CN112375810A - GnT-II基因下调表达作为肝癌预后标志物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了GnT‑II基因下调表达作为肝癌预后标志物中的应用。本发明利用CRISRP人全基因组编码基因敲除文库筛选到调节抑制性免疫检查点分子CD155表达的编码基因GNT‑II，并发现在肝癌患者的肿瘤组织中GNT‑II的表达与CD155的表达呈正相关；进一步地，GNT‑II的表达与肝癌患者的预后明显相关，即在早期男性肝癌患者中GNT‑II的表达越高，患者的预后越差。因此GNT‑II在肝癌中作为预后指标具有一定的潜在应用价值。

Description

GnT-II基因下调表达作为肝癌预后标志物中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，涉及GnT-II基因下调表达作为肝癌预后标志物中的应用。
背景技术
肝癌是常见的恶性肿瘤，其病死率在所有恶性肿瘤中位居第二，严重威胁人类的生命和健康。肝癌常见的治疗方案手术治疗、靶向治疗、经导管动脉化疗栓塞和消融等治疗对晚期肝癌的治疗效果非常有限。近年来，免疫治疗的出现给肝癌的治疗提供了新的选择，细胞免疫治疗、细胞因子、肿瘤疫苗、溶瘤病毒以及免疫检查点抑制剂等新兴的免疫治疗技术也逐步往临床应用上推进，但是总体治疗应答率仍非常有限。以免疫检查点抑制剂药物为代表的免疫治疗，虽在多种实体瘤上的临床试验结果令人鼓舞，但在肝癌的临床试验结果表明，PD-1/PD-L1抗体单药免疫治疗和联合CTLA-4抗体组并未能显著改善肝癌患者的总体生存率。总体来看，肝癌目前的免疫治疗的应答率尚未达到理想的疗效。
近年来，多项研究表明TIGIT/CD155免疫检测点信号通路也是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。TIGIT分子主要作为一种具有免疫抑制作用的协同刺激分子与CD155分子结合，从而对T细胞和NK细胞功能产生抑制，进而介导肿瘤免疫逃逸。CD155是Nectin样分子家族中的第五成员，最初是作为脊髓灰质炎病毒受体被发现的，因此，CD155也被称为nel-5或PVR。CD155作为免疫球蛋白样的粘附分子，参与细胞的粘附与迁移，同时调节自然杀伤细胞和T细胞介导的免疫。CD155在各种正常人体组织中基本不表达或弱表达，但常在人类恶性肿瘤细胞中过度表达，促进肿瘤细胞侵袭和迁移，并与肿瘤进展和预后不良有关。目前针对CD155抗体单药已经在黑色素瘤、膀胱癌、卵巢癌、肾细胞癌、乳腺癌等多个癌种中开展了临床试验(https://clinicaltrials.gov)。
有研究者已经证实肝癌组织中CD155的表达高于癌旁组织，且与肝癌分期、无病生存期(DFS)和总生存期时间(OS)有很强的相关性，在阻断CD155表达后能够逆转NK细胞耗竭，使其恢复抗肿瘤活性(Sun H,et al.Hepatology,2019；70:168-183)；另有研究表明随着肝癌分化程度的降低，肝癌患者癌组织中CD155表达也随之升高，这都提示CD155可能在肝癌发生发展中发挥重要作用(Duan X,et al.Molecular medicine reports,2019；20:3773-3781)。尽管在肝癌肿瘤微环境内细胞表达的CD155具有关键作用，但对CD155调节的研究仍然有限。
CRISPR系统是存在于细菌纲和古细菌纲中的一种天然免疫系统，其全称为“成簇规律间隔短回文重复序列”(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)，可以通过识别和剪切入侵病毒基因组中的特定核酸序列，进而清除病毒、保护细菌细胞。基于CRISPR系统的作用方式，科学家将其改造成高通量CRISPR文库，它可以在全基因组水平进行编码基因或者非编码基因的功能性遗传筛选，是迄今为止最为强大的正向遗传性筛选工具。CRISPR基因敲除文库可以敲除几乎所有编码基因或者非编码基因，并对各种重要生物学过程中的关键基因进行高通量功能性筛选，为探索各种生命科学问题提供强大的工具。
发明内容
本发明的目的是提供GnT-II基因下调表达作为肝癌预后标志物中的应用。
