WO2021206467A1 - GLRB 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

GLRB 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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methylation
gene
colorectal
glrb
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조상래
문영호
한진일
이윤영
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주식회사 젠큐릭스
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Definitions

  • the present invention relates to a composition, kit, nucleic acid chip and method capable of diagnosing colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma by detecting the methylation level of the CpG region of the GLRB gene.
  • the large intestine is the last part of the digestive system, about 2m long, and is divided into the cecum, ascending colon, transverse colon, descending colon, sigmoid colon, and rectum.
  • Colorectal cancer is cancer occurring in this region and is mostly adenocarcinoma, and is largely divided into colon cancer and rectal cancer by region.
  • Colorectal cancer can occur in any part of the colon/rectum, but it occurs most frequently in the rectum (about 40%), followed by the S colon, which is an office worker, with about 30%. Changes in dietary habits have significantly increased the incidence and mortality of colorectal cancer in Korea, and also act as a major cause of cancer-related deaths in the United States and Europe (American Cancer Society statics for 2009).
  • the diagnosis of colorectal cancer is simply performed by performing a fecal occult blood test during a health examination. Although the examination is mainly performed through rectal examination, sigmoid colonoscopy, large intestine enema (barium enema), and colonoscopy, the prognosis varies greatly depending on the progress of the cancer at the time of diagnosis. Discovery is very important in improving patient survival.
  • epigenetics is a field that studies the regulation of gene expression in a state in which the base sequence of DNA is not changed.
  • Epigenetics studies the regulation of gene expression through epigenetic changes such as DNA methylation, acetylation of miRNAs or histones, methylation, phosphorylation and ubiquitination.
  • Double DNA methylation is the most studied epigenetic mutation. Epigenetic mutations can result in gene function alterations and changes to tumor cells. Therefore, DNA methylation is associated with the expression (or inhibition and induction) of disease-regulating genes in cells, and recently, cancer diagnosis methods through DNA methylation measurement have been proposed. In particular, since cancer-specific methylation occurs in advance even in precancerous tissues, the detection of cancer-specific methylation is highly likely to be used for diagnosis of cancer.
  • the present inventors found that a specific gene CpG region is in a hypermethylated state in colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma, and by detecting the methylation level, a composition, kit, which can diagnose colorectal cancer, rectal cancer or colon adenoma;
  • the present invention was completed by developing a nucleic acid chip and method.
  • compositions for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma comprising an agent for measuring the methylation level of a specific gene CpG region.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma, comprising an agent for measuring the methylation level of a specific gene CpG region.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma essentially consisting of an agent for measuring the methylation level of a specific gene CpG region.
  • another object of the present invention is colon cancer, rectal cancer or colon containing a PCR primer pair for amplifying a fragment containing the CpG region of a specific gene and a sequencing primer for pyrosequencing the PCR product amplified by the primer pair
  • a kit for diagnosing adenoma is provided.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid chip for diagnosing colon cancer, rectal cancer or colorectal adenoma in which a probe capable of hybridization under stringent conditions with a fragment containing a CpG region of a specific gene is immobilized.
  • Another object of the present invention is to measure the methylation level of a specific gene CpG region from a sample of an individual, and based on this, colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma, comprising the step of determining whether colon cancer, rectal cancer or colorectal adenoma It is to provide a method for providing information for diagnosis.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a preparation for measuring the methylation level of the CpG region of the GLRB gene for preparing a preparation for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer, or colon adenoma.
  • compositions for diagnosing colon cancer, rectal cancer, or colon adenoma comprising an agent for measuring methylation level.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma, comprising an agent for measuring the methylation level of the CpG region of the GLRB gene.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma, which is essentially an agent for measuring the methylation level of the CpG region of the GLRB gene.
  • the present invention provides a kit for diagnosing colon cancer, rectal cancer or colorectal adenoma, comprising a primer pair for amplifying a fragment including a CpG region of a GLRB gene.
  • the present invention provides a nucleic acid chip for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma to which a probe capable of hybridization with a fragment containing the CpG region of the GLRB gene is immobilized. .
  • the method comprising: measuring the methylation level of the CpG region of the GLRB gene from a sample of an individual suspected of having colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma; and
  • It provides a method of providing information for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma, including; determining whether colon cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma is based on the measured methylation level.
  • the present invention provides the use of an agent for measuring the methylation level of the CpG region of the GLRB gene for preparing a diagnostic agent for colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma.
  • It provides a method for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma, comprising c) determining whether or not colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma is based on the measured methylation level.
  • the present invention provides a composition for diagnosing colon cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma, comprising an agent for measuring the methylation level of the CpG region of the GLRB gene.
  • methylation refers to the attachment of a methyl group to a base constituting DNA.
  • methylation refers to whether methylation occurs at a specific CpG site cytosine of a specific gene.
  • methylation occurs, the binding of transcription factors is disturbed and the expression of a specific gene is suppressed.
  • unmethylation or hypomethylation occurs, the expression of a specific gene is increased.
  • 5-methylcytosine In the genomic DNA of mammalian cells, in addition to A, C, G, and T, there is a fifth base called 5-methylcytosine (5-mC) with a methyl group attached to the fifth carbon of the cytosine ring. do. 5-methylcytosine methylation occurs only at C of a CG dinucleotide called CpG (5'-mCG-3'), and CpG methylation inhibits expression of alu or transposon and genomic repeats. In addition, since 5-mC of CpG is easily deamidated to thymine (T), CpG is a site where most epigenetic changes frequently occur in mammalian cells.
  • 5-mC of CpG is easily deamidated to thymine (T)
  • T thymine
  • the term “measuring methylation level” refers to measuring the methylation level of the CpG region of the GLRB gene, and may be measured by a bisulfite-treated detection method or a bisulfite-independent detection method.
  • the measurement of methylation level can be performed by methylation-specific PCR, for example, methylation-specific polymerase chain reaction (MSP), real time methylation-specific polymerase chain reaction (PCR), methylated DNA-specific binding protein or It can be measured by PCR or quantitative PCR using a methylation sensitive restriction enzyme.
  • MSP methylation-specific polymerase chain reaction
  • PCR real time methylation-specific polymerase chain reaction
  • methylated DNA-specific binding protein methylated DNA-specific binding protein
  • the measurement may be performed by automatic sequencing such as pyrosequencing and bisulfite sequencing or next generation sequencing (NGS), but is not limited thereto.
  • TET ten-eleven translocation protein
  • the TET protein is an enzyme that acts on DNA and is involved in the chemical change of bases, and when treated with bisulfite, all Cs except for methylated C are changed to T bases, whereas in the TET protein, only methylated C is changed to T. Efficient detection is possible.
  • the CpG region of the GLRB gene refers to a CpG region present on the DNA of the gene.
  • the DNA of the gene is a concept including all of a series of structural units that are necessary for expression of the gene and are operably linked to each other, for example, a promoter region, a protein coding region (open reading frame, ORF) and a terminator. includes area.
  • the CpG region of the GLRB gene may exist in a promoter region, a protein coding region (open reading frame, ORF) or a terminator region of the corresponding gene.
  • measuring the methylation level of the CpG region of the GLRB gene in the present invention may mean measuring the level of cytosine methylation of the CpG region of the gene shown in Table 1 below.
  • the CpG region of the GLRB gene is characterized in that it is located between +/- 2000 bases (2 kb) from the transcription start site (TSS) of the gene.
  • the nucleotide sequence of the human genome chromosomal region is expressed according to The February 2009 Human reference sequence (GRCh37), but the specific sequence of the human genome chromosomal region may be slightly changed as the genomic sequence study results are updated. , the expression of the human genome chromosomal region of the present invention may be different according to this change. Therefore, the human genome chromosomal region expressed according to The February 2009 Human reference sequence (GRCh 37) of the present invention has been updated with the human reference sequence since the filing date of the present invention, so that the expression of the human genome chromosomal region is now Even if it is changed differently from , it will be apparent that the scope of the present invention extends to the altered human genome chromosomal region. These changes can be easily recognized by anyone with ordinary skill in the art to which the present invention pertains.
  • the agent for measuring the methylation level of the CpG region is a compound that modifies a cytosine base or a methylation sensitive restriction enzyme, a primer specific for the methylated allele sequence of the GLRB gene, and a non-methylated allele sequence specific It may contain a specific primer.
  • the compound that modifies the cytosine base is an unmethylated cytosine or a compound that modifies methylated cytosine, and bisulfite or a salt thereof that modifies unmethylated cytosine, preferably sodium bisulfite or a methylated cytosine is modified. It may be a TET protein, but is not limited thereto.
  • a method for detecting whether a CpG site is methylated by modifying a cytosine base is well known in the art (WO01/26536; US2003/0148326A1).
