WO2022216125A1 - Dna 메틸화 마커 검출을 이용한 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물 및 이의 활용 - Google Patents

Dna 메틸화 마커 검출을 이용한 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물 및 이의 활용 Download PDF

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WO2022216125A1
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methylation
fatty liver
liver disease
measuring
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PCT/KR2022/005162
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김미랑
김원
박종열
고한용
임현정
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한국생명공학연구원
서울대학교병원
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a composition for diagnosing nonalcoholic fatty liver disease using DNA methylation marker detection and its application, and more particularly, to a nonalcoholic fatty liver disease diagnosis of a composition capable of detecting a genetic marker whose DNA methylation changes in nonalcoholic fatty liver disease It relates to uses and uses thereof.
  • Fatty liver disease also called fatty liver, is a disease that causes liver damage due to abnormal accumulation of fat (triglycerides, etc.) in liver cells.
  • Fatty liver disease is largely divided into alcoholic fatty liver disease and nonalcoholic fatty liver disease.
  • nonalcoholic fatty liver disease is the most common cause of chronic liver disease, and is characterized by the accumulation of triglycerides in the liver cells of patients without excessive alcohol intake.
  • the prevalence of nonalcoholic fatty liver disease continues to increase in parallel with the overnutrition associated with high-fat and high-carbohydrate intake.
  • liver function tests such as aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) and abdominal ultrasonography are widely used. Because it may be normal, the sensitivity is lowered as a screening test. Abdominal ultrasonography has high sensitivity, but it has the disadvantage of being expensive as a screening test. Other serum ferritin and uric acid tests are being studied as screening tests, but additional research is needed to evaluate their effectiveness (Kim C.W., et al. Metabolism, 61:1182-1188, 2012).
  • the present inventors have conducted intensive studies to search for new biomarkers and combinations thereof that can accurately diagnose nonalcoholic fatty liver disease. It was confirmed that it was reduced, and the present invention was completed.
  • an object of the present invention is the expression level of a gene selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2.
  • a gene selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2.
  • an object of the present invention is the expression level of a gene selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2.
  • a gene selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2.
  • an object of the present invention is the expression level of a gene selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2.
  • a composition for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease which consists essentially of an agent capable of measuring the methylation level of the CpG region of these genes.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing nonalcoholic fatty liver disease comprising the composition.
  • Another object of the present invention is to provide information necessary for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease, SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2,
  • To provide a method for measuring the methylation level of a gene CpG region comprising measuring the methylation level of a gene CpG region selected from the group consisting of TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2.
  • Another object of the present invention is to provide information necessary for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease, SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2,
  • a method for measuring gene expression levels comprising measuring the expression level of a gene selected from the group consisting of TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2.
  • Another object of the present invention is to provide useful information for selecting an EZH2 inhibitor as a therapeutic agent for patients with nonalcoholic fatty liver disease, SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26 , TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 to provide a method for measuring the methylation level of a gene CpG region comprising the step of measuring the methylation level of the gene CpG region selected from the group consisting of.
  • Another object of the present invention is SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12 and To provide the use of an agent capable of measuring the expression level of a gene selected from the group consisting of or the methylation level of the CpG region of these genes.
  • Another object of the present invention is
  • the processed DNA is selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 gene CpG regions. Amplifying using a primer capable of amplifying the;
  • the present invention provides a group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2. It provides a composition for diagnosing nonalcoholic fatty liver disease, comprising an agent capable of measuring the expression level of a selected gene or the methylation level of the CpG region of these genes.
  • the present invention provides an expression level of or selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 genes.
  • a composition for diagnosing nonalcoholic fatty liver disease comprising an agent capable of measuring the methylation level of a gene CpG region.
  • the present invention provides an expression level of or selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 genes.
  • a composition for diagnosing nonalcoholic fatty liver disease consisting essentially of an agent capable of measuring the methylation level of a gene CpG region.
  • the present invention provides a kit for diagnosing nonalcoholic fatty liver disease comprising the composition.
  • the present invention provides SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26 in a biological sample provided from a subject in order to provide information necessary for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease.
  • TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and provides a method for measuring the methylation level of a gene CpG region comprising measuring the methylation level of a gene CpG region selected from the group consisting of TGFB2.
  • the present invention provides SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26 in a biological sample provided from a subject in order to provide information necessary for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease.
  • TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12 comprising the step of measuring the expression level of a gene selected from the group consisting of GLIS3 and TGFB2, it provides a method for measuring gene expression level.
  • the present invention provides SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, Measuring the methylation level of a CpG region of a gene, comprising measuring the level of methylation of a CpG region of a gene selected from the group consisting of NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 provide a way
  • the present invention provides SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63,
  • the processed DNA is selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 gene CpG regions. Amplifying using a primer capable of amplifying the;
  • step (e) provides a method for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease, comprising the step of diagnosing infectious non-alcoholic fatty liver disease when the methylation level of the gene CpG region is increased compared to normal individuals in step (d).
  • the present invention relates to the expression level of a gene selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2, or CpG of these genes It provides a composition for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease, comprising an agent capable of measuring the methylation level of the site.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing nonalcoholic fatty liver disease comprising the composition.
  • the present inventors provide SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, GLISANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF3 in patients with nonalcoholic fatty liver disease. And it was confirmed that the expression level of the TGFB2 gene and the specific CpG region of these genes are hypermethylated or hypomethylated compared to normal people, and based on this, the expression level or methylation level of the genes is determined using a biomarker to treat nonalcoholic fatty liver disease. A molecular biological diagnostic technology for diagnosing is provided.
  • the term 'expression' means that a protein or nucleic acid is produced in a cell.
  • 'protein' is used interchangeably with 'polypeptide' or 'peptide', for example, refers to a polymer of amino acid residues as commonly found in proteins in a natural state.