本发明构思如下：基于CD155是重要的肿瘤免疫调控基因，本发明利用CRISPR基因敲除文库(Genome-scale CRISPR/Cas9 knockout,GeCKO，参见Ponting CP.Cell,2009；136:629-641)在全基因组水平高通量筛选能够正向调节CD155表达的关键基因，经高通量测序数据后，通过生物信息学分析发现GNT-II的sgRNA被显著富集，这提示GNT-II可能正向调控细胞内CD155的表达水平。由此推测GNT-II正向调节CD155表达，进而抑制T细胞功能，导致肝癌细胞的免疫逃逸，最终影响患者的预后。
已知GNT-II是乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosaminyltransferase，GnT)家族成员之一。GnT家族成员主要包括GnT-I，GnT-II，GnT-III，GnT-IV，GnT-V，GnT-VI等，其主要功能是对细胞内翻译后蛋白进行糖基化修饰，而修饰后的蛋白进一步在细胞识别和粘附、受体活化、信号传递等过程中发挥重要的生物学功能(Kizuka Y,TaniguchiN.Biomolecules,2016；6(2).)。当GnT表达异常时，会使得细胞膜上糖蛋白的寡糖链发生改变，即糖基异常化(aberrant glycosylation)，会进一步影响细胞的正常功能，是导致细胞恶性转化的分子基础。目前研究最热门是GnT-III和GnT-V，多项研究已经证实GnT-V在乳腺癌、结肠癌及肝癌等恶性组织中都过表达及B1,6分支结构的异常增多，在肿瘤细胞中GnT-III因启动子甲基化而表达下调，其对应的GnT-V上调会使得钙黏着蛋白和其它蛋白形成三、四天线糖链结构，这导致E-钙黏着蛋白内化到细胞质而破坏细胞与细胞间接触，损害细胞粘附和下游信号传导，并有助于肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)、侵袭、转移和肿瘤血管生成(Pinho SS,et al.Cell Mol Life Sci Actions,2011；68(6):1011-20)。
GNT-II在高尔基体中表达，参与蛋白质翻译后修饰，在蛋白质N-糖基化中起到重要作用。Tan等发现GNT-II的缺失会引起II型糖蛋白糖链缺失综合症(carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome,CDGS)(Tan J,et al.Am J Hum Genet,1996；59(4):810-817)。糖基转移酶具有受体专一性和作用的次序性。GNT-II只有在GNT-I作用后才能发挥作用，使糖链从杂合型变为复合型。随后，GnT-V和GnT-IV才能催化后续的反应(Antti H,Sakari K.J Biol Chem,2014；289(39):26937-48)。因此，GNT-II可直接影响GnT-V的活性。有研究表明GNT-II可促进小鼠乳腺癌细胞的迁移(葛宇清,顾玉超,于文功.中国生物工程杂志,2007；5:6-10)及神经母细胞瘤细胞的增殖和侵袭(Hall MK,et al.Biology(Basel),2020；9(4).)。Zhang等对GNT-II的启动子区域进行研究,发现GNT-II基因表达受Ets-1调节(Zhang W,et al.Biochem J,2000；347:511-518)。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供GnT-II基因下调表达作为肝癌预后标志物中的应用。TCGA肝癌RNA-seq数据库标准化后cutoff值的count数为1921，GnT-II基因表达低于1921，则肝癌患者的预后较好。
本发明采用的技术方案如下：
1、利用CRISRP人全基因组编码基因敲除文库(HCT116-GeCKO文库)筛选调节抑制性免疫检查点分子CD155表达的编码基因。首先，利用流式细胞术筛选出高表达CD155的肿瘤细胞系，然后使用人全基因组编码基因CRISRP敲除文库(Ponting CP.Cell,2009；136:629-641)对其进行感染，通过高通量测序和生物信息学分析技术筛选能够使肿瘤细胞中CD155表达下调的编码基因GNT-II。