  • the methylation-sensitive restriction enzyme may be a restriction enzyme capable of specifically detecting methylation of a CpG site, and may be a restriction enzyme containing CG as a recognition site of the restriction enzyme. Examples include, but are not limited to, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI, and the like. Depending on the methylation or unmethylation at C of the restriction enzyme recognition site, cleavage by the restriction enzyme changes, and it can be detected through PCR or Southern blot analysis. Methylation-sensitive restriction enzymes other than the above restriction enzymes are well known in the art.
  • the primer may include a primer specific for the methylated allele sequence of the GLRB gene and a primer specific for the unmethylated allele sequence.
  • primer refers to a short nucleic acid sequence that is capable of base pairing with a complementary template with a nucleic acid sequence having a short free 3' terminal hydroxyl group and serves as a starting point for template strand copying. . Primers are capable of initiating DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates in appropriate buffers and temperatures. In addition, the primers may incorporate additional features that do not change the basic properties of the primers, which are sense and antisense nucleic acids with a sequence of 7 to 50 nucleotides, which serve as the starting point of DNA synthesis.
  • the primer of the present invention can be preferably designed according to the sequence of a specific CpG site to be analyzed for methylation, and more preferably, can specifically amplify methylated and unmodified cytosine by bisulfite.
  • the present invention provides a kit for diagnosing colon cancer, rectal cancer or colorectal adenoma, which includes a primer pair for amplifying a fragment containing the CpG region of the GLRB gene.
  • composition and kit may further include a polymerase agarose, a buffer solution required for electrophoresis, and the like, in addition to the preparation.
  • the present invention also provides a nucleic acid chip for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma to which a probe capable of hybridization with a fragment containing the CpG region of the GLRB gene is immobilized.
  • nucleic acid means oligonucleotides, nucleotides, polynucleotides or fragments thereof, single- or double-stranded DNA or RNA of genomic or synthetic origin, sense or antisense strands of genomic origin or DNA of synthetic origin or RNA, PNA (peptide nucleic acid), or DNA or RNA-like substances of natural or synthetic origin. If the nucleic acid is RNA, it is obvious to one of ordinary skill in the art that instead of deoxynucleotides A, G, C and T, ribonucleotides A, G, C and U are substituted, respectively.
  • the gene involved in cell transformation can be diagnosed early by detecting methylation outside the regulatory region.
  • the methylation gene marker for early diagnosis of cells likely to form colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma.
  • a gene confirmed to be methylated in cancer cells is methylated in a cell that appears to be clinically or morphologically normal, the normal-looking cell is undergoing cancerization. Therefore, by confirming the methylation of a gene specific for colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma in normal-looking cells, early diagnosis of colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma can be achieved.
  • the present invention comprises the steps of measuring the methylation level of the GLRB gene CpG region from a sample of an individual suspected of having colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma;
  • It provides a method of providing information for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma, including; determining whether colon cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma is based on the measured methylation level.
  • Methods for measuring the methylation level include PCR, methylation specific PCR, real time methylation specific PCR, PCR using a methylated DNA-specific binding protein, and methylation using a methylation sensitive restriction enzyme. , but may be selected from the group consisting of quantitative PCR, DNA chip, pyrosequencing and bisulfite sequencing, but is not limited thereto.
  • methylation-specific PCR is a method of designing and using different types of primers depending on whether CpG dinucleotide is methylated as a primer to be subjected to PCR after treating sample DNA with bisulfite. am. If the primer binding site is methylated, PCR is performed by the methylated primer, and if not methylated, PCR is performed by the normal primer. That is, after treating the sample DNA with bisulfite, PCR is performed using two types of primers at the same time, and the results are compared.
  • Real-time methylation-specific PCR is a conversion of a methylation-specific PCR method to a real-time measurement method. After genomic DNA is treated with bisulfite, PCR primers corresponding to methylation are designed, and real-time PCR is performed using these primers. is to perform At this time, there are two methods: a method of detecting using a TaqMan probe complementary to the amplified nucleotide sequence, and a method of detecting using SYBRgreen. Therefore, real-time methylation-specific PCR can selectively quantitatively analyze only methylated DNA. In this case, a standard curve is prepared using an in vitro methylated DNA sample, and for standardization, a gene without a 5'-CpG-3' sequence is amplified together as a negative control group to quantitatively analyze the degree of methylation.
  • the methylation-sensitive restriction enzyme uses a CpG dinucleotide as an action site, and when this site is methylated, it cannot function as an enzyme. Therefore, if the sample DNA is treated with a methylation-sensitive restriction enzyme and amplified by PCR to include the enzyme target site, the restriction enzyme does not work in the case of methylation and is amplified by PCR, but the unmethylated normal site is cut by the restriction enzyme and PCR Since it is not amplified, it is possible to determine whether a specific DNA site is methylated.
  • methylated DNA-specific binding protein when a protein that specifically binds only methylated DNA is mixed with DNA, only methylated DNA can be selectively isolated because the protein specifically binds only to methylated DNA. .
  • genomic DNA After mixing genomic DNA with methylated DNA-specific binding protein, only methylated DNA is selectively isolated. This is a method of amplifying the isolated DNA using a PCR primer corresponding to the intron region, and measuring whether methylation is performed by agarose electrophoresis.
  • methylation can be measured by quantitative PCR, and methylated DNA separated with a methylated DNA-specific binding protein is labeled with a fluorescent dye and hybridized to a DNA chip integrated with a complementary probe to measure methylation. can do.
  • the methylated DNA specific binding protein is not limited to MBD2bt.
  • pyrosequencing of bisulfite-treated DNA is based on the following principle.
  • 5-methylcytosine (5-mC) is formed, which is changed to uracil upon bisulfite treatment.
  • the DNA extracted from the sample is treated with bisulfite, if the CpG dinucleotide is methylated, it is conserved as cytosine, and the remaining unmethylated cytosine is changed to uracil.
  • Sequencing of the bisulfite-treated DNA can be preferably performed using a pyrosequencing method.
  • TET ten-eleven translocation
  • the method for providing information for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma of the present invention comprises the steps of a) obtaining a sample from an individual, b) obtaining genomic DNA from the sample, c) the obtained genomic DNA Treating a compound that modifies an unmethylated cytosine base, d) amplifying the treated DNA by PCR using a pyrosequencing primer capable of amplifying the promoter of the GLRB gene to obtain a PCR product and e) measuring the degree of methylation by pyrosequencing the PCR product using a sequencing primer.
  • the genomic DNA obtained in step b) can be performed using a phenol/chloroform extraction method, an SDS extraction method, a CTAB separation method, or a commercially available DNA extraction kit commonly used in the art.
  • determining whether colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma is based on the measured methylation level means measuring the methylation level of the CpG region of the GLRB gene from a sample of a patient suspected of having colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma. It may be determined by simultaneously or sequentially measuring the methylation level of the CpG region of the same gene as above from a sample of a normal control group and then comparing the two.
  • the determination may be made by measuring the methylation level of the CpG region of the GLRB gene in advance from a sample of a normal control group, setting a threshold value, and then comparing the threshold value with the value measured from the patient's sample. If the threshold value is set by measuring the methylation level of the CpG region of the GLRB gene from the sample of the normal control in advance, the methylation level of the CpG region of the GLRB gene is measured in the patient's sample without the need to measure the methylation level of the normal control each time for each diagnosis. It is possible to quickly provide information for diagnosing whether the patient has colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma.
  • sample refers to a wide range of body fluids, including all biological fluids obtained from individuals, body fluids, cell lines, tissue culture, etc., depending on the type of analysis to be performed.
  • Methods for obtaining bodily fluids and tissue biopsies from mammals are generally well known, and in the present invention, the samples are preferably from the group consisting of tissues, cells, blood, plasma, serum, feces, and human derivatives including urine.
  • the prediction of the occurrence of rectal cancer or colorectal adenoma there is an advantage in that it is possible to easily diagnose using blood or body fluids.
  • the present invention provides the use of an agent for measuring the methylation level of the CpG region of the GLRB gene for preparing a diagnostic agent for colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma.
  • It provides a method for diagnosing colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma, comprising c) determining whether or not colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma is based on the measured methylation level.
  • the present invention provides a method of diagnosing and treating colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma in an individual comprising the steps of:
  • Step iv) is a step of performing treatment of the disease through means such as administration of a therapeutic drug or surgery to the individual diagnosed with the disease in step iii).
  • the 'treatment' of the present invention refers generically to improving the symptoms of colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma or the disease, which may include curing, substantially preventing, or improving the condition of the disease. and alleviating, curing, or preventing one symptom or most symptoms resulting from colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma, but is not limited thereto.