  • 'polynucleotide' or 'nucleic acid' refers to deoxyribonucleotides (DNA) or ribonucleotides (RNA) in single- or double-stranded form. Unless otherwise limited, known analogs of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner analogous to naturally occurring nucleotides are also included.
  • 'mRNA' is an RNA that delivers genetic information (gene-specific nucleotide sequence) to the ribosome, which specifies the amino acid sequence from a specific gene during protein synthesis.
  • the expression level means measuring the expression level of a protein or gene encoded by each of the genetic markers.
  • the agent for measuring the expression level of the protein encoded by each genetic marker is not particularly limited as long as it is known in the art that it can be used for measuring the expression level of a protein, but preferably an antibody that specifically binds to each protein Or it may be an aptamer.
  • measuring the expression level of each gene means measuring the expression level of transcripts derived from each gene, and for example, measuring the mRNA expression level.
  • the agent for measuring the expression level of the gene is not limited thereto, but may preferably mean an agent for detecting mRNA expressed from the gene. Therefore, the type of the agent for detecting each gene is not particularly limited as long as it is a ligand that specifically attaches or hybridizes to the mRNA expressed from the gene, but may be, for example, a primer (pair) or a probe.
  • methylation refers to the attachment of a methyl group to a base constituting DNA.
  • methylation refers to whether methylation occurs in cytosine of a specific CpG region of a specific gene.
  • methylation the binding of transcription factors is disturbed and the expression of a specific gene is suppressed, and, conversely, when unmethylation or hypomethylation occurs, the expression of a specific gene is increased.
  • 5-methylcytosine (5-mC) 5-methylcytosine with a methyl group attached to the fifth carbon of the cytosine ring.
  • CpG is the site of most epigenetic changes in mammalian cells, as 5-mC is prone to natural deamination to thymine (T). It is the most well-known epigenetic change caused by the addition of a methyl group to the 5'-position of cytosine (CpG) DNA methylation changes are easy to detect because they exist in DNA, are more stable than protein or RNA markers, and Since it occurs at a specific location of a gene, it has the advantage of easy analysis.
  • the CpG region of a gene refers to a CpG region present on the DNA of a gene.
  • the DNA of a gene is a concept that includes all a series of structural units necessary for expression of a gene and operably linked to each other, for example, a promoter region, a protein coding region (open reading frame, ORF) and a terminator region.
  • a promoter region for example, a promoter region, a protein coding region (open reading frame, ORF) and a terminator region.
  • the CpG region of a gene may exist in a promoter region, a protein coding region (open reading frame, ORF) or a terminator region of the corresponding gene.
  • the genes of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 can be identified in known gene databases. have.
  • NR5A2 is a member of the nuclear receptor family of intracellular transcription factors. NR5A2 plays an important role in the regulation of development, cholesterol transport, bile acid homeostasis, and steroid production.
  • the human NR5A2 gene is located on chromosome 1 and is registered as Gene ID: 2494 in the NCBI Entrez database.
  • the CYP2C19 belongs to the CYP2C subfamily of the cytochrome P450 mixed function oxidase system, and the human CYP2C19 gene is located on chromosome 10. It is registered as Gene ID: 1557 in NCBI Entrez database.
  • the SALL1 is a human version of the spalt gene known from Drosophila.
  • the human SALL1 gene is located on chromosome 16 and is registered as Gene ID: 6299 in the NCBI Entrez database.
  • the IGFBP1 is a gene encoding the IGFBP1 protein, which is a member of the insulin-like growth factor-binding protein (IGFBP1) family, and the protein functions to increase the half-life of IGF after binding to insulin-like growth factor (IGF).
  • the human IGFBP1 gene is located on chromosome 7 and is registered as Gene ID: 3484 in the NCBI Entrez database.
  • the NCOR1 is a gene encoding a transcriptional regulatory protein containing several nuclear receptor interaction domains.
  • the human NCOR1 gene is located on chromosome 17 and is registered as Gene ID: 9611 in the NCBI Entrez database.
  • the MGMT is a gene encoding a protein essential for maintaining the stability of the genome by repairing a naturally occurring mutant DNA region.
  • the human MGMT gene is located on chromosome 10 and is registered as Gene ID: 4255 in the NCBI Entrez database.
  • the TP63 is located on human chromosome 3 and is registered as Gene ID: 8626 in the NCBI Entrez database.
  • the LIMA1 is a gene encoding EPLIN, a cytoskeleton-associated protein that prevents depolymerization of actin filaments.
  • the human LIMA1 gene is located on chromosome 12 and is registered as Gene ID: 51474 in the NCBI Entrez database.
  • the ARHGEF12 is located on human chromosome 11 and is registered as Gene ID: 23365 in the NCBI Entrez database.
  • the MTSS1 is located on human chromosome 8 and is registered as Gene ID: 9788 in the NCBI Entrez database.
  • the WBP1L is located on human chromosome 10, and is registered as Gene ID: 54838 in the NCBI Entrez database.
  • the ARHGEF26 is located on human chromosome 3 and is registered as Gene ID: 26084 in the NCBI Entrez database.
  • the TBC1D14 is located on human chromosome 4 and is registered as Gene ID: 57533 in the NCBI Entrez database.
  • the ANKS1A is located on human chromosome 6 and is registered as Gene ID: 23294 in the NCBI Entrez database.
  • the TNS2 is located on human chromosome 12 and is registered as Gene ID: 23371 in the NCBI Entrez database.
  • the GLIS3 is located on human chromosome 9 and is registered as Gene ID: 169792 in the NCBI Entrez database.
  • the TGFB2 is located on human chromosome 1 and is registered as Gene ID: 7042 in the NCBI Entrez database.
