KR102338677B1

KR102338677B1 - 간 이식 처방 환자의 간암 재발 예측 마커 및 이의 용도

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Publication number: KR102338677B1
Application number: KR1020190054157A
Authority: KR
Inventors: 남진우; 윤상호
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2021-12-10
Also published as: KR20200129562A

Abstract

본 발명은 간암 환자의 간암 재발 예후 예측용 마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로 간 이식 수술 환자 또는 예비 간 이식 수술 환자군에서 나타나는 염증 반응과 염증 반응을 억제하기 위한 면역조절세포의 양과 관련된 RNA 마커를 간암 재발 예후 예측용 마커로 사용하는 것에 관한 것이다.
본 발명자들은 간 이식 수술을 처방 받은 환자에서 간암 재발과 관련된 유전자의 발현 패턴의 변화를 발견하고, 상기 유전자가 간암 재발 예후 예측 마커가 될 수 있음을 규명하였는바, 본 발명에 따른 마커는 간 이식을 처방 받은 간암 환자의 간암 재발 여부를 예측하여 이들의 관리 및 치료에 도움을 줄 것으로 기대된다.

Description

간 이식 처방 환자의 간암 재발 예측 마커 및 이의 용도{Marker predicting liver cancer recurrence in patients with liver transplantation prescription and uses thereof}

본 발명은 간암 환자의 간암 재발 예후 예측용 마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로 간 이식 수술 환자 또는 간 이식 수술 예비 환자군에서 나타나는 염증 반응과 염증 반응을 억제하기 위한 면역조절세포의 양과 관련된 RNA 마커를 간암 재발 예후 예측용 마커로 사용하는 것에 관한 것이다.

간암은 간에서 발생하는 종양으로, 간암 환자의 80 ~ 90 %는 만성 B형 간염 보유자 또는 만성 C형 간염 보유자이다. 우리나라에서 간암 발생률은 중장년 10만 명을 조사한 결과, 전체 암 사망자 중 사망자의 수가 두 번째로 많은 암이며, 연간 10만 명당 사망률이 24.1명으로 알려져 있다.

한편, 간암의 치료 방법으로는 간 이식, 간 절제술, 경동맥 화학 색전술, 고주파 열 치료법, 알코올 주입술 등이 있는데, 종양 발달의 비교적 초기 단계에서 적용할 수 있는 외과적 치료 방법은 외과적 절제술 (partial hepatectomy)과 간 이식 수술 (total hepatectomy)이며, 많은 연구에서 간 이식을 진행한 경우 더 낮은 사망률과 재발률을 나타내어 좋은 예후를 보이는 것으로 보고되어, 최근에는 간암 초기에 선제적으로 간 이식을 하는 경우가 많아지고 있다. 또한, 간 이식은 정상 간 기증자 (donor)로부터 장기를 확보한 후 진행할 수 있으므로 이식 수술 전까지 화학색전술 (transarterial chemoembolization) 혹은 고주파 열 치료 (radiofrequency ablation, RFA) 등의 전 치료를 받는 경우가 많다.

이에, 상기의 간 이식이나 전 치료가 수술 후 간암의 전이나 재발에 어떤 영향을 주는지 파악되어야 하여 이에 대한 연구 (J Korean Med Assoc 2008, Suy et al.)가 진행 중이나 아직 미흡하여, 이식 또는 전 치료 (pretreatment) 처방을 받은 환자의 예후 예측 및 사후 관리를 위하여 종양 조직의 유전자 발현 패턴을 바탕으로 간 이식 암 환자의 재발 위험을 판단하기 위한 마커의 발굴이 시급한 실정이다.