  • the 'therapeutic drug' is not particularly limited as long as it is a type of drug typically used for the treatment of colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma.
  • the therapeutic drug is administered to a subject in a 'therapeutically effective amount', and the therapeutically effective amount can be determined by those skilled in the art not only for the intrinsic properties of the drug, the route of administration and the number of treatments, but also the age, weight, health status, sex, and disease of the patient.
  • the effective dosage for a patient can be determined by considering various factors such as the severity of the drug, diet, and excretion rate.
  • the route of administration of the therapeutic drug is not particularly limited, and may be administered orally or parenterally, and includes both local administration as well as systemic administration.
  • the parenteral administration is not limited thereto, but may be, for example, intranasal drug application, subcutaneous injection, or the like, and as another example, intramuscular injection, intravenous injection, etc. may be used.
  • the 'sample' of the present invention is obtained by separating from a subject suspected of a disease, but is not limited thereto, but is not limited to cells, tissues, blood, serum, plasma, saliva, and sputum. It may be selected from the group consisting of mucosal fluid and urine, and the 'individual' may be an animal, preferably a mammal, particularly an animal including a human, and may be an animal-derived cell, tissue, organ, or the like. The subject may be a patient in need of the therapeutic effect.
  • the term “comprising” is used synonymously with “including” or “characterized by”, and in a composition or method according to the present invention, specifically It does not exclude additional components or method steps that have not been performed. Also, the term “consisting of” means excluding additional elements, steps, or components not otherwise described. The term “essentially consisting of” means that, in the scope of a composition or method, it may include substances or steps that do not materially affect its basic properties in addition to the substances or steps described.
  • hypermethylation of the CpG region of the GLRB gene is specifically shown in colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma. It can be diagnosed accurately and quickly, and can be diagnosed at an early stage.
  • 1 is a result of confirming the methylation information of the GLRB gene in a total of 32 cancer types.
  • cancer tumor tissue
  • adenoma colorectal adenoma tissue
  • normal tissue normal
  • FIG. 6 is a comparative example, showing the results of confirming the methylation information of the OPLAH gene.
  • ddPCR droplet digital PCR
  • ddPCR droplet digital PCR
  • Example 1 Colorectal cancer-specific methylation gene selection
  • Tumor tissue used in this study means cancerous tissue of colorectal cancer
  • non-tumor tissue means tissue other than cancer tissue including normal tissue.
  • DNA extracted from each tissue is converted through bisulfite treatment. Through this, the cytosine base is modified depending on whether the DNA site is methylated.
  • the probe used in the microarray experiment was specifically designed for methylation and unmethylation to check whether the cytosine base was modified at the gene methylation site.
  • the microarray experiment measures the degree of methylation of a gene through about 450,000 (450k) probes representing the methylation site of each gene, and the result of each probe derived from the test is presented as a beta value. .
  • the beta value ranges from 0 to 1, and the closer to 1, the higher the degree of methylation of the genetic region.
  • DMRs differentially methylated regions
  • the Limma method is known to be the least affected by outliers among several methylation statistical analysis methods that identify differences between groups. Therefore, it is a suitable method for finding cancer-specific markers as it is less affected by abnormal measurements of some samples. In this experiment, it was determined that there was a significant difference in methylation between the two groups as the adjusted p-value derived through the Limma method decreased.
  • tumor-specific methylation sites among gene regions with significant beta differences between tumor and non-tumor groups, sites with higher methylation in tumor tissues than in non-tumors were selected as cancer-specific biomarker candidates.
  • the tumor group had a significantly lower p value (the top 10% with the lowest P value), and a large difference in the beta value of 0.2 or more between the groups was found in the gene region.
  • Tumor-specific hypermethylated regions were selected. Through this, 3,878 genetic regions showing tumor-specific hypermethylation in common among all datasets among about 450,000 genetic regions were selected as biomarker candidates.
  • the degree of methylation of the gene through the microarray experiment on tumor tissue (cancer tissue of colorectal cancer) and non-tumor tissue (tissue other than cancer tissue including normal tissue) for the gene is shown in FIG. 1 same as As for the degree of methylation, the result of each probe derived through the test was expressed as a beta value.
  • the beta value ranges from 0 to 1, and the closer to 1, the higher the degree of methylation of the genetic region.
  • methylation may also occur in cancers other than colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma. That is, colorectal cancer, rectal cancer, or colorectal adenoma-specific methylation was not confirmed.
  • OPLAH 5-oxoprolinase, ATP-hydrolysing
  • the 32 types of cancer are as follows: Acute Myeloid Leukemia, Adrenocortical cancer, Bile Duct cancer, Breast cancer, Cervical Cancer, Colorectal cancer Colon cancer, Endometrioid Cancer, Esophageal Cancer, Glioblastoma, Head and neck cancer, Kidney chromophobe, Kidney Clear cell carcinoma), Kidney Papillary cell carcinoma, Liver cancer, Lower Grade Glioma, Lung adenocarcinoma, Melanoma, Mesothelioma, ocular melanoma Ocular melanomas, Ovarian cancer, Pancreatic cancer, Pheochromocytoma&paraganglioma, Prostate cancer, Rectal cancer, Sarcoma, Stomach cancer, testicular cancer, Thymoma, Thyroid cancer, Uterine carcinosarcoma.
  • Example 3 Confirmation of colorectal cancer specificity of a selection gene in a cell line
  • methylation patterns were analyzed in 1,022 cancer cell lines derived from 14 major tissues using a public database. did. The data is the result of the Infinium Human Methylation 450 Beadchip microarray experiment on DNA extracted from each cell line according to the standardized manufacturer's methylation analysis test procedure.
  • the degree of gene methylation is measured through about 450,000 probes as in Example 1, and the methylation value of each probe is presented as a beta value.
  • the beta value ranges from 0 to 1, and the closer to 1, the higher the degree of methylation of the genetic region is determined.
  • the 14 tissues are as follows: aerodigestive tract, blood, bone, breast, digestive system, kidney, lung, nervous system ( nervous system, pancreas, skin, soft tissue, thyroid, urogenital system, other tissues.
  • DMRs differentially methylated regions
  • Limma Linear Models for Microarray Data
  • the GLRB gene is colorectal cancer-specific as it has a significantly lower adjusted p-value in colorectal and rectal cancer cell lines compared to other cancer cell lines.
  • Example 4 Evaluation of diagnostic performance of colorectal cancer, rectal cancer or colorectal adenoma diagnostic marker candidates
  • sensitivity and specificity are used. It is possible to represent the ROC (Receiver Operating Characteristic) curve that presents the change in sensitivity and specificity according to the cut-off value through the calculation of the sensitivity and specificity values for possible cut-off values of consecutive diagnostic test measurements. have.
  • the accuracy of diagnosis can be measured by the area under the ROC curve (AUC).
  • AUC area under the ROC curve
  • the AUC value has a value between 0.5 and 1, and the higher the value, the higher the diagnosis accuracy is evaluated. If the AUC value is 1, it means that the diagnosis result is a perfectly accurate test, but if the AUC value is 0.5, it is judged to be the same as the random result.
  • Adenoma is a disease at the stage before it progresses to colorectal cancer, and most colorectal cancers arise from adenoma. Therefore, early detection of adenoma is essential for early diagnosis of colorectal cancer.
  • the hypermethylation biomarkers selected through the previous study show hypermethylation characteristics in adenomas, 64 colorectal cancer tissues, 42 colorectal adenoma tissues, and non-tumor The hypermethylation characteristics of genes selected from 41 tumor) tissues were investigated.
  • the selected gene showed the same characteristics of non-tumor tissue and significant hypermethylation in colorectal cancer as well as colorectal adenoma. could confirm that
  • the selected gene can be used for the diagnosis of colorectal adenoma as well as colorectal cancer.
  • Example 6 qMSP-based methylation measurement in tissues of selected genes
  • a methylation difference between cancer tissues and non-cancer tissues was measured using methylation-specific PCR (quantitative methylation specific PCR, qMSP).
  • genomic DNA was isolated from a pair of cancer tissues and surrounding tissues of 12 colorectal cancer patients and cancer tissues of 4 adenoma patients. The degree of amplification and methylation was to be observed.
  • the ACTB gene which is not related to methylation, was used to specifically bind to and amplify the bisulfite-modified genetic region, and to normalize the amplified value of the region.
  • ⁇ Ct The methylation level of the bisulfite-converted DNA amplified by PCR is expressed as ⁇ Ct, which is a value corrected by the Ct (Cycle of Threshold) value of ACTB used as an internal control.
