WO2007132883A1 - 肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法及びキット - Google Patents

肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法及びキット Download PDF

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WO2007132883A1
WO2007132883A1 PCT/JP2007/060018 JP2007060018W WO2007132883A1 WO 2007132883 A1 WO2007132883 A1 WO 2007132883A1 JP 2007060018 W JP2007060018 W JP 2007060018W WO 2007132883 A1 WO2007132883 A1 WO 2007132883A1
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liver cancer
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Hideki Taniguchi
Tetsuhiro Chiba
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Yokohama City University
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for predicting liver cancer, determining a disease stage, or predicting prognosis.
  • Non-patent Document 1 cancer has been considered to be a single cell because of its origin (Non-patent Document 2,). 3). Due to the small mouth-one formation at the soft agar medium and the spleen mouth-one formation, the cells that have the ability to form the mouth are small groups, and most cancer cells do not have the ability to form colonies. (Non-Patent Documents 4 and 5). In vivo transplantation, cancer occurred even when a small subset of cancer cells were injected (Non-patent Documents 6 and 7). These results indicate that only a small population of cells have the ability to elicit tumors, and the majority of cells lack the activity of eliciting tumors.
  • Non-Patent Documents 8 and 9 A probabilistic model is composed of a relatively homogeneous population of cancers and a few cells that acquire the potential for extreme growth and form new tumors by experiencing stochastic events. It is shown that.
  • Another hypothesis ie, the hierarchical model
  • a subpopulation of cancer stem cells forms a hierarchical structure that includes a variety of differentiated progeny cells, and induces new tumors at a high frequency by extreme growth. To do.
  • Non-Patent Document 10 A small subset of cells capable of inducing human acute myeloid leukemia in non-obese diabetic / severe combined immunodeficiency (NOD / SCID) mice was also identified as a leukemia patient. These cells were isolated as CD34 + CD38- cells and were able to induce leukemia in continuous transplantation. Furthermore, it has been reported that there is a common mechanism for regulating self-renewal of both hematopoietic stem cells and leukemia stem cells (Non-patent Document 11).
  • cancer stem cells CD44 + CD24- / low ESA (epithelial specific antigen) + breast cancer cells, and CD133 + cells of medulloblastoma or glioblastoma were identified as expected "cancer stem cells" (non-patent literature) 12, 13).
  • cancer stem cells CD44 + CD24- / low ESA (epithelial specific antigen) + breast cancer cells
  • CD133 + cells of medulloblastoma or glioblastoma were identified as expected "cancer stem cells” (non-patent literature) 12, 13).
  • cancer stem cells a small subset of cells purified as cancer stem cells showed tumorigenic potential, but the majority of tumor cells were not able to show such potential in in vivo transplantation.
  • These observational powers obtained from culture and in vivo transplantation may also be the power to propose a hierarchical model (Non-patent Document 14).
  • HCC Liver cancer cells
  • Non-Patent Document 15 Liver cancer cells
  • Non-patent Documents 16-18 the overall mechanism underlying liver cancer formation has clearly not been demonstrated.
  • the cellular origin of HCC remains unclear. Identifying what is expected to be cancer stem cells and elucidating the hierarchy in HCC cells may help to understand hepatocarcinogenesis and explore new therapies.
  • SP cell sorting is first applied to the identification of hematopoietic stem cells, and is used to concentrate stem cell compartments in a wide variety of tissues and organs (Non-patent Documents 19-21). SP cells are detected by their ability to efflux Hoechst 3334 2 dye through the ATP binding cassette (ABC) membrane transporter. Recently, SP cells have also been used in attempts to isolate a stem cell-like fraction of cancer cells (Non-patent Document 22). This method seems reasonable and valuable. This is because it has been shown that various cancers including HCC highly express ABC transporters and contribute closely to multidrug resistance (Non-patent Document 23).
  • Non-Patent Document 1 Heppner GH. Tumor heterogeneity. Cancer Res 1984; 44: 2259-2265.
  • Non-Patent Document 2 Fialkow PJ, G artier SM, Yoshida A. Clonal origin of chronic myelocyti c leukemia in man. Proc Natl Acad Sci USA 1967; 58: 1468-1471.
  • Non-Patent Document 3 Grunstein M. Acute myeloolastic leukemia considered as a clonal hem opathy.Blood cells 1979; 15: 261-282.
  • Non-patent document 4 Hamburger AW, Salmon SE.Primary bioassay of human tumor stem c ells.Cell Science 1977; 197: 461-463.
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  • Non-Special Publication 7 Lapidot T, Sirard C, Vormoor J, Murdoch B, Hoang T, Caceres- Cortes es J, Minden M, et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transpla ntation into SCID mice. Nature 1994; 367: 645-648.
  • Non-Patent Document 8 Warner JK, Wang JC, Hope KJ, Jin L, Dick JE.Concepts of human le ukemic development.Oncogene 2004; 23: 7lb4-7177.
  • Non-Special Terms 9 Wang JC, Dick JE. Cancer stem cells: lessons from leukemia.Trends Cell Biol 2005; 15: 494-501.
  • Non-Special Terms 10 Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med 1997; 3: 730-737.
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  • Non-Patent Document 12 A ⁇ Hajj M, Wicha MS, Benito- Hernandez A, Morrison SJ, Clarke M F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100: 3983-3988.
  • Non-Patent Document 13 Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, Squire JA, Bayani J, Hide T, Henk elman RM, et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 2004; 4 32: 396-401.
  • Non-Special Terms 14 Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, Weissman IL.Stem cells, cancer, and cancer stem cells.Nature 2001; 414: 105-111.
  • Non-Patent Literature 15 Okuda K. Hepatocellular carcinoma: recent progress.Hepatology 19 92; 15: 948-963.
  • Non-Patent Document 16 Vogelstein B, Kinzler KW. Nat Med 2004; 10: 789-799.
  • Non-Special Publication 17 Lund AH, van Lohuizen M. Epigenetics and cancer. Genes Dev 200
  • Non-Special Publication 18 Satyanarayana A, Manns MP, Rudolph KL. Telomeres and telomeras e: a dual role in hepatocarcinogenesis. Hepatology 2004; 40: 276-283.
  • Non-Patent Document 19 Goodell MA, Brose K, Paradis G, Conner AS, Mulligan RC. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med 1996; 183: 1797-1806.
  • Non-Special Reference 20 Shimano K, Satake M, Okaya A, Kitanaka J, Kitanaka N, Takemura M, Sakagami M, et al. Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP— binding cassette transporter ABCG2 / BCRP1 Am J Pathol 2 003; 163: 3-9.
  • Non-Special Publication 21 Falciatori I, Borsellino G, Haliassos N, Boitani C, Corallini S, Battis tini L, Bernardi G, et al. Identification and enrichment of spermatogonial stem cells displaying side-population phenotype in immature mouse testis. 2004; 18: 3 76-378.
  • Non-Special Publication 22 Kondo T, Setoguchi T, Taga T. Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line.Proc Natl Acad Sci U S 2004; 101: 781-786.
  • the present invention clarified whether SP cells purified from hepatoma cells have cancer stem cell-like properties, investigated the difference in gene expression profiles between SP cells and non-SP cells, and utilized the information. Thus, it is intended to enable identification of liver cancer, determination of disease stage, or prediction of prognosis.
  • genes that are up-regulated and down-regulated in SP cells are identified as liver cancer differentiation, disease stage determination, or prognosis. It can be used as a marker for prediction.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a method for differentiation of liver cancer, determination of disease stage, or prediction of prognosis comprising measuring expression of a specific gene in blood, liver cancer cells or liver cancer tissue, wherein the specific gene is The aforementioned method, wherein the expression is different between the SP fraction and the non-SP fraction of liver cancer cells.
  • the specific gene is at least one of the genes listed in any of Tables A, B, C or D.
  • liver cancer is highly malignant, disease is progressing, and the prognosis of the patient is The method described in (2), which predicts that the risk of recurrence is high or the risk of recurrence is high.
  • Specific genes are CHM, MSH6, NCOA7, CYP2E1, TM4SF1, F2RL1, TRPM3, AKR1C1, FOXHl, RAB40C, MGC27085, PPP1R3E, UST ⁇ CANP, PRSS3, UACA, FOSL2, RTPC1, 388, TN FAM20A FGF FGF18, HOXA13, FO LR1, TMF1, PCGF5, GSTA1, XRCC5, MAP3K7IP2, RTN4, BCD02, CDH22, MY CNOS, FMNL2, PHEX, WDR56, HERC6, SBN01, FDFT1, ZFR and PF6 force TH, PCTH ZCCHC6, HRMT1L1, INHBC, ATP8B3, TALI, FGF1, ADCY9, CAPS2, ANXA2, FLJ34077, AD7C— NTP ⁇ GLRB, MGAT2, SASH1, HIF1A, LMT K3, EYA3, IPP, CA
  • a method for detecting liver cancer stem cells comprising measuring the expression of a specific gene in any one of blood, liver cancer cells, or liver cancer tissue, wherein the specific gene is an SP fraction of liver cancer cells. The method as described above, wherein the expression is different between the non-SP fraction.
  • a method for distinguishing between hepatoma stem cells and hepatoma non-stem cells comprising measuring the expression of a specific gene in either blood, liver cancer cells or liver cancer tissues, wherein the specific gene is a hepatoma cell The above method, wherein the expression is different between the SP fraction and the Non-SP fraction.
  • a diagnostic marker for differentiation of liver cancer, determination of disease stage, or prediction of prognosis is provided.
  • a method for identifying liver cancer, determining a disease stage, or predicting prognosis and kite are also provided.
  • the present invention also provides a method for detecting liver cancer stem cells, a method for distinguishing liver cancer stem cells from liver cancer non-stem cells, a liver cancer stem cell, and a method for preparing the same.
  • FIG. 2 Cell viability (A, B) and apoptosis sensitivity (C, D) at 24, 48 and 72 hours after separation in Huh7 and PLC / PRF / 5 cells.
  • SP cells purified from Huh7 and PLC / PRF / 5 cells showed higher viability than the corresponding Non-SP cells.
  • the number of TUNEL positive cells in SP cells was consistently higher than the number of TUNEL positive cells in Non-SP cells in both cells. * Indicates statistical significance.
  • FIG. 3 Immunohistochemical analysis in Huh7 and PLC / PRF / 5 SP cells.
  • AD AFP and CK 19 expression was examined in Huh7 SP cells (A), Huh7 Non-SP cells (B), PLC / PRF / 5 SP cells (C) and PLC / PRF / 5 Non-SP cells (D) It was.
  • E, F Cells positive for either AFP or CK19 were preferentially found in Non-SP cells, but many cells positive for both AFP and CK19 were identified as Huh7 SP cells ( E) and observed in PLC / PRF / 5 SP cells (F).
  • FIG. 4 Tumorigenicity in SP cells.
  • FIG. 6 Gene expression profile based on microarray.
  • A Of the genes up-regulated (ratio> 2.0) in Huh7 and PLC / PRF / 5 SP cells, 440 and 789 genes were characterized, respectively. Those genes were categorized into 11 groups.
  • B Overlapping stem cell genes in gene expression profiles in HCC SP cells with stem cell enriched genes reported by Ramalho-Santos et al.
  • ESC embryonic stem cell
  • NSC neural stem cell
  • HSC hematopoietic stem cell.
  • the present invention provides a method for differentiation of liver cancer, determination of disease stage, or prediction of prognosis, which comprises measuring the expression of a specific gene in any of blood, liver cancer cells or liver cancer tissue.
  • Specific genes are expressed differently in the SP and non-SP fractions of liver cancer cells. Examples of “different expression” include different gene expression and different expression levels. It is preferable that the specific gene is at least one gene listed in any of Tables A, B, C, or D, and it may be one or more.
  • Table A summarizes genes up-regulated in Huh7 SP cells (confirmed in Examples described later).
  • Table B summarizes genes down-regulated in Huh7 SP cells (confirmed in the examples below).
  • Table C summarizes genes (confirmed in the examples described below) upregulated in Alexander cells (same cell lines as PLC / PRF / 5 SP cells).
  • Table D shows the genes down-regulated in Alexander cells (same cell lines as PLC / PRF / 5 SP cells). (Confirmed in the examples).
  • expression level in the first column gene name in the second column (abbreviation: NCB I symbol name), GeneBank registration number in the third column, gene name in the fourth to seventh columns, and eighth column Is the crawling method and the 9th column is the Unigene registration number.
  • PAK5 solute carrier fami ly 7 (cat ionic anlno)
  • al cohol lcohol dehydrogenase IB class I
  • dehydros Hs.4 polypeptide class 1
  • beta polypeptide suscepti i class 1
  • Hs.792 1.G kDa protein 1 isoforn beta;
  • interleukln A natural ki l ler cel l
  • HDLBP BF303940 EST Hs.427152 protein (violin) ye85f09.s1 Soares fetal liver spleen
  • IMAGE124553 3 ' mRNA sequence.
  • myosin VA (heavy polypeptide 12
  • myosin VA (heavy polypeptide 12
  • solute carrier family 1 (glutamate
  • BC038533 Clone IMAGE5165367, mRNA Hs.224502
  • HIST1H3H sapiens histone 1, H3b (HIST1H3B),
  • HSPB7 protein family member 7 Hs.56874 4 member 7 (cardiovascular) (cardiovascular)
  • FLJ20701 hypothetical protein FLJ20701 Hs.424598 3 FLJ20701
  • EPN2 H05668 epsin 2 EST Hs.7407 papilin, proteo (rfycan-like sulfated
  • PAPLN AU145309 EST Hs.458428 glycoprotein chromosome 20 open reading frame
  • GRSP1 AK00024 GRPI-binding protein GRSP1 fis full insert Hs.158867 sequence
  • AI632259 contains Alu repetitive EST
  • XOSC6, LOC388558, RTTN, FAM20A, FGF18, HOXA13 FOLRl, TMF1, PCGF Replacement paper (Rule 26) 5, GSTA1, XRCC5, MAP3K7IP2, RTN4, BCD02, CDH22, MYCNOS, FMNL2, PH EX, WDR56, HERC6, SBN01, FDFT1, ZFR and PF6 are Huh7 SP cells and Alexander cells (PLC / PRF / 5 SP cells and It is a gene that was up-regulated in both of the same cell lines (confirmed in the examples described later).
  • XRCC5 is a stem cell gene that is up-regulated in both Huh7 SP cells and Alexander cells (the same cell line as PLC / PRF / 5 SP cells) (confirmed in the examples below).
  • liver cancer can be identified, disease stage can be determined, or prognosis can be predicted as follows.
  • liver cancer is highly malignant, the disease is progressing, and the patient has a poor prognosis Predict that the risk of recurrence is high.
  • the liver cancer is highly malignant, the disease is progressing, or the patient has a poor prognosis, or Predicts that the risk of recurrence is high.
  • normal hepatocytes or liver tissue may be compared as a control.
  • expression of certain genes may be compared between liver cancer with poor prognosis (recurrence / invasion 'with metastasis) and liver cancer with good prognosis (recurrence, invasion' without metastasis).
  • the control is liver cancer with a good prognosis.
  • the expression of a specific gene in any one of blood, liver cancer cells or liver cancer tissue may be measured at the protein level or at the RNA level.
  • it can be measured by Northern plot method, PCR method, Western plot method, immunohistochemical analysis method and the like.
  • the measurement may be performed using a cDNA microarray, ELISA method or the like.
  • an antibody that specifically recognizes the protein to be measured may be used.
  • the antibody may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. These antibodies can be produced by known methods, and some are commercially available.
  • the antibody, 125 1-labeled protein A is detected secondarily by using a Peruokishidaze binding IgG.
  • the antibody may be labeled with a fluorescent dye, ferritin, enzyme or the like.
  • a nucleic acid probe that can specifically hybridize with the mRNA of the gene to be measured should be used! / ⁇ (when measured by the Northern blot method) ).
  • a nucleic acid primer that can specifically hybridize with the mRNA of the gene to be measured and a pair of nucleic acid primers that can also specifically hybridize with cDNA synthesized using the mRNA as a saddle type can be used. Good (when measuring by PCR).
  • the nucleic acid probe and the nucleic acid primer can be designed based on the sequence information of the gene to be measured.