본 발명자들은 간 이식 수술을 받은 환자에서 간암 재발과 관련된 유전자의 발현 패턴의 변화를 발견하고, 특정 유전자가 간암 재발 예후 예측 마커가 될 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 ANAPC1, CAMK4, CD69, CYTIP, DDX55, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 및 WAS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 간 이식 환자에서의 간암 재발 예후 예측용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 ANAPC1, CAMK4, CD69, CYTIP, DDX55, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 및 WAS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 간 이식 환자에서의 간암 재발 예후 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 간 이식 환자에서의 간암 재발 예후 예측용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 간 이식 환자시료로부터 ANAPC1, CAMK4, CD69, CYTIP, DDX55, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 및 WAS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계 및 상기 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 간 이식 환자에서의 간암 재발 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은

ANAPC1, CAMK4, CD69, CYTIP, DDX55, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 및 WAS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 간 이식 처방 환자의 간암 재발 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로 상기 간 이식 처방 환자는 간 이식 수술 전에, 절제 (ablation), 화학색전술 (transarterial chemoembolization) 및 고주파 열 치료 (radiofrequency ablation, RFA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 전 치료 (pretreatment)를 받은 환자일 수 있다.

또한, 본 발명은 ANAPC1, CAMK4, CD69, CYTIP, DDX55, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 및 WAS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 간 이식 처방 환자의 간암 재발 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로 상기 간 이식 처방 환자는 간 이식 수술 전에, 절제 (ablation), 화학색전술 (transarterial chemoembolization) 및 고주파 열 치료 (radiofrequency ablation, RFA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 전 치료 (pretreatment)를 받은 환자일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 간 이식 처방 환자의 간암 재발 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 일구현예로 상기 키트는 유전자 패널일 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 간 이식 처방 환자시료로부터 ANAPC1, CAMK4, CD69, CYTIP, DDX55, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 및 WAS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 간 이식 처방 환자의 간암 재발 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로 상기 ANAPC1 또는 DDX55 유전자의 발현 수준이 높을 경우 간암 재발의 위험성이 높은 것으로 예측될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로 상기 CAMK4, CD69, CYTIP, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 및 WAS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 낮을 경우 간암 재발의 위험성이 높은 것으로 예측될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 mRNA의 발현수준은 중합효소연쇄반응 (PCR), 역전사 중합효소연쇄반응 (RTPCR), 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay; RPA), 마이크로 어레이 (microarray), 및 노던 블롯팅 (northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅 (western blotting), 방사선면역분석법 (radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 효소면역분석법 (ELISA), 면역침강법 (immunoprecipitation), 유세포분석법 (flow cytometry), 면역형광염색법 (immunofluorescence), 오우크테로니 (ouchterlony), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay), 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 간 이식 처방 환자는 간 이식 수술 전에, 절제 (ablation), 화학색전술 (transarterial chemoembolization) 및 고주파 열 치료 (radiofrequency ablation, RFA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 전 치료 (pretreatment)를 받은 환자일 수 있다.

본 발명자들은 간 이식 수술을 처방 받은 환자에서 간암 재발과 관련된 유전자의 발현 패턴의 변화를 발견하고, 상기 유전자가 간암 재발 예후 예측 마커가 될 수 있음을 규명하였는바, 본 발명에 따른 마커는 간 이식을 처방 받은 간암 환자의 간암 재발 여부를 예측하여 이들의 관리 및 치료에 도움을 줄 것으로 기대된다.