  • ⁇ Ct is defined as:
  • ⁇ Ct Ct value of the ACTB gene - Ct value of the gene to be detected
  • methylation of the GLRB gene has a relatively high ⁇ Ct value regardless of the stage in colorectal cancer tissue compared to normal tissue surrounding the cancer, and in particular, a very high ⁇ Ct value in precancerous adenoma. It was confirmed that the GLRB gene was hypermethylated in colorectal cancer and colorectal adenoma. This is a result that actually shows that methylation of the selected GLRB gene is effective as a biomarker for the diagnosis of colorectal cancer, especially early diagnosis.
  • the selected gene can be used for the diagnosis of colorectal adenoma as well as colorectal cancer.
  • Example 7 Measurement of methylation based on digital PCR in tissues of selected genes
  • genomic DNA was isolated from the cancer tissues of 16 colorectal cancer patients, pairs of cancer surrounding tissues (4 pairs by stage), and cancer tissues of 5 adenoma patients, and after treatment with bisulfite, droplet digital PCR (Droplet digital PCR, ddPCR) was used to observe amplification and methylation levels of GLRB-specific gene regions.
  • the ACTB gene was used as an internal control for the modification of the genetic region due to bisulfite and the amplification of the genetic region using PCR.
  • the degree of methylation obtained by amplifying the bisulfite-converted cfDNA by ddPCR was calculated as the number of copies.
  • methylation of the GLRB gene has a relatively high copy number irrespective of the stage in colorectal cancer tissue compared to normal tissue surrounding the cancer, and in particular, it shows a very high copy number in the precancerous stage adenoma.
  • PCR it was confirmed that the GLRB gene was hypermethylated in colorectal cancer and colorectal adenoma. This result shows that methylation of the selected GLRB gene can be effectively detected not only by real-time PCR but also by digital PCR.
  • the selected gene can be diagnosed using various molecular biological techniques.
  • methylation of the GLRB gene showed a high methylation level in colorectal cancer plasma samples compared to normal subjects, and it was shown that it could be measured with 100% accuracy. This result shows that methylation of the selected GLRB gene is effective for the diagnosis of tissue as well as blood-based colorectal cancer.
  • composition, kit, chip or method according to the present invention is used to accurately and Not only can it be diagnosed quickly, but it can also be diagnosed early.

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Abstract

본 발명은 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출함으로써, 대장암, 직장암 또는 대장 선종을 진단할 수 있는 조성물, 키트, 핵산 칩 및 방법에 관한 것으로, 대장암, 직장암 또는 대장 선종을 정확하고 신속하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라 조기에 진단할 수 있다.

Description

GLRB 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물 및 이의 용도
본 출원은 2020년 4월 8일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0042726호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출함으로써, 대장암, 직장암 또는 대장 선종을 진단할 수 있는 조성물, 키트, 핵산 칩 및 방법에 관한 것이다.
대장은 소화기관의 마지막 부위로, 길이는 약 2m이며, 맹장, 상행결장, 횡행결장, 하행결장, S상결장, 직장으로 나누어진다. 대장암(colorectal cancer)은 이 부위에 발생하는 암으로 대부분 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암(colon cancer)과 직장암(rectal cancer)으로 구분된다.
대장암은 대장/직장의 어느 부위에서도 발생할 수 있으나, 직장에서 발생하는 경우가 약 40%로 가장 높고, 그 다음으로는 직장인근인 에스 결장에서 발생하는 경우가 약 30%이다. 식이 습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발생률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있으며, 또한 미국 및 유럽에서는 암 관련 사망의 주요 요인으로 작용한다(American Cancer Society statics for 2009).
대장암의 진단은 간단하게는 건강검진시 분변 잠혈 반응검사를 실시하는데, 실제로 대장암을 확인하기 위해서는 추가적인 진찰과 검사가 필요하다. 직장 수지 검사, 에스상 결장경 검사를 비롯해서, 대장관장사진(바륨관장사진), 대장내시경검사를 통해서 주로 검사가 이루어지나, 진단 당시의 암의 진행상태에 따라 예후가 크게 달라지기에 대장암 환자의 조기 발견은 환자의 생존율을 높이는데 매우 중요하다.
한편, 후성유전학(epigenetics)은 DNA의 염기서열이 변화하지 않은 상태에서 이루어지는 유전자의 발현 조절을 연구하는 분야이다. 후성유전학은 DNA 메틸화, miRNA 또는 히스톤의 아세틸화, 메틸화, 인산화 및 유비퀴틴화 등과 같은 후성적 변이를 통한 유전자 발현 조절을 연구한다.
이중 DNA 메틸화가 가장 많이 연구가 되어있는 후성적 변이이다. 후성적 변이는 유전자 기능 변이 및 종양 세포로의 변화를 초래할 수 있다. 따라서 DNA 메틸화는 세포 내 질환 조절 유전자의 발현(또는 억제 및 유도와)과 연관되어 있으며, 최근에 DNA 메틸화 측정을 통한 암 진단 방법들이 제시되고 있다. 특히 전암 단계의 조직에서도 암 특이적 메틸화 현상이 미리 발생하는 경우가 많아 암 특이적 메틸화의 검출은 암의 진단에 이용될 가능성이 높다.
따라서 대장암 및 이와 유사한 특정을 가지는 직장암, 대장 선종의 위험 예측이 가능한 효과적인 대장암, 직장암 또는 대장 선종 특이적 메틸화 마커의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 대장암, 직장암 또는 대장 선종에 있어서 특정 유전자 CpG 부위가 과메틸화된 상태인 것을 발견하고, 상기 메틸화 수준을 검출함으로써 대장암, 직장암 또는 대장 선종을 진단할 수 있는 조성물, 키트, 핵산 칩 및 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 특정 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 특정 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제로 이루어지는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 특정 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제로 필수적으로 이루어지는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 특정 유전자의 CpG 부위를 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 특정 유전자의 CpG 부위를 포함하는 단편과 엄격한 조건하에서 혼성화(hybridization)할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 핵산 칩을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 개체의 시료로부터 특정 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하고, 이를 기준으로 하여 대장암, 직장암 또는 대장 선종 여부를 판단하는 단계를 포함하는, 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 제제를 제조하기 위한 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은
a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
b) 상기 시료로부터 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
c) 상기 측정된 메틸화 수준을 기준으로 대장암, 직장암 또는 대장 선종 여부를 판단하는 단계;를 포함하는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단 방법을 제공하는 것이다.
메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제로 이루어지는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제로 필수적으로 이루지는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GLRB 유전자의 CpG 부위를 포함하는 단편을 증폭하기 위한 프라이머쌍을 포함하는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GLRB 유전자의 CpG 부위를 포함하는 단편과 혼성화(hybridization)할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 핵산 칩을 제공한다.
또한 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 대장암, 직장암 또는 대장 선종 발생이 의심되는 개체의 시료로부터 GLRB 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 메틸화 수준을 기준으로 대장암, 직장암 또는 대장 선종 여부를 판단하는 단계;를 포함하는, 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 제제를 제조하기 위한 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
b) 상기 시료로부터 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
c) 상기 측정된 메틸화 수준을 기준으로 대장암, 직장암 또는 대장 선종 여부를 판단하는 단계;를 포함하는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단 방법을 제공한다.
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.
본 발명은 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "메틸화"는 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 말한다. 바람직하게, 본 발명에서 메틸화 여부는 특정 유전자의 특정 CpG 부위 사이토신에서 일어나는 메틸화 여부를 의미한다. 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제되며, 반대로, 비메틸화또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가하게 된다.
포유동물 세포의 게놈 DNA 에는 A, C, G 및 T에 더하여, 사이토신 링의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-메틸사이토신의 메틸화는 CpG라고 불리는 CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다.
본 발명에서 용어, "메틸화 수준의 측정"은 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것으로서, 바이설파이트 처리에 따른 검출법 또는 바이설파이트 비의존적 검출법을 통해 측정할 수 있다. 메틸화 수준의 측정은 메틸화 특이적인 PCR, 예를 들어 메틸화 특이적 PCR (methylation-specific polymerasechain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR (real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질 또는 메틸화 민감 제한효소(methylation sensitive restriction enzyme)를 이용한 PCR 또는 정량 PCR 등을 통해 측정할 수 있다. 또는, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱과 같은 자동염기분석 또는 차세대 염기서열 분석법(Next Generation Sequencing, NGS)으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 바이설파이트 비의존적 검출법으로써 TET 단백질(ten-eleven translocation protein)을 이용하여 측정할 수 있다. 상기 TET 단백질은 DNA에 작용하는 효소로 염기의 화학적 변화에 관여하며, 바이설파이트를 처리할 경우 메틸화된 C를 제외한 모든 C가 T 염기로 바뀌는 것과 달리 TET단백질은 메틸화된 C만이 T로 바뀌어 보다 효율적인 검출이 가능하다.