  • measuring the methylation level of the NR5A2 gene may mean measuring the methylation level at a site indicated by Illumina ID cg20406878 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the CYP2C19 gene may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg27505447 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the SALL1 gene may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg08304084 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the IGFBP1 gene may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg18463453 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the NCOR1 gene may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg14044233 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the MGMT gene may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg00639517 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the TP63 gene in the present invention may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg15007954 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the LIMA1 gene may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg19342791 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the ARHGEF12 gene may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg05099464 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the MTSS1 gene may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg24838345 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the WBP1L gene in the present invention may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg05809484 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the ARHGEF26 gene may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg06465407 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the TBC1D14 gene may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg04470688 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the ANKS1A gene in the present invention may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg08194377 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the TNS2 gene may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg06149155 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the GLIS3 gene in the present invention may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg15089921 in HumanEPIC BeadChip.
  • measuring the methylation level of the TGFB2 gene may mean measuring the methylation level at the site indicated by Illumina ID cg24000206 in HumanEPIC BeadChip.
  • the nucleotide sequence of the human genome chromosomal region is expressed according to GRCh37 Genome Reference Consortium Human Reference 19 (GRCh37/hg19), but the specific sequence of the human genome chromosomal region is slightly changed as the genome sequence study results are updated. and the expression of the human genome chromosomal region of the present invention may be different according to such changes. Therefore, the human genome chromosomal region expressed according to the GRCh37 Genome Reference Consortium Human Reference 19 (GRCh37/hg19) of the present invention has been updated with the human reference sequence after the filing date of the present invention to express the human genome chromosomal region. Even if this is changed differently from now, it will be apparent that the scope of the present invention extends to the altered human genome chromosomal region. These changes can be easily recognized by anyone with ordinary skill in the art to which the present invention pertains.
  • the agent for measuring the methylation level of the CpG region is a compound that modifies an unmethylated cytosine base or a methylation-sensitive restriction enzyme, a primer specific for the methylated allele sequence of a gene, and a non-methylated allele sequence specific a primer, a methylated CpG binding domain, or a methylated DNA antibody that specifically binds to the methylated DNA (eg, an antibody that specifically binds to methylcytosine), and the like.
  • the compound that modifies the unmethylated cytosine base may be, but is not limited to, bisulfite or a salt thereof, and preferably sodium bisulfite.
  • Bisulfite-modified DNA can detect methylation through various methods such as sequencing or methylation-specific PCR, and the method of detecting methylation of a gene by modifying an unmethylated cytosine residue using this bisulfite is It is well known in the art (eg WO01/26536; US2003/0148326A1).
  • the methylation-sensitive restriction enzyme may be a restriction enzyme capable of specifically detecting methylation of a CpG site, and may be a restriction enzyme containing CG as a recognition site of the restriction enzyme. Examples include, but are not limited to, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI , and the like. Depending on the methylation or unmethylation at C of the restriction enzyme recognition site, whether or not cleavage by the restriction enzyme is changed, and this can be detected through PCR or Southern blot analysis. Methylation sensitive restriction enzymes other than the above restriction enzymes are well known in the art.
  • genomic DNA is obtained from a patient's sample, and a compound that modifies unmethylated cytosine bases in the obtained DNA or methylation sensitivity limiting
  • the treated DNA can be amplified by PCR using primers and measured by checking the presence or absence of the amplified product.
  • the agent of the present invention may include a primer specific for a methylated allele sequence of a gene and a primer specific for an unmethylated allele sequence.
  • the term "primer” refers to a short nucleic acid sequence that is capable of base pairing with a complementary template with a nucleic acid sequence having a short free three-terminal hydroxyl group and serves as a starting point for template strand copying. Primers are capable of initiating DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates in appropriate buffers and temperatures.
  • the primers may incorporate additional features that do not change the basic properties of the primers, which are sense and antisense nucleic acids with a sequence of 7 to 50 nucleotides, which serve as the starting point of DNA synthesis.
  • the primers of the present invention can be preferably designed according to the sequence of a specific CpG site to be analyzed for methylation, and each methylated primer pair capable of specifically amplifying cytosine that has not been modified by bisulfite; and a primer pair capable of specifically amplifying a cytosine modified by bisulfite because it is not methylated.
  • a methylated DNA antibody refers to an antibody that specifically binds to a methylated base in DNA.
  • an antibody having a property of recognizing and binding to methylated cytosine in a DNA chain, such as an antibody against methylcytosine is mentioned.
  • it may be an antibody capable of specifically recognizing and specifically binding to the methylated DNA described herein.
  • a methylated DNA antibody can be prepared by a conventional method using a methylated base, methylated DNA, or the like as an antigen.
  • a methylcytosine antibody 5-methylcytosine, 5-methylcytosine, or 5-methylcytosine-containing DNA as an antigen to prepare an antibody, and then use methylcytosine in DNA The specific binding of can be selected as an indicator.
  • methylated DNA is immunoprecipitated using these, and then Southern blot, PCR, microarray, or sequence A specific CpG site may be identified through sequencing or the like.
  • a substrate an appropriate buffer solution, a chromogenic enzyme or fluorescent substance label, a secondary antibody labeled with a chromogenic enzyme or fluorescent substance, and a chromogenic substrate may be used.
  • a nitrocellulose membrane As the substrate, a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized from polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized from polystyrene resin, and a glass slide glass may be used, and the chromogenic enzyme is peroxidase, alkaline phosphorus Alkaline phosphatase, etc. may be used, FITC, RITC, etc. may be used as a fluorescent material, and ABTS (2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfur) as a color developing substrate solution.
  • radioactive isotope labels examples include radioactive isotope labels, latex bead labels, colloidal labels, biotin labels, etc. may be used, but are limited thereto not.
  • nonalcoholic fatty liver disease in the present invention may include simple fatty liver disease, nutrient fatty liver disease, starvation fatty liver disease, obese fatty liver disease, diabetic fatty liver disease, steatohepatitis, liver fibrosis and cirrhosis, but is limited thereto. it's not going to be
  • the composition may be a composition for diagnosing the severity of non-alcoholic fatty liver disease.