  • the nucleic acid probe is usually about 15 to 1500 bases.
  • the nucleic acid probe may be labeled with a radioactive element, a fluorescent dye, an enzyme, or the like.
  • Nucleic acid primers are usually about 15-30 bases It is.
  • the presence or absence of specific gene expression in blood, liver cancer cells or liver cancer tissue may be detected, or the expression level may be measured.
  • the presence or absence of gene expression can be confirmed by the presence or absence of the appearance of spots and bands at predetermined positions.
  • the gene expression level can be measured by the staining intensity of spots and bands.
  • the protein that is a gene expression product and the mRNA that is a gene transcription product or mRNA may be quantified by a known method.
  • DNA array probe fixed to substrate
  • protein chip antibody
  • a detection method such as (NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, SEPTEMBER 2002, 683-695), Noremi Nex (NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, JUNE 2002, 447-4 56).
  • a detection method such as (NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, SEPTEMBER 2002, 683-695), Noremi Nex (NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, JUNE 2002, 447-4 56).
  • Blood, liver cancer cells, or liver cancer tissue is derived from the subject to be determined, and the biological species of the subject include humans, pigs, monkeys, chimpanzees, Inu, Usi, Usagi And mammals such as rats and mice.
  • liver cancer biopsy sample or cultured liver cancer cells, cultured liver cancer tissue, blood and the like obtained therefrom can be used.
  • An example of a liver cancer biopsy sample is a tumor thread and tissue removed by surgery.
  • the present invention also provides a kit for differentiation of liver cancer, determination of disease stage, or prediction of prognosis.
  • the kit of the present invention contains a reagent capable of measuring the expression of genes whose expression is different between the SP fraction and non-SP fraction of liver cancer cells.
  • the kit of the present invention uses an antibody capable of specifically recognizing a protein that is an expression product of a gene whose expression is different between the SP fraction and the non-SP fraction of hepatoma cells as a reagent.
  • the gene whose expression is different between the SP and non-SP fractions of hepatoma cells is preferably at least one of the genes listed in Table A, B, C or D 1 Species or multiple species may be used.
  • the kit further includes a device for collecting blood, liver cancer cells or tissues, and a protein that is an expression product of a gene whose expression is different between the SP and non-SP fractions of liver cancer cells.
  • a set of reagents for detection, instruction manuals, etc. may be included.
  • the instruction manual should include liver cancer discrimination, disease stage determination, or prognostic prediction criteria.
  • the kit of the present invention is a reagent for a nucleic acid probe that can specifically and hybridize with mRNA, which is a transcription product of a gene whose expression is different between the SP fraction and non-SP fraction of liver cancer cells.
  • mRNA a transcription product of a gene whose expression is different between the SP fraction and non-SP fraction of liver cancer cells.
  • the gene whose expression is different between the SP and non-SP fractions of hepatoma cells is preferably at least one of the genes listed in Table A, B, C or D 1 Species or multiple species may be used.
  • the kit further includes a device for collecting blood, liver cancer cells or tissues, reagents for extracting RNA such as collected blood, liver cancer cells or tissue force, and RNA analysis by Northern plotting. Reagents, instruction manuals, etc. may be included. In addition to how to use the kit, the instruction manual should include liver cancer discrimination, disease stage determination, or prognostic prediction criteria.
  • the kit of the present invention is a nucleic acid primer that can specifically hybridize with mRNA, which is a transcription product of genes whose expression differs between the SP fraction and non-SP fraction of hepatoma cells.
  • the gene whose expression is different between the SP and non-SP fractions of hepatoma cells is preferably at least one of the genes listed in Table A, B, C or D. One kind or plural kinds may be used.
  • the kit further includes a device for collecting blood, hepatoma cells or tissues, reagents for extracting RNA such as collected blood, hepatoma cells or tissues, and RNA for analysis by RT-PCR.
  • Reagents, instruction manuals, etc. should be included.
  • the instruction manual should include liver cancer differentiation, disease stage determination, or prognostic prediction criteria.
  • the present invention provides a method for detecting liver cancer stem cells, comprising measuring the expression of a specific gene in any of blood, liver cancer cells, or liver cancer tissues. Specific genes are expressed differently in the SP and non-SP fractions of liver cancer cells. The expression difference between the SP fraction and the non-SP fraction of hepatoma cells is as described above.
  • the present invention provides a method for discriminating liver cancer stem cells from liver cancer non-stem cells, comprising measuring the expression of a specific gene in any of blood, liver cancer cells, or liver cancer tissues. Specific genes are expressed differently in the SP and non-SP fractions of liver cancer cells. The difference in expression between the SP and non-SP fractions of liver cancer cells is as described above.
  • the present invention provides hepatoma cells that retain tumorigenicity when secondary transplantation is performed. This cell is considered a liver cancer stem cell.
  • This cell can be prepared by separating a cell population having a weak fluorescence signal by a side population cell separation method. Specifically, hepatoma stem cells can be prepared as described in Examples below.
  • Hoechst 33342 after incubating liver cancer-derived cells with Hoechst 33342, single suspension cells are obtained by techniques such as filtration. Hoechst 33342 remaining in the cells is excited with a UV laser at 350 nm, and fluorescence emission is measured with a 405 / BP30 (Hoechst blue) and 570 / BP20 (Hoechst red) light filter. Hoechst 33342 is a DNA-binding dye with high membrane permeability and emits short-wavelength blue and long-wavelength red fluorescence by UV excitation. By contrast, hepatoma stem cells are detected as a subpopulation of cells with weak fluorescent signals. This subpopulation can be sorted by sorting using a flow cytometer.
  • This subpopulation of cells is transplanted into an immunodeficient animal, and the formed tumor is collected and minced, and then the cells that have been separated by digestion with collagenase are cultured.
  • a cultured cell is collected, and a cell population having a weak fluorescent signal is separated again by the side population cell separation method and transplanted to an immunodeficient animal, a tumor can be formed. If a drug targeting such cells can be developed, it can be effectively used as a novel anticancer agent.
  • the present invention also provides a method of screening for an anticancer agent using hepatoma cells retaining tumorigenicity when secondary transplantation is performed.
  • the liver cancer stem cells of the present invention are cultured in the presence or absence of the test substance, and the growth rate or survival rate of the cells cultured in the presence of the test substance and the cells cultured in the absence of the test substance Should be compared. If the growth rate or survival rate of cells cultured in the presence of the test substance decreases compared to cells cultured in the absence of the test substance, the substance is considered to be effective as an anticancer agent.
  • the culture of hepatoma stem cells may be performed under any conditions suitable for screening.
  • the cell viability and proliferation rate can be examined by measuring the number of viable cells by a method such as the MTT method (Carmichael et al., Cancer Res. 47: 936-942, 1987).
  • the anticancer activity of the test substance may be examined using an immunodeficient animal that has formed a tumor by transplanting the liver cancer stem cells of the present invention.
  • the anticancer activity is, for example, a test subject Evaluation can be made by comparing tumor weight, animal survival rate, number of days of survival, etc., between animals that received quality and controls (animals that did not receive the test substance). If a decrease in tumor weight, an increase in the survival rate of animals, or an increase in the number of days of survival are observed in animals administered a test substance compared to controls, the substance is considered to be effective as an anticancer drug. .
  • the test substance may be either a natural product or a synthetic product. Specifically, extracts derived from plants and microorganisms and purified products thereof, low-molecular synthetic compounds, antibodies, peptides, adams, siRNA, genes Examples include nucleic acids used for treatment, modified products and derivatives thereof.
  • Human cell carcinoma cell lines HepG2, Huh6, Huh7 and PLC / PRF / 5 were obtained from Human Science Research Resource Bank (HSRRB, Osaka, Japan). These cells are cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DM EM) (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.) Containing 10% FCS and 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen) and cultured at 37 ° C with 5% CO.
  • DM EM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • TUNEL positive cells were calculated by randomly measuring 1 X 10 3 cells. MTS and TUNEL assays were performed 24, 48 and 72 hours after cell sorting.
  • the immunocytochemical assay sorting SP cells and non-SP cells were cultured for 12 hours and washed in PBS.
  • the cells were fixed with methanol at ⁇ 20 ° C. for 20 minutes and washed with PBS containing 0.1% Tween 20 (Wako).
  • primary antibody is rabbit anti- ⁇ -1-fetoprotein (AFP) (DakoCytomation) and mouse anti-cytokeratin 19 (CK19) (WakoCytomation) at 4 ° in a humidity chamber.
  • AFP rabbit anti- ⁇ -1-fetoprotein
  • CK19 mouse anti-cytokeratin 19
  • Non-obese diabetes / severe combined immunodeficiency xenograft NOD / SCID mice were purchased from Sankyo Laboratory Co. Ltd. (Tsukuba, Japan). 100-lxlO Six different numbers of SP and Non-SP cells are suspended in 200 ⁇ l DMEM and Matrigel (BD) (1: 1) and male under anesthesia using the force of ketamine and xylazine. They were transplanted into NOD / SCID mice (6-10 weeks old). SP cells and non-SP cells were injected into the subcutaneous space of the right and left backs, respectively. Observe and touch tumor formation weekly Monitored for 16 weeks by examination. Subcutaneous tumors were fixed in formalin and embedded in norafine.
  • Sections were stained with hematoxylin-eosin for histological analysis.
  • SP-derived tumors were removed and minced in sterile PBS on ice.
  • a small section of the obtained tumor was placed in DMEM containing 5 mg / ml type IV collagenase (Sigma) and digested at 37 ° C. for 3 hours.
  • the cells were cultured for 7 days to remove non-epithelial cells such as hematopoietic cells and fibroblasts.
  • Harvested cells were analyzed by flow cytometry and injected again into NOD / SCI D mice as described above.
  • RNA extraction and oligonucleotide microarray analysis Using Isogen reagent (Nippon Gene, Toyama, Japan), total RNA was extracted separately from SP cells and non-SP cells according to the manufacturer's instructions. RNA quality and concentration were measured with NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilming ton, DE) and Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, Calif.). Microarray analysis was performed according to a standard protocol (Aifymetrix GeneChip Manual). In brief, oligo (dT) -T7 primer and Superscript kit (Invitrogen)
  • the first and second cDNAs were generated from 1 ⁇ g of total RNA. Thereafter, a piotin-labeled cRNA was synthesized using Bioarray, High Yield RNA Transcript Labeling Kit (Enzo Diagonostics, Farmingdale, NY). After purification and fragmentation, 15 g of cRNA was hybridized to Human Genome U133A Plus 2.0 Arrays (Afiymetrix, Santa Clara, Calif.). This array presents over 47,000 gene transcripts containing 38,500 characterized genes. After amplification and detection of the hybridized signal through streptavidin-conjugated phycoerythrin fluorescence, the array image was scanned using GeneChip Scanner 3000 (Aifymetrix).
  • test ID is Hs0023 6976— ml, Hs00298949_ml, Hs00255026_ml, respectively , Hs00245009_ml, Hs00268739_ml, HsO 0169455- ml, Hs00191727_ml, Hs00222634_ml, Hs00232683_ml, Hs00210562_ml, Hs00275833_sl, Hs00184500- ml, Hs00217448_ml, Hs00157694_ml, Hs00227694_ml, Hs00227694_ml . Thermal cycling was performed using three samples of 45 cycles at 95
  • Huh7 and PLC / PRF / 5 cells contain a large number of cells marked with both the hepatocyte-specific marker afetoprotein (AFP) and the bile duct cell-specific marker cytokeratin 19 (CK19). And! In Huh7 and PLC / PRF / 5 cells, the percentage of cells positive for both AFP and CK19 was 68.2% and 55.0%, respectively. On the other hand, the majority of Non-SP Huh7 and PLC / PRF / 5 cells were labeled with either AFP or CK19.
  • AFP hepatocyte-specific marker afetoprotein
  • CK19 bile duct cell-specific marker cytokeratin 19
  • Huh7 and PLC / PRF / 5 Various numbers of SP cells and non-SP cells in the cells were injected into NOD / SCID mice (FIG. 4a). Subcutaneous tumor formation required injection of at least lxlO 6 unsorted Huh7 and PLC / P RF / 5 cells. In Huh7 and PLC / PRF / 5 SP cells, tumors were induced in 8 out of 9 mice and 8 out of 8 mice, respectively, with a small injection of about 1 xlO 3 cells (Table 1).
  • SP and Non-SP cells were separated separately from the digested SP-derived tumors and injected into NOD / SCID mice. Transplantation and tumor formation were observed as in the first transplantation.
  • stem cell genes are commonly expressed in stem cells (embryonic stem cells (ESC), neural stem cells (NSC) and hematopoietic stem cells (HSC)) (25, 26). These profiling data were converted to human homologues using available websites and compared with our current data ( Figure 6B, Table 4). As a result, 5 genes including ITGB1, USP9X and ZFX in Huh7 SP cells, TXNL, WTAP, ABCBl, STATIPl and GCLM in PLC / PRF / 5 SP cells were reported by Ramalho-Santos et al.
  • PPP1R3E Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 3E 2.76 2.249 227412— at Hs.39911
  • ID4 a Inhibitor of DNA binding 4, dominant negative helix-loop-helix protein 2.725 2.076 229386_at Hs.391392
  • TCERG1 Transcription elongation regulator 1 2.218 3.566 229706_at Hs.300052
  • HELZ Helicase with zinc finger domain 2.65 2.013 240486_at Hs .99437
  • FGF18 a Fibroblast growth factor 18 2.358 6.124 231382_at Hs.87191
  • MAP3K7IP2 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7 interacting protein '. 2.249 14.55 243557_at Hs.269775
  • F2RLl a Coagulation factor II (thrombin) receptoHike 1 5.705 2.594 206429_at Hs.154299
  • TM4SF1 3 Transmembrane 4 L six family member 1 5.922 4.696 238168 at Hs.351316
  • PRSS3 a Protease, serine, 3 (mesotrypsin) 2.64 5.1 213421_x_at Hs.435699
  • MYCNOS v-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian) 2.186 18.63 216188_at Hs.103989
  • the mRNA expression of 6 genes including 9X and ZFX was analyzed by quantitative real-time RT-PCR.
  • Ten genes in PLC / PRF / 5 SP cells and non-SP cells, ie TXNL, WTAP, ELAVL4, XRCC5, AF5Q31, ADARB1, FZD7, ABCB1, STATIP1, and GCLM were also examined.
  • Real-time RT-PCR shows that these 16 genes have higher mRNA expression levels in SP cells than in non-SP cells, which is in good agreement with microarray data (Figure 6C). .
  • the present inventors examined the tumorigenic potential and self-renewal ability of SP cells in NOD / SCID mouse xenograft assembly. Injection of 3 lxlO SP cells purified from Huh7 and PLC / PRF / 5 cells allowed tumors to develop. However, Non-SP cells, which constitute the majority of cancer cells, were unable to form tumors despite the increased number of cells injected. An additional marker for SP phenotype is breast cancer It is also not capable of promoting the enrichment of cancer stem cells such as CD44 + CD24- / low ESA + cells (12). These results indicate that only the SP subpopulation has the ability to induce tumors, and that functional and phenotypic heterogeneity is present in the HCC cell lines!
  • SP-derived tumors also generate SP and non-SP cells, indicating the ability of both SP cells to self-renew and separate.
  • the proportion of SP and non-SP cells in SP-derived tumors was similar to that of previously isolated cells in both Huh7 and PLC / PRF / 5 cells.
  • the proportion of SP and non-SP cells appears to be closely regulated and maintained in vitro and in vivo.
  • secondary transplantation of SP cells formed tumors, and the tumorigenic potential seems to be well maintained in sequential transplants.
  • Huh7 and PLC / PRF / 5 cells both produce AFP and are well known to be CK19-positive cell lines (30, 31). Transformed cells are usually thought to inherit the potential of their origin. For example, MYC inactivation in a conditional transgenic model leads to several liver tumor cells with stem cell properties and differentiates into normal hepatocyte and bile duct cell lineages (32). Analysis of surgical specimens showed a biliary marker-positive HCC, which suggests that at least some HCCs may result in a subpopulation force with dichotomous stem / precursor properties. Show me (33). Immunocytochemical analysis revealed an imbalance in marker expression between SP and non-SP cells.