바람직하게, GLRB 유전자의 CpG 부위란, 상기 유전자의 DNA 상에 존재하는 CpG 부위를 말한다. 상기 유전자의 DNA는, 상기 유전자가 발현하는데 필요하며 서로 작동가능하게 연결되어 있는 일련의 구성단위를 모두 포함하는 개념으로, 예를 들어, 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 및 터미네이터 영역을 포함한다. 따라서, GLRB 유전자의 CpG 부위는 해당 유전자의 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 또는 터미네이터 영역 등에 존재할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 하기 표 1에 기재된 유전자 CpG 부위의 사이토신 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
Symbol Genome Build Chromosome Region
GLRB GRCh37 4 157997167-157997686
본 발명에 있어서, 상기 GLRB 유전자의 CpG 부위는 유전자의 전사 시작 부위 (transcription start site, TSS)로부터 +/- 2000 염기(base) (2kb) 사이에 위치하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 인간 게놈 염색체 부위의 염기서열은 The February 2009 Human reference sequence (GRCh37)에 따라 표현하였지만, 상기 인간 게놈 염색체 부위의 구체적 서열은 게놈 서열 연구 결과가 업데이트됨에 따라서 그 표현이 다소 변경될 수 있으며, 이러한 변경에 따라 본 발명의 상기 인간 게놈 염색체부위의 표현이 상이해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 The February 2009 Human reference sequence (GRCh 37)에 따라 표현된 인간 게놈 염색체 부위는 본 발명의 출원일 이후 인간 표준 염기서열(human reference sequence)이 업데이트되어 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 지금과 다르게 변경된다고 하여도, 본 발명의 범위가 상기 변경된 인간 게놈 염색체 부위에 미치게 됨은 자명하다고 할 것이다. 이러한 변경 내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 용이하게 알 수 있는 사항이다.
본 발명에서, 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, GLRB 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.
상기 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 비메틸화 사이토신 또는 메틸화 사이토신을 변형시키는 화합물이며, 비메틸화 사이토신을 변형시키는 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염, 바람직하게는 소듐 바이설파이트이거나 메틸화 사이토신을 변형시키는 TET 단백질 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 사이토신 염기를 변형시켜 CpG 부위의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다(WO01/26536; US2003/0148326A1).
또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당 업계에 잘 알려져 있다.
상기 프라이머는 GLRB 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3'말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 보다 바람직하게는, 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 메틸화되어 TET 계열의 단백질에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 TET 계열의 단백질에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
따라서 본 발명은 GLRB 유전자의 CpG 부위를 포함하는 단편을 증폭하기 위한 프라이머쌍을 포함하는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 키트를 제공한다.
상기 조성물 및 키트에는 상기 제제 이외에도, 중합효소 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 GLRB 유전자의 CpG 부위를 포함하는 단편과 혼성화(hybridization)할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 핵산 칩을 제공한다.
본 발명에서 용어 "핵산" 이란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 의미하거나 이들의 단편, 단일가닥 또는 이중가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 센스 또는 안티센스 가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, PNA (peptide nucleic acid) 또는 자연 기원 또는 합성 기원의 DNA 양 또는 RNA 양 물질을 말한다. 핵산이 RNA이면, 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T를 대신하여, 각각 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U로 대체된다는 것은 당해 분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명하다.
메틸화는 유전자 조절 부위의 외곽에서부터 시작되어 내부로 진행되기 때문에, 조절 부위의 외곽에서 메틸화를 검출하는 것으로 세포 형질전환에 관여하는 유전자를 조기 진단할 수 있다.
따라서 상기 메틸화 유전자 마커를 이용하여 대장암, 직장암 또는 대장 선종을 형성할 가능성이 있는 세포의 조기 진단이 가능하다. 암세포에서 메틸화된다고 확인된 유전자가 임상적으로 또는 형태학적으로 정상으로 보이는 세포에서 메틸화되면, 상기 정상으로 보이는 세포는 암화가 진행되고 있는 것이다. 그러므로, 정상으로 보이는 세포에서의 대장암, 직장암 또는 대장 선종 특이적 유전자가 메틸화를 확인함으로, 대장암, 직장암 또는 대장 선종을 조기 진단할 수 있다.
또한 본 발명은 대장암, 직장암 또는 대장 선종 발생이 의심되는 개체의 시료로부터 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 메틸화 수준을 기준으로 대장암, 직장암 또는 대장 선종 여부를 판단하는 단계;를 포함하는, 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 메틸화 수준을 측정하는 방법은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 민감성 제한 효소를 사용한 메틸화 여부 측정, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 메틸화 특이 PCR(methylation-specific PCR)의 방법은 시료 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, PCR을 수행할 프라이머를 CpG 디뉴클레오타이드의 메틸화 여부에 따라 다른 종류의 프라이머를 디자인하여 사용하는 방법이다. 프라이머 결합 부위가 메틸화되었으면 메틸화된 프라이머에 의해 PCR이 진행되고, 메틸화가 되지 않았으면 정상 프라이머에 의해 PCR이 진행된다. 즉, 시료 DNA에 바이설파이트를 처리한 후 두 가지 종류의 프라이머를 동시에 사용하여 PCR을 행한 후, 결과를 비교하는 방법이다.
실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TaqMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 SYBRgreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro methylated DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열 내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석하는 방법이다.
메틸화 민감성 제한 효소를 사용하여 메틸화 여부를 측정하는 방법에서 메틸화 민감성 제한 효소는 CpG 디뉴클레오타이드를 작용부위로 하며, 이 부위가 메틸화된 경우에는 효소로서 작용하지 못한다. 따라서, 시료 DNA를 메틸화 민감성 제한효소로 처리한 후 효소 타깃 부위를 포함하도록 PCR로 증폭하면, 메틸화된 경우에는 제한효소가 작용되지 않아 PCR 증폭되지만 메틸화되지 않은 정상 부위는 제한 효소에 의해 절단되어 PCR 증폭되지 않으므로 특정 DNA 부위의 메틸화 여부를 측정할 수 있다.
메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리한다. 이들 분리된 DNA를 인트론 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정하는 방법이다. 또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 혼성화(hybridization)시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다. 여기서 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질은 MBD2bt에 제한되지 않는다.
또한, 바이설파이트 처리된 DNA의 파이로시퀀싱(bisulfite pyrosequencing)은 다음과 같은 원리에 기초한다. CpG 디뉴클레오타이드 부위에서 메틸화가 발생되면 5-메틸사이토신(5-mC)이 형성되는데, 이 변형된 염기는 중아황산염 처리시 우라실(uracil)로 변화된다. 시료로부터 추출된 DNA에 바이설파이트를 처리할 때 CpG 디뉴클레오타이드가 메틸화되었다면 사이토신(cytosine)으로 보존되며, 나머지 메틸화 되지 않은 사이토신은 우라실로 변화한다. 바이설파이트 처리된 DNA의 서열분석은 바람직하게는 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 방법을 사용하여 행할 수 있다. 파이로시퀀싱에 대한 상세한 설명은 선행문헌에 공지되어 있다[Ronaghi et al, Science 1998 Jul 17, 281(5375), 363-365; Ronaghi et al,Analytical Biochemistry 1996 Nov 1, 242(1), 84-9; Ronaghi et al. Analytical Biochemistry 2000 Nov 15, 286 (2): 282-288; Nyr, P. Methods Mol Biology 2007, 373, 114].
한편, TET 단백질을 이용한 바이설파이트 비의존적 검출법으로 TET 단백질을 사용해 메틸화된 C만이 T로 변환시켜 메틸화 부위의 염기를 검출할 수도 있다(LIU, Yibin, et al., Nature Biotechnology volume 37, pages 424-429 (2019) 참고).