도 1은 간암의 재발 가능성 예측에 사용될 마커 유전자의 선별 과정을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 한국인 간암 환자 중 간 이식을 받은 환자군에서 간암의 재발과 높은 상관관계를 나타내는 16개의 유전자에 대한 무병 생존율 (disease-free survival)을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 간 절제술을 시행한 환자로 구성된 TCGA 간암 코호트에서의 16개의 유전자에 대한 무병 생존율 (disease-free survival)을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 전 치료를 처방받은 간 이식 환자군에서 간암의 재발과 높은 상관관계를 나타내는 4개의 유전자에 대한 무병 생존율 (disease-free survival)을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 간 이식을 받은 환자군, 전 치료를 처방받은 간 이식 환자군 및 간 절제술을 시행한 환자로 구성된 TCGA 간암 코호트 군에서의 16개 유전자에 대한 간암의 재발 예후 예측용 마커 유전자의 선별 실험 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 간 이식 수술을 받은 환자에서 간암 재발과 관련된 유전자의 발현 패턴의 변화를 발견하고, 상기 유전자가 간암 재발 예후 예측 마커가 될 수 있음을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 ANAPC1 (anaphase promoting complex subunit 1, NM_022662.4), CAMK4 (calcium/calmodulin dependent protein kinase IV, NM_001744.6, NM_001323374.1, NM_001323375.1, NM_001323376.1, NM_001323377.1), CD69 (CD69 molecule, NM_001781.2), CYTIP (cytohesin 1 interacting protein, NM_004288.5), DDX55 (DEAD-box helicase 55, NM_020936.3), FAM189A2 (family with sequence similarity 189 member A2, NM_004816.4, NM_001127608.2, NM_001347995.1), IL7R (interleukin 7 receptor, NM_002185.5) , NTF3 (neurotrophin 3, NM_001102654.2, 　NM_002527.4), PLA2G5 (phospholipase A2 group V, NM_000929.3), S1PR4 (sphingosine-1-phosphate receptor 4, NM_003775.3), SLA2 (Src like adaptor 2, NM_032214.4, NM_175077.2), SLC2A2 (solute carrier family 2 member 2, NM_000340.2, NM_001278658.1, 　NM_001278659.1), STEAP4 (STEAP4 metalloreductase, NM_024636.3, NM_001205315.1, NM_001205316.1), TMEM173 (transmembrane protein 173, NM_198282.4, NM_001301738.2, NM_001367258.1), VIPR1 (vasoactive intestinal peptide receptor 1, NM_004624.4, NM_001251882.1, NM_001251883.1, NM_001251884.1, NM_001251885.1) 및 WAS (WASP actin nucleation promoting factor, NM_000377.2)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 간 이식 처방 환자에서의 간암 재발 예후 예측용 마커 조성물; 상기 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 간 이식 처방 환자에서의 간암 재발 예후 예측용 조성물; 및 상기 조성물을 포함하는 간 이식 처방 환자에서의 간암 재발 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 대상 질환인 "간암 (liver　cancer)"은 성인의 원발성 간암 (간 자체에 기원을 둔 암) 중 발생 빈도가 가장 높은 간세포 암종을 의미하며, 병리학적으로 원발성 간암에는 간세포 암종, 담관 상피 암종, 간 모세포종, 혈관 육종 등 다양한 종류가 있으며, 크게는 간세포에서 기원한 간세포 암종과 담관 세포에서 기원한 담관 세포 암종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 간 이식 처방 환자는 간암 환자로서, 간암에 대한 치료방법 중 하나로 간 이식 수술을 처방 받은 환자를 말하며, 이미 간 이식을 받거나 앞으로 간 이식 수술을 받을 예정인 간암 환자를 의미한다. 또한, 상기 간 이식 처방 환자는 간 이식 수술 전에 전 치료 (pretreatment)를 받은 환자일 수 있다.

본 발명에 따른 "전 치료 (pretreatment)"는 후행되는 치료 또는 요법의 효과를 강화하거나 부작용을 완화하기 위한 목적으로 후행되는 치료 전에 수행하는 치료 및 요법을 말한다. 보다 구체적으로, 암의 전 치료는 암세포가 다른 치료법으로 치료되기 전에 암세포를 감작하여 그 다른 치료법들의 효과를 증대시키는 것을 포괄한다. 전 치료 자체는 전형적으로 암세포에 대한 효과에만 국한된다. 암세포에 대한 효과적인 치료를 제공하는 것은 전 치료 및 다른 치료법들의 조합이며, 전 치료에는 절제 (ablation), 화학색전술 (transarterial chemoembolization) 및 고주파 열 치료 (radiofrequency ablation, RFA) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 유전자의 수준을 측정하는 "제제"는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이다. 상기 안티센스는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어 표적 서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로 이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기 서열 및 서브 유닛 간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 "키트"는 간암 재발 군에서 차등적으로 발현이 증가된 마커 유전자의 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현수준을 확인하여 검사 대상에게서 상기 마커 유전자의 과다 발현 여부를 확인하고, 간암 비재발군에서 발현이 증가된 마커 유전자의 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현수준을 확인하여 검사 대상에게서 상기 마커 유전자의 과다 발현 여부를 확인함으로써 간암의 재발 가능성을 예후 예측할 수 있다. 상기 키트는 마커 유전자의 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현수준을 확인하여 마커를 검출함으로써 간암 재발 가능성을 예후 예측할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 간암 재발 여부를 예후 예측할 수 있는 마커 유전자의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브, 또는 상기 마커 유전자로부터 코딩된 단백질을 선택적으로 인지하는 항체뿐만 아니라 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 장치 (유전자 패널 등)이 포함될 수 있으며, 상기 마커 유전자들의 mRNA 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함하는 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물 (DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에서, 간암 재발과 유의미한 상관관계를 가지는 16개의 유전자를 선별하였으며 (실시예 2 참조), 본 발명의 다른 실시예에서, 간 이식을 수술을 받은 환자군에서 전술한 단백질을 암호화하는 ANAPC1, CAMK4, CD69, CYTIP, DDX55, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 및 WAS 유전자의 발현과 상기 유전자에 대한 무병 생존율을 측정하는 실험을 수행하여, 상기 유전자의 발현 수준이 간암 재발과 유의적으로 관련 있음을 확인하였다 (실시예 3 참조).