  • the present inventors compared data showing a subset of genes that are up-regulated in SP cells with the so-called “stem cell gene” profiling (25, 26). . These genes are thought to be very important in maintaining functional and phenotypic properties in stem cells.
  • the six genes up-regulated in Huh7 SP cells and the 10 genes up-regulated in PLC / PRF / 5 SP cells were identified as ⁇ stem cell properties '' demonstrated in previous microarray studies.
  • Gene ”. ITGB1 (CD29) up-regulated in Huh7 SP cells is recognized as one of the stem cell markers in the liver. Monoclonal antibodies against ITGB1 are often used to isolate hepatic stem cells using flow cytometry (39).
  • FZD7 which is up-regulated in PLC / PRF / 5 SP cells, is a receptor for the Wnt signaling pathway, which is closely related to the regulation of stem cell self-renewal. Furthermore, WNT5A, WNT6, CTNNB1 and JUN are important components of the Wnt pathway, which are also up-regulated in PLC / PRF / 5 SP cells.
  • the dysregulated Wnt pathway sometimes allows extensive proliferation of tumor cells (40), and the role of FZD7 oncogenesis has already been reported in HCC (41). Taken together, these results may indicate that these genes are deeply involved in the maintenance of both normal and cancer stem cells in the liver. In the future, it may be better to investigate whether these gene expressions are seriously involved in determining cancer stem cell-like properties, including tumorigenesis in SP cells.
  • the SP phenotype has been reported to be determined by ABCG2 / BCRP1 since it was observed in the bone marrow of ABCG2 / BCRP1 null mice with a marked reduction in SP cells (42, 43). However, it is debatable whether other ABC transporters like AB CBl (MDRl) are similarly related to phenotypes (44). According to our microarray analysis, ABCG1 and ABCF2 in Huh7 SP cells, ABCB2, ABCC7, ABC A5 and ABCB1 in PLC / PRF / 5 SP cells are up-regulated in either SP cell. BCRP1 was shown not to be up-regulated. ABCA3 was also demonstrated to be highly expressed in neuroblastoma SP cells than in non-SP cells (45). In summary, another mechanism that excretes Hoechst dye operates between normal cells and transformed cells!
  • Fialkow PJ G artier SM, Yoshida A. Clonal origin of chronic myelocytic leukemia i n man.Proc Natl Acad Sci U S A 1967; 58: 1468-1471.
  • Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expressi on of ATP— binding cassette transporter ABCG2 / BCRP1. Am J Pathol 2003; 163: 3-9
  • the ABC transporter Bcrpl / ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med 2 001; 7: 1028-1034.
  • hepatoma stem cells obtained by the present invention can be used for IJ in the development of anticancer agents targeting these cells.

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Abstract

　血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することで、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測を可能とする。 　血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定することを含む、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法であって、前記特定の遺伝子は肝癌細胞のSP画分とNon-SP画分とで発現が相違するものである前記方法。肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測のためのキット、肝癌幹細胞の検出方法、肝癌幹細胞と肝癌非幹細胞を見分ける方法、肝癌幹細胞及びその調製方法も提供される。

Description

明 細 書
肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法及びキット 技術分野
[0001] 本発明は、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法及びキットに 関する。
背景技術
[0002] 一般に、癌細胞は種種の癌において機能的不均一性を示す (非特許文献 1)が、癌 はその起源にぉ 、ては単細胞であると考えられてきた (非特許文献 2,3)。軟寒天培 地におけるコ口-一形成アツセィ及び脾臓コ口-一アツセィにより、コ口-一形成能を 有する細胞は小集団であり、大部分の癌細胞はコロニー形成能を有さないことが示さ れた (非特許文献 4, 5)。 In vivo移植アツセィにおいて、小サブセットの癌細胞を注射 しても癌が発生した (非特許文献 6, 7)。これらの結果は、少数集団の細胞だけが腫瘍 を惹起する能力を有し、大多数の細胞は腫瘍を惹起する活性を欠 ヽて ヽることを示 している。これらの実験を観察することにより、 2つの一般論が導かれた (非特許文献 8 , 9)。確率モデルは、確率的な事象を経験することにより、癌が比較的同種の細胞集 団と、極度に増殖するポテンシャルを獲得して新たな腫瘍を形成するわずかの細胞 とカゝら構成されることを示している。もう一つの仮説 (すなわち、階層モデル）は、癌幹 細胞のサブ集団が、多様な分化した子孫細胞を含む階層構造を形成し、極度に増 殖することにより高頻度で新しい腫瘍を惹起すると仮定する。
[0003] フローサイトメトリーを用いる細胞分離、細胞培養、及び免疫不全マウスへの移植と いった幹細胞生物学の技術的進歩により、腫瘍における幹細胞の同定が容易になつ た。非肥満糖尿病/重症複合免疫不全 (NOD/SCID)マウスにヒト急性骨髄性白血病 を惹起する能力を有する小サブセットの細胞が白血病患者力も同定された (非特許 文献 10)。これらの細胞は、 CD34+CD38-細胞として分離され、連続的な移植におい ても白血病を惹起することができた。さらに、造血性幹細胞と白血病幹細胞の両方の 自己複製を調節する共通の機構が存在することが報告されている (非特許文献 11)。 白血病幹細胞の分野を越えて、フローサイトメトリーを用いて、固形腫瘍における腫 瘍形成性のサブ集団を検出する試みもなされている。最近、 CD44+CD24-/low ESA (上皮特異的抗原) +乳癌細胞、及び髄芽腫又は神経膠芽腫の CD133+細胞は「癌幹 細胞」と予想されるものとして同定された (非特許文献 12, 13)。これらの研究において 、癌幹細胞として精製された小サブセットの細胞は腫瘍形成ポテンシャルを示したが 、腫瘍細胞の大多数は in vivo移植アツセィにおいてそのようなポテンシャルを示さな 力つた。白血病における癌幹細胞の表現型及び固形腫瘍は、それらの起源幹細胞 の大部分を再利用するので、おそらく癌幹細胞は自己複製と分化とのバランスを調 節し、正常幹細胞が発生と再生において組織を形成するのと同じようなやり方で腫瘍 を再構成しているのだろう。培養及び in vivo移植アツセイカゝら得られるこれらの観察 力もは、階層モデルが提唱される力もしれな 、(非特許文献 14)。
[0004] 肝癌細胞 (HCC)は世界中で共通の悪性腫瘍であり、いまだに死亡率が高い (非特 許文献 15)。遺伝的及び後成的な変化の蓄積が多段階の肝臓癌形成に貢献すると 推定されている (非特許文献 16-18)。しかしながら、肝臓癌形成の根底にある全体的 な機構は明らかに実証されていない。さらに、 HCCの細胞起源は解明されずにいる。 癌幹細胞と予想されるものを同定し、 HCC細胞における階層性を解明することは、肝 臓癌形成を理解し、新規治療法を探索することに役立つかもしれない。
[0005] Side population(SP)細胞ソーティングは、最初に造血性幹細胞の同定に適用され、 多種多様な組織と器官における幹細胞の区画の濃縮に利用されている (非特許文献 19-21)。 SP細胞は、 ATP結合カセット (ABC)膜トランスポーターを通して Hoechst 3334 2色素を流出する能力によって検出される。最近、 SP細胞は癌細胞の幹細胞様画分 を分離する試みにも用いられた (非特許文献 22)。この方法は合理的で価値のあるも のと思われる。なぜならば、 HCCを含む種種の癌は ABCトランスポーターを高度に発 現し、多剤耐性に密接に貢献することが示されて ヽるからである (非特許文献 23)。
[0006] 非特許文献 1 : Heppner GH. Tumor heterogeneity. Cancer Res 1984;44:2259-2265. 非特許文献 2 : Fialkow PJ, G artier SM, Yoshida A. Clonal origin of chronic myelocyti c leukemia in man. Proc Natl Acad Sci U S A 1967;58:1468-1471.
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発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明は、肝癌細胞から精製した SP細胞が癌幹細胞様の性質を有するか否かを 明らかにした上で、 SP細胞と Non-SP細胞との遺伝子発現プロファイルの相違を調べ 、その情報を利用して、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測を可能 とすることを目的とする。 課題を解決するための手段
[0008] 最近の幹細胞生物学の進歩により、正常固形組織における推定上の幹細胞同様、 固形腫瘍における癌幹細胞を同定できるようになった。本発明者らは、癌幹細胞とし て機能するサブ集団を検出し、それらの腫瘍形成における役割を解明するために、 si de population(SP)細胞分析とソーティングを行い、肝細胞癌 (HCC)の細胞株を確立し た。 Huh7及び PLC/PRF/5細胞における SPサブ集団がそれぞれ全細胞数中 0.25%及 び 0.80%の割合で検出された。 SP細胞は、 Non-SP細胞と比較して、高い増殖能と抗 アポトーシス性を示した。免疫細胞化学検査により、 SP画分は肝細胞と胆管細胞の 両方の系譜の特徴を提示する多数の細胞を含んでいることが明らかになった。非肥 満糖尿病/重症複合免疫不全 (NOD/SCID)マウスへの異種移植実験により、腫瘍形 成には、わずか lxlO3個の SP細胞で十分であつたのに対して、 lxlO6個の Non-SP細 胞を注射しても腫瘍は惹起されないことが明らかになった。 SP細胞が誘導した腫瘍を 再分析したところ、 SP細胞は SP細胞と Non-SP細胞の両方を生成し、腫瘍を惹起する ポテンシャルは連続的な移植にぉ 、て SP細胞のみに維持されて 、た。マイクロアレイ 分析により SP細胞と Non-SP細胞との遺伝子発現プロファイルの相違が明らかになり、 いくつかのいわゆる「幹細胞性遺伝子 (sternness genes)」が HCC細胞中の SP細胞に おいてアップレギュレートしていた。結論として、本発明者らは、 HCC細胞中の SP細 胞として検出された少数のものが、非常に高い腫瘍形成ポテンシャルを有し、明らか な階層構造によって特徴付けされる癌幹細胞システムにおける不均一性を構成して 、ることを提 P昌する。
[0009] SP細胞と Non-SP細胞との間で遺伝子発現プロファイルを比較したときに、 SP細胞 でアップレギュレートした遺伝子及びダウンレギュレートした遺伝子は、肝臓癌の鑑別 、疾患ステージの判定又は予後の予測のマーカーとして利用可能である。
[0010] 本発明の要旨は以下の通りである。
(1) 血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測 定することを含む、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法であつ て、前記特定の遺伝子は肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違するもの である前記方法。 (2) 特定の遺伝子が、表 A、 B、 C又は Dのいずれかに列挙されている遺伝子の少 なくとも 1つである（1)記載の方法。
(3) 表 A及び Z又は Cに列挙されている遺伝子の少なくとも 1つの発現が上昇して いる場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あ るいは再発のリスクが高 、と予測する（2)記載の方法。
[0011] (4) 表 B及び Z又は Dに列挙されている遺伝子の少なくとも 1つの発現が低下して いる場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あ るいは再発のリスクが高 、と予測する（2)記載の方法。
(5) 特定の遺伝子が、 CHM、 MSH6、 NCOA7、 CYP2E1、 TM4SF1、 F2RL1、 TRPM3 、 AKR1C1、 FOXHl、 RAB40C、 MGC27085, PPP1R3E、 USTゝ CANP、 PRSS3、 UACA 、 FOSL2、 PSPC1、 EXOSC6、 LOC388558、 RTTN、 FAM20Aゝ FGF18、 HOXA13、 FO LR1、 TMF1、 PCGF5、 GSTA1、 XRCC5、 MAP3K7IP2, RTN4、 BCD02、 CDH22、 MY CNOS、 FMNL2、 PHEX、 WDR56、 HERC6、 SBN01、 FDFT1、 ZFR及び PF6力らなる 群並びに PCOTH、 ZCCHC6、 HRMT1L1、 INHBC、 ATP8B3、 TALI, FGF1、 ADCY9 、 CAPS2、 ANXA2、 FLJ34077, AD7C— NTPゝ GLRB、 MGAT2、 SASH1、 HIF1A、 LMT K3、 EYA3、 IPP、 CAPN2、 GAFA1、 HELLS, NF1、 NUSAPl及び SESN3からなる群より 選択される少なくとも 1つの遺伝子である（1)記載の方法。
[0012] (6) CHM、 MSH6、 NCOA7、 CYP2E1、 TM4SF1、 F2RL1、 TRPM3、 AKR1C1、 FOXH 1、 RAB40C、 MGC27085, PPP1R3E、 USTゝ CANP、 PRSS3、 UACA, FOSL2、 PSPC1、 EXOSC6、 LOC388558、 RTTN、 FAM20A、 FGF18、 HOXA13、 FOLRl、 TMF1、 PCG F5、 GSTA1、 XRCC5、 MAP3K7IP2, RTN4、 BCD02、 CDH22、 MYCNOS、 FMNL2、 P HEX, WDR56、 HERC6、 SBN01、 FDFT1、 ZFR及び PF6からなる群から選択される少 なくとも 1つの遺伝子の発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患 が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する（5)記 載の方法。
(7) PCOTH、 ZCCHC6、 HRMT1L1、 INHBC、 ATP8B3、 TALI, FGF1、 ADCY9、 C APS2、 ANXA2、 FLJ34077, AD7C— NTP、 GLRB、 MGAT2、 SASH1、 HIF1A、 LMTK3 、 EYA3、 IPP、 CAPN2、 GAFA1、 HELLS, NF1、 NUSAPl及び SESN3からなる群より選 択される少なくとも 1つの遺伝子の発現が低下している場合に、肝臓癌の悪性度が高 い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測す る（5)記載の方法。
[0013] (8) 特定の遺伝子力 XRCC5である（1)記載の方法。
(9) XRCC5の発現が上昇して 、る場合に、肝臓癌の悪性度が高 、、疾患が進行し ている、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する（8)記載の方法
(10) 特定の遺伝子の発現をタンパク質レベルで測定する（1)〜（9)のいずれかに 記載の方法。
(11) 特定の遺伝子の発現を RNAレベルで測定する（1)〜（9)のいずれかに記載 の方法。
( 12) 肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違する遺伝子の発現を測定 することができる試薬を含む、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測 のためのキット。
[0014] (13) 血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測 定することを含む、肝癌幹細胞の検出方法であって、前記特定の遺伝子は肝癌細胞 の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違するものである前記方法。
(14) 血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測 定することを含む、肝癌幹細胞と肝癌非幹細胞とを見分ける方法であって、前記特 定の遺伝子は肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違するものである前記 方法。
(15) 二次移植をした場合に、腫瘍形成能を保持している肝癌細胞。
(16) side population細胞分離法により、蛍光シグナルの弱い細胞集団を分離する ことを含む、（15)記載の肝癌細胞の調製方法。
(17) (15)記載の肝癌細胞を用いて、抗癌剤をスクリーニングする方法。
発明の効果
[0015] 本発明により、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測の診断マーカ 一が提供された。 本発明により、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法及びキッ 卜も提供された。
また、本発明により、肝癌幹細胞の検出方法、肝癌幹細胞と肝癌非幹細胞とを見 分ける方法、肝癌幹細胞及びその調製方法が提供された。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2006- 138072号の 明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[図 1]SP細胞分析。 HepG2及び Huh6細胞は SP画分を含まないが、 Huh7及び PLC/PR F/5細胞においては、それぞれ、 0.25%及び 0.80%の SPサブ集団が検出された。 SP細 胞は Hoechst及びべラノ ミル処理により消失した。
[図 2]Huh7及び PLC/PRF/5細胞における分離後、 24、 48及び 72時間目の細胞生存 率 (A, B)及びアポトーシス感受性 (C, D)。 Huh7及び PLC/PRF/5細胞から精製された SP細胞は、対応する Non-SP細胞より高い生存率を示した。 SP細胞における TUNEL 陽性細胞の数は一貫して両細胞中の Non-SP細胞における TUNEL陽性細胞の数よ り多かった。 *は統計的有意差あり。
[図 3]Huh7及び PLC/PRF/5 SP細胞における免疫組織化学分析。（A-D)AFP及び CK 19発現を Huh7 SP細胞 (A)、 Huh7 Non- SP細胞 (B)、 PLC/PRF/5 SP細胞 (C)及び PLC /PRF/5 Non-SP細胞 (D)において調べた。（E, F) AFP又は CK19のいずれかに陽性 の細胞は Non-SP細胞に優先的に見 、だされたが、 AFP及び CK19の両方に対して 陽性である多数の細胞が Huh7 SP細胞 (E)及び PLC/PRF/5 SP細胞 (F)において観察 された。スケールバー =(a, b)20 μ m; (c,d)=50 μ m
[図 4]SP細胞における腫瘍形成性。（a)lxlO3個の Huh7 SP細胞の注射による代表的な 皮下腫瘍 (矢印）。 Huh7 SP細胞 (b)及び PLC/PRF/5 SP細胞 (c)に由来する腫瘍のへ マトキシリン及びェォシン染色。 Non-SP細胞の移植は 16週間で腫瘍を惹起すること はできなかった。スケールバー =50 μ m