2、验证GNT-II对CD155表达水平的调控。使用CRISRP/Cas9技术，在高表达CD155的肝癌细胞系中敲除GNT-II，利用流式细胞术分析敲除GNT-II对CD155表达量的影响。
3、确定肝癌组织中GNT-II的表达模式及其临床意义。首先，通过免疫组化技术，在原发性肝细胞癌的临床标本中，确定GNT-II在肝癌组织和癌旁组织中的表达水平；然后，利用PCR技术检测GNT-II的mRNA表达水平与肝癌组织中CD155表达水平表达的相关性，并进一步通过生存分析明确GNT-II对肝癌患者预后的影响。
4、确定肝癌细胞中GNT-II的表达水平与T细胞的表型的相关性。通过对公共肿瘤数据库TCGA数据库中的肝癌RNA-seq数据进行免疫浸润分析，确定GNT-II的表达水平与肝癌组织中T细胞的浸润频率的相关性。
第二方面，本发明提供GNT-II基因作为标志物在制备肝癌预后评价试剂中的应用。
第三方面，本发明提供GNT-II基因在下调肿瘤细胞中CD155表达中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明利用CRISRP人全基因组编码基因敲除文库筛选到调节抑制性免疫检查点分子CD155表达的编码基因GNT-II，并发现在肝癌患者的肿瘤组织中GNT-II的表达与CD155的表达呈正相关；进一步地，GNT-II的表达与肝癌患者的预后明显相关，即在早期男性肝癌患者中GNT-II的表达越高，患者的预后越差。因此GNT-II在肝癌中作为预后指标具有一定的潜在应用价值。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中HCT116-GeCKO文库细胞的构建、筛选及测序结果；其中，A：HCT116-GeCKO文库细胞的构建及筛选流程；B：流式细胞术分选低表达CD155的过表达文库筛选过程；C：下调CD155的HCT116-GeCKO的PCR扩增片段；D：HCT116-GeCKO-sgRNASanger测序验证。
图2为本发明较佳实施例中利用生物信息学分析下调CD155表达的候选关键基因；其中，A：HCT116-GeCKO文库筛选下调CD155的候选关键基因气泡图；B：候选关键基因GO聚类分析；C：候选关键基因KEGG信号通路分析。
图3为本发明较佳实施例中在肝癌细胞系和肝癌组织中GNT-II正向调节CD155的表达；其中，A：利用流式细胞术检测肝癌细胞系中CD155的表达；B：使用sgRNA敲除肿瘤细胞系中的GNT-II，利用流式细胞术检测肿瘤细胞系中CD155的表达；C：利用TCGA数据库中RNAseq数据，利用QuantiSeq算法推算免疫细胞的浸润频率(从TCIA数据库下载)，分析肝癌中GNT-II的表达水平与T细胞频率的关系；D：在肝癌组织中检测GNT-II和CD155 mRNA表达的相关性；E：通过免疫组化的方法检测GNT-II在肝癌组织和癌旁组织中的表达。
图4显示在TCGA数据库中GNT-II表达越高，肝癌患者的预后越差。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1利用CRISRP人全基因组编码基因敲除文库筛选调节抑制性免疫检查点分子CD155表达的编码基因GNT-II
尽管有关免疫检查点的抗体药物已经逐步在临床上开始应用，但对于这些免疫检查点的调控机制仍然研究较少。本发明基于CRISPR文库建立一套筛选调控免疫检查点的关键基因技术，通过该技术筛选到了CD155的关键调节基因GNT-II，为CD155单抗药物在临床的应用提供理论基础，确定GNT-II在肝癌中作为预后指标的潜在价值，这也为非直接单抗阻断TIGIT/CD155轴的方式开发抗肿瘤药物带来了更多选择。
具体方法如下：
首先在100％表达CD155的HCT116、MHCC-97H和SK-HEP1肿瘤细胞系中利用与CRISPR文库筛选中一致的GNT-II sgRNA敲除细胞中的GNT-II，并利用流式细胞术检测细胞中CD155的表达，研究发现在这三种细胞系中敲除GNT-II后，CD155的表达会降低，这也进一步证实CRISPR文库筛选的可靠性，提示在肝癌细胞中GNT-II可能正向调节CD155的表达。我们也在肝细胞癌病理组织切片上进行GNT-II免疫组化染色。
免疫组织化学染色采用EnVision两步法，具体步骤如下：
1、高温脱蜡：将切片放置60℃温箱1-1.5h；