  • the "severity” refers to the severity of a patient suffering from nonalcoholic fatty liver disease, and refers to the severity of symptoms from mild fatty liver disease to severe liver fibrosis, steatohepatitis, cirrhosis, and liver cancer.
  • the "severity” refers to the severity of nonalcoholic steatohepatitis, and the nonalcoholic steatohepatitis is divided into stages F0, F1, F2, F3, and F4 according to the stage of liver fibrosis. "Severity” may mean that the lesion worsens from NASH-F1 (F1 and F2) to NASH-F2 (F3 and F4), and further to cirrhosis and liver cancer.
  • composition and kit may further include a polymerase agarose, a buffer solution required for electrophoresis, and the like, in addition to the preparation.
  • kit may be implemented in the form of a DNA methylation microarray.
  • the present invention also provides SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LI in a biological sample provided from a subject in order to provide information necessary for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease.
  • ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 provides a method for measuring the methylation level of a gene CpG region, comprising measuring the methylation level of the gene CpG region selected from the group consisting of.
  • the step of measuring the methylation level of the CpG region of the gene comprises the steps of (a) treating genomic DNA in a biological sample provided from a subject with bisulfite or a salt thereof, or a methylation-sensitive restriction enzyme; and (b) converting the processed DNA into the gene CPG selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2. It may include the step of amplifying using a primer capable of amplifying the site.
  • the "biological sample” includes samples such as cells, tissues, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, or urine with different methylation levels of genes due to nonalcoholic fatty liver disease, but is not limited to the above examples. Any sample from which DNA extraction is possible can be used.
  • genomic DNA is obtained by phenol/chloroform extraction, SDS extraction, CTAB separation, or a commercially available DNA extraction kit commonly used in the art. can be done using
  • the step of detecting the methylation level of a specific CpG region of the gene a method using a restriction enzyme or bisulfite, using a difference between a methylated base and an unmethylated base, a methylated CpG binding domain or an anti-methylcytosine antibody Immunoprecipitation method (eg, MIRA, MeDIP) using a DNA methylation microarray, etc. can be performed.
  • a method using a restriction enzyme or bisulfite using a difference between a methylated base and an unmethylated base, a methylated CpG binding domain or an anti-methylcytosine antibody Immunoprecipitation method (eg, MIRA, MeDIP) using a DNA methylation microarray, etc.
  • methylation-specific polymerase chain reaction For example, methylation-specific polymerase chain reaction, real time methylation-specific polymerase chain reaction, PCR using methylated DNA-specific binding protein, quantitative PCR,
  • the methylation level may be measured or detected using pyrosequencing, bisulfite sequencing, DNA methylation microarray, or immunoprecipitation using a methylated CpG binding domain or an anti-methylcytosine antibody.
  • the method of the present invention comprises the steps of (a) treating the genomic DNA in the obtained sample with a compound that modifies unmethylated cytosine bases or a methylation-sensitive restriction enzyme; and (b) amplifying the processed DNA by PCR using a primer capable of amplifying a specific CpG region of the gene.
  • the compound that modifies the unmethylated cytosine base in step (a) may be bisulfite, preferably sodium bisulfite.
  • a method for detecting whether a gene is methylated by modifying an unmethylated cytosine residue using such a bisulfite is well known in the art.
  • the methylation-sensitive restriction enzyme in step (a) is a restriction enzyme capable of specifically detecting methylation of a specific CpG site, and may be a restriction enzyme containing CG as a recognition site of the restriction enzyme. , for example, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI , and the like, but is not limited thereto.
  • the amplification in step (b) may be performed by a conventional PCR method.
  • the primers used at this time can be preferably designed according to the sequence of a specific CpG site to be analyzed for methylation, and specifically amplify cytosines that have been methylated and have not been modified by bisulfite. and a primer pair capable of specifically amplifying a cytosine modified by bisulfite because it is not methylated.
  • the step of detecting the methylation level of the specific CpG region of the gene may further include (c) confirming the presence or absence of the amplified product in step (b).
  • the presence or absence of the amplified product in step (c) may be performed according to whether a band at a desired position is detected by a method known in the art, for example, electrophoresis.
  • a primer capable of specifically amplifying methylated cytosine that has not been modified by bisulfite The degree of methylation can be determined according to the presence or absence of a PCR product amplified by a pair and a primer pair capable of specifically amplifying a cytosine modified by bisulfite because it is not methylated.
  • methylation can be determined using a bisulfite genome sequencing method in which the sample genomic DNA is treated with bisulfite, the CpG region of the corresponding gene is amplified by PCR, and the nucleotide sequence of the amplified region is analyzed. .
  • CpG is methylated by a method known in the art, for example, if there is a PCR product in the DNA treated with a restriction enzyme in a state where the PCR product is shown in mock DNA, If there is no PCR product in the DNA treated with the enzyme, whether CpG is methylated can be determined according to the determination that it is unmethylated, which is apparent to those skilled in the art.
  • mock DNA refers to sample DNA separated from the sample and untreated.
  • an immunoprecipitation method using a methylated DNA antibody for example, an antibody against a methylated CpG binding domain (MBD) or methylcytosine
  • a specific CpG site can be identified through Southern blot, PCR, microarray, or sequencing.
  • the methylation level of the CpG region of a gene selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A and TNS2 in the biological sample was increased compared to that of a normal person ( hypermethylation), or when the methylation level of the CpG region of a gene selected from the group consisting of TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 is decreased (hypomethylated) compared to normal individuals, it can be determined that the patient has nonalcoholic fatty liver disease. .
  • the methylation change of the specific CpG region of the above-described gene is specifically shown in a sample from a patient with nonalcoholic fatty liver disease
  • the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease using the methylation change of the gene as a biomarker it may be usefully used for prognosis prediction.