CpG 디뉴클레오타이드 부위에서 메틸화가 발생되어 사이토신이 5-메틸사이토신(5-mC)이 형성된 경우 TET (ten-eleven translocation) 단백질을 처리할 때 Cpg 디뉴클레오타이드가 메틸화 되었다면 우라실로 변화하며, 메틸화 되지 않은 사이토신은 보존된다. TET 처리된 DNA의 서열분석은 파이로시퀀싱 방법에 대해서만 제한된 것은 아니며 메틸화 민감 PCR (methylation-sensitive PCR, MSP), 마이크로어레이(microarray), 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS) 등의 방법을 사용하여 분석할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계, b) 시료에서 게놈 DNA를 수득하는 단계, c) 수득된 게놈 DNA를 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 변형시키는 화합물을 처리하는 단계, d) 상기 처리된 DNA를 GLRB 유전자의 프로모터를 증폭할 수 있는 파이로시퀀싱용 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시킴으로써 PCR 생산물을 얻는 단계 및 e) 상기 PCR 생산물을 시퀀싱 프라이머(sequencing primer)를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)함으로써 메틸화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 b)단계의 게놈 DNA 수득은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB 분리법 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 "측정된 메틸화 수준을 기준으로 대장암, 직장암 또는 대장 선종 여부를 판단" 이란, 대장암, 직장암 또는 대장 선종 발생이 의심되는 환자의 시료로부터 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정함과 동시에 혹은 순차적으로 정상 대조군의 시료로부터 상기와 동일한 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정한 뒤 양자를 비교함으로써 판단하는 것일 수 있다. 또한 정상 대조군의 시료로부터 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 미리 측정하여 역치값을 설정한 뒤 그 역치값과 환자의 시료로부터 메틸화 수준을 측정한 값을 비교함으로써 판단하는 것일 수 있다. 미리 정상 대조군의 시료로부터 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하여 역치값을 설정해 놓으면 각각의 진단을 위해 매번 정상 대조군의 메틸화 수준을 측정할 필요 없이 환자의 시료에서 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것만으로도 빠르게 해당 환자의 대장암, 직장암 또는 대장 선종 여부 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어 "시료"는 수행되는 분석의 종류에 따라, 개인, 체액, 세포주, 조직 배양 등에서 얻어지는 모든 생물학적 체액, 포함하는 폭넓은 범위의 체액을 의미하는 것이다. 포유동물로부터 체액 및 조직 생검을 획득하는 방법은 통상적으로 널리 알려져 있으며, 본 발명에 있어서 상기 시료는 바람직하게는 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 대변 및 소변을 포함하는 인체 유래물로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 암 조직의 비정상적인 메틸화 변화는 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 생물학적 시료에서 얻은 게놈 DNA의 메틸화 변화와 상당한 유사성을 보이므로, 본 발명의 마커를 이용할 경우 대장암, 직장암 또는 대장 선종 발생 예측에 대하여, 혈액이나 체액 등을 통한 손쉬운 진단이 가능하다는 장점이 있다.
본 발명은 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 제제를 제조하기 위한 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공한다.
본 발명은
a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
b) 상기 시료로부터 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
c) 상기 측정된 메틸화 수준을 기준으로 대장암, 직장암 또는 대장 선종 여부를 판단하는 단계;를 포함하는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 개체의 대장암, 직장암 또는 대장 선종을 진단 및 치료하는 방법을 제공한다.
i) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
ii) 상기 시료로부터 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
iii) 상기 측정된 메틸화 수준을 기준으로 대장암, 직장암 또는 대장 선종 여부를 판단하는 단계;
iv) 상기 판단된 개체에 방광암을 치료하기 위한 치료 약물을 투여하거나 수술을 통해 대장암, 직장암 또는 대장 선종을 치료하는 단계.
상기 i) 내지 iv) 단계를 포함하는 방법들은, 전술한 a) 내지 c) 단계를 포함하는 방법에 준하여 이해된다.
상기 iv) 단계는 상기 iii) 단계에서 질환이 진단된 개체에 치료 약물 투여 또는 수술 등의 수단을 통해 상기 질환의 치료를 수행하는 단계이다.
본 발명의 상기 '치료'는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 또는 상기 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 대장암, 직장암 또는 대장 선종으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 '치료 약물'은 통상적으로 대장암, 직장암 또는 대장 선종의 치료에 대하여 사용되는 약물 종류라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다. 또한 상기 치료 약물은 '치료학적으로 유효한 양'으로 개체에 투여되며, 상기 치료학적으로 유효한 양은 당업자가 약물의 고유성질, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량을 결정할 수 있다. 상기 치료 약물의 투여 경로는 특별히 제한되지 않으며, 경구 또는 비경구적으로 투여되는 것일 수 있으며, 국소적 투여뿐만 아니라 전신적 경로의 투여를 모두 포함한다. 상기 비경구적 투여는, 이에 제한되지 않으나, 일례로 비강내 약물 도포, 피하주사 등일 수 있으며, 또 다른 일례로 근육내 주사, 정맥 주사 등의 방법을 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 '시료'는 질환이 의심되는 개체로부터 분리 수득되는 것으로서, 이에 제한되지는 않으나, 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담. 점막액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 '개체'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 치료 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "을 포함하는(comprising)"이란 "함유하는(including)" 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 "로 이루어지는(consisting of)"이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 "필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)"이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, GLRB 유전자의 CpG 부위 과메틸화는 대장암, 직장암 또는 대장 선종에서 특이적으로 나타나므로, 본 발명에 따른 조성물, 키트, 칩 또는 방법을 이용하여 대장암, 직장암 또는 대장 선종을 정확하고 신속하게 진단할 수 있으며, 더불어 조기에 진단할 수 있다.
도 1은 총 32 종의 암 유형에서 GLRB 유전자의 메틸화 정보를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따라 선별된 GLRB 유전자의 대장직장암 진단 정확도를 확인한 결과이다.
도 3은 대장직장암 종양 조직(tumor) 세포주 그룹과 비 대장직장암 종양 조직 (others) 세포주 그룹간 메틸화의 차이를 확인한 결과이다.
도 4는 대장 선종(adenoma)에서 종양 조직(cancer), 대장직장 선종 조직(adenoma), 정상 조직(normal)에서의 메틸화 차이를 확인한 결과이다.
도 5는 대장 선종(adenoma)에서 종양 조직(cancer), 종양 주변 정상조직 (non tumor)에서의 qMSP 기반 메틸화 차이를 확인한 결과이다.
도 6은 비교예로서, OPLAH 유전자의 메틸화 정보를 확인한 결과이다.
도 7은 대장 선종(Adenoma), 종양 조직(Tumor), 종양 주변 정상 조직 (Non-tumor)에서의 드롭렛 디지털 유전자증폭법(Droplet digital PCR, ddPCR) 기반 메틸화 차이를 확인한 결과이다.
도 8은 정상인 및 대장암 환자의 혈장에서 드롭렛 디지털 유전자증폭법(Droplet digital PCR, ddPCR)을 사용하여 메틸화 차이를 분석한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 대장직장암 특이적 메틸화 유전자 선별
대장직장암에서 특이적으로 발견되는 메틸화 유전자를 선별하고자, 2개의 대규모 메틸레이션 마이크로어레이 칩(methylation microarray chip) 데이터를 이용해 대장직장암 환자의 암 수술로부터 얻은 암 조직과 정상 조직의 대규모 메틸화 비교 연구를 수행하였다(표 2 참고). 해당 연구에서 사용된 종양 조직(tumor tissue)은 대장직장암의 암 조직을 의미하며, 비종양 조직(non-tumor tissue)은 정상 조직을 포함한 암 조직 이외의 조직을 의미한다.
dataset#1 dataset#2 총합
종양
(tumor) 		112개 395개 507개
비종양
(non-tumor) 		149개 45개 194개
대장직장암 특이적 메틸화 유전자 선별하기 위해서 각 조직에서 DNA를 추출하였으며, Infinium Human Methylation 450 Beadchip microarray를 이용해 유전자 부위의 메틸화 정도를 확인하였다.
각 조직으로부터 추출된 DNA는 바이설파이트 처리를 통해 변환한다. 이를 통해 DNA 부위의 메틸화 여부에 따라 사이토신 염기의 변형이 이루어진다. 해당 microarray 실험에 사용되는 프로브는 유전자 메틸화 부위의 사이토신 염기 변형 여부를 확인하기 위해 메틸화(methylation), 비메틸화(unmethylation) 특이적으로 디자인되었다.
해당 microarray 실험은 각각 유전자의 메틸화 부위를 나타내는 약 45만개(450k)의 프로브(probe)들을 통해 유전자의 메틸화 정도를 측정하며 시험을 통해 도출된 각 프로브의 결과는 베타값(beta value)으로 제시된다. 베타값은 0에서 1까지의 값을 가지며 1에 가까울수록 해당 유전 부위의 메틸화 정도가 높다고 판단된다.
종양 그룹과 비종양 그룹간 차별적인 메틸화 부위(differentially methylated regions, DMRs)를 확인하고자 경험적 베이즈 t-test (empirical Bayes t-test)인 Limma (Linear Models for Microarray Data) 방법을 사용하여 그룹 간 통계적으로 유의한 메틸화 차이를 보이는 유전자 부위를 확인하였다.
Limma 방법은 그룹 간 차이를 확인하는 여러 메틸화 통계 분석 방법 중 가장 이상치 (outlier)에 적은 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 따라서 일부 샘플의 비정상적 측정값으로부터 영향을 적게 받아 암 특이적 마커를 찾는데 적합한 방법이다. 본 실험에서는 Limma 방법을 통해 도출된 보정된 p값 (adjusted p-value)값이 적을수록 두 그룹 간 유의한 메틸화 차이가 있다고 판단하였다.