[図 5]SPに由来する腫瘍の再分析。 Huh7及び PLC/PRF/5 SPに由来する腫瘍細胞 における SPサブ集団をそれぞれ 0.34%及び 0.90%で検出した。 SP分析パターンは以前 に分離した Huh7及び PLC/PRF/5細胞のそれと似ていた。 [図 6]マイクロアレイに基づく遺伝子発現プロファイル。（A) Huh7及び PLC/PRF/5 SP 細胞においてアップレギュレートした（比 >2.0)遺伝子中、 440及び 789個の遺伝子が それぞれ特徴付けされた。それらの遺伝子は 11群にカテゴリー化された。 (B)HCC SP 細胞における遺伝子発現プロファイル中の幹細胞性の遺伝子と、 Ramalho-Santosら と Ivanovaらにより報告された幹細胞濃縮遺伝子との重複。（C)リアルタイム RT-PCRに より算出された SP/Non- SPの fold changeはマイクロアレイデータのそれと比較的一致 している。 ESCは胚性幹細胞、 NSCは神経幹細胞、 HSCは造血幹細胞。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発 現を測定することを含む、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法 を提供する。特定の遺伝子は肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違する ものである。「発現が相違する」態様としては、遺伝子の発現の有無が異なること、発 現量が異なることが挙げられる。特定の遺伝子は、表 A、 B、 C又は Dのいずれかに 列挙されている遺伝子の少なくとも 1つであることが好ましぐ 1種でも複数種であって もよい。例えば、 CHM、 MSH6、 NCOA7、 CYP2E1、 TM4SF1、 F2RL1、 TRPM3、 AKR1 Cl、 F0XH1、 RAB40C、 MGC27085, PPP1R3E、 USTゝ CANP、 PRSS3、 UACA、 FOSL 2、 PSPC1、 EXOSC6、 LOC388558、 RTTN、 FAM20Aゝ FGF18、 HOXA13、 F0LR1、 T MF1、 PCGF5、 GSTA1、 XRCC5、 MAP3K7IP2, RTN4、 BCD02、 CDH22、 MYCNOS 、 FMNL2, PHEX、 WDR56、 HERC6、 SBN01、 FDFT1、 ZFR、 PF6、 PCOTH、 ZCCHC
6、 HRMT1L1、 INHBC、 ATP8B3、 TALI, FGF1、 ADCY9、 CAPS2、 ANXA2、 FLJ3407
7、 AD7C— NTPゝ GLRB、 MGAT2、 SASH1、 HIF1A、 LMTK3、 EYA3、 IPPゝ CAPN2、 G AFA1、 HELLS, NF1、 NUSAP1、 SESN3、 XRCC5などを例示することができる。
[0018] 表 Aには、 Huh7 SP細胞でアップレギュレートした遺伝子（後述の実施例で確認）を まとめた。表 Bには、 Huh7 SP細胞でダウンレギュレートした遺伝子 (後述の実施例で 確認）をまとめた。表 Cには、 Alexander細胞（PLC/PRF/5 SP細胞と同じ細胞株）でァ ップレギュレートした遺伝子（後述の実施例で確認）をまとめた。表 Dには、 Alexander 細胞 (PLC/PRF/5 SP細胞と同じ細胞株)でダウンレギュレートした遺伝子 (後述の実 施例で確認)をまとめた。表中、 1列目には発現量、 2列目には遺伝子名（略号: NCB Iシンボルネーム）、 3列目には GeneBankの登録番号、 4〜7列目には遺伝子名、 8列 目にはクローユング方法、 9列目には Unigene (ュ-ジーン)登録番号を記載した。
[表 1]
Figure imgf000013_0001
差替え ^鈹 W126)
Figure imgf000014_0001
ϋ替え ^紙 mW126)
Figure imgf000015_0001
逡轡ぇ 用 紙（規則 26)
Figure imgf000016_0001
差替え 用 紙（規則 26)
Figure imgf000017_0001
差替え周 ¾ imm)
Figure imgf000018_0001
替え用 紙（ 則 26》
Figure imgf000019_0001
差替え用 紙 (規則 26.)
Figure imgf000020_0001
差替え用 紙（- 則 26) 表 B
Figure imgf000021_0001
差替え甩紙（ '2s)
Figure imgf000022_0001
差替え用 紙（規則 26)
Figure imgf000023_0001
差替え用紙（規則 26) 。
Figure imgf000024_0001
差替え用 紙（規則 2
Figure imgf000025_0001
差替え屈紙 (Μ2δ) 表 C
Figure imgf000026_0001
逢替え用紙 wm)
Figure imgf000027_0001
差替え甩紙（規則 26)
Figure imgf000028_0001
差替え用紙（規則 26)
Figure imgf000029_0001
差替え用紙 { )
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
差替え用 紙（規則 26) 7d76hia
瞧
删
K
i
_NH056aC01. 2;
； 5,
替え用 紙（規則 26) ia 63 EVI5 BF435861 ecotropic vi ral integration si te 5 EST Hs. 387251 v-nyc nyelocytoaatosls vlra) related
18. 63 OS BC002892 oncogene, neuroblastoma derived (avian), Hs. 103989 opposite strand
UI-H-B»(D -(H2-IHJ!. si NCLCGAP_Sub6
ia r7 AIZ94722 Horn sapiens cDNA clone ) AGE:Z729SDZ 3' . EST
nRNA protein
13. 78 PAK7 ABO 2 P2KCDKN1A) -activated kinase 7 p21-ac iv»ted kinase 7 kinase Hs. 32539
PAK5 solute carrier fami ly 7 (cat ionic anlno
18.96 SLC7A2 AAM55S4 EST Hs.432978 acid transporter, y system), member 2
DKF2p56BK21 6.sl 566 (synonym: hfkd2)
19. 11 AL03B704 Hono sapiens cDNA clone DKFZp566K21463' , EST
nRNA sequence.
19. 16 GC34290 NM_1523t5 hypothetical protein MGC34290 hypothetical protein HGC342 0 Hs.374720
13. 22 BUI 76936 Ful l length insert cONA clone YW29F03 EST Hs. 125008 s1 SoaresJJhHBPu_S1 Homo sapiens
19. 22 AA424567 cDNA clone IMAGE: 7B7165 3', nRNA EST
«lngless~type WTV integration site
19.81 NNT5A Al 703321 EST Hs. 152213 fami ly, menber 5A cycl In-dependent kinase 10
isofori 1; cycl In-dependent
20. 33 CDK10 N 03674 cycl In-dependent kinase (CDC2-l lke) 10 kinase 10 Isoforn 2; Hs. 77313 cycl In-dependent kinase 10
Isoforn 3
20. 55 chol inergic receptor, nicotinic, alphs chol inergic receptor,
C 3 0513 UGC Hs. 9Ε05 polypeptide 3 nicotinic alpha polypeptide 3
2a 62 45 Hypothetical L0C339025 (L0C339025), nRNA EST Hs.368520
20. 7 AI023333 Transcribed sequences EST Hs. 16374
2a 75 FU13S41 BC021704 hypothetical protein FU13M1 hypothetical protein FU13341 UGC Hs. 443310
21. 16 FLJ32752 AL040S9Z hypothetic protein FLJ32752 EST Hs.4241 B3 ol lso capping;
fls
21.29 KIAA1374 AK025109 IAA1374 protein 374 protein (ful l Hs. 166547
Insert seauence
)
1.46 UGC 0579 NHJ 52776 hypothetical protein MGC40579 hypothetical protein HGC40579 Hs.409960
Horn sapiens cONA clone MGC: 27457 llnknovn (protein for
1. BC022058 UGC
1 :4710250. UCC :27457) 替え 甩 紙（m¾26) ankyrin repeat and SDCS box-containing 4 EST Hs. 413226
Al cohol isn
al cohol lcohol dehydrogenase IB (class I) , beta alcohol dehydrogenase 1B
dehydros Hs.4 polypeptide (class 1), beta polypeptide suscepti i
enase l lty to qu39f10. xl HCLCGAP_Lym5 Hono sapiens
cDNA clone IMAGE:1967179 3' simi lar to
EST
contains Alu repeti tive element;, niRNA
seauence.
sapiens, clone IMAGE:4401081, nRNA. leucine zipper, putative tumor
HTC Hs- 93605 suppressor 1
Clone UAGE :5283686, nRNA EST Hs.459142
DEP domain con ining 4 DEP domain containing 4 Hs. 250472 chromosome 9 open reading fra«i
chronosoRte 9 open reading frame S4 Hs. 116292
84
Homo sapiens nRNA; cDNA DKfZp564M316
(froi clone D FZp564l1316) . bobby sox homo (Drosophi lat Hs. 35380
TSPY-l ike 3 EST Hs. 375468 pred i cted protein of HQ2372 Ηοιηα sa i ens
PR02372 HTC
372 nRNA, complete cds. interleukin 6 (interferon, beta 2) EST Hs. 130210
EST387380 UAGE reseauences. UAGN Homo
EST
sapiens cDNA, sequence.
Clone IUAG£:4826526. nRNA Hs. 191614
AAT1-atpha Hs. 3419DG
CDNA FLJ11723 fis, clone HEMBA10053H EST Hs. 196008 hypothetical protein LOC339005 Hs. 212670
Myosin, l ight polypeptide kinase Hs. m
NACKT, leucine rich repeat and PYD NACHT, and PYD contalnlnc
Hs.4 9E36 contalnim 10 protein 10
差替え甩紙 (¾ !J26) Left
ventrlcu
nonconpact
In Iso ■ 1
Ion with
in alpha iso n 3
congeni tal
In alpha iso 7
heart
in alpha iso 2
30. 6 U2674 dystrobrevin. a I hi defects; Hs. 255526 in iso 4
Left
in iso 5
ventricula
in iso nt 6
dystrobrevi in alpha iso n 8
nonconpact
ion,
fani t lal
isolated
31. 04 0LX6 AA040332 distat-less honeo box S EST Hs. 249196
Asthma, N-meth lat
31. 34 HNMT histaiine N-nethyl transferase histanine N-nethyl transferase susceptibi ion of Hs.42151
Uty to histamine
31.93 MGC33382 NM.173529 hypothetical protein MGC33382 hypothetical protein GC33382 Hs. 208701
33. 26 FU35728 NJL152610 hypothetical protein FL J 35728 hypothetical protein FLJ35728 Hs. 192090
M0Z/CBP type I I ; Hono sapiens partial niRNA for M0Z/CBP
36. 07 AJ25184 M0Z CBP oncoprotei
M0Z/CBP chimeric transcript type I I.
ADP-ribosylation factor dona in
protein 1 isoforn alpha;
ADP-ribosylation factor domain protein
6. 72 ADP-ribosy)atlon factor dona in
Hs.792 1. G kDa protein 1 isoforn beta;
ADP-rifaosyla lon factor dona in
protein 1 isoforn gamna
interleukln A (natural ki l ler cel l
7. 84 NH_000882 stimulatory factor 1, cytotoxi interleukln 12A precursor Hs. 673 lymphocyte maturation factor 1, p35) 7. 84 PLGL plasninogen-Mke Hs.450026 sinl lar to golgl autoanttgen, gotsin
8.5S L0C374S76 BC017995 HTC Hs. 378848 subfaii ly a, 2; SY11 protein
CDNA FU262S6 fis, clone 0UC07192, highly
B. 67 AA476303 sill Ur to Is kappa chain -l l l region HAH EST Hs. 525S93 precursor
DKF2P56<G2
9.62 KFZP56 G2022 protein DKF2P564G2022 protein
022 Hs. 2O0B92 3G AA875997 Transcribed sequences EST Hs. 88629 1.47 2NF15L1 Clone 1UAGE:5300759, iflNA EST Hs.407603
差替え ^紙 (mm) .
Figure imgf000036_0001
差替え用紙（ 則 26) - 表 D
Figure imgf000037_0001
差替え用 紙 mM26)
Figure imgf000038_0001
差替え用紙 ($ΜΨΜ) AA927562 Transcribed sequences EST Hs.148234
FKHL18 AL160175
ucopolysac
charidosis th;
Mucopotysac
afpha-L-iduronidase
SLC26A1 M74715 iduronidase, a!pha-L- charidosis Hs.89560 precursor
[h/s:
Mucopotysac
charidosis Is
CDNA clone IMAGE:5296106,
BC042986 Hs.441051 partial cds
AV657587 Transcribed sequences EST Hs.282580
SCIN AF276507 scinderin scinderin Hs.356726 phosphodiesterase 6A,
PDE6A AA018923 EST Hs.151710 cG MP— specific, rod, alpha
BE044089 Transcribed sequences EST Hs.60049 nuctear receptor
nuclear receptor subfamily 1， roup
NR1H4 AF478446 subfamily 1, roup H, Hs.133209
H, member 4
member 4
Homo sapiens mRNA; cDNA
AL832887 D FZp667N093 (from clone
DKFZpB67N093). high density lipoprotein binding
HDLBP BF303940 EST Hs.427152 protein (violin) ye85f09.s1 Soares fetal liver spleen
R0Z287 1NFLS Homo sapiens cD A clone EST
IMAGE124553 3', mRNA sequence.
RST16640 Athersys RAGE Library
BG197397 Homo sapiens cDNA, mRNA EST
sequence.
AW00772
Transcribed sequences EST Hs.132650 7 1
potassium voltage-gated channel,
KCNE4 AI002713 EST Hs.348522
Isk-related family, member 4
CDNA F 37676 fis, clone
N71087 EST Hs.268806 BRHIP2012627
NM.00553 inhibit! beta C chain
I HBC inhib!n, beta C Hs.374664 8 preproprotein
FCRH3 BF51 552 Fc receptoHike protein 3 EST Hs.434881
Griscelli dilute gene;
myosin VA (heavy polypeptide 12, myosin VA (heavy
Y05A Z22957 syndrome, myosin I; Hs.21213 myoxin) polypeptide 12, myoxin)
type 1 MYOXIN type 1 tumor necrosis lector
RTS-1 BE55113B receptor sheddinc aminopcptidase EST Hs.436186 regulator ti33c10.x1 NCi_CGAP_Pan1 Homo
sapiens cDNA clone
AI446D64 EST
iMAGE2H33143', mRNA
sequence. 差替え用 紙（規則 26) cytochrome P450, family
2, subfamily C,
N 00077 cytochrome P450, family 2, polypeptide 8 isofoim 1;
CYP2C8
0 Hs.282871 subfamily C, polypeptide 8 cytochrome P450, family
2, subfamily C,
polypeptide S isoform 2 hypothetical protein o!igo capping;
FLJ39821 AK097140 hypothetical protein FLJ39821 fis (full insert Hs.211713
FLJ39821
sequence)
SILV U01874 silver homolog (mouse) silver homolog Hs.95972
LOC28562 MRNA full length insert cDNA clone
AL389942
8 FU.CDNA Hs.406790
EUROI AGE 2005635
Hypothetical gene supported by
BC028978 Hs.374715 BC028978 (LOC401181), mRNA
A1140607 LOC389629 CLOC389629), mRNA EST Hs.423159
Transcribed sequence with weak
similarity to protein ref:NP_004563.1
AA806845 EST Hs.271078 (H.sapiens) plakophilin 2 [Homo
sapiens]
AA760776 Transcribed sequences EST Hs.445940
AW24200 Clone I AG&3868989, mRNA,
EST Hs.42239 9 partial cds
solute carrier family 1
solute carrier family 1 (glutamate
SLC1A7 BC000G51 C^utamate transporter), Hs.104637 transporter), member 7
member 7
BC038533 Clone IMAGE5165367, mRNA Hs.224502
CDNA FLJ4 78 fis, clone
UC P AF388367 Hs.434110
UTERU2031834
glutamate receptor interacting
GRIP2 AF052177 FU.CDNA Hs.318125 protein 2
oligo capping;
Homo sapiens cDNA FLJ3688 fis,
FLJ10726 AK094203 fis (full insert
clone B DE2000463.
sequence) similar to hypothetical gene
BC028245 LOCI 30797, clone IMAG&5395354, HTC Hs.348697 mRNA
CDNA FLJ32525 fis, clone
AA705015 EST Hs.185918 SMINT2OOO06O nab97b09.x1 NCI.CGAP_Bm23
Homo sapiens cDNA clone
[MAGE3275489 3' similar to
BF438471 EST
contains MER3Zb3 MER32
repetitive element：, mRNA
sequence.
