCUGAAGCAGACCCCCAUAGUCCCCUUCCGGGAGUCCCAGCCACUGCACAGCAAGAGGCCUGUCAGCUUCCCAGAAACCCCUUACACAGUAUCACCAGCAGGGGCCGACAGAGUCCCUCCCUACCGACAGCCUUCUGGGAGCUUCUCCACCCCCGGUUCGGCCACCUACGUGAGAUACAAGCCAUCCCCAGAAAG
将获得的原始序列首尾两个碱基标记。在原始序列中截取任意位点，将此位点至序列尾端移至原始序列最前端，构成新序列，针对新序列设计引物。其中，后引物要求跨序列间的首尾碱基位点。此设计的引物即为背靠背引物（divergent primers），背靠背引物序列如SEQ ID No. 2-3所示；针对原序列设计引物，此引物称为面对面引物（convergentprimers），面对面引物序列如SEQ ID No. 4-5所示。其基因组中的位置为chr19:38631823-38633350，其在亲本基因中的位置及接头位置测序结果如图1所示；
2、PC3细胞株Trizol法提取总RNA
参照TaKaRa公司RNAiso Plus（Code No.9109）试剂盒说明书进行操作。具体步骤如下：
①T25培养瓶培养PC3细胞，细胞汇合度在80％-90％时，倒掉培养基，用1ml PBS清洗细胞，0.25%胰酶消化细胞，800rpm离心5min，弃上清；
②PBS洗涤PC3细胞沉淀，离心后弃上清，加入1ml RNAiso Plus，移液枪吸打混匀至无沉淀，形成细胞裂解液，室温静置5min；
③加入200μl 氯仿，振荡混匀，室温静置5min，12000g，4℃离心15min；
④将上层透明清液转移至新的1.5ml EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，12000g，4℃离心10min，弃上清；
⑤向④的EP管中加入1ml 75%乙醇，颠倒洗涤RNA沉淀，12000g，4℃离心5min，弃上清；
⑥瞬时离心⑤中EP管，弃上清，室温晾干至沉淀透明，加入DEPC水30μl；
⑦细胞总RNA电泳鉴定其质量，A260/A280=1.8-2.0且28S：18S=1.8-2.0时，RNA质量好，可用于后续研究。整个过程中所用的试剂和耗材均为RNase-free的。
3、RNA酶(RNase R)消化总RNA中的线性RNA
参照EPicentre公司RNase R（Code No. RNR-07250）试剂说明书进行操作。具体步骤如下：
①在RNase-free的EP管中依次加入上述2中提取的PC3细胞总RNA 10μg，RNase R10U和10×RNase R Buffer 2μl，DEPC水补至总体积20μl；
②将①中含有反应液的EP管置于37℃孵育15min；
③Trizol法提取②中非线性RNA并将其溶解于20μl DEPC水中。
4、反转录
参照TaKaRa公司Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）（Code No. 2641A）试剂盒说明书进行操作。反转录体系为20μl具体步骤如下：
①Microtube管中配制上述3中经RNase R消化后的RNA 1μg、Random primers 1μl和DEPC水的混合液，总体积14μl，70℃保温10min后迅速在冰上急冷至少2min，13000g瞬时离心使混合液聚集于Microtube管底部；
②向①中混合液中依次加入4μl 5×M-MLV Buffer、0.5μl dNTP Mixture（10mM），RNase inhibitor 0.5μl以及0.5μl RTase M-MLV（RNase H-）混匀后瞬时离心；
③将②中Microtube管置于PCR仪中，依次进行三个温度反应：30℃，10min；42℃保温1h；70℃保温15min后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于PCR扩增及Q-PCR等。
5、hsa_circ_0006670引物的验证
参照康为世纪生物科技有限公司2×Taq MasterMix（Code No. CW0682L）试剂说明书进行操作。具体操作如下：
①以上述4所得cDNA为模板，分别用divergent primer和convergent primer进行PCR扩增；
②PCR体系为20μl，cDNA 2μl，上下游primer（10μM）各1μl，2×Taq MasterMix 10μl，ddH2O补至总体积20μl；
③PCR扩增：95℃，2min；[95℃，10s；60℃，30s；72℃，10S]×40 cycles；72℃，5min；16℃保温；
④2%琼脂糖（Amresco，Code No. E776-25G）胶电泳，目的条带位置如图2所示。
6、PCR扩增产物回收
将上述5中PCR产物进行回收，按照康为世纪Gel Extraction Kit（Code No.CW2302M）试剂盒说明书进行操作。具体操作如下：
①将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，置于干净1.5ml EP管中，凝胶称重；
②向胶块中加入3倍体积的Buffer PG；当琼脂糖凝胶浓度＞2%时，使用6倍体积的Buffer PG（凝胶重100mg则其体积视为100μl，以此类推）；
③50℃孵育10min，每隔2-3min上下颠倒EP管，直至胶块完全溶解；
④当回收片段＜500bp或＞4kb时，应加入1倍凝胶体积的异丙醇，上下颠倒混匀；