2、切片脱蜡至水：依次经过二甲苯I、二甲苯Ⅱ，30min/每缸；无水乙醇、95％酒精、75％酒精、蒸馏水，3min/每缸；
3、清洗：0.1％Tween 20的PBS清洗3次，5min/每次；
4、高压修复：将切片浸泡在Tris/EDTA修复液(pH8.0)中，高压锅加压阀冒气开始计时，并将电磁炉由高火调至中火，2.5min计时结束，取出，放在室温慢慢降温；
5、清洗：0.1％Tween 20的PBS清洗3次，5min/每次；
6、封闭过氧化物酶活性：将切片浸泡在3％过氧化氢封闭液中，避光封闭30min；
7、吸去多余液体，滴加300μl 5％BSA(牛血清白蛋白)封闭液(新鲜配制)，37℃孵育30分钟；
8、抗体孵育：滴加一抗(anti-GNT-II 1:100，abcam，#238762)，4℃孵育过夜；
9、0.1％Tween 20的PBS清洗：洗3次，5min/每次；
10、滴加二抗，室温孵育60min；
11、0.1％Tween 20的PBS清清洗：洗3次，5min/每次；
12、DAB显色：滴加DAB稀释液(即用型)覆盖切片组织区域，显微镜下控制染色程度，用自来水冲洗终止染色；
13、复染：将切片浸泡在苏木素中0.5～2min，用自来水冲洗；1％盐酸酒精分化3S，自来水冲洗；氨水返蓝，当切片中的细胞核变蓝，自来水冲洗；
14、脱水、透明、封片：依次经过蒸馏水、75％酒精、95％酒精、无水乙醇，5min/每缸，二甲苯Ⅱ1min，中性树脂胶封片；
15、观察和扫片：光学显微镜下观察切片，使用高分辨显微镜扫描仪(200×或400×)扫描图像，进行结果判读。
每个组织在显微镜下随机观察5-10个高倍镜视野，对组织实质细胞和癌细胞胞膜和胞浆中GNT-II蛋白表达进行评分。染色强度评分：无黄色或棕色为阴性，0分；淡黄色为弱阳性，1分；黄或深黄色为中度阳性，2分；褐或棕褐色为强阳性，3分。阳性细胞比例评分：阳性细胞比例0％为0分；1％～10％为1分；11％～50％为2分；51％～80％为3分；＞80％为4分。染色评分：染色强度与阳性细胞比例评分两者相乘。RFX5表达水平评价标准：染色评分0～2分(﹣)，3～5分(+)，6～9分(++)，10～12分(+++)。
研究发现GNT-II在肝癌组织肿瘤细胞中的表达强度高于癌旁组织，且肝癌组织中浸润的炎症细胞GNT-II的表达低于肿瘤细胞。随后，我们进一步在32例肝癌患者的肝组织中利用实时荧光定量PCR的方法分别对GNT-II和CD155的mRNA表达进行定量，通过相关性分析发现在肝癌组织中GNT-II的表达水平与CD155的表达水平呈一定的正相关，这提示在肿瘤组织中GNT-II可能正向调节CD155表达的作用。我们通过对TCGA数据库分析发现，GNT-II的表达与肝癌患者的预后明显相关，即在早期男性肝癌患者中GNT-II的表达越高，患者的预后越差。
实时荧光定量PCR法如下：
用Trizol一步法提取HCC组织样本和肝癌细胞系总RNA，然后按照High CapacityRNA-to-cDNA Kit试剂说明书进行RNA逆转录：
按照表1配制10μl 2×mix，混匀；
表1配制逆转录PCR产物
Figure BDA0002780660590000061
加入1μg RNA，用水补足至20μl体积，混匀，离心；
PCR反应程序：25℃ 10min，37℃ 120min，85℃ 5min，4℃∞，PCR产物保存于-20℃。
进行实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,QRT-PCT)反应，按照PowerSYBR Green Master Mix试剂说明书进行基因表达定量。
将所有组织和细胞cDNA模板进行定量PCR预扩增，确定标准品。
按照表2配制10μl 2×mix，混匀，离心。定量PCR引物均为跨基因内含子设计(表3)。
表2配制PCR反应体系
Figure BDA0002780660590000062
Figure BDA0002780660590000071
PCR程序：将反应体系置于LightCycler 480system(Roche)进行扩增，95℃预变性10min后，进行45个循环(95℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸20s，并采集荧光信号)，扩增结束后控制温度从55℃缓慢上升到95℃，建立熔解曲线，最后40℃降温10s。