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 간 이식 전 전 치료를 받은 간 이식을 받은 환자군에서 상기 유전자 중 ANAPC1, CAMK4, S1PR4, STEAP4의 발현과 무병 생존율을 측정하는 실험을 수행하여, 상기 유전자의 발현 수준이 간암 재발과 유의적으로 관련이 있다는 것을 확인하였다 (실시예 4 참조).

상기의 결과들은 ANAPC1, CAMK4, CD69, CYTIP, DDX55, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 및 WAS 유전자가 간 이식 환자군에서 간암 재발 예후 예측을 위한 적합한 마커로 사용될 수 있음을 확인한 것이다.

본 발명의 다른 양태로서, 간 이식 처방 환자시료로부터 ANAPC1, CAMK4, CD69, CYTIP, DDX55, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 및 WAS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계 및 상기 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 간 이식 처방 환자에서의 간암 재발 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 ANAPC1 또는 DDX55 유전자의 발현 수준이 높을 경우 간암 재발의 위험성이 높은 것으로 예측될 수 있다.

본 발명에서 상기 CAMK4, CD69, CYTIP, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 및 WAS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 낮을 경우 간암 재발의 위험성이 높은 것으로 예측될 수 있다.

본 발명에서 상기 mRNA의 발현수준은 중합효소연쇄반응 (PCR), 역전사 중합효소연쇄반응 (RTPCR), 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay; RPA), 마이크로 어레이 (microarray), 및 노던 블롯팅 (northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅 (western blotting), 방사선면역분석법 (radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 효소면역분석법 (ELISA), 면역침강법 (immunoprecipitation), 유세포분석법 (flow cytometry), 면역형광염색법 (immunofluorescence), 오우크테로니 (ouchterlony), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay) 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 정보제공방법에서 상기 간 이식 처방 환자는 간 이식 수술 전에, 절제 (ablation), 화학색전술 (transarterial chemoembolization) 및 고주파 열 치료 (radiofrequency ablation, RFA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 전 치료 (pretreatment)를 받은 환자일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "간암 재발 예후 예측을 위한 정보제공방법"이란 진단 또는 예후 예측을 위한 예비적 단계로써 간암 재발 예후 예측을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다. 상기 간 이식 환자시료는 조직, 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. RNA 추출 실험 및 RNA-seq 실험

채취한 간암 조직에서 균질화 (homogenization)를 거친 뒤 RNA 분석을 위해 RNA 추출을 진행하였다. RNA 추출은 Trizol reagent를 이용해 RNA, DNA, protein을 제외한 세포 구성 물질들을 제거한 뒤, chloroform을 사용하여 DNA, RNA, protein을 분리하였다. 분리된 층 중 RNA 층을 추출한 뒤 RNA 세척과 침적을 진행하였다. RNA를 침전시켜 pellet을 만들어준 뒤 Nuclease-free water에 녹여 RNA sample을 확보하였다. RNA sample은 일루미나 HiSeq 2000을 사용하여 시퀀싱을 수행하였다.