⑤向已装入收集管中的吸附柱中加入200μl Buffer PS，13000rpm，2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
⑥将③或④所得溶液加入到吸附柱中，室温放置2min，13000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
⑦向吸附柱中加入750μl Buffer PW（使用前检查是否已加入无水乙醇），13000rpm，1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中；
⑧13000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干；
⑨将吸附柱放到一个新的1.5ml EP管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μlBuffer EB，室温放置2min；13000rpm，1min，收集DNA溶液，-20℃保存。
7、PCR胶回收产物连接至克隆载体并测序
此部分选用克隆载体为pMD-19T，参照TaKaRa公司pMDTM19-T Vector（Code No.6013）说明书进行操作。具体操作如下：
①上述6所得PCR产物为Insert DNA，微量离心管中配置下列DNA溶液，总量为5μl：pMD19-T 1μl，Insert DNA 0.1pmol-0.3pmol（通常克隆时，Vector DNA与Insert DNA的摩尔比为1:2-1:10），加水至总体积5μl；
②向①微量离心管中加入5μl Solution I，混匀，16℃反应1-2h；
③将②中反应液加至100μl JM109感受态细胞中，冰浴30min；
④42℃热激活45s，迅速冰浴至少2min；
⑤加入890μl SOC培养基，37℃，180rpm，60min；
⑥在含有X-Gal、IPTG和Amp的LB-琼脂平板培养基上37℃倒置培养过夜；
⑦挑选白色菌落，用PCR法确定载体中插入DNA片段的长度；
⑧PCR法筛选DNA片段与目的DNA相同的菌落；
⑨对菌落使用BcaBEST Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序；
⑩测序结果进行比对，确定hsa_circ_0006670 的全长序列及首尾接头序列。
至此，完成hsa_circ_0006670的引物设计与验证部分，结果如图1，2所示。
实施例2
hsa_circ_0006670来源验证
1、PC3细胞全基因组DNA (gDNA) 的提取
参照Promega公司Wizard® Genomic DNA Purification（Code No. A1120）试剂盒说明书进行操作。具体步骤如下：
①T25培养瓶培养PC3细胞，细胞汇合度在80％-90％时，倒掉培养基，用1ml PBS清洗细胞，0.25%胰酶消化细胞，800rpm离心5min，弃上清；
②PBS洗涤PC3细胞沉淀，离心后弃上清，加入600μl Nuclei Lysis Solution，移液枪吸打混匀至无沉淀，形成细胞裂解液；
③加入3μl RNase Solution至PC3细胞裂解液中，37℃孵育30min，降至室温；
④加200μl Protein Precipitation Solution，涡流混匀后冰浴5min，13000g离心4min；
⑤上清转移至含600μl 异丙醇的1.5ml EP（Eppendorf）管中，来回颠倒混匀，13000g离心1min，弃上清；
⑥在⑤离心管中加入600μl 70%乙醇，混匀，13000g离心1min，弃上清，室温晾干15min；
⑦在⑥中加入100μl DNA Rehydration Solution，65℃溶解1h后4℃过夜。
2、PCR验证hsa_circ_0006670来源
具体步骤同实施例1，引物为divergent primer，模板本别选用实施例1中PC3细胞总RNA及本实施例中gDNA。产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，hsa_circ_0006670来源于总RNA而不是gDNA。
实施例3
hsa_circ_0006670细胞定位检测
1、PC3细胞核浆分离
参照ambion公司PARISTM KIT（Code No. AM1921）试剂盒说明书进行操作。具体步骤如下：
①T25培养瓶培养PC3细胞，细胞汇合度在80%-90%时，倒掉培养基，用1ml PBS清洗细胞，0.25%胰酶消化细胞，800rpm离心5min，弃上清；
②预冷的PBS重悬PC3细胞，4℃，800rpm，5min；③向②中冰浴的PC3细胞沉淀中加入400μl预冷的Cell Fractionation Buffer，轻轻混匀，冰浴10min，待其澄清则裂解完成，4℃，800rpm，5min，收集上清为细胞浆裂解液；
④向③中离心后的沉淀中加入400μl Cell Disruption Buffer裂解细胞核，保持冰浴直至裂解液均一；
⑤分别向③④裂解液中加入400μl 2×Lysis/Binding Buffer，室温用移液枪枪头反复吹打3-4次至完全裂解；
⑥用胰岛素针反复吹打裂解液，4℃，10000g，1min，收上清至新的RNase-free的1.5ml EP管中；
⑦加入400μl 100%乙醇至上清，轻柔吹打混匀，将上清转移至吸附柱中，室温静止2min，4℃，10000g，1min，弃收集液；