  • the methylation level of the CpG region of a gene selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A and TNS2 in the biological sample is compared with that of a normal person.
  • a gene selected from the group consisting of TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 compared to normal individuals.
  • the present invention provides a molecular biological diagnostic method for diagnosing or predicting prognosis of nonalcoholic fatty liver disease by measuring the degree of methylation of a specific gene CpG region of genomic DNA collected from a patient's sample, which is simple, non-invasive, and has economic advantages. have.
  • DNA methylation changes are easy to detect, stable and easy to analyze compared to conventional protein or RNA markers.
  • composition, kit and method of the present invention selects a diseased patient from among nonalcoholic fatty liver disease patients and stops or delays the progression as much as possible through special and appropriate management, ultimately improving quality of life It can be used clinically to maintain
  • compositions, kits and methods of the present invention may be used to evaluate liver function in patients with nonalcoholic fatty liver disease, to evaluate the possibility of future changes in liver conditions in patients, to monitor deterioration of liver function, or to reduce the risk of future impairment of liver function. It can be used for various clinical purposes, such as determining or determining an appropriate treatment regimen.
  • the present invention also provides SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3, and provides a method for measuring the gene expression level comprising the step of measuring the expression level of a gene selected from the group consisting of TGFB2.
  • the above-mentioned bar may be referred to as a method for measuring the expression level of each gene.
  • the expression level of a gene selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A and TNS2 in the biological sample is decreased compared to that of a normal person, or TP63,
  • the expression level of a gene selected from the group consisting of LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 is increased compared to that of a normal person, it can be determined that the patient has nonalcoholic fatty liver disease.
  • the present invention also provides information useful for selecting an EZH2 inhibitor as a therapeutic agent for patients with nonalcoholic fatty liver disease. , ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and provides a method for measuring the methylation level of a gene CpG region comprising the step of measuring the methylation level of the gene CpG region selected from the group consisting of TGFB2.
  • Non-limiting examples of EZH2 inhibitors include compounds, molecules, chemicals, polypeptides, proteins that inhibit and/or decrease the expression and/or activity of EZH2. Additional non-limiting examples of EZH2 inhibitors include S-adenosyl-methionine-competitive small molecule inhibitors. In certain non-limiting embodiments, the EZH2 inhibitor is derived from a tetramethylpiperidinyl compound. Additional non-limiting examples include UNC1999, 3-deazaneplanosine A (DZNep), EI1, EPZ-5676, EPZ-6438, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 and GSK126.
  • DZNep 3-deazaneplanosine A
  • EZH2 inhibitors are described in Garapati-Rao et al., Chemistry and Biology, 20: pp. 1-11 (2013), PCT Patent Application Nos. WO 2013/138361, WO 2013/049770 and WO 2003/070887, and US Patent Application Nos. US 2014/0275081, US 2012/0071418, US 2014/0128393 and US 2011/0251216 ], the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.
  • the methylation level of the CpG region of a gene selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A and TNS2 in the biological sample was increased compared to that of a normal person ( hypermethylation), or when the methylation level of the CpG region of a gene selected from the group consisting of TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 is decreased (hypomethylated) compared to a normal person, non-alcoholic fatty liver in the subject from which the biological sample was isolated It may be desirable to select an EZH2 inhibitor as a treatment for a disease.
  • the present invention relates to the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 for manufacturing a preparation for diagnosing nonalcoholic fatty liver disease. It provides the use of an agent capable of measuring the expression level of a gene selected from or the methylation level of the CpG region of these genes.
  • the processed DNA is selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 gene CpG regions. Amplifying using a primer capable of amplifying the;
  • step (e) provides a method for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease, comprising the step of diagnosing infectious non-alcoholic fatty liver disease when the methylation level of the gene CpG region is increased compared to normal individuals in step (d).
  • the present invention provides a method of diagnosing and treating nonalcoholic fatty liver disease in an individual comprising the steps of:
  • the processed DNA is selected from the group consisting of SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2 gene CpG regions. Amplifying using a primer capable of amplifying the;
  • step (v) diagnosing an infectious nonalcoholic fatty liver disease when the methylation level of the gene CpG region is increased compared to the normal subject in step (iv);
  • step vi pioglitazone, metformin, ursodeoxycholic acid (UDCA), carnitine, milk thistle, etc. It is a step of performing the treatment of the disease through means such as administration of a therapeutic drug, surgery, and the like.
  • UDCA ursodeoxycholic acid
  • the 'treatment' of the present invention refers to alleviating non-alcoholic fatty liver disease or symptoms of the disease, which may include curing, substantially preventing, or ameliorating the disease, including, but not limited to, alleviating, curing or preventing one or most of the symptoms resulting from the disease.
  • the 'sample' of the present invention is obtained by separating from a subject suspected of a disease, but is not limited thereto, but is not limited to cells, tissues, blood, serum, plasma, saliva, and sputum. It may be selected from the group consisting of mucosal fluid and urine, and the 'subject' or 'subject' may be an animal, preferably an animal, including a mammal, particularly a human, and may be an animal-derived cell, tissue, organ, etc. may be The subject may be a patient in need of the therapeutic effect.
  • the term “comprising” is used synonymously with “including” or “characterized by”, and in a composition or method according to the present invention, specifically referring to It does not exclude additional components or method steps that are not listed.
  • the term “consisting of” means excluding additional elements, steps, or components not specifically described.
  • the term “essentially consisting of” means that, in the scope of a composition or method, it may include substances or steps that do not materially affect its basic properties in addition to the substances or steps described.
  • the present invention provides a method for diagnosing nonalcoholic fatty liver disease by measuring the degree of methylation of a specific gene CpG region of genomic DNA collected from a sample provided from a patient, and DNA methylation changes are easy to detect, and conventional protein or RNA markers It has the advantage of being stable and easy to analyze.