Similar to HERV-H
BC0319S6 LTR-associating 3, clone HTC Hs.382100 1MAG& 830680. mRNA 差替え甩 紙（規則 26) CDNA FLJ30563 fis, clone
BC036592 Hs.303527 BRAWH2004842
Ν 01788 hypothetical protein
FLJ20574 hypothetical protein Fし J20574 Hs.123427 6 F 20574
14505 hypothetical protein
GC27 34 hypothetical prcrtein GC27434 Hs.362994 0 MGC27434
AV658701 GLC Homo sapiens
ALDOB AV658701 cDNA clone GLCFPC05 3', mRNA EST
sequence.
O-iinked mannose O— linked mannose oligD capping:
Muscle-eye-
FLJ20277 ΑΚ026430 betal ,2-N-acetylgtucosaminyltrans betal ,2-N-acetyiglucosa fis (full insert Hs.435108 brain disease
f erase minyHransferase sequence)
Transcribed sequence with weak
similarity to protein ref:NP_060312.1
ΑΑ017093 EST Hs.271780 (Ksapiens) hypothetical protein
FLJ20489 [Homo sapiens]
Ν .00069 aldehyde dehydrogenase t famity, aldehyde dehydrogenase
ALDH1A3 Hs.75746 3 member A3 1A3
CO 01C BC014583 coronin, actin binding protein, 1G HTC Hs.17377 nuclear ctor [ X
nuclear factor I X (CGAAT-binding transcription
ΝΠΧ U18759 (CCAAT-fainding Hs.35841 transcription factor)
transcription factor)
Hypothetical protein LOC286184,
LOC286 8
BC037345 mRNA (cDNA clone Hs.391564 4
I AGE5265748), partial cds
ΒΕ219617 Transcribed sequences EST Hs.222068
FLJ35782 AL043093 hypothetical protein FLJ35782 EST Hs.197801 collagen, type XXV, alpha
iso orm 2; collagen,
COL25A1 AF293340 collagen, type XXV, alpha 1 Hs.512787 type XXV, alpha 1
isoform 1
AW13874
ΚΙΑΑ1914 KIAA1914 EST Η&35319Θ 3
ΑΑ642385 Transcribed sequences EST Hs.371930
AW97624
Transcribed sequences EST Hs.153248 7
synonyms*. H3/I, H3FL; Homo
Ν .00353 H3 histone family,
HIST1H3H sapiens histone 1, H3b (HIST1H3B),
7 member L
mRNA. erythrocyte membrane protein band
EPB41L1 ΑΑ573523 EST Hs.437422
"Hike 1
COL9A1 ΑΙ286254 collagen, type DC alpha 1 EST Hs.149809 hypothetical protein
MGC48625 BC029855 hypothetical protein MGC4S625 HTC Hs.20506
MGC48625
CAPS2 BC033860 calc >hosphine 2 Hs.407154
Homo sapiens, clone
BC040680
I AGE4817893, mRNA.
chromosome 20 open reading frame
C20orf71 ΑΙ638623 EST Hs.360989
71 逡替え用紙（規則 26) heat shock 27kDa
N _0H42 heat shock 27kDa protein family,
HSPB7 protein family, member 7 Hs.56874 4 member 7 (cardiovascular) (cardiovascular)
BF437470 Transcribed sequences EST Hs.255277 chromosome 20 open reading frame
C20orf112 AI871356 EST Hs.335142
112
AL566553 Homo sapiens FtTAL
BRAIN Homo sapiens cDNA clone
AL566553 EST
CS0DF020YD11 3-PRIME, mRNA
sequence.
Hematopoicsi
NM.00197 s, cyclic;
ELA2 elastase 2, neutrophil elastase 2, neutrophil Hs.99863 2 Neutropenia,
congenital
NM.01793 hypothetical protein
FLJ20701 hypothetical protein FLJ20701 Hs.424598 3 FLJ20701
EPN2 H05668 epsin 2 EST Hs.7407 papilin, proteo(rfycan-like sulfated
PAPLN AU145309 EST Hs.458428 glycoprotein chromosome 20 open reading frame
C20orf32 BC027951 HEF-like protein MGC Hs.283102
32
AW66366
Transcribed sequences EST Hs.437802 8
N _00567 prostate stem cell
PSCA prostate stem cell antigen Hs.379010 2 antigen
LOC28348 AW66518 CDNA FLJ46005 fis, clone
EST Hs.148675 4 4 SMINT2013833
oligo capping;
CDNA: FLJ20890 fis, clone
AK024543 fis (full insert Hs.306686 ADKA03323
sequence)
CDNA FLJ13671 fis, clone
AU158247 EST Hs.287587 PLACE1011729
oligo capping;
CDNA: FLJ21424 fis, clone
AK025077 fis (full insert Hs.287662 COLO" 57
sequence)
FBXW3 AA845710 breakpoint cluster region EST Hs.4 6394 erythroid differentiation
HFL-EDD N .00655 erythroid differentiation and
and donucleation factor Hs.514718 G1 3 donucleation factor 1
1
oligo capping;
GRSP1 AK00024 GRPI-binding protein GRSP1 fis (full insert Hs.158867 sequence) oligo capping;
CDNA FLJ1 fis, clone
AK021880 fis (full insert Hs.529986 HE BA1006424
sequence) meningioma expressed antigen 5
GEA5 AA284256 EST Hs.5734
(hyaluronidase)
CDNA FLJ13886 fis, clone
AU159390 EST Hs.296746 THYRO1001559
差替え用 紙（規則 26) out-of-frame rearrangement, stop IGVL2 gene;
codon in FR3; Homo sapiens partial immunoglobulin lambda immunoglobuli
AJ275399 【GVL2 gene for immunoglobu m light chain variable n lambda light
lambda light chain V region, case 1, rep'on chain; variable cell Mo V 94. region
SP100 AA286940 nuclear antigen Sp100 EST Hs.371696
BG771696 Clone iMAGE4836780, mRNA EST Hs.443506
Homo sapiens mRNA; cDNA
ALS32948 DKF2p666K2010 (from clone
DKFZp666K2010).
DKFZP434 hypothetical protein
AL137361 hypothetical protein Hs.98173 C0826 DKFZP434C0826
hypothetical protein
FLJ38993 AF070524 hypothetical protein FLJ38993 FU.CDNA Hs.13t236
FLJ38993
eukaryotic translation initiation
eIF3k AA470798 EST Hs.143773 factor 3 sub unit k
BFt 10977 Transcribed sequences EST Hs.530421 ow44c09.x1
Soaresj)arathyroid_tumor_NbHPA
A1028528 Homo sapiens cDNA clone EST
I AGB1649680 3'， mRNA
sequence.
KSHV latent nuclear antigen
KUP1 AA460299 EST Hs.38178 interacting protein 1
oltgo capping:
LRRC27 AK098G52 KIAA1674 fis (full insert Hs.132888 sequence) tt20g10.x1 NCI.CGAP.GC6 Homo
sapiens cDNA clone
[MAGE:2241378 3* simitar to
AI632259 contains Alu repetitive EST
element;contains element THR
repetitive element；, mRNA
sequence.
BC018 40
ARHGEF1 Rho guanine nucleotide exchange
AL137508 Hs.436196 0 factor (GEF) 10
Mdm2, transformed 3T3 cell double
TBP AL832671 minute 2, p53 binding protein Hs.186433
(mouse) binding protein, 10 ^Da
A-kinase anchor protein
13 isoform 1; A-kinase
anchor protein 13
AKAP13 AF126008 A kinase (PRKA) anchor protein 13 Hs.350631 isoform 2; A- inase
anchor protein 13
isoform 3
AI694327 Transcribed sequences EST Hs.47189 差替え 用 紙 (miU28)
Figure imgf000044_0001
PCOTH、 ZCCHC6, HRMT1L INHBC、 ATP8B3, TALI, FGF1.、 ADCY9、 CAPS2
、 ANXA2, FLJ34077, AD7C-NTP, GLRB、 MGAT2、 SASH HIF1A、 LMTK3、 EYA
3、 IPP、 CAPN2、 GAFA1、 HELLS, F1、 NUSAP1及ぴ SES 3ほ、 Huh7 SP細 及び
Alexiinder D胞 (PLC/PRF/5 SP細胞と同じ細胞株）の両方でダウンレギユレ一トした 遣伝子 (後述の実施例で ¾SIS)である。
CHM、 MSH6、 NCOA7, CYP2E1、 TM4SF1, F2RL1、 TRPM3, AKR1C1、 FOXHl、
RAB40C、 MGC27085, PPP1R3E、 UST、 CANP、 PRSS3、 UACA、 FOSL2、 PSPC1、 E
XOSC6、 LOC388558, RTTN, FAM20A, FGF18、 HOXA13 FOLRl、 TMF1、 PCGF 差替 え 屈 紙（規則 26) 5、 GSTA1、 XRCC5、 MAP3K7IP2, RTN4、 BCD02、 CDH22、 MYCNOS、 FMNL2、 PH EX、 WDR56、 HERC6、 SBN01、 FDFT1、 ZFR及び PF6は、 Huh7 SP細胞及び Alexand er細胞（PLC/PRF/5 SP細胞と同じ細胞株）の両方でアップレギュレートした遺伝子（ 後述の実施例で確認)である。
XRCC5は、 Huh7 SP細胞及び Alexander細胞（PLC/PRF/5 SP細胞と同じ細胞株） の両方でアップレギュレーションを示す幹細胞性遺伝子 (後述の実施例で確認)であ る。
例えば、以下のように、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測をする ことができる。
[0020] 1.表 A及び Z又は Cに列挙されている遺伝子の少なくとも 1つの発現が上昇してい る場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、ある いは再発のリスクが高 、と予測する。
2.表 B及び Z又は Dに列挙されている遺伝子の少なくとも 1つの発現が低下してい る場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、ある いは再発のリスクが高 、と予測する。
3. CHM、 MSH6、 NCOA7、 CYP2E1、 TM4SF1、 F2RL1、 TRPM3、 AKR1C1、 FOXH1 、 RAB40C、 MGC27085, PPP1R3E、 USTゝ CANP、 PRSS3、 UACA、 FOSL2、 PSPC1、 EXOSC6、 LOC388558、 RTTN、 FAM20A、 FGF18、 HOXA13、 FOLRl、 TMF1、 PCG F5、 GSTA1、 XRCC5、 MAP3K7IP2, RTN4、 BCD02、 CDH22、 MYCNOS、 FMNL2、 P HEX, WDR56、 HERC6、 SBN01、 FDFT1、 ZFR及び PF6からなる群より選択される少 なくとも 1つの遺伝子の発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患 が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する。
[0021] 4. PCOTH、 ZCCHC6、 HRMT1L1、 INHBC、 ATP8B3、 TALI, FGF1、 ADCY9、 CAP S2、 ANXA2、 FLJ34077, AD7C— NTP、 GLRB、 MGAT2、 SASH1、 HIF1A、 LMTK3、 E YA3、 IPP、 CAPN2、 GAFA1、 HELLS, NF1、 NUSAPl及び SESN3からなる群より選択 される少なくとも 1つの遺伝子の発現が低下している場合に、肝臓癌の悪性度が高い 、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する 5. XRCC5の発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行して いる、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する。
[0022] 本発明の鑑別、判定又は予測方法において、特定の遺伝子の発現が上昇又は低 下して 、ると判断する際には、正常肝細胞又は肝組織をコントロールとして比較する とよい。あるいは、予後不良肝癌 (再発 ·浸潤 '転移あり）と予後良好肝癌 (再発，浸潤 '転移無し）との間で特定の遺伝子の発現を比較してもよい。その場合、コントロール は予後良好肝癌となる。
本発明の方法において、血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定 の遺伝子の発現は、タンパク質レベルで測定してもよいし、 RNAレベルで測定しても よい。例えば、ノーザンプロット法、 PCR法、ウェスタンプロット法、免疫組織化学分析 法などで測定することができる。あるいはまた、 cDNAマイクロアレイ、 ELISA法などを 利用して測定してもよい。
[0023] 特定の遺伝子の発現をタンパク質レベルで測定するためには、測定の対象となるタ ンパク質を特異的に認識する抗体を用いるとよい。抗体は、モノクローナル抗体、ポリ クローナル抗体の 、ずれであってもよ 、。これらの抗体は公知の方法で製造すること 力 Sできるし、また、市販されているものもある。ウェスタンプロット法で測定する場合に は、抗体は、 1251標識プロテイン A、ペルォキシダーゼ結合 IgGなどを用いて二次的に 検出される。免疫組織ィ匕学分析法で測定する場合には、抗体は、蛍光色素、フェリ チン、酵素などで標識するとよい。
[0024] 特定の遺伝子の発現を RNAレベルで測定するためには、測定の対象となる遺伝子 の mRNAと特異的にハイブリダィズできる核酸プローブを用いるとよ!/ヽ（ノーザンブロッ ト法で測定する場合)。あるいはまた、測定の対象となる遺伝子の mRNAと特異的に ハイブリダィズできる核酸プライマー及び前記 mRNAを铸型として合成される cDNAと 特異的にハイブリダィズできる核酸プライマーカもなる 1対の核酸プライマーを用いて もよい (PCR法で測定する場合)。核酸プローブ及び核酸プライマーは、測定の対象 となる遺伝子の配列情報に基づいて設計することができる。核酸プローブは、通常、 約 15〜1500塩基のものが適当である。核酸プローブは、放射性元素、蛍光色素、 酵素などで標識するとよい。核酸プライマーは、通常、約 15〜30塩基のものが適当 である。