⑧加入700μl Wash Solution 1至吸附柱中，10000g，1min，弃收集液；
⑨加入500μl Wash Solution 2/3至吸附柱中，10000g，1min，弃收集液；重复洗涤2-3次，室温静止30s；
⑩向吸附柱中加入40μl 95-100℃ Elution Solution，10000g，1min，将收集液再次加入吸附柱中，进行第二次收集，10000g，1min，所得RNA即为PC3细胞浆RNA和PC3细胞核RNA，置于-80℃保存。
2、PCR
具体步骤同实施例1，引物为divergent primer，模板本别选用本实施中PC3细胞核、浆总RNA。对照组设置：GAPDH为细胞浆参照物，引物序列如SEQ ID NO. 7-8，所示NEAT1为细胞核参照物，引物序列如SEQ ID NO. 9-10所示。产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，hsa_circ_0006670定位于细胞浆。
3、定量PCR
采用SYBR-Green染料法（Real-time qPCR Master Mix, Takara, Dalian）进行实时荧光定量PCR，以检测PC3细胞核、浆中hsa_circ_0006670的表达水平。具体操作如下：
①反应体系：SYBR 10μl，Forward Primer (10μM) 0.5μl，Reverse Primer (10μM) 0.5μl，cDNA 2μl，加水至总体积为20μl。反应条件为：95℃，预变性30s；95℃，5s；60℃，20s；72℃，10s；40个反应循环。选用GAPDH为细胞浆内参，NEAT1为细胞核内参时，cDNA 1ul，其他参数与hsa_circ_0006670的反应体系相同；
②实时荧光定量PCR使用仪器型号为罗氏RT-PCR LC480Ⅱ；
③基因细胞定位的定量计算方法：同一基因以Ct值高的细胞定位组为内参，计算核、浆的2-△Ct值，再计算核、浆2-△Ct比值；
④先计算GAPDH和NEAT1，再计算hsa_circ_0006670，根据核浆比值确定hsa_circ_0006670的细胞定位，结果如图3所示。
实施例4
circRNA在前列腺癌细胞株表达的检测
1、培养正常前列腺上皮细胞RWPE-1，前列腺癌细胞株LnCap、22RV-1，PC3和DU145。
2、提取各细胞总RNA并进行反转录及PCR扩增hsa_circ_0006670，具体步骤如实施例1所示。
3、hsa_circ_0006670相对表达值通过定量PCR进行计算，具体步骤如实施例3所示，GAPDH为内参。
4、计算hsa_circ_0006670相对于内参的定量：ΔCt＝Ct目的-Ct内参，ΔΔCt＝ΔCt前列腺癌细胞-ΔCt正常上皮细胞。采用2-ΔΔCt表示前列腺癌细胞株hsa_circ_0006670表达相对于正常前列腺癌上皮细胞组变化的倍数，结果如图4所示。
实施例5
PCR法检测hsa_circ_0006670在前列腺组织中的表达
1、前列腺增生及前列腺癌穿刺组织采集
收集我院收治的前列腺癌病人的新鲜穿刺组织10例，临床前列腺增生手术切除的BPH 5例，置于液氮中保存，避免RNA降解。所收取的样本均经病理学检查确诊。
2、组织总RNA提取
① 研磨组织所用的研钵，研杵等用品用锡箔纸包好，200℃烤4h，冷却后待用；
②研磨前用液氮将研钵研杵预冷，从液氮中取出所收集的组织，立刻放入研钵中，加液氮反复研磨直至成为粉末状，加入1ml RNAiso Plus将所有粉末覆盖，待RNAiso Plus融化后，转移至1.5ml EP管中；
③Trizol法裂解后的组织进行总RNA提取，具体步骤参照实施例1，最终选用3例BPH和6例PCa进行hsa_circ_0006670表达验证。
3、组织RNA反转录、PCR如实施例1所示，定量PCR如实施例3所示，所用引物为hsa_circ_0006670 divergent primer，GAPDH为内参。结果如图5所示。
实施例6
组织原位杂交（in situ hybridization, ISH）检测hsa_circ_0006670在前列腺
组织中的表达
1、石蜡样本来源
石蜡包埋组织样品来源于四川大学华西医院病理科存档的前列腺癌（PCa）石蜡包埋组织20例（2014-2015），2018年存档的前列腺癌增生症（BPH）石蜡包埋组织10例。
2、原位杂交的具体实施步骤如下：
①石蜡组织切片为0.4μm，56℃烤3h，冷却后-20℃保存；
②选取实验切片，脱蜡至水：二甲苯 2×5min；100%乙醇 2×5min；85%乙醇 5min；70%乙醇 5min；DEPC水 3×5min；
③10% H2O2去除内源性过氧化氢酶：切片加10% H2O2室温孵育20min，DEPC水 3×5min；
④胃蛋白酶消化：切片滴加胃蛋白酶 20μg/ml，37℃，20min，0.5M TBS 4×5min；
⑤预杂交：滴加预杂交液，37℃，1h；
⑥杂交：甩掉预杂交液，加入hsa_circ_0006670杂交探针（用杂交液稀释，终浓度为2μg/ml），特异性识别hsa_circ_0006670的探针序列如SEQ ID NO. 6所示，60℃过夜；
⑦杂交后洗涤：2×SSC 2×15min；0.5×SSC 2×15min；
⑧滴加封闭液37℃，1h；
⑨甩掉封闭液，滴加Anti-biotin-AP（1:1000，封闭液稀释），37℃，1h，0.5M TBS 4×5min；
⑩滴加NBT/BCIP（1:100，检测缓冲液配制），避光显色2min，蒸馏水终止反应，1%甲基绿复染，55℃ 2h，树胶封片。