특히 종양 특이적 메틸화 부위 탐색을 위해서 종양과 비종양 그룹 간 유의한 베타값 차이가 있는 유전자 부위 중 비종양보다 종양 조직에서 더 높은 메틸화를 부위를 암 특이적 바이오마커 후보로 선정하였다.
그 결과 2개의 dataset 각각에서 Limma 분석 결과 비종양 그룹에 비해 종양 그룹 간 비교 시 유의하게 낮은 p값(가장 낮은 P값을 가지는 상위 10%)을 가지며 그룹 간 베타값 0.2 이상의 큰 차이를 유전자 부위를 종양 특이적 과메틸화 부위(hypermethyalted regions)로 선별하였다. 이를 통해 약 45만개의 유전 부위 중 dataset 모두 공통으로 종양 특이적 과메틸화를 보이는 3,878개의 유전 부위를 바이오마커 후보로 선별하였다.
실시예 2: 대장직장암 특이적 과메틸화 유전자 선별
상기 실시예 1에서 확인한 바이오마커 3,878개의 유전 부위에 있어서, 대장직장암 이외의 종양에서 각 해당 부위의 메틸화 정도를 확인하고 비교하여 바이오마커 중 대장직장암 또는 대장 선종 특이적인 유전 부위를 찾았다. 암 유전자 공공 데이터 베이스인 TCGA (The Cancer Genome Atlas)의 DNA methylation 450k array 실험 결과를 분석하여 32종의 암 유형(cancer type)에 해당하는 유전 부위 메틸화 정보를 확인할 수 있었다. 이 중 대장암 및 직장암 외 나머지 30종의 암 대비 대장암, 직장암 또는 대장 선종에서 유의하게 높은 베타값을 보이는 유전 부위를 확인한 결과, 3,878개의 유전 부위 중 GLRB 유전자의 유전 부위가 대장암, 직장암 또는 대장 선종 특이적 메틸화가 발생함을 확인할 수 있었다.
상기 유전자에 대한 종양 조직(tumor tissue, 대장직장암의 암 조직) 및 비종양 조직(non-tumor tissue, 정상 조직을 포함한 암 조직 이외의 조직)에 대한 상기 microarray 실험을 통한 유전자의 메틸화 정도는 도 1과 같다. 메틸화 정도는 시험을 통해 도출된 각 프로브의 결과를 베타값(beta value)으로 나타냈으며, 베타값은 0에서 1까지의 값을 가지며 1에 가까울수록 해당 유전 부위의 메틸화 정도가 높다고 판단하였다.
한편, 대장암, 직장암 또는 대장 선종의 종양 조직과 비종양 조직 비교 시 메틸화 차이가 관찰되는 유전 부위의 경우 대장암, 직장암 또는 대장 선종 이외의 다른 암에 대해서도 메틸화가 발생될 수 있다. 즉, 대장암, 직장암 또는 대장 선종 특이적 메틸화가 확인되는 것은 아니었다.
예를 들어, OPLAH (5-oxoprolinase, ATP-hydrolysing) 유전자의 경우 상기 실시예 1에서 확인한 3,878개의 유전 부위 중 가장 큰 종양 조직과 비종양 조직 간 메틸화 차이가 확인된 부위 중 하나였으나, 도 5에서 보듯이 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia), 안구 흑색종(Ocular melanomas), 갈색세포종양&부신결절종(Pheochromocytoma&paraganglioma), 흉선종(Thymoma), 갑상선암(Thyroid cancer) 등을 제외한 모든 종류의 암종에서 높은 메틸화가 발생함을 확인하였다.
상기 32 종의 암은 다음과 같다: 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia), 부신피질 암(Adrenocortical cancer), 담도암(Bile Duct cancer), 유방암(Breast cancer), 자궁경부암(Cervical Cancer), 대장암(Colon cancer), 자궁내막암(Endometrioid Cancer), 식도암(Esophageal Cancer), 교모세포종(Glioblastoma), 두경부암(Head and neck cancer), 신장혐색소암종(Kidney chromophobe), 신세포암(Kidney Clear cell carcinoma), 신장 유두모양 세포 암종(Kidney Papillary cell carcinoma), 간암(Liver cancer), 저등급교종(Lower Grade Glioma), 폐선암(Lung adenocarcinoma), 흑색종(Melanoma), 중피종(Mesothelioma), 안구 흑색종(Ocular melanomas), 난소암(Ovarian cancer), 췌장암(Pancreatic cancer), 갈색세포종양&부신결절종(Pheochromocytoma&paraganglioma), 전립선암(Prostate cancer), 직장암(Rectal cancer), 육종(Sarcoma), 위암(Stomach cancer), 고환암(Testicular cancer), 흉선종(Thymoma), 갑상선암(Thyroid cancer), 자궁육종(Uterine carcinosarcoma).
이러한 유전 부위 중 위유전자(pseudogene)가 아니며 해당 부위가 CpG 섬 (CpG island) 부위에 존재하고 유전자의 전사 시작 부위(transcription start site, TSS)로부터 +/- 2000 염기 (base) (2kb) 사이에 선별된 유전 부위에 있으며 상염색체(autosome)에 존재하는 경우에 대장직장암 특이적 과메틸화 유전자로 선별하였다. 그 결과 하기 표 3과 같이, 1개의 유전자가 선별되었다(도 1 참고).
Symbol Name Location
(Chromosome) 		CpG Island
GLRB glycine receptor beta 4 Island
실시예 3: 세포주에서 선별 유전자의 대장직장암 특이성 확인
선별된 GLRB 유전자가 타 암과 구별되는 대장암, 직장암 특이적인 메틸화를 나타내는지 확인하기 위해 공공 데이터베이스를 활용해 크게 14개의 조직서 유래된 1,022개의 암세포주(cancer cell lines)에서의 메틸화 패턴을 분석하였다. 해당 데이터는 각 세포주에서 추출한 DNA를 표준화된 제조사의 메틸화 분석 시험 과정에 따라 Infinium Human Methylation 450 Beadchip microarray 실험한 결과이다.
수행된 실험의 결과값은 상기 실시예 1에서와 같이 약 45만개의 프로브들을 통해 유전자 메틸화 정도를 측정하며 각 프로브의 메틸화 값은 베타값으로 제시된다. 베타값은 0에서 1까지의 값을 가지며 1에 가까울수록 해당 유전 부위의 메틸화 정도가 높다고 판단한다.
상기 14개의 조직은 다음과 같다: 호흡소화관(aerodigestive tract), 혈액 (blood), 뼈(bone), 유방(breast), 소화기 계통(digestive system), 신장(kidney), 폐(lung), 신경계(nervous system), 췌장(pancreas), 피부(skin), 연조직(soft tissue), 갑상선(thyroid), 비뇨생식기계통(urogenital system), 기타 조직(other tissue).
선별된 GLRB 유전자의 대장암, 직장암 또는 대장 선종 특이적 메틸화를 확인하기 위해 1,022개의 세포주에서 유래된 메틸화 데이터는 크게 대장직장암 세포주 그룹(n=51)과 비 대장직장암 세포주 그룹(n=971)으로 분류하였다
분류된 두 그룹 간 차별적인 메틸화 부위(differentially methylated regions, DMRs)를 확인하고자 경험적 베이즈 t-test (empirical Bayes t-test)인 Limma (Linear Models for Microarray Data) 방법을 사용하여 그룹 간 통계적으로 유의한 메틸화 차이를 보이는 유전자 부위를 확인하였다.
선별된 GLRB 유전자의 대장직장암 세포주 그룹과 비 대장직장암 세포주 그룹 간 메틸화의 차이
Symbol Difference
(average Δβ) 		adjusted p-value
GLRB 0.65 7.05e-31
세포주를 사용한 분석에서도 GLRB 유전자는 다른 암 세포주에 비해 대장암, 직장암 세포주에서도 확연하게 낮은 보정된 p값(adjusted p-value)을 가져 대장직장암 특이적이라는 것이 확인되었다.
실시예 4: 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단 마커 후보의 진단 성능평가
선별된 유전자의 대장직장암에서 진단 마커로서의 유용성을 확인하기 위해 메틸화 정도에 따른 대장직장암 진단의 정확도를 평가하였다.
진단의 정확도를 평가하기 위해서는 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 사용한다. 연속된 진단 검사 측정치의 가능한 절단값(cut-off value)에 대한 민감도와 특이도의 값의 계산을 통해 절단값에 따른 민감도와 특이도의 변화를 제시하는 ROC (Receiver Operating Characteristic) curve를 나타낼 수 있다. 진단의 정확도는 ROC curve 아래의 면적 (area under the ROC curve, AUC)에 의해 측정될 수 있다. AUC값은 0.5에서 1 사이의 값을 가지고 그 값이 클수록 진단 정확도가 높다고 평가한다. 만약 AUC값이 1이라면 진단 결과가 완벽히 정확한 검사임을 의미하지만 0.5일 경우 무작위 결과와 동일하다고 판단한다.