PCR产物经过2％琼脂糖凝胶电泳检测电泳检测，确定为特异性扩增目的条带。
取Cp值最低的样品cDNA进行5倍梯度稀释，设定依次相对浓度为：1、2×10-1、4×10-2、8×10-3、1.6×10-3、3.2×10-4。
将待测样品和标准品进行上述定量PCR反应，通过LightCycler 480软件内置的Abs Quant/2nd Derivative Max分析模式，根据标准品梯度稀释浓度拟合标准曲线，根据Cp值计算待测样品的相对表达量，目的基因相对表达量除以管家基因GAPDH相对表达量，即为目的基因的校正后相对表达量。
表3荧光定量PCR引物序列
Figure BDA0002780660590000072
通过对TCGA肝癌RNA-seq数据进行免疫浸润分析，发现GNT-II的表达水平与肝癌组织中T细胞的浸润频率呈显著负相关。结合CD155对T细胞抑制作用，这提示GNT-II可能通过正向调节CD155表达而抑制T细胞活性，从而影响肝癌患者的预后。因此，GNT-II在肝癌中作为预后指标具有一定的潜在应用价值。
综上，GNT-II正向调节CD155表达，进而抑制T细胞功能，导致肝癌细胞的免疫逃逸，最终影响患者的预后。
本发明中，HCT116-GeCKO文库细胞的构建、筛选方法如下(图1A)：
1、高表达CD155的人消化系统肿瘤细胞系的确定
为了确定高表达CD155的人消化系统肿瘤细胞系，以期进行后续的文库细胞的构建以及筛选等实验，我们通过流式细胞术分析的方法从HCT116、MHCC-97H、HepG2、Huh7、SK-HEP-1这5种人肿瘤细胞系中进行筛选。根据流式细胞术分析的结果显示，以细胞未染CD155抗体为对照组，染CD155抗体为实验组，通过流式细胞术分析每种人肿瘤细胞系CD155的阳性率，发现这5种细胞系基本100％表达CD155。我们选择HCT116细胞系进行后续实验。
2、HCT116细胞各类抗生素筛选条件的确定
设定6个不同浓度梯度的Blasticidin、Hygromycin，对HCT116细胞进行不同天数的处理，每天记录细胞的存活率，最终确定了这3种抗生素筛选HCT116细胞的最适浓度及作用时间。结果显示，15μg/mL Blasticidin(BSD)处理4d和300μg/mL Hygromycin处理3d，可使HCT116细胞的死亡率达到100％。
3、利用人全基因组编码基因的转录激活文库的CRISPR文库筛选抑制CD155表达的编码基因
1)从Addgene购买靶向人全基因组编码基因的敲除文库(Human GeCKOLentiviral sgRNA Library v2(LentiCRISPR)，#1000000048)，首先进行CRISPR质粒文库的电转扩增和质粒提取：然后使用文库主质粒、psPAX2和pVSVG辅助质粒共同转染293T细胞进行慢病毒包装，使用20ml注射器将10％蔗糖溶液，缓慢地注入离心瓶底部，体积比为4:1(病毒上清4份，蔗糖溶液1份)，4℃、14000rpm离心2h对病毒液进行纯化浓缩，使用化学发光法(CMIA)测定慢病毒滴度；
2)构建HCT116-espCas9稳定细胞系。利用纯化的espCas9病毒原液感染HCT116细胞系，感染细胞48h后，加入终浓度为300ug/ml Hygromycin进行抗生素筛选，连续抗性筛选6天左右(空白对照全部杀亡)。对于存活的HCT116-espCas9稳定表达细胞系进行扩增培养。
3)CRISPR文库慢病毒转导MOI测定及细胞文库建立。
测定MOI＝0.4所需的病毒量，首先，接种4×105HCT116-espCas9，培养至细胞30％融合，分别加入不同量的GeCKO慢病毒(A：0.1×105,B：0.2×105,C：0.5×105,D：1×05和E：2×105TU)，保留1个未感染孔作为对照，感染过夜后，消化感染孔和未感染对照孔细胞，将细胞均分为两份并分别接种至两个孔中，添加15μg/mL Blasticidin进行抗性筛选，一旦未感染对照孔的细胞被全部杀死，则分别计数每个孔的细胞数，并计算MOI值；用相应MOI的病毒量进行大规模细胞转导，用Blasticidin筛选7-14天，建立HCT116-GeCKO细胞文库。