[0025] 本発明にお 、て、血液、肝癌細胞又は肝癌組織の 、ずれかにおける特定の遺伝 子発現の有無を検出してもよいし、発現量を測定してもよい。遺伝子発現の有無は、 所定の位置におけるスポットやバンドの出現の有無により確認できる。遺伝子の発現 量はスポットやバンドの染色強度により測定できる。あるいはまた、遺伝子発現産物 であるタンパク質及び Z又は遺伝子転写産物である mRNAを公知の方法で定量して もよい。複数の遺伝子発現や複数のタンパク発現を同時に検出するためには、 DNA アレイ（プローブを基板に固定）（NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUM E 1, DECEMBER 2002, 951-960)、プロテインチップ（抗体を基板に固定）（NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, SEPTEMBER 2002, 683- 695)、ノレミ ネックス（NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, JUNE 2002, 447-4 56)等の検出法を用いることが好ま U、。
[0026] 血液、肝癌細胞又は肝癌組織は判定の対象となる被験体に由来するものであると よぐ被験体の生物種としては、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、ィヌ、ゥシ、ゥサギ、ラ ット、マウスなどの哺乳動物を挙げることができる。
本発明の方法により、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測をする ためには、肝癌生検試料、あるいはそこから得られる培養肝癌細胞、培養肝癌組織、 血液などを用いることができる。肝癌生検試料としては、外科手術により摘出した腫 癌糸且織を挙げることができる。
本発明は、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測のためのキットも 提供する。本発明のキットは、肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違する 遺伝子の発現を測定することができる試薬を含む。
[0027] 一つの例として、本発明のキットは、肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が 相違する遺伝子の発現産物であるタンパク質を特異的に認識できる抗体を試薬とし て含む。肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違する遺伝子は、表 A、 B、 C又は Dのいずれかに列挙されている遺伝子の少なくとも 1つであることが好ましぐ 1 種でも複数種であってもよい。例えば、 CHM、 MSH6、 NCOA7、 CYP2E1、 TM4SF1、 F2RL1、 TRPM3、 AKR1C1、 F0XH1、 RAB40C, MGC27085, PPP1R3E、 USTゝ CANP 、 PRSS3、 UACA、 FOSL2、 PSPC1、 EXOSC6、 LOC388558、 RTTN、 FAM20Aゝ FGF1 8、 HOXA13、 F0LR1、 TMF1、 PCGF5、 GSTA1、 XRCC5、 MAP3K7IP2, RTN4、 BCD 02、 CDH22、 MYCNOS、 FMNL2、 PHEX、 WDR56、 HERC6、 SBN01、 FDFT1、 ZFR、 PF6、 PCOTH、 ZCCHC6、 HRMT1L1、 INHBC、 ATP8B3、 TALI, FGF1、 ADCY9、 C APS2、 ANXA2、 FLJ34077, AD7C— NTP、 GLRB、 MGAT2、 SASH1、 HIF1A、 LMTK3 、 EYA3、 IPP、 CAPN2、 GAFA1、 HELLS, NF1、 NUSAP1、 SESN3、 XRCC5などを例示 することができる。キットには、さらに、血液、肝癌細胞又は組織を採取するための器 具、肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違する遺伝子の発現産物である タンパク質を免疫化学的に検出するための試薬一式、取扱説明書などが含まれても よい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定 又は予後の予測基準なども記載しておくとよい。
別の一例として、本発明のキットは、肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が 相違する遺伝子の転写産物である mRNAと特異的にノ、イブリダィズできる核酸プロ一 ブを試薬として含む。肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違する遺伝子 は、表 A、 B、 C又は Dのいずれかに列挙されている遺伝子の少なくとも 1つであること が好ましぐ 1種でも複数種であってもよい。例えば、 CHM、 MSH6、 NCOA7、 CYP2E 1、 TM4SF1、 F2RL1、 TRPM3、 AKR1C1、 F0XH1、 RAB40C、 MGC27085, PPP1R3E、 USTゝ CANP、 PRSS3、 UACA、 FOSL2、 PSPC1、 EXOSC6、 LOC388558、 RTTN、 FAM 20Aゝ FGF18、 HOXA13、 F0LR1、 TMF1、 PCGF5、 GSTA1、 XRCC5、 MAP3K7IP2, R TN4、 BCD02、 CDH22、 MYCNOS、 FMNL2、 PHEX、 WDR56、 HERC6、 SBN01、 FD FT1、 ZFR、 PF6、 PCOTH、 ZCCHC6、 HRMT1L1、匪 BC、 ATP8B3、 TALI, FGF1、 ADCY9、 CAPS2、 ANXA2、 FLJ34077, AD7C— NTPゝ GLRB、 MGAT2、 SASH1、 HIF1 A、 LMTK3, EYA3、 IPP、 CAPN2、 GAFA1、 HELLS, NF1、 NUSAP1、 SESN3、 XRCC5 などを例示することができる。キットには、さらに、血液、肝癌細胞又は組織を採取す るための器具、採取した血液、肝癌細胞又は組織力ゝら RNAを抽出するための試薬類 、 RNAをノーザンプロット法で分析するための試薬類、取扱説明書などが含まれても よい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定 又は予後の予測基準なども記載しておくとよい。 [0029] さらに別の一例として、本発明のキットは、肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発 現が相違する遺伝子の転写産物である mRNAと特異的にハイブリダィズできる核酸プ ライマー及び前記 mRNAを铸型として合成される cDNAと特異的にハイブリダィズでき る核酸プライマーカ なる 1対の核酸プライマーを試薬として含む。肝癌細胞の SP画 分と Non-SP画分とで発現が相違する遺伝子は、表 A、 B、 C又は Dのいずれかに列 挙されている遺伝子の少なくとも 1つであることが好ましぐ 1種でも複数種であっても よい。例えば、 CHM、 MSH6、 NCOA7、 CYP2E1、 TM4SF1、 F2RL1、 TRPM3、 AKR1C 1、 F0XH1、 RAB40C、 MGC27085, PPP1R3E、 USTゝ CANP、 PRSS3、 UACA、 FOSL2 、 PSPC1、 EXOSC6、 LOC388558、 RTTN、 FAM20Aゝ FGF18、 HOXA13、 F0LR1、 T MF1、 PCGF5、 GSTA1、 XRCC5、 MAP3K7IP2, RTN4、 BCD02、 CDH22、 MYCNOS 、 FMNL2, PHEX、 WDR56、 HERC6、 SBN01、 FDFT1、 ZFR、 PF6、 PCOTH、 ZCCHC
6、 HRMT1L1、 INHBC、 ATP8B3、 TALI, FGF1、 ADCY9、 CAPS2、 ANXA2、 FLJ3407
7、 AD7C— NTPゝ GLRB、 MGAT2、 SASH1、 HIF1A、 LMTK3、 EYA3、 IPPゝ CAPN2、 G AFA1、 HELLS, NF1、 NUSAP1、 SESN3、 XRCC5などを例示することができる。キット には、さらに、血液、肝癌細胞又は組織を採取するための器具、採取した血液、肝癌 細胞又は組織力ゝら RNAを抽出するための試薬類、 RNAを RT- PCR法で分析するため の試薬類、取扱説明書などが含まれるとよい。取扱説明書には、キットの使用方法の 他、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測基準なども記載しておくと よい。
[0030] さらに、本発明は、血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝 子の発現を測定することを含む、肝癌幹細胞の検出方法を提供する。特定の遺伝子 は肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違するものである。肝癌細胞の SP 画分と Non-SP画分とで発現が相違するものは前述の通りである。
さらにまた、本発明は、血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の 遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌幹細胞と肝癌非幹細胞とを見分ける方法 を提供する。特定の遺伝子は肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違する ものである。肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違するものは前述の通り である。 [0031] 本発明は、二次移植をした場合に、腫瘍形成能を保持している肝癌細胞を提供す る。この細胞は肝癌幹細胞と考えられる。この細胞は、 side population細胞分離法に より、蛍光シグナルの弱い細胞集団を分離することにより、調製することができる。具 体的には、後述の実施例に記載のようにして、肝癌幹細胞を調製することができる。 簡単に説明すると、肝臓癌由来の細胞を Hoechst 33342とともにインキュベートした後 、濾過などの手法で単一の懸濁細胞を得る。細胞内に残存する Hoechst 33342を UV レーザーで 350 nmにて励起し、蛍光の発光を 405/BP30(Hoechst blue)及び 570/BP2 0(Hoechst red)光フィルターで測定する。 Hoechst 33342は、膜透過性の高い DNA結 合色素で、 UV励起により短波長の青色と長波長の赤色の蛍光を発する。力べして、 肝癌幹細胞は、蛍光シグナルの弱い細胞の亜集団として検出される。この亜集団は 、フローサイトメーターを用いたソーティングにより分取することができる。この亜集団 の細胞を免疫不全動物に移植し、形成された腫瘍を採取して、刻んだ後に、コラゲ ナーゼで消化してバラバラになった細胞を培養する。培養細胞を採取し、再度、 side population細胞分離法により、蛍光シグナルの弱い細胞集団を分離して、免疫不全 動物に移植すると、腫瘍が形成されうる。このような細胞を標的とする薬剤を開発する ことができれば、新規な抗癌剤として有効に利用できる。
[0032] 本発明は、二次移植をした場合に、腫瘍形成能を保持している肝癌細胞を用いて 、抗癌剤をスクリーニングする方法も提供する。
例えば、被験物質の存在下又は非存在下で、本発明の肝癌幹細胞を培養し、被 験物質の存在下で培養した細胞と被験物質の非存在下で培養した細胞の増殖率又 は生存率を比較するとよい。被験物質の非存在下で培養した細胞と比較して、被験 物質の存在下で培養した細胞の増殖率又は生存率が低下した場合には、その物質 は抗癌剤として有効であると考えられる。肝癌幹細胞の培養は、スクリーニングに適し たいかなる条件下で行ってもよい。細胞の生存率及び増殖率は、例えば、 MTT法 (C armichael et al.， Cancer Res. 47:936-942, 1987)などの手法で生細胞数を測定する こと〖こより、調べることができる。
[0033] あるいはまた、本発明の肝癌幹細胞を移植することにより腫瘍を形成した免疫不全 動物を用いて、被験物質の抗癌活性を調べてもよい。抗癌活性は、例えば、被験物 質を投与した動物とコントロール (被験物質を投与しない動物）との間で、腫瘍重量、 動物の生存率、生存日数などを比較することにより、評価することができる。コントロー ルと比較して、被験物質を投与した動物で、腫瘍重量の減少、動物の生存率の上昇 、生存日数の長期化が観察されれば、その物質は抗癌剤として有効であると考えら れる。
被験物質は、天然物又は合成品のいずれであってもよぐ具体的には、植物および 微生物由来の抽出物およびその精製品、低分子合成化合物、抗体、ペプチド、アブ タマ一、 siRNA、遺伝子治療に用いられる核酸、その修飾体や誘導体などを挙げるこ とがでさる。
実施例
[0034] 以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
〔実施例 1〕
材料及び方法
[0035] 細朐培着 ヒト肝臓癌細胞株 HepG2、 Huh6、 Huh7及び PLC/PRF/5をヒューマンサ ィエンス研究資源バンク (HSRRB, Osaka, Japan)から得た。これらの細胞を 10% FCS及 び 1%ペニシリン/ストレプトマイシン (Invitrogen)含有ダルベッコ変法イーグル培地 (DM EM)(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)で培養し、 37°Cで 5% COを含む培
2 養器中でインキュベートした。
[0036] フローサイトメトリーを用いた Side population分析 トリプシン- EDTA(Invitrogen)を用 いて皿から細胞を剥がし、 3% FCSと 10 mM Hepesを補充したハンクス平衡塩類溶液 中に lxlO6 cells/mlで懸濁させた。その後、これらの細胞を 37°Cで 90分間単独又は 50 μ Μのべラパミル (Sigma)の存在下で 20 μ g/mlの Hoechst 33342 (Sigma Chemical, St Louis, MO)とともにインキュベートした。インキュベーション後、 1 μ g/mlのヨウ化プロピ ジゥム (BD Pharmingen, San Diego, CA)を添カ卩し、その後、 40 μ mの cell strainer (BD Falcon)で濾過して、単一の懸濁細胞を得た。三重レーザーを保持する MoFlo(DakoC ytomation, Fort Collins, CO)を用いて、細胞分析及び精製を行った。 Hoechst 33342 を UVレーザーで 350 nmにて励起し、蛍光の発光を 405/BP30(Hoechst blue)及び 570 /BP20(Hoechst red)光フィルターで測定した。死細胞を判別するためにヨウ化プロピ ジゥム標識を 630/BP30フィルターを通して測定した。
[0037] 増殖アツセィ及びアポトーシス検出 ゥエル毎に SP細胞と Non-SP細胞 (5xl03)を 96ゥ エルマイクロプレートに分離し、 3(4,5-ジメチルチアゾール -2-ィル) -5-(3-カルボキシ メトキシフエ-ル)- 2-(4-スルホフエ-ル) -2H-テトラゾリゥム inner salt (MTS)アツセィを 行い、既報のように (24)各々三検体のサンプルで細胞生存率を調べた。製造者の説 明書 (Takara Bio Inc., Tokyo, Japan)に従い、 TUNELアツセィによりおのおの三検体 でアポトーシス細胞の定量を行った。ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼを用い 、フルォレツセインイソチオシァネート (FITC)で細胞を標識し、 DNAフリーの末端を抗 FITC西洋わさびペルォキシダーゼ及びジァミノべンジジンで染色した。 1 X 103個の 細胞をランダムに計測することにより、 TUNEL陽性細胞の比率を算出した。細胞ソー ティング後 24、 48及び 72時間目に MTS及び TUNELアツセィを行った。
[0038] 免疫細朐化学アツセィ ソーティングした SP細胞及び Non-SP細胞を 12時間培養し 、 PBS中で洗浄した。細胞をメタノールで- 20°Cにて 20分間固定し、 0.1% Tween 20 (W ako)を含有する PBSで洗浄した。 10%ャギ正常血清で 1時間ブロッキングした後、一次 抗体であるゥサギ抗 α - 1-フエトプロテイン (AFP)(DakoCytomation)及びマウス抗サイ トケラチン 19(CK19)(WakoCytomation)とともに湿室内で 4°Cにてー晚、固定細胞をィ ンキュペートした。 0.1% Tween 20を含有する PBS中でこれらの細胞を洗浄し、再度、 3 0分間ブロッキングを行い、 Alexa 555結合ャギ抗ゥサギ IgG(Molecular Probes, Eugen e, OR)及び Alexa 488結合ャギ抗マウス IgG(Molecular Probes)で室温にて 1時間処理 した。 PBS中で洗浄した後、 DAPI(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を含有する mounting mediumを細胞に乗せてカバーグラスをかけ、 Olympus 1X70顕微鏡下で観
¾πίした。
[0039] 非肥満糖尿病/重症複合免疫不全異種移植 NOD/SCIDマウスを Sankyo Laborat ory Co. Ltd. (Tsukuba, Japan)から購入した。 100- lxlO6個の種種の数の SP及び Non- SP細胞を 200 μ 1の DMEMとマトリゲル (BD)(1:1)中に懸濁し、ケタミンとキシラジンの力 クテルを用いた麻酔下で雄 NOD/SCIDマウス（6- 10週令）に移植した。 SP細胞と Non- SP細胞をぞれぞれ右と左の背中の皮下空間に注射した。腫瘍形成を毎週観察と触 診により 16週間モニターした。皮下腫瘍をホルマリン中で固定し、ノラフィンに包埋し た。切片を組織学的な分析のためにへマトキシリン-ェォシン染色した。次に、 SP由 来の腫瘍を除去し、氷上の無菌の PBS中で刻んだ。得られた腫瘍の小切片を 5 mg/ mlの Π型コラゲナーゼ (Sigma)含有 DMEM中に置き、 37°Cで 3時間消化した。洗浄と濾 過をした後、造血細胞や線維芽細胞のような非上皮細胞を除くために細胞を 7日間 培養した。採取した細胞をフローサイトメトリーで分析し、上述のように再度 NOD/SCI Dマウスに注射した。これらの実験は実験室動物の使用に関する施設ガイドラインに 従って行われた。
[0040] RNA柚出及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析 Isogen reagent(Nippon Gene, Toyama, Japan)を用い、製造者の説明書に従って、全 RNAを SP細胞と Non-SP細胞か ら別々に抽出した。 RNAの品質と濃度は NanoDrop(NanoDrop Technologies, Wilming ton, DE)及び Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)により測 定した。マイクロアレイ分析は標準プロトコル (Aifymetrix GeneChip Manual)に従って 行った。簡単に説明すると、 oligo(dT) -T7プライマーと Superscript kit(Invitrogen)を
24