선별된 유전자를 이용한 비종양 조직과 종양 조직 간의 메틸화 정도에 따른 암 분류 정확도를 수집된 메틸레이션 데이터셋을 이용해 분석한 결과 도 2와 같이, 모든 선별된 유전자는 0.920 이상의 AUC (Area Under Curve) 값을 가져 높은 진단 정확도를 보여 선별된 유전자가 대장직장암 진단에 유용한 것을 확인하였다.
실시예 5: 선별된 유전자의 선종(adenoma)에서의 메틸화 확인
선종(adenoma)은 대장직장암으로 진행되기 전 단계의 질환으로 대부분의 대장암은 선종에서부터 발생한다. 따라서 빠른 선종의 발견은 대장직장암의 조기 진단을 위해 필수적이다. 앞선 연구를 통해 선별된 과메틸화 바이오마커가 선종에서도 과메틸화의 특징이 나타나는지 확인하기 위해 대장직장암의 종양(colorectal cancer) 조직 64개, 대장직장 선종(colorectal adenoma) 조직 42개, 비종양(non-tumor) 조직 41개로부터 선별된 유전자의 과메틸화 특성을 조사하였다.
Human Methylation450 Beadchip microarray 실험을 통해 도출된 메틸화 데이터를 분석한 결과, 도 4에서 보듯이, 선별된 유전자는 비종양 조직과 유의한 과메틸화의 특성이 대장직장암 뿐만 아니라 대장직장 선종에서도 동일한 양상으로 나타난다는 것을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과로, 선별된 유전자가 대장직장암 뿐 아니라 대장직장 선종의 진단에도 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6: 선별된 유전자의 조직에서의 qMSP 기반 메틸화 측정
암 조직에서 GLRB 유전자의 대장직장암 및 선종 특이적 메틸화를 확인하기 위하여 메틸화 특이 PCR (quantitative methylation specific PCR, qMSP) 기법을 이용하여 암조직과 비암조직 간 메틸화 차이를 측정하였다. 이를 위하여 12명의 대장직장암 환자의 암조직과 암 주변 조직 쌍 및 4명의 선종 환자의 암 조직으로부터 게놈 DNA를 분리하였으며, 바이설파이트 처리를 한 후 일반화된 qMSP 실험 방법에 따라 GLRB 특이적 유전자 부위의 증폭 및 메틸화 정도를 관찰하고자 하였다.
또한 바이설파이트로 변형된 유전 부위에 특이적으로 결합하여 증폭하며 해당 부위의 증폭된 값을 표준화하기 위해 메틸화와 관련없는 ACTB 유전자를 사용하였다.
상기 바이설파이트로 전환된 DNA를 PCR로 증폭시킨 메틸화 수준은 internal control로 사용한 ACTB의 Ct (Cycle of throshold)값으로 보정한 값인 ΔCt로 나타낸다. ΔCt는 다음과 같이 정의된다:
ΔCt = ACTB 유전자의 Ct값 - 검출 대상 유전자의 Ct값
도 5에서 보는 바와 같이, GLRB 유전자의 메틸화는 암 주변 정상조직과 비교하여 대장암 조직에서 병기와 관계없이 상대적으로 높은 ΔCt 값을 가지며, 특히 전암 단계인 선종(Adenoma)에서 매우 높은 ΔCt 값을 보여 대장암 및 대장 선종에서 GLRB 유전자가 hypermethylation된 것을 확인할 수 있었다. 이는 선별된 GLRB 유전자의 메틸화가 대장암의 진단, 특히 조기진단의 바이오마커로 효과적임을 실제로 보여주는 결과이다.
이와 같은 결과로, 선별된 유전자가 대장직장암 뿐 아니라 대장직장 선종의 진단에도 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 7: 선별된 유전자의 조직에서 digital PCR 기반 메틸화 측정
일반적인 real-time PCR 방법 대비 뛰어난 검출 민감도를 보이는 디지털 PCR 기법을 이용하여 암조직과 비암조직 간 메틸화 차이를 측정하였다. 이를 위하여 16명의 대장직장암 환자 암조직과 암 주변조직 쌍(병기별 4쌍) 및 5명의 선종 환자의 암 조직으로부터 게놈 DNA를 분리하였으며, 바이설파이트 처리한 후 드롭렛 디지털 PCR (Droplet digital PCR, ddPCR) 기법을 이용하여 GLRB 특이적 유전자 부위의 증폭 및 메틸화 정도를 관찰하고자 하였다.
바이설파이트로 인한 유전부위의 변형 및 PCR을 이용한 유전부위 증폭 여부에 대한 대조군(internal control)은 ACTB 유전자를 사용하였다.
상기 바이설파이트로 전환된 cfDNA를 ddPCR로 증폭시킨 메틸화 정도를 카피수로 산출하였다
도 7에서 보는 바와 같이 GLRB 유전자의 메틸화는 암 주변 정상조직과 비교하여 대장암 조직에서 병기와 관계없이 상대적으로 높은 카피수를 가지며, 특히, 전암 단계인 선종에서 매우 높은 카피수를 보여 Real-time PCR을 이용한 결과와 같이 대장암 및 대장 선종에서 GLRB 유전자가 과메틸화(Hypermethylation)된 것을 확인할 수 있었다. 이는 선별된 GLRB 유전자의 메틸화를 Real-time PCR 뿐 아니라 디지털 PCR 기법에서도 효과적으로 검출할 수 있음을 보여주는 결과이다.
이와 같은 결과로, 선별된 유전자가 다양한 분자생물학적 기법을 이용하여 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 8: 혈장에서 디지털 PCR 기반 메틸화 측정
혈액 검체에서 대장직장암의 특이적 메틸화를 확인하기 위하여 ddPCR 기법을 이용하여 대장직장암 환자와 정상인 간 메틸화 차이를 측정하였다. 이를 위하여 10개의 대장직장암 환자의 혈장 검체와 정상인의 혈장 검체를 수집하여 세포 유리 DNA (Cell-free DNA, cfDNA)를 분리하였으며, 바이설파이트 처리한 후 ddPCR 실험 방법에 따라 GLRB 특이적 유전자 부위의 증폭 및 메틸화 정도를 관찰하고자 하였다.
도 8에서 보는 바와 같이, GLRB 유전자의 메틸화는 정상인과 비교하여 대장직장암 혈장 검체에서 높은 메틸화 수준을 보였으며 100% 정확도로 측정할 수 있음을 보였다. 이는 선별된 GLRB 유전자의 메틸화가 조직뿐 아니라 혈액기반의 대장암의 진단에 효과적임을 보여주는 결과이다.
이상 살펴본 바와 같이 GLRB 유전자의 CpG 부위 과메틸화는 대장암, 직장암 또는 대장 선종에서 특이적으로 나타나므로, 본 발명에 따른 조성물, 키트, 칩 또는 방법을 이용하여 대장암, 직장암 또는 대장 선종을 정확하고 신속하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라 조기에 진단할 수 있다.

Claims (12)

  1. GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CpG 부위는 유전자의 전사 시작 부위로부터 +/- 2000 염기(base) (2kb) 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 또는 메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물;
    GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머; 및
    비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite), 이의 염이며, 상기 메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 TET 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 메틸화 수준의 측정은 바이설파이트 비의존적 (bisulfite-free) 검출법, 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질 또는 메틸화 민감 제한효소 (methylation sensitive restriction enzyme)을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱 및 차세대염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물
  6. GLRB 유전자의 CpG 부위를 포함하는 단편을 증폭하기 위한 프라이머쌍을 포함하는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 키트.
  7. GLRB 유전자의 CpG 부위를 포함하는 단편과 혼성화(hybridization)할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 핵산 칩.
  8. 대장암, 직장암 또는 대장 선종 발생이 의심되는 개체의 시료로부터 GLRB 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 메틸화 수준을 기준으로 대장암, 직장암 또는 대장 선종 여부를 판단하는 단계;를 포함하는, 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 메틸화 수준을 측정하는 방법은 바이설파이트 비의존적 (bisulfite-free) 검출법, 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질 또는 메틸화 민감 제한효소 (methylation sensitive restriction enzyme)을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱 및 차세대염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 대변 및 소변으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 제제를 제조하기 위한 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제의 용도.
  12. a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
    b) 상기 시료로부터 GLRB 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
    c) 상기 측정된 메틸화 수준을 기준으로 대장암, 직장암 또는 대장 선종 여부를 판단하는 단계;를 포함하는 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단 방법.
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