3、结果判定：
hsa_circ_0006670杂交信号定位于胞浆，呈紫色颗粒状，根据着色强度评价染色结果。结果如图6所示。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 四川大学华西医院
<120> 环状RNA标志物 hsa_circ_0006670及其在前列腺癌诊断中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0序列表中电子文件的软件版本信息
<210> 1
<211> 390
<212> RNA
<213> 人（Homo Sapiens）
<221> hsa_circ_0006670
<400> 1
ggguuggccg gagaccuacg acaugaauac cucggagccc aagacggagc aggaaagcau 60
cacuccuggg ggccggcccc ccuaccgcag caaugcuccc uggcagugga gcgggcccgc 120
aucccauaac ucucuaccag ccuccaagug ggccacucca accacucccg gccaugccca 180
gucccugagc cggccccuga agcagacccc cauagucccc uuccgggagu cccagccacu 240
gcacagcaag aggccuguca gcuucccaga aaccccuuac acaguaucac cagcaggggc 300
cgacagaguc ccucccuacc gacagccuuc ugggagcuuc uccacccccg guucggccac 360
cuacgugaga uacaagccau ccccagaaag 390
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> hsa_circ_0006670 divergent primer (up)
<400> 2
gccacctacg tgagatacaa gc 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> hsa_circ_0006670 divergent primer (dw)
<400> 3
cccctgctgg tgatactgtg t 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> hsa_circ_0006670 convergent primer (up)
<400> 4
caagacggag caggaaagc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> hsa_circ_0006670 convergent primer (dw)
<400> 5
gggatggctt gtatctcacg 20
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> hsa_circ_0006670 probe
<400> 6
tctccggcca acccctttct ggggatggct tgta 34
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> GAPDH primer (up)
<400> 7
ggagcgagct ccctccaaaa t 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> GAPDH primer (dw)
<400> 8
ggctgttgtc atacttctca tgg 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> NEAT1 primer (up)
<400> 9
ggcaggtcta gtttgggcat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> NEAT1 primer (dw)
<400> 10
cctcatccct cccagtacca 20
序列表
<110> 四川大学华西医院
<120> 环状RNA标志物 hsa_circ_0006670及其在前列腺癌诊断中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0序列表中电子文件的软件版本信息
<210> 1
<211> 390
<212> RNA
<213> 人（Homo Sapiens）
<221> hsa_circ_0006670
<400> 1
ggguuggccg gagaccuacg acaugaauac cucggagccc aagacggagc aggaaagcau 60
cacuccuggg ggccggcccc ccuaccgcag caaugcuccc uggcagugga gcgggcccgc 120
aucccauaac ucucuaccag ccuccaagug ggccacucca accacucccg gccaugccca 180
gucccugagc cggccccuga agcagacccc cauagucccc uuccgggagu cccagccacu 240
gcacagcaag aggccuguca gcuucccaga aaccccuuac acaguaucac cagcaggggc 300