4、流式细胞术分选富集HCT116-GeCKO文库细胞中低表达CD155的细胞。经过4次分选，富集CD155阴性表达的HCT116-GeCKO文库细胞，以减少背景细胞，提高真正下调CD155表达的目的细胞比例。
5、富集下调CD155表达的HCT116-GeCKO文库细胞的sgRNA PCR扩增、建库和高通量测序。
1)利用细胞基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,Cat:DP304)提取HCT116-GeCKO文库细胞基因组DNA；
2)PCR扩增sgRNA序列。
使用试剂为PlatinumTM SuperFiTM Green PCR Master Mix(Invitrogen，Cat.:12359050)。
GeCKO-sgRNA需经过两轮PCR扩增以获得足够的特定序列产量。
GeCKO-sgRNA引物：
Primer-F1：5’-GACTATCATATGCTTACCGTAAC-3’；
Primer-R1：5’-AAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’；
GAPDH引物：
Primer-F：5’-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’；
Primer-R：5’-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3’
a.按照表4配制第1轮PCR反应体系：
表4 GECKO-sgRNA第1轮PCR反应体系
Figure BDA0002780660590000091
b.设置第1轮PCR反应条件(表5)：
表5 GECKO-sgRNA第1轮PCR反应条件
Figure BDA0002780660590000092
c.按照表6配制第2轮PCR反应体系：
表6 GECKO-sgRNA第2轮PCR反应体系
Figure BDA0002780660590000093
Figure BDA0002780660590000101
d.设置第2轮PCR反应条件(表7)：
表7 GECKO-sgRNA第2轮PCR反应条件
Figure BDA0002780660590000102
e.将两轮PCR产物进行电泳：1.5％琼脂糖凝胶，每孔上5μL PCR产物，每块胶加5μL100bp Marker，150V，30min；
f.凝胶成像系统中显影并保存结果。
3)GECKO-sgRNA一代测序
一代测序委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行。
分别取10uL PCR产物及相应的引物送一代测序(Sanger测序)，初步验证HCT116-GeCKO文库细胞的构建及筛选过程中是否成功转导了sgRNA，并通过一代测序结果中出现的套峰情况初步判断sgRNA的多样性。
4)GeCKO-sgRNA高通量测序分析
高通量测序分析工作由苏州金唯智生物科技有限公司完成，主要包括：
①样品的核酸质量检测和样品纯化；
②合格样品进行文库构建及质控；按照实验说明书对基因组DNA进行片段化，末端修复、3’末端加A、连接接头、富集等步骤，完成测序样本文库构建；所建文库使用
Figure BDA0002780660590000103
2.0Fluorometer检测浓度，Agilent2100检测文库的大小，根据质检结果，确认样品可以上机测序；
③使用HiSeq 2×150bp平台进行测序，测序长度为2×150bp，每个测序文库提供1.0Gb的数据量；
④对高通量测序所得的数据进行初步处理分析，提供Raw data。测序得到RawReads进行过滤处理后，得到可用于数据分析的clean Reads。去除平均质量Q<20的reads(碱基错误率大于0.01)、去除reads中所含有的接头序列、去除reads中含有的模糊的N碱基，是由于测序强度不够,机器无法识别的碱基、去除长度小于50的测序片段(reads)；
5)生物信息学分析确定候选的关键基因
①以p<0.05和log2 Fold Change>1为标准，确定下调CD155表达的HCT116-GeCKO文库细胞和DMSO处理的对照组文库细胞之间显著差异的sgRNA；