用いて 1 μ gの全 RNAから第一及び第二の cDNAを生成した。その後、 Bioarray, High Yield RNA Transcript Labeling Kit(Enzo Diagonostics, Farmingdale, NY)を用 ヽて、 ピオチン標識した cRNAを合成した。精製と断片化を行った後、 15 gの cRNAを Huma n Genome U133A Plus 2.0 Arrays(Afiymetrix, Santa Clara, CA)にハイブリダィズさせ た。このアレイは、 38,500個の特徴付けされた遺伝子を含む、 47,000個以上の遺伝 子転写物を提示する。増幅を行い、ストレプトアビジン結合フィコエリトリン蛍光を通し てハイブリダィズシグナルを検出した後、 GeneChip Scanner 3000(Aifymetrix)を用い て、アレイ画像をスキャンした。得られたデータを GeneChip Operating Softwareで分 祈した。完全マッチ及びミスマッチプローブ対を用いて、検出 P値を算出し、各プロ一 ブを absent(A)、 marginal(M)又は present(P) callとして割り当てた。 SP細胞及び対応す る Non-SP細胞の両方において A callとスコア付けされたプローブを以下の分析から 排除した。実験の標準化後、 GeneSpring system(Agilent Technologies)を用いて、 fold change測定とカテゴリー化を含むデータマイニングを行った。
[0041] 定量的リアルタイム逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応 増幅グレードの DNase I(lnv itrogen)で前処理を行った後、 first-strand superscript(Invitrogen)を用いて逆 fe (R T) 行った。 ABI PRISM 7000 sequence Detection System(Applied Biosystem, Foste r City, CA, USA)を用い、 TaqMan技術でポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を行った。 ITGB 1, FMN2, ABCF2, USP9X, ZFX, TXNL, WTAP, ELAVL4, AF5Q31, ADARB1, FZD 7, ABCB1, STATIP1, GCLM, XRCC5及び j8 - actin (assay IDは、それぞれ、 Hs0023 6976— ml, Hs00298949_ml, Hs00255026_ml, Hs00245009_ml, Hs00268739_ml, HsO 0169455— ml, Hs00191727_ml, Hs00222634_ml, Hs00232683_ml, Hs00210562_ml, Hs00275833_sl, Hs00184500— ml, Hs00217448_ml, Hs00157694_ml, Hs00221707_m 1及び Hs99999903_ml; Applied Biosystems)用の遺伝子発現アツセィプライマー及 びプローブ混合物を用いた。 95°Cで 15分間、 60°Cで 1分間の 45サイクルを用い、おの おの三検体を用いて、 thermal cyclingを行った。 j8 -actinを標準化のために用いた。 製造者が記述しているような comparative cycle threshold (C )を用いて、相対的な定
T
量を行った。
[0042] 統計分析 データは平均値士 SEMで表す。 Mann-Whitney U検定を用いて、 2群間 の統計差を分析した。 P値が 0.05より小さければ、有意差があると見なした。
[0043] 結果
肝癌細胞における Side DODulationの枪出 Hoechst 33342染色によるフローサイトメ トリー分析により、 Huh7及び PLC/PRF/5細胞力 それぞれ、 0.25%及び 0.80%の SPサ ブ集団を含むことが示された。これらの SP細胞は Hoechst 33342とカルシウムチャンネ ルブロッカーであるべラバミルの存在下で実際に減少した。一方、 Huh6及び HepG2 細胞では SP細胞が検出されなカゝつた。 Huh7及び PLC/PRF/5細胞中の SP細胞及び N on-SP細胞を別々にソーティングし、さらなる実験に用いた (図 1)。形態学的には SP細 胞と Non-SP細胞に顕著な差はなかった。
[0044] 増殖活性及びアポトーシス耐性 SP細胞及び Non-SP細胞の in vitro増殖活性の差 を調べるために、 MTSアツセィを用いて生細胞数を測定した。 Huh細胞 (図 2A)及び PL C/PRF/5細胞 (図 2B)にお!/、ては、 SP細胞の細胞可変性は一貫して Non-SP細胞より 高かった。 PLC/PRF/5細胞の 72時間培養物中の SP細胞は Non-SP細胞より有意に (p < 0.05)高!、細胞生存率を示した。 SP細胞及び Non-SP細胞のアポトーシス感受性の 差を TUNELアツセィで調べた。 Huh7及び PLC/PRF/5細胞において、 SP細胞におけ る TUNEL陽性細胞の百分率は Non-SP細胞より低かった (Huh7細胞 (図 2C)、 PLC/PR F/5細胞 (図 2D))。 24時間及び 72時間培養物中の Huh 7 SP細胞における TUNEL陽 性と、 72時間培養物中の PLC/PRF/5 SP細胞における TUNEL陽性とは、 Non- SP細 胞のそれと比較して統計的有意差 (pく 0.05)を示した。
[0045] 系譜マーカー発現の分析 デュアル免疫細胞化学分析を行い、 SP細胞と Non-SP 細胞の分化ポテンシャルを比較した (図 3A_D)。 Huh7及び PLC/PRF/5細胞は、肝細 胞特異的マーカーである aフエトプロテイン (AFP)と胆管細胞特異的マーカーである サイトケラチン 19(CK19)の両方でマーキングされた多数の細胞を含んで!/、た。 Huh7 及び PLC/PRF/5細胞において、 AFP及び CK19の両方に対して陽性の細胞の百分 率は、それぞれ、 68.2%及び 55.0%であった。一方で、大多数の Non-SP Huh7及び PL C/PRF/5細胞は AFP又は CK19のいずれかで標識された。 Huh7及び PLC/PRF/5 No n-SP細胞において、ただ一つのマーカーのみを発現した細胞の百分率は、それぞ れ、 74.4%及び 79.6%であった。これらの細胞株において、 AFPでも CK19でもマーキン グされなかった少数の細胞がこれらの細胞株の SP細胞にも Non-SP細胞にも同様に 存在した。
[0046] Side Population移植により引き走 3こされた腈瘍惹起 腫瘍形成活性が SP細胞と Non -SP細胞とで異なるカゝ否かと ヽぅ問題を検証するために、 Huh7及び PLC/PRF/5細胞 における種種の数の SP細胞及び Non-SP細胞を NOD/SCIDマウスに注射した (図 4a)。 皮下腫瘍形成には、少なくとも lxlO6個のソーティングされていない Huh7及び PLC/P RF/5細胞の注射が必要であった。 Huh7及び PLC/PRF/5 SP細胞では、それぞれ、 1 xlO3個程度の少量の細胞注射で、それぞれ、 9匹中 8匹、 8匹中 8匹のマウスに腫瘍を 惹起した（表 1)。しかしながら、 Huh7及び PLC/PRF/5細胞における lxlO6個の Non-S P細胞を注射しても、一貫してすべてのマウスに腫瘍が形成されなかった。これらの S Pサブ集団は腫瘍形成細胞に対して少なくとも 1 ,000倍濃縮されて 、る。 Huh7及び PL C/PRF/5 SP細胞起源の腫瘍を組織学的に分析したところ、ソーティングされていな い細胞の注射により形成された腫瘍と同様の特徴を示した（図 4b, 4c) o
[表 33] 表 1. NOD/SCID異種移植片アツセィにおける SP細胞の腫瘍形成性
注射した細胞数
100 lxlO3 lxlO4 lxlO5 lxlO6 lxlO7
Huh7
ソーティングしていない細胞 0/5 5/5 5/5
SP細胞 0/5 8/9 8/8 8/8
Non-SP細胞 0/5 0/5 0/8 0/8 0/8
PLC/PRF/5
ソーティングしていない細胞 0/5 0/5 5/5 5/5
SP細胞 0/5 8/8 8/9a 8/8
Non-SP細胞 0/5 0/5 0/9 0/8 0/8
SP及び Non-SP細胞を別々に分離して、 NOD/SCIDマウスの皮ド空間に注射した。 注射後 16週間、 腫瘍形成を観察した。
a注射後 4週目に、 1匹のマウスが病気になり、 腫瘍を形成する前に死亡した。 Side Population由来の腫瘍の再分析及び連続的な移植 SP細胞が自己複製し、 in vivoで非対称的な細胞分裂により非腫瘍形成性の Non-SP細胞を生成するか否かを 解明するために、 SP由来の皮下腫瘍のフローサイトメトリー分析を行った。 SP分析に より、 Huh7及び PLC/PRF/5細胞は、それぞれ、 0.34%及び 0.90%の SPサブ集団を含む ことが示された（図 5)。これらの分析パターンは、以前に分離した HCC細胞のそれに 似ていた。 Huh7及び PLC/PRF/5細胞は、 4週間の培養後に SP細胞と Non-SP細胞の 両方を生成した（データは示さず）。続いて、 NOD/SCIDマウスへの SP細胞と Non-SP 細胞の二次移植を行った (表 2)。 Non-SP細胞を注射しても新 ヽ腫瘍は形成されな かったが、両細胞株中の lxlO3個程度の少数の SP細胞が 5匹の NOD/SCIDマウス中 4 匹に腫瘍を形成した。
[表 34] 表 2.連続的な移植において再度ソーティングされた SP細胞の腫瘍形成性
注射した細胞数
100 lxlO3 lxlO5
Huh7
SP細胞 0/5 5/5 5/5 4/5
Non-SP細胞 0/5 0/5 0/5 0/5
PLC/PRF/5
SP細胞 0/4 4/5 4/4 5/5
NoiHSP細胞 0/5 0/5 0/4 0/5
消化した SP由来の腫瘍から SP及び Non-SP細胞を別々に分離し、 NOD/SCIDマウスに注 射した。 移植及び腫瘍形成の観察を最初の移植と同様に行った。
マイクロアレイ分析に某づく遣伝子発現プロファイル SP細胞と Non-SP細胞との遺 伝子発現プロファイルの違いを明らかにするために、 oマイクロアレイ分析を行った。全 部で、！¾117細胞中の26,764個のプローブ及び131^：/?1^/5細胞中の25,755個のプロ ーブを上述の callアルゴリズムに従って分析した。対応する Non-SP細胞と比較して、 Huh7及び PLC/PRF/5 SP細胞中でアップレギュレートされた（比〉 2.0)遺伝子の数 は、それぞれ、 1,015個及び 1,542個であった。利用可能のウェブサイトを用いて、これ らの遺伝子を以下のように機能的にカテゴリー化した。 Gene Ontology (http：〃 www.g eneontology.org)及 Ό、 Geneし ards (http://thr.cit. nin. gov/carasハ ndex.shtml)。 Huh7 及び PLC/PRF/5 SP細胞にぉ 、てアップレギュレーションを示した遺伝子（特徴付け されている）の百分率は、それぞれ、 43.3%(440/1,015)及び 51.2%(789/1,542)であつ た。これらの遺伝子はその機能に従って以下の 11群にカテゴリー化された。転写調 節 (Transcriptional regulation)^核酸結合 (Nucleic acid binding)^シグナノレ 達 (Signal ing)、輸送 (Transport)、代謝 (Metabolism)、タンパク質合成 (Protein synthesis),ュビキ チン化/タンパク質分解 (Ubiquitination/Proteolysis)、受容体活性 (Receptor activity) 、アポトーシス/細胞周期 (Apoptosis/Cell cycle),細胞骨格/膜 (Cytoskeleton/Membr ane)、及びその他 (Others)である（図 6A)。これらの遺伝子の約 1/3が「転写調節」及 び「核酸結合」群にカテゴリー化された。 62個のアップレギュレートされた遺伝子が両 方の細胞株に共通に見出された (表 3)。一方、 940個及び 941個の遺伝子が、それぞ れ、 Huh7及び PLC/PRF/5 SP細胞においてダウンレギユレギユーシヨンを示し（比く 0 .5)、 51個の遺伝子が両細胞株で重複した。
[0049] 次に、 SP細胞においてアップレギュレートした遺伝子のプロフアイリングをいわゆる「 幹細胞性遺伝子」の以前のマイクロアレイに基づくプロフアイリングと比較した。「幹細 胞性遺伝子」は幹細胞 (胚性幹細胞 (ESC)、神経幹細胞 (NSC)及び造血性幹細胞 (H SC))に共通に発現している (25, 26)。利用可能なウェブサイトを用いてこれらのプロフ アイリングデータをヒト相同体に変換し、本発明者らの現在のデータと比較した（図 6B 、表 4)。その結果、 Huh7 SP細胞における ITGB1, USP9X及び ZFX、 PLC/PRF/5 SP 細胞における TXNL, WTAP, ABCBl, STATIPl及び GCLMを含む 5個の遺伝子が、 R amalho-Santosらが報告した (25)幹細胞性の遺伝子の発現プロフアイリングと一致した 。さらに、 Huh7 SP細胞と PLC/PRF/5 SP細胞の両方で XRCC5がアップレギュレートし ていることが示された。 Huh7 SP細胞における FMN2及び ABCF2、 PLC/PRF/5 SP細 胞における AF5Q31, ADARB1, ELAVL4及び FZD7を含む 4個の遺伝子が、 Ivanova らにより示された幹細胞性遺伝子プロフアイリング (26)に含まれていた。
[0050] [表 35]
表 3. Huh7及ぴ PLC/PRF/5 SP細胞の両方でアップレギュレートした 02. 0)遺伝子
Gene Symbol Gene Name Fold Change Probe Set Unigene
Huh7 PLC/PRF/5
Transcriptional regulation
FOXH1 Forkhead box HI 3.75 3.035 231407— s_at Hs.449410
PPP1R3E Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 3E 2.76 2.249 227412— at Hs.39911
ID4a Inhibitor of DNA binding 4, dominant negative helix-loop-helix protein 2.725 2.076 229386_at Hs.391392
FOSL2a FOS ike antigen 2 2.551 2.891 228188_at Hs.301612
HOXA13b Homeo box A13 2.352 2.649 238808_at Hs.414467
TMF1 TATA element modulatory factor 1 2.321 2.291 242243_at Hs.267632
TCERG1 Transcription elongation regulator 1 2.218 3.566 229706_at Hs.300052
PF6 Projection protein PF6 2.016 2.089 1557593— at Hs.442001
Nucleic acid bin ding
MSH6a MutS homolog 6 (E. coli) 14.15 17.74 211449_at Hs.445052
HIST1H2AK Histone 1, H2ak 10.66 4.462 23904 l_at Hs.131954
HELZ Helicase with zinc finger domain 2.65 2.013 240486_at Hs .99437
EXOSC6 Homolog of yeast mRNA transport regulator 3 2.493 2.574 1553947_at Hs .432795
ZNF600 Zinc finger protein 600 2.467 11.97 1554476— x_at Hs.166312
X CC53 Xィ ay repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 5 2.279 2.027 233007— at Hs.257082
SBNOl Sno, strawberry notch homolog 1 (Drosophila) 2.099 2.86 216161— at Hs.306665
Signaling
RAB40C RAB40C, member RAS oncogene family 3.746 2.363 1569396_at Hs.31408
FGF18a Fibroblast growth factor 18 2.358 6.124 231382_at Hs.87191
MAP3K7IP2 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7 interacting protein '. 2.249 14.55 243557_at Hs.269775
Transport
CH Choroideremia (Rab escort protein 1) 48.85 2.973 1569183_a_at Hs.416244
CYP2Ela b Cytochrome P450, family 2, subfamily E, polypeptide 1 9.321 3.186 1431一 at Hs.12907
Metabolism
GSTAla Glutathione S -transferase A 1 2.299 14.78 215766— at Hs.446309
BCD02 Beta-carotene dioxygenase 2 2.197 3.096 232449_at Hs.558563
KIAA1463 KIA A 1463 protein 2.147 2.407 242970— at Hs.21104
Protein synthesis
UST Uronyl-2-sulfotransferase 2.679 2.125 205139_s_at Hs.131514
Ubiquitinatioii/Proteolysis
LOC51136 PTD016 protein 5.584 3.012 221195— at Hs.30154
PCGF5 Polycomb group ring finger 5 2.303 2.45 235331— x— at Hs.246914
WDR56 WD repeat domain 56 2.118 21.29 1564231— at Hs.186547
Receptor activity
NCOA7 Nuclear receptor coactivator 7 13.42 2.096 1568805_at Hs.292676
F2RLla Coagulation factor II (thrombin) receptoHike 1 5.705 2.594 206429_at Hs.154299
TRPM3 Transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 3 4.269 6.918 211422— at Hs.288911
FOLRl3 Folate receptor 1 (adult) 2.325 6.516 204437_s_at Hs .73769