실시예 2. 간암의 예후 예측을 위한 마커 유전자의 선별

간암의 재발 가능성 예측에 사용될 마커 유전자는 도 1에서 나타낸 바와 같이, 다음의 과정을 통해 선별되었다.

2-1. 한국인 간암 코호트 중 간 이식 수술을 진행한 환자에서 유전자 발현 패턴 변화의 확인

가장 대중적으로 사용되는 단백질 암호화 유전자 주석 데이터인 GENCODE version 19를 사용하여 20242개의 단백질 암호화 유전자에 대해 한국인 간암 코호트와 TCGA의 간암 코호트에서 상기 유전자의 발현 패턴을 분석하였다.

보다 구체적으로, 한국인 간암 코호트 중 간 이식 수술을 진행한 환자에 대하여 전 치료 (pretreatment)를 처방한 환자에서 발현 패턴이 변화된 유전자를 t- 검정 (t-test)을 통하여 선별하였다.

그 결과, 상기 20242개의 단백질 암호화 유전자 중 2253개의 유전자의 발현 패턴이 유의미하게 달라지는 것을 확인하였다 (P-value < 0.1).

2-2. 간 이식 수술 환자에서 재발과 관련된 유전자 확인

실시예 2-1에서 확인한 2253개의 유전자 중 간 이식 수술 환자에서 간암 재발과 관련된 유전자 259개를 선별 (P-value < 0.05)한 후, TCGA의 간암 코호트 (n=331, P-value < 0.01 )에서 5년 내 간암의 재발 위험도를 판단하였다.

그 결과, 간암 코호트에서 간암 재발과 관련된 유전자는 총 21개로 확인되었다.

2-3. 간 이식 수술 환자군에서 간암 재발과 유의미한 관련이 있는 유전자의 선별

상기 실시예 2-2에서 확인된 21개의 유전자 중, 간 이식을 받은 환자에서 간암의 재발과 높은 상관관계를 보이는 조절 T 림프구 (regulatory T cell or Treg)의 침투량과 관련된 유전자의 발현 패턴의 변화를 전체 간 이식 환자와 전 치료 (pretreatment)를 처방받은 환자에서 확인하였다.

그 결과, 간암 재발과 유의미한 상관관계를 가지는 16개의 유전자를 선별하였다 (P-value < 0.05).

보다 상세하게는, ANAPC1, CAMK4, CD69, CYTIP, DDX55, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1, WAS의 상기 16개의 유전자 중 ANAPC1, CAMK4, CD69, CYTIP, DDX55, FAM189A2, PLA2G5, TMEM173, VIPR1의 9개 유전자는 전 치료 여부와 관계없이 간 이식 이후 간암 재발 예후와 관련 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. 간 이식 환자군에서 간암의 예후 예측 마커의 적용

실시예 2에서 선별한 마커를 사용하여 간 이식을 받은 환자군에서 5년 내 간암의 재발 위험도를 판단하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, ANAPC1 또는 DDX55 유전자의 발현 수준이 높을 경우 간암 재발의 위험성이 높아지는 것을 확인하였으며, CAMK4, CD69, CYTIP, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 또는 WAS는 유전자의 발현 수준이 낮을 경우 간암 재발의 위험성이 높아지는 것을 확인하였다.

또한, 도 3에서 나타낸 바와 같이, 간 절제술을 시행한 환자로 구성된 TCGA 간암 코호트에서의 상기 유전자에 대한 top quartile과 bottom quartile의 무병 생존율 (disease-free survival) 차이는 간 이식 환자에서의 상기 유전자에 대한 upper expression 군과 lower expression 군의 무병 생존율 (disease-free survival) 차이에 비해 작기 때문에, 상기 유전자들은 TCGA 코호트보다는 간 이식 환자군에서 간암 재발 예후 예측용 마커로 적합하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 전 치료를 처방받은 간 이식 환자군에서 간암의 예후 예측 마커의 적용

실시예 2에서 선별한 마커를 사용하여 전 치료를 처방받은 간 이식 환자군에서 5년 내 간암의 재발 위험도를 판단하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 전 치료를 처방받은 간 이식 환자군에서 ANAPC1 유전자의 발현 수준이 높을 경우 간암 재발의 위험성이 높다는 것을 확인하였으며, CAMK4, S1PR4, STEAP4 는 유전자의 발현 수준이 낮을 경우 간암 재발의 위험성이 높다는 것을 확인하였다.