  • 1A to 1E are results of analyzing DNA extracted from liver tissues derived from normal controls, fatty liver patients, and steatohepatitis patients in order to search for nonalcoholic fatty liver disease-specific DNA methylation markers.
  • NASH non-alcoholic fatty liver disease-specific methylation pattern of the top 12 genes showing DNA hyper-methylation according to the degree of fibrosis (F1-F4) of non-alcoholic fatty liver disease (NAFL) and non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
  • Figure 3 shows the expression patterns of the top 12 genes showing increased gene expression specifically for nonalcoholic fatty liver disease according to the degree of fibrosis (F1 to F4) of nonalcoholic fatty liver disease (NAFL) and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). to be.
  • F1 to F4 degree of fibrosis
  • NAFL nonalcoholic fatty liver disease
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • F1-F4 non-alcoholic fatty liver disease-specific methylation pattern of the top five genes showing DNA low-methylation according to the degree of fibrosis (F1-F4) of non-alcoholic fatty liver disease (NAFL) and non-alcoholic steatohepatitis (NASH). is the result
  • NASH non-alcoholic fatty liver disease-specific DNA low-methylation expression pattern of the top five genes that show according to the degree of fibrosis (F1-F4) of non-alcoholic fatty liver disease (NAFL) and non-alcoholic steatohepatitis (NASH). is the result
  • Example 1 Search for non-alcoholic fatty liver disease specific DNA methylation markers
  • Full-length DNA was extracted from liver tissue from patients with normal control (31 cases), fatty liver (17 cases), and steatohepatitis (58 cases) in the nonalcoholic fatty liver disease cohort.
  • DNA methylation markers that significantly increase or decrease methylation specifically for steatohepatitis and liver fibrosis were selected by integrated analysis of the produced DNA methylation data, transcriptome data, and clinical data (Fibrosis, Steatosis, Ballooning, NASH score, etc.) (FIGS. 1A-1E).
  • FIG. 1a A DNA methylation heat map was prepared according to the disease severity of 1,725 CpGs discovered (FIG. 1c), and the correlation between DNA methylation and gene expression of 492 genes corresponding to 568 CpGs was analyzed with Pearson correlation coefficient (FIG. 1D) .
  • FIG. 1E 77 genes with low-methylation and increased expression were selected (R ⁇ -0.4) ( FIG. 1E ).
  • the correlation between DNA methylation and gene expression of 924 genes corresponding to 1,157 CpGs was analyzed by Pearson correlation coefficient, and 143 genes with hypermethylated and decreased expression according to severity were selected (R ⁇ -0.4).
  • the top 12 hypermethylated genes SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A and TNS2
  • SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A and TNS2 the expression level of each gene is shown in FIG. 3,
  • the top five low-methylated genes (TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 and TGFB2) were selected, and their methylation levels are shown in FIG. 4 and the expression levels of each gene are shown in FIG. 5 .
  • IGFBP1 cg18463453
  • NCOR1 cg14044233
  • NR5A2 cg20406878
  • ARHGEF12 cg05099464
  • the methylation degree of the 12 hypermethylation markers showed a tendency to increase
  • EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) catalyzes the methylation of Lys 27 of histone H3, and abnormal activation of EZH2 is known to promote nonalcoholic fatty liver disease. In addition, it has been confirmed through several studies that various EZH2 inhibitors can have therapeutic effects on nonalcoholic fatty liver disease.
  • the present inventors analyzed the correlation between the degree of methylation of 12 hyper-methylation markers and 5 hypo-methylation markers and EZH2 selected in Example 2.
  • the methylation degree of the 12 types of hypermethylation markers had a positive correlation with the expression of EZH2, and the methylation degree of the 5 types of hypomethylation markers showed a positive correlation with the expression of EZH2. It was confirmed to show a negative correlation.
  • nonalcoholic fatty liver patients with a high degree of methylation of the 12 hypermethylation markers or nonalcoholic fatty liver patients with a low methylation degree of the 5 low-methylation markers are highly likely to exhibit high therapeutic responsiveness to EZH2 inhibitors.
  • the present invention provides a method for diagnosing nonalcoholic fatty liver disease by measuring the degree of methylation of a specific gene CpG region of genomic DNA collected from a sample provided from a patient, and DNA methylation changes are easy to detect, and conventional protein or RNA markers It has the advantage of being stable and easy to analyze compared to the previous one, so it has high industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 DNA 메틸화 마커 검출을 이용한 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물 및 이의 활용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비알코올성 지방간 질환에서 DNA 메틸화가 변화하는 유전자 마커를 검출할 수 있는 조성물의 비알코올성 지방간 질환 진단 용도 및 이의 활용에 관한 것이다.

Description

DNA 메틸화 마커 검출을 이용한 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물 및 이의 활용
본 출원은 2021년 4월 9일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2021-0046754호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 DNA 메틸화 마커 검출을 이용한 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물 및 이의 활용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비알코올성 지방간 질환에서 DNA 메틸화가 변화하는 유전자 마커를 검출할 수 있는 조성물의 비알코올성 지방간 질환 진단 용도 및 이의 활용에 관한 것이다.
지방간 질환(fatty liver disease)이란, 지방간이라고도 불리며 간세포에 지방(트리글리세리드 등)이 이상 축적되는 것에 기인하여 간장해를 초래하는 질환이다.
지방간 질환은 크게 알코올성 지방간 질환과 비알콜성 지방간 질환으로 나누어진다. 이 중에서 비알콜성 지방간 질환은 만성 간 질환의 가장 흔한 원인이며, 과도한 알콜 섭취 없이 환자의 간 세포에서 트리글리세라이드 축적되는 것이 특징이다. 비알콜성 지방간 질환의 유병률은 고지방 및 고탄수화물 섭취와 관련된 영양 과다와 병행하여 지속적으로 증가하고 있다.