②根据富集的sgRNA数进行排序，排在末位为1，倒数第二位为2，依次类推，然后将序号数最大的sgRNA的得分Sscore.x记为1分，序号数为1的sgRNA的得分Sscore.x的得分记为0分，再结合每个基因所富集到的sgRNA的Sscore.x进行累计积分，得出每个富集的基因的Sscore.y得分；
③用DESeq2软件根据富集的sgRNA种类数及Sscore.y得分对HCT116-GECKO文库中所富集的候选基因进行统计图的绘制；
④利用DAVID数据集对富集的显著候选关键基因进行GO分析，并采用Fisher精确检验法和Benjamin-Hochberg多重假设检验进行校正；
⑤利用Kolmogorov-Smirnov检验进行候选关键基因的基因集富集分析，在整个已排序基因列表中确定KEGG信号通路的富集情况。
测序结果见图1。从图中可以看出，利用流式细胞术分选CD155表达阴性的细胞群体，在第四次分选时，HCT116-GeCKO文库细胞中低表达CD155的细胞比例已提高到88.8％(图1B)，说明含有下调CD155关键基因的细胞被明显富集，随后，通过PCR对其进行验证，发现扩增的片段与GeCKO-sgRNA的序列长度一致，而对照组未扩出条带(图1C)。将PCR产物进行Sanger测序，发现在sgRNA相应的序列位置上出现套峰(图1D)，说明下调CD155的HCT116-GeCKO文库细胞中成功转导了sgRNA，提示测序的sgRNA序列具有多样性。此外，下调CD155的sgRNA的套峰中，每个位点4种碱基的分布趋于平缓，说明下调CD155的sgRNA种类较多。
生物信息学分析下调CD155表达的候选关键基因情况见图2。从图中可以看出，用R包DESeq2分析原始数据得到差异基因，通过对ggplot2绘制的气泡图、GO聚类通路、KEGG信号通路分析发现筛选基因主要富集在代谢相关通路上。其中GNT-II和PVR(CD155)经排序分别位于筛选基因的第一位和第二位。
在肝癌细胞系和肝癌组织中GNT-II正向调节CD155的表达情况见图3。从图中可以看出，为了进一步确定GNT-II是否也调控肝癌细胞中CD155的表达，我们首先通过流式细胞术在多个肝癌细胞系进行检测，研究发现MHCC-97H、SK-HEP-1、Huh7、HepG2等肝癌细胞系的细胞膜表明100％表达CD155(图3A)。随后，在HCT116、MHCC-97H和SK-HEP1等肿瘤细胞中，利用与CRISPR文库筛选中一致的GNT-II sgRNA敲除细胞中的GNT-II，并利用流式细胞术检测细胞中CD155的表达，研究发现在这三种细胞系中敲除GNT-II后，CD155的表达会降低(图3B)，这也进一步证实CRISPR文库筛选的可靠性，提示在肝癌细胞中GNT-II可能正向调节CD155的表达。我们也在肝细胞癌病理组织切片上进行GNT-II免疫组化染色，研究发现GNT-II在肝癌组织肿瘤细胞中的表达强度高于癌旁组织，且肝癌组织中浸润的炎症细胞GNT-II的表达低于肿瘤细胞(图3E)。随后，我们进一步在32例肝癌组织中利用实时荧光定量PCR的方法分别对GNT-II和CD155的mRNA表达进行定量，通过相关性分析发现在肝癌组织中GNT-II的表达水平与CD155的表达水平呈一定的正相关(图3D)，这提示在肿瘤组织中GNT-II可能正向调节CD155表达的作用。
在TCGA数据库中GNT-II在早期男性肝癌患者中表达越高，肝癌患者的预后越差。我们在TCGA数据库官网上下载肝癌队列FPKM标准化数据RNA-seq数据集，然后分亚组分析GNT-II在早期男性肝癌患者中对生存预后有显著影响。
GNT-II在早期男性肝癌患者中对生存预后的影响见图4。从图中可以看出在TCGA数据库中GNT-II在早期男性肝癌患者中表达越高，肝癌患者的预后越差。
TCGA肝癌RNA-seq数据库标准化后cutoff值的count数为1921，GnT-II基因表达低于1921，则肝癌患者的预后较好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.GnT-II基因下调表达作为肝癌预后标志物中的应用。
2.GnT-II基因作为标志物在制备肝癌预后评价试剂中的应用。
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