특히, 간 이식을 받은 환자군에 비해 전 치료 및 간이식 받은 환자군에서 CAMK4, S1PR4, STEAP4에 대한 upper expression 군과 lower expression 군의 무병 생존율 (disease-free survival) 차이가 크기 때문에, 상기 유전자들은 전 치료 및 간이식 받은 환자군에서 더욱 효과적으로 간암 재발 예후 예측의 마커로 활용 가능함을 확인하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

ANAPC1 (anaphase promoting complex subunit 1, NM_022662.4)유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 간 이식 처방 환자의 간암 재발 예후 예측용 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 CAMK4 (calcium/calmodulin dependent protein kinase IV, NM_001744.6, NM_001323374.1, NM_001323375.1, NM_001323376.1, NM_001323377.1), CD69 (CD69 molecule, NM_001781.2), CYTIP (cytohesin 1 interacting protein, NM_004288.5), DDX55 (DEAD-box helicase 55, NM_020936.3), FAM189A2 (family with sequence similarity 189 member A2, NM_004816.4, NM_001127608.2, NM_001347995.1), IL7R (interleukin 7 receptor, NM_002185.5) , NTF3 (neurotrophin 3, NM_001102654.2, 　NM_002527.4), PLA2G5 (phospholipase A2 group V, NM_000929.3), S1PR4 (sphingosine-1-phosphate receptor 4, NM_003775.3), SLA2 (Src like adaptor 2, NM_032214.4, NM_175077.2), SLC2A2 (solute carrier family 2 member 2, NM_000340.2, NM_001278658.1, 　NM_001278659.1), STEAP4 (STEAP4 metalloreductase, NM_024636.3, NM_001205315.1, NM_001205316.1), TMEM173 (transmembrane protein 173, NM_198282.4, NM_001301738.2, NM_001367258.1), VIPR1 (vasoactive intestinal peptide receptor 1, NM_004624.4, NM_001251882.1, NM_001251883.1, NM_001251884.1, NM_001251885.1) 및 WAS (WASP actin nucleation promoting factor, NM_000377.2)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 더 포함하는, 간 이식 처방 환자의 간암 재발 예후 예측용 마커 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 간 이식 처방 환자는 간 이식 수술 전에, 절제 (ablation), 화학색전술 (transarterial chemoembolization) 및 고주파 열 치료 (radiofrequency ablation, RFA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 전 치료 (pretreatment)를 받은 것을 특징으로 하는, 간암 재발 예후 예측용 마커 조성물.
ANAPC1 (anaphase promoting complex subunit 1, NM_022662.4) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 간 이식 처방 환자의 간암 재발 예후 예측용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 조성물은 CAMK4 (calcium/calmodulin dependent protein kinase IV, NM_001744.6, NM_001323374.1, NM_001323375.1, NM_001323376.1, NM_001323377.1), CD69 (CD69 molecule, NM_001781.2), CYTIP (cytohesin 1 interacting protein, NM_004288.5), DDX55 (DEAD-box helicase 55, NM_020936.3), FAM189A2 (family with sequence similarity 189 member A2, NM_004816.4, NM_001127608.2, NM_001347995.1), IL7R (interleukin 7 receptor, NM_002185.5) , NTF3 (neurotrophin 3, NM_001102654.2, 　NM_002527.4), PLA2G5 (phospholipase A2 group V, NM_000929.3), S1PR4 (sphingosine-1-phosphate receptor 4, NM_003775.3), SLA2 (Src like adaptor 2, NM_032214.4, NM_175077.2), SLC2A2 (solute carrier family 2 member 2, NM_000340.2, NM_001278658.1, 　NM_001278659.1), STEAP4 (STEAP4 metalloreductase, NM_024636.3, NM_001205315.1, NM_001205316.1), TMEM173 (transmembrane protein 173, NM_198282.4, NM_001301738.2, NM_001367258.1), VIPR1 (vasoactive intestinal peptide receptor 