Apoptosis/Cell cycle
RTN4a Reticulon 4 2.225 2.058 1556049_at Hs.436349
Cytoskeleton/Membrane
TM4SF13 Transmembrane 4 L six family member 1 5.922 4.696 238168 at Hs.351316
¾S3 CDH22 Cadherin4ike 22 2.188 2.416 1569679— at Hs.382126
Others
AKR1C13 Aldo^ceto reductase famil 1， member CI 4.254 2.565 1562102_at Hs.295131
CANP Cancer-associated nucleoprotein 2.671 44.05 1557129一 a—at Hs.186579
PRSS3a Protease, serine, 3 (mesotrypsin) 2.64 5.1 213421_x_at Hs.435699
RTTN Rotatin 2.407 3.023 1557388_at Hs.31931
MYCNOS; v-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (avian) 2.186 18.63 216188_at Hs.103989
PHEX Phosphate regulating endopeptidase homolog, X4inked 2.125 13.3 210617一 at Hs.72874
Unknown
ESTs 38.24 9.57 1564257_at Hs.523133
ESTs 30.1 49.67 237112_at
ESTs 20.73 31.93 1553652_a_at Hs.208701
ESTs 7.58 3.867 1561989_at
ESTs 5.997 8.968 1562472_at Hs.376697
ESTs 3.035 2.676 242518_at
ESTs 2.997 48.78 236654_s_at Hs.120277
ESTs 2.65 4.122 1559126_at Hs.434251
ESTs 2.61 41.69 238868— at Hs.528735
ESTs 2.546 17.52 243997_x_at Hs.213198
ESTs 2.467 8.547 241559_at Hs.359534
ESTs 2.396 3.148 243221— at Hs.115930
ESTs 2.329 2.286 238485_at Hs.61205
ESTs 2.315 3.259 231909 x at Hs.435537
ESTs 2.287 6.153 1564444_at Hs.516912
ESTs 2.278 2.306 1554712— a— at Hs.254271
ESTs 2.252 5.708 215372— x— at Hs.116678
ESTs 2.134 2.372 215062— at Hs.284257
ESTs 2.115 3.972 239988— at Hs.105713
ESTs 2.095 2.016 239358— at Hs.94151
ESTs 2.05 2.027 238970一 at
ESTs 2.019 5.258 1559479— at Hs.529653
a 以前に非肝起源の癌に関与すると報告されている。
b以前に HCCに関与すると報告されている。
EST, 発現配列タグ。
S¾3 o
Figure imgf000063_0001
9X及び ZFXを含む 6個の遺伝子の mRNAの発現を定量的リアルタイム RT-PCRにより 分析した。 PLC/PRF/5 SP細胞及び Non-SP細胞における、 10個の遺伝子、すなわ ち、 TXNL, WTAP, ELAVL4, XRCC5, AF5Q31, ADARB1, FZD7, ABCB1, STATIP1 及び GCLMも調べた。リアルタイム RT-PCR〖こより、これら 16個の遺伝子は、 Non-SP 細胞より SP細胞で mRNAの発現レベルが高!、ことが示され、このことはマイクロアレイ データと非常によく一致した（図 6C)。
[0052] 考察
広範に増殖し、自己複製し、分ィ匕する能力は、幹細胞に最も特徴的な性質である。 本研究では、 HCC細胞カゝら精製した SPサブ集団が培養物中及び異種移植片アツセ ィ中で幹細胞様の性質を有するか否かを評価した。全細胞の 1%以下の割合を占める SPサブ集団が Huh7及び PLC/PRF/5細胞において検出できた。しかしながら、 HepG 2及び Huh6細胞にはこのようなサブ集団は見られなかった。 HepG2及び Huh6細胞は 、 Hoechst色素の用量を増やして染色したときもフローサイトメトリー分析パターンの変 化をほとんど示さな力つた。高 、排出能力に基づ 、て幹細胞様サブ集団を検出する ことは必ずしも有効ではないの力もしれない。なぜならば、このようなサブ集団は検討 した癌細胞株の 30%以下でし力検出されなかったことが実証されているからである (27)
[0053] 最初に、本発明者らは、培養系で Huh7及び PLC/PRF/5細胞における SP細胞が対 応する Non-SP細胞より高い増殖能力を有することを示した。この能力はアポトーシス に対する耐性を伴って 、た。種種の組織起源の正常な幹/先駆細胞は Be卜 2のような 抗アポトーシス性タンパク質を高レベルで発現することが報告されている (28, 29)。ま とめると、抗アポトーシス作用は、本質的に、消耗の心配から正常及び癌幹細胞の両 方において用意された機構である。
[0054] 次に、本発明者らは、 NOD/SCIDマウス異種移植アツセィにおける SP細胞の腫瘍 形成ポテンシャル及び自己複製能を検討した。 Huh7及び PLC/PRF/5細胞から精製 した lxlO3個の SP細胞を注射すると、腫瘍を発生させることができた。し力しながら、癌 細胞の大多数を構成する Non-SP細胞は、注射する細胞の数を増加させたにもかか わらず、腫瘍を形成することができな力つた。 SP表現型のさらなるマーカーは、乳癌 における CD44+CD24-/low ESA+細胞 (12)のような癌幹細胞の濃縮を促進するの力も しれない。これらの結果は、 SPサブ集団だけが腫瘍惹起能力を有し、機能的及び表 現型の不均一性 (heterogeneity)が HCC細胞株に存在することを示して!/、る。 4週間の 培養物中の SP細胞のこれらの分析により、 SP細胞と Non-SP細胞の両方の存在が示 された。さらに、 SP由来の腫瘍も SP細胞と Non-SP細胞を生成し、このことは SP細胞の 自己複製と分ィ匕の両方の能力を示している。 SP由来の腫瘍における SP細胞と Non-S P細胞の割合は、 Huh7及び PLC/PRF/5細胞の両方における以前に分離された細胞 のそれに類似していた。 SP細胞と Non-SP細胞の割合は、 in vitro及び in vivoで密接 に調節され、維持されていると思われる。さらに、 SP細胞を二次移植しても腫瘍が形 成され、腫瘍形成能力は連続的な移植においてよく保持されているようである。
[0055] Huh7及び PLC/PRF/5細胞はどちらも AFPを産生し、 CK19陽性の細胞株であること 力 く知られている (30, 31)。形質転換した細胞は通常その起源力も分ィ匕ポテンシャ ルを引き継ぐと考えられている。例えば、コンデショナルなトランスジエニックモデルに おける MYC不活性ィ匕は、幹細胞の性質を有するいくつかの肝腫瘍細胞を導き、正常 な肝細胞及び胆管細胞系譜に分化する (32)。外科的検体の分析により、胆汁マーカ 一陽性の HCCが示され、このことは、少なくとも HCCのあるものは二分ィ匕性の幹/前 駆的性質を有するサブ集団力 生じて 、る可能性を示して 、る (33)。免疫細胞化学 的分析から、 SP細胞と Non-SP細胞との間にマーカー発現の不均衡があることが明白 になった。 AFPと CK19の両方を発現する細胞がこれらの SP細胞において高度に濃 縮された一方で、大半の Non-SP細胞力 SAFP又は CK19の!、ずれかに対して陽性であ つた。仮想の肝幹/前駆体と考えられて ヽる卵細胞又は肝芽腫 (34)の二分ィ匕能を考 慮すると、 SPサブ集団は HCC細胞の上流の階層内に存在し、適当な培養条件下で 肝細胞及び胆管細胞に分化する潜在能力を保持している。
[0056] オリゴヌクレオチドアレイを用いた網羅的ゲノムスクリーニングにより、 Huh7及び PLC /PRF/5細胞における SP細胞と Non-SP細胞との間で遺伝子発現プロフアイリングが異 なっていることが明らかになった。これらの SP細胞中の千個の遺伝子の 2つ組が遺伝 子発現の変動を示したが、このことは、遺伝子的観点からは HCC細胞が明らかに不 均一であることを示している。 Huh7及び PLC/PRF/5 SP細胞の両方において、アップ レギュレートした 62個の遺伝子のうち、 HOXA13及び CYP2E1遺伝子だけが HCCに含 まれることが以前に実証されている (35, 36)。 SP細胞は、大部分の HCC細胞株 (30, 36 )及び外科的試料 (37, 38)と比較して、全く異なる mRNA発現パターンを示すことを強 調すべきである。
[0057] 次に、本発明者らは、 SP細胞においてアップレギュレートしている遺伝子のサブセ ットを示すデータを 、わゆる「幹細胞性遺伝子」のプロフアイリング (25, 26)と比較した 。これらの遺伝子は、幹細胞における機能的及び表現型の性質を維持するのに非常 に重要であると考えられる。この分析において、 Huh7 SP細胞においてアップレギユレ ートした 6個の遺伝子及び PLC/PRF/5 SP細胞にお!、てアップレギュレートした 10個 の遺伝子は、以前のマイクロアレイ研究で実証された「幹細胞性遺伝子」と重複して いた。 Huh7 SP細胞においてアップレギュレートした ITGB1(CD29)は肝臓における幹 細胞マーカーの一つであると認められる。 ITGB1に対するモノクローナル抗体はしば しばフローサイトメトリーを用いる肝幹細胞の分離に利用される (39)。 PLC/PRF/5 SP 細胞にぉ 、てアップレギュレートした FZD7は、 Wntシグナル伝達経路の受容体の一 つであり、これは幹細胞の自己複製の調節と密接に関連がある。さらに、 WNT5A, W NT6, CTNNB1及び JUNは Wnt経路の重要な構成要素であるが、これも PLC/PRF/5 SP細胞にぉ 、てアップレギュレートして 、る。調節不全になった Wnt経路は時折腫瘍 細胞の広範な増殖を許し (40)、 FZD7の癌化の役割はすでに HCCにお 、て報告され ている (41)。まとめると、これらの結果は、これらの遺伝子が、肝臓の正常幹細胞及び 癌幹細胞の両方の維持に深く関与して 、ることを示して 、るの力もしれな 、。今後、 これらの遺伝子発現が、 SP細胞における腫瘍形成を含む癌幹細胞様の性質の決定 に重篤に関与する力否かを調べた方がよいであろう。
[0058] SP細胞の著しい減少力ABCG2/BCRP1ヌルマウスの骨髄で観察されたので、 SP表 現型は ABCG2/BCRP1により決定されると報告されている (42, 43)。しかしながら、 AB CBl(MDRl)のような他の ABCトランスポーターが同様に表現型に関係しているか否 かは議論の余地がある (44)。本発明者らのマイクロアレイ分析によると、 Huh7 SP細胞 における ABCG1及び ABCF2、 PLC/PRF/5 SP細胞における ABCB2、 ABCC7、 ABC A5及び ABCB1はアップレギュレートしている力 どちらの SP細胞においても ABCG2/ BCRP1はアップレギュレートしていないことが示された。また、 ABCA3は、神経芽細胞 腫 SP細胞において Non-SP細胞より高度に発現していることが実証された (45)。まとめ ると、正常細胞と形質転換細胞との間では、 Hoechst色素を排出する別の機構が作 動して!/、るの力もしれな!、。
[0059] 結論として、本発明者らは、 Huh7及び PLC/PRF/5細胞における SP細胞ソーティン グを用いて腫瘍形成性のサブ集団を定義することができた。これらのデータは、 HCC 細胞株の癌幹細胞を起点とする明確な階層性により特徴付けられる不均一性を示す 。最近の癌研究及び治療様式の大半は、比較的同種の細胞力 なる塊として癌を考 えているように思われるが、腫瘍の不均一性を認識し、癌幹細胞を標的とする治療方 法を探索する必要がある。 SPサブ集団が培養物中で抗癌剤に対して低い感受性を 示したことが実証されている (45, 46)。原発の HCC試料において、幹細胞様の性質を 持つ細胞を同定し、特徴付けするためのさらなる研究は、新規な治療戦略の確立に 貢献するであろう。
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本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性 肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違する遺伝子を見出した。これらの 遺伝子をマーカーとして利用することにより、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又 は予後の予測をすることができる。
また、本発明により得られた肝癌幹細胞は、この細胞を標的とする抗癌剤の開発に 禾 IJ用することがでさる。

Claims

請求の範囲
[1] 血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定する ことを含む、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測方法であって、前 記特定の遺伝子は肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違するものである j記方法。
[2] 特定の遺伝子が、表 A、 B、 C又は Dのいずれかに列挙されている遺伝子の少なくと も 1つである請求項 1記載の方法。
[3] 表 A及び Z又は Cに列挙されている遺伝子の少なくとも 1つの発現が上昇している場 合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは 再発のリスクが高いと予測する請求項 2記載の方法。
[4] 表 B及び Z又は Dに列挙されている遺伝子の少なくとも 1つの発現が低下している場 合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは 再発のリスクが高いと予測する請求項 2記載の方法。
[5] 特定の遺伝子が、 CHM、 MSH6、 NCOA7、 CYP2E1、 TM4SF1、 F2RL1、 TRPM3、 AK R1C1、 FOXHl、 RAB40C, MGC27085, PPP1R3E、 USTゝ CANP、 PRSS3、 UACA、 FO SL2、 PSPC1、 EXOSC6、 LOC388558、 RTTN、 FAM20Aゝ FGF18、 HOXA13、 FOLR1 、 TMF1、 PCGF5、 GSTA1、 XRCC5、 MAP3K7IP2, RTN4、 BCD02、 CDH22、 MYCN OS、 FMNL2、 PHEX、 WDR56、 HERC6、 SBN01、 FDFT1、 ZFR及び PF6からなる群並 びに PCOTH、 ZCCHC6、 HRMT1L1、 INHBC、 ATP8B3、 TALI, FGF1、 ADCY9、 CA PS2、 ANXA2、 FLJ34077, AD7C— NTPゝ GLRB、 MGAT2、 SASH1、 HIF1A、 LMTK3、 E YA3、 IPP、 CAPN2、 GAFA1、 HELLS, NF1、 NUSAP1及び SESN3からなる群より選択 される少なくとも 1つの遺伝子である請求項 1記載の方法。
[6] CHM、 MSH6、 NCOA7、 CYP2E1、 TM4SF1、 F2RL1、 TRPM3、 AKR1C1、 F0XH1、 R AB40C、 MGC27085, PPP1R3E、 USTゝ CANP、 PRSS3、 UACA、 FOSL2、 PSPC1、 EX OSC6、 LOC388558、 RTTN、 FAM20Aゝ FGF18、 HOXA13、 F0LR1、 TMF1、 PCGF5 、 GSTA1、 XRCC5、 MAP3K7IP2, RTN4、 BCD02、 CDH22、 MYCNOS、 FMNL2、 PH EX、 WDR56、 HERC6、 SBN01、 FDFT1、 ZFR及び PF6からなる群から選択される少な くとも 1つの遺伝子の発現が上昇している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾患が 進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する請求項 5 記載の方法。
[7] PCOTH、 ZCCHC6、 HRMT1L1、 INHBC、 ATP8B3、 TALI, FGF1、 ADCY9、 CAPS2、 ANXA2、 FLJ34077, AD7C— NTPゝ GLRB、 MGAT2、 SASH1、 HIF1A、 LMTK3、 EYA3 、 IPP、 CAPN2、 GAFA1、 HELLS, NF1、 NUSAP1及び SESN3からなる群より選択され る少なくとも 1つの遺伝子の発現が低下している場合に、肝臓癌の悪性度が高い、疾 患が進行している、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する請求 項 5記載の方法。
[8] 特定の遺伝子が、 XRCC5である請求項 1記載の方法。
[9] XRCC5の発現が上昇して 、る場合に、肝臓癌の悪性度が高 、、疾患が進行して ヽ る、患者の予後が悪い、あるいは再発のリスクが高いと予測する請求項 8記載の方法
[10] 特定の遺伝子の発現をタンパク質レベルで測定する請求項 1〜9のいずれかに記載 の方法。
[11] 特定の遺伝子の発現を RNAレベルで測定する請求項 1〜9のいずれかに記載の方 法。
[12] 肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違する遺伝子の発現を測定すること ができる試薬を含む、肝臓癌の鑑別、疾患ステージの判定又は予後の予測のための やット。
[13] 血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定する ことを含む、肝癌幹細胞の検出方法であって、前記特定の遺伝子は肝癌細胞の SP 画分と Non-SP画分とで発現が相違するものである前記方法。
[14] 血液、肝癌細胞又は肝癌組織のいずれかにおける特定の遺伝子の発現を測定する ことを含む、肝癌幹細胞と肝癌非幹細胞とを見分ける方法であって、前記特定の遺 伝子は肝癌細胞の SP画分と Non-SP画分とで発現が相違するものである前記方法。
[15] 二次移植をした場合に、腫瘍形成能を保持して ヽる肝癌細胞。
[16] side population細胞分離法により、蛍光シグナルの弱!ヽ細胞集団を分離することを含 む、請求項 15記載の肝癌細胞の調製方法。 [17] 請求項 15記載の肝癌細胞を用いて、抗癌剤をスクリーニングする方法。
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