비알코올성 지방간질환에 대한 진단검사로 여러 가지 방법이 시도되고 있으나 현재까지는 명확하게 확립된 선별검사법은 없다. 일반적으로 아스파르트산 아미노기 전달효소(aspartate aminotransferase: AST), 알라닌 아미노 전달효소(Alanine aminotransferase: ALT)와 같은 간기능 검사와 복부 초음파검사가 많이 사용되고 있으나, 간기능 검사는 비알코올 지방간 혹은 지방간염 환자에서 정상일 수 있어 선별검사로는 민감도가 떨어지며 복부 초음파검사는 민감도는 높지만 선별검사로는 비용이 비싸다는 단점이 있다. 그 외 혈청 페리틴(ferritin), 요산 검사 등이 선별검사로 연구되고 있지만, 그 효용성을 평가하기 위해서는 추가 연구가 필요한 실정이다 (Kim C.W., et al. Metabolism, 61:1182-1188, 2012).
이에, 본 발명자들은 비알코올성 지방간 질환을 정확하게 진단할 수 있는 새로운 바이오 마커 및 이의 조합을 탐색하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 비알코올성 지방간 질환 환자의 특정 유전자에서 메틸화가 특이적으로 증가되어 있거나 또는 감소되어 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준 또는 이들 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준 또는 이들 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제로 이루어진, 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준 또는 이들 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제로 필수적으로 이루어진, 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비알코올성 지방간 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비알코올성 지방간 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유전자 발현 수준 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비알코올성 지방간 질환 환자의 치료제로 EZH2 저해제를 선택하는데 유용한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비알코올성 지방간 질환 진단용 제제제를 제조하기 위한 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준 또는 이들 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
(a) 피검체로부터 제공된 생물학적 시료 내 게놈 DNA를 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염, 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계;
(b) 상기 처리된 DNA를 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계;
(c) 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
(d) 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 정상 개체와 비교하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 정상 개체 대비 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 증가한 경우 감염성 비알코올성 지방간 질환인 것으로 진단하는 단계를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준 또는 이들 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준 또는 이들 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제로 이루어진, 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준 또는 이들 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제로 필수적으로 이루어진, 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비알코올성 지방간 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준 측정 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비알코올성 지방간 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유전자 발현 수준 측정 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비알코올성 지방간 질환 환자의 치료제로 EZH2 저해제를 선택하는데 유용한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준 측정 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비알코올성 지방간 질환 진단용 제제제를 제조하기 위한 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준 또는 이들 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 피검체로부터 제공된 생물학적 시료 내 게놈 DNA를 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염, 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계;
(b) 상기 처리된 DNA를 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계;
(c) 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
(d) 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 정상 개체와 비교하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 정상 개체 대비 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 증가한 경우 감염성 비알코올성 지방간 질환인 것으로 진단하는 단계를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준 또는 이들 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에서, 본 발명자들은 비알코올성 지방간 질환 환자의 환자에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2 유전자의 발현 수준 및 이들 유전자의 특정 CpG 부위가 정상인과 비교해 과메틸화 또는 저메틸화되어 있다는 것을 확인하였으며, 이에 기초해 상기 유전자들의 발현 수준 또는 메틸화 정도를 바이오 마커를 이용하여 비알코올성 지방간 질환을 진단하는 분자생물학적 진단 기술을 제공한다.
본 발명에서 용어 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 '단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명에서 용어 '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보(유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA이다.
상기 발현 수준이란 상기 각 유전자 마커가 코딩하는 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 의미한다.
상기 각 유전자 마커가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는, 당업계에 단백질의 발현수준 측정에 사용가능한 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 각 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 발명에서 상기 각 유전자의 발현 수준을 측정한다는 의미는 상기 각 유전자로부터 파생되는 전사물들의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 의미이고, 일례로 mRNA 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.
따라서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 상기 유전자로부터 발현된 mRNA를 검출하는 제제를 의미하는 것일 수 있다. 따라서 상기 각 유전자를 검출하는 제제는, 상기 유전자로부터 발현된 mRNA에 특이적으로 부착 또는 혼성화(hybridization)하는 리간드라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 프라이머(쌍) 또는 프로브일 수 있다.
본 발명에서, “메틸화" 또는 "메틸레이션"은 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 말한다. 바람직하게, 본 발명에서 메틸화 여부는 특정 유전자의 특정 CpG 부위의 사이토신에서 일어나는 메틸화 여부를 의미한다. 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제되며, 반대로, 비메틸화 또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가하게 된다. 보다 구체적으로, 포유동물 세포의 게놈 DNA 에는 A, C, G 및 T에 더하여, 사이토신 링의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-메틸사이토신의 메틸화는 CpG라고 불리는 CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후성유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다. DNA 메틸화(methylation)는 사이토신-구아닌 디뉴클레오타이드(CpG)의 사이토신의 5'-위치에 메틸기가 추가되어 발생되는 가장 잘 알려진 후성학적 변화이다. DNA 메틸화 변화는 DNA에 존재하기 때문에 검출이 용이하고, 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며, 한 유전자의 특정 위치에서 일어나므로 분석이 손쉬운 장점을 가진다.
본 발명에서, 유전자의 CpG 부위란, 유전자의 DNA 상에 존재하는 CpG 부위를 말한다. 유전자의 DNA는, 유전자가 발현하는데 필요하며 서로 작동가능하게 연결되어 있는 일련의 구성 단위를 모두 포함하는 개념으로, 예를 들어, 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 및 터미네이터 영역을 포함한다. 따라서, 유전자의 CpG 부위는 해당 유전자의 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 또는 터미네이터 영역 등에 존재할 수 있다.
SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2의 유전자 내 특정 CpG는 각각 비알코올성 지방간 질환에서 특이적인 메틸화 변화를 나타내므로, 이들 중 각각을 비알코올성 지방간 질환을 진단하기 위한 단독의 바이오 마커로 사용하거나, 이들 중 2종 이상을 복합 바이오 마커로 사용할 수도 있다.