1, NM_004624.4, NM_001251882.1, NM_001251883.1, NM_001251884.1, NM_001251885.1) 및 WAS (WASP actin nucleation promoting factor, NM_000377.2)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정할 수 있는 제제를 더 포함하는, 간 이식 처방 환자의 간암 재발 예후 예측용 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 간 이식 처방 환자는 간 이식 수술 전에, 절제 (ablation), 화학색전술 (transarterial chemoembolization) 및 고주파 열 치료 (radiofrequency ablation, RFA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 전 치료 (pretreatment)를 받은 것을 특징으로 하는, 간암 재발 예후 예측용 조성물.
제4항 또는 제5항의 조성물을 포함하는, 간 이식 처방 환자의 간암 재발 예후 예측용 키트.
제7항에 있어서,
상기 키트는 유전자 패널인 것을 특징으로 하는, 간암 재발 예후 예측용 키트.
a) 간 이식 처방 환자시료로부터 ANAPC1 (anaphase promoting complex subunit 1, NM_022662.4) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함하는, 간 이식 처방 환자의 간암 재발 예후 예측을 위한 정보제공방법.
제9항에 있어서,
상기 a) 단계에서 CAMK4 (calcium/calmodulin dependent protein kinase IV, NM_001744.6, NM_001323374.1, NM_001323375.1, NM_001323376.1, NM_001323377.1), CD69 (CD69 molecule, NM_001781.2), CYTIP (cytohesin 1 interacting protein, NM_004288.5), DDX55 (DEAD-box helicase 55, NM_020936.3), FAM189A2 (family with sequence similarity 189 member A2, NM_004816.4, NM_001127608.2, NM_001347995.1), IL7R (interleukin 7 receptor, NM_002185.5) , NTF3 (neurotrophin 3, NM_001102654.2, 　NM_002527.4), PLA2G5 (phospholipase A2 group V, NM_000929.3), S1PR4 (sphingosine-1-phosphate receptor 4, NM_003775.3), SLA2 (Src like adaptor 2, NM_032214.4, NM_175077.2), SLC2A2 (solute carrier family 2 member 2, NM_000340.2, NM_001278658.1, 　NM_001278659.1), STEAP4 (STEAP4 metalloreductase, NM_024636.3, NM_001205315.1, NM_001205316.1), TMEM173 (transmembrane protein 173, NM_198282.4, NM_001301738.2, NM_001367258.1), VIPR1 (vasoactive intestinal peptide receptor 1, NM_004624.4, NM_001251882.1, NM_001251883.1, NM_001251884.1, NM_001251885.1) 및 WAS (WASP actin nucleation promoting factor, NM_000377.2) 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제10항에 있어서,
상기 ANAPC1 또는 DDX55 유전자의 발현 수준이 높을 경우 간암 재발의 위험성이 높은 것으로 예측되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제10항에 있어서,
상기 CAMK4, CD69, CYTIP, FAM189A2, IL7R, NTF3, PLA2G5, S1PR4, SLA2, SLC2A2, STEAP4, TMEM173, VIPR1 및 WAS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 낮을 경우 간암 재발의 위험성이 높은 것으로 예측되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 mRNA의 발현수준은 중합효소연쇄반응 (PCR), 역전사 중합효소연쇄반응 (RTPCR), 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay; RPA), 마이크로 어레이 (microarray), 및 노던 블롯팅 (northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅 (western blotting), 방사선면역분석법 (radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 효소면역분석법 (ELISA), 면역침강법 (immunoprecipitation), 유세포분석법 (flow cytometry), 면역형광염색법 (immunofluorescence), 오우크테로니 (ouchterlony), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay), 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 간 이식 처방 환자는 간 이식 수술 전에, 절제 (ablation), 화학색전술 (transarterial chemoembolization) 및 고주파 열 치료 (radiofrequency ablation, RFA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 전 치료 (pretreatment)를 받은 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.