cgacagaguc ccucccuacc gacagccuuc ugggagcuuc uccacccccg guucggccac 360
cuacgugaga uacaagccau ccccagaaag 390
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> hsa_circ_0006670 divergent primer (up)
<400> 2
gccacctacg tgagatacaa gc 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> hsa_circ_0006670 divergent primer (dw)
<400> 3
cccctgctgg tgatactgtg t 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> hsa_circ_0006670 convergent primer (up)
<400> 4
caagacggag caggaaagc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> hsa_circ_0006670 convergent primer (dw)
<400> 5
gggatggctt gtatctcacg 20
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> hsa_circ_0006670 probe
<400> 6
tctccggcca acccctttct ggggatggct tgta 34
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> GAPDH primer (up)
<400> 7
ggagcgagct ccctccaaaa t 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> GAPDH primer (dw)
<400> 8
ggctgttgtc atacttctca tgg 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> NEAT1 primer (up)
<400> 9
ggcaggtcta gtttgggcat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<221> NEAT1 primer (dw)
<400> 10
cctcatccct cccagtacca 20
Claims (3)
1.检测环状RNA标志物hsa_circ_0006670表达水平的试剂在制备前列腺癌诊断试剂盒中的用途，其特征在于，
所述标志物hsa_circ_0006670的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
所述试剂包括特异性扩增hsa_circ_0006670的背对背引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示；
所述试剂包括特异性扩增hsa_circ_0006670的面对面引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括原位杂交检测hsa_circ_0006670表达的试剂，核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括扩增GAPDH内参基因的引物，核苷酸序列如SEQ ID NO. 7-8所示。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202010856114.1A CN111876488B (zh) | 2020-08-24 | 2020-08-24 | 环状RNA标志物hsa_circ_0006670及其在前列腺癌诊断中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010856114.1A CN111876488B (zh) | 2020-08-24 | 2020-08-24 | 环状RNA标志物hsa_circ_0006670及其在前列腺癌诊断中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111876488A CN111876488A (zh) | 2020-11-03 |
| CN111876488B true CN111876488B (zh) | 2022-05-06 |
Family
ID=73203611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Families Citing this family (1)
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-
2020
- 2020-08-24 CN CN202010856114.1A patent/CN111876488B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 环状RNA;shatie;《circbase》;20131231;1-3 * |
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