본 발명에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2의 유전자는 공지된 유전자 데이터베이스에서 그 서열 정보를 확인할 수 있다.
구체적으로, 상기 NR5A2는 세포 내 전사인자의 핵 수용체 패밀리의 구성원이다. NR5A2는 발달, 콜레스테롤 수송, 담즙산 항상성 및 스테로이드 생성 조절에 중요한 역할을 한다. 인간 NR5A2 유전자는 1번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 2494 로 등록되어 있다.
상기 CYP2C19은 사이토크롬 P450 혼합 기능 산화효소시스템의 CYP2C 서브 패밀리에 속하며, 인간 CYP2C19 유전자는 10번 염색체에 위치한다. NCBI Entrez database에 Gene ID: 1557로 등록되어 있다.
상기 SALL1은 드로소필라(Drosophila)에서 알려진 spalt 유전자의 인간 버젼이다. 인간 SALL1 유전자는 16번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 6299 로 등록되어 있다.
상기 IGFBP1은 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질(IGFBP1) 패밀리의 멤버인 IGFBP1 단백질을 코딩하는 유전자로서 상기 단백질은 인슐린-유사 성장 인자(IGF)에 결합한 후 IGF의 반감기를 증가시키는 기능을 한다. 인간 IGFBP1 유전자는 7번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 3484 로 등록되어 있다.
상기 NCOR1은 몇몇 핵 수용체 상호 작용 도메인을 함유하는 전사적 조절 단백질을 코딩하는 유전자이다. 인간 NCOR1 유전자는 17번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 9611 로 등록되어 있다.
상기 MGMT는 자연적으로 발생한 돌연변이성 DNA 영역을 수리하여 게놈의 안정성을 유지하는데 필수적인 단백질을 코딩하는 유전자이다. 인간 MGMT 유전자는 10번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 4255 로 등록되어 있다.
상기 TP63은 인간의 3번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 8626으로 등록되어 있다.
상기 LIMA1은 액틴 필라멘트가 탈폴리머화 되는 것을 방지하는 사이토스켈레톤-연관 단백질인 EPLIN을 코딩하는 유전자이다. 인간 LIMA1 유전자는 12번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 51474 로 등록되어 있다.
상기 ARHGEF12는 인간의 11번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 23365 로 등록되어 있다.
상기 MTSS1는 인간의 8번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 9788 로 등록되어 있다.
상기 WBP1L는 인간의 10번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 54838 로 등록되어 있다.
상기 ARHGEF26는 인간의 3번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 26084 로 등록되어 있다.
상기 TBC1D14는 인간의 4번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 57533 로 등록되어 있다.
상기 ANKS1A는 인간의 6번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 23294 로 등록되어 있다.
상기 TNS2는 인간의 12번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 23371 로 등록되어 있다.
상기 GLIS3는 인간의 9번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 169792 로 등록되어 있다.
상기 TGFB2는 인간의 1번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database에 Gene ID: 7042 로 등록되어 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 NR5A2 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg20406878으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 CYP2C19 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg27505447으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 SALL1 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg08304084으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 IGFBP1 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg18463453으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 NCOR1 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg14044233으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 MGMT 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg00639517으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 TP63 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg15007954으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 LIMA1 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg19342791으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 ARHGEF12 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg05099464으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 MTSS1 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg24838345으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 WBP1L 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg05809484으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 ARHGEF26 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg06465407으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 TBC1D14 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg04470688으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 ANKS1A 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg08194377으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 TNS2 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg06149155으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 GLIS3 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg15089921으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 TGFB2 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 것은, HumanEPIC BeadChip에서 Illumina ID cg24000206으로 표시되는 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서는 상기 인간 게놈 염색체 부위의 염기서열은 GRCh37 Genome Reference Consortium Human Reference 19 (GRCh37/hg19)에 따라 표현하였지만 상기 인간 게놈 염색체 부위의 구체적 서열은 게놈 서열 연구 결과가 업데이트됨에 따라서 그 표현이 다소 변경될 수 있으며, 이러한 변경에 따라 본 발명의 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 상이해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 GRCh37 Genome Reference Consortium Human Reference 19 (GRCh37/hg19)에 따라 표현된 인간 게놈 염색체 부위는 본 발명의 출원일 이후 인간 표준 염기서열(human reference sequence)이 업데이트되어 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 지금과 다르게 변경된다고 하여도, 본 발명의 범위가 상기 변경된 인간 게놈 염색체 부위에 미치게 됨은 자명하다고 할 것이다. 이러한 변경 내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 용이하게 알 수 있는 사항이다.
본 발명에서, CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 메틸화된 CpG 결합 도메인, 또는 메틸화 DNA에 특이적으로 결합하는 메틸화 DNA항체 (예를 들어, 메틸사이토신에 특이적으로 결합하는 항체) 등을 포함할 수 있다.
상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 바이설파이트 변형된 DNA는 서열분석 또는 메틸화 특이적 PCR 등 다양한 방법을 통하여 메틸화를 검출할 수 있으며, 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, WO01/26536; US2003/0148326A1).
또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당업계에 잘 알려져 있다.
비알코올성 지방간 질환 환자의 유전자의 특정 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 대표적인 일예로서, 환자의 시료에서 게놈 DNA를 수득하고, 수득한 DNA에 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소를 처리한 후, 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고 그 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 것을 통해 측정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 상기 제제는 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다.
한편, 메틸화 DNA 항체란, DNA 중의 메틸화된 염기에 특이적으로 결합하는 항체를 말한다. 구체적으로는, 메틸사이토신에 대한 항체와 같이, DNA 사슬 중 메틸화된 사이토신을 인식하여 결합하는 성질을 가진 항체를 들 수 있다. 또한, 시판되고 있는 메틸화 DNA 항체 중에서, 본원에 기재된 메틸화 상태의 DNA를 특이적으로 인식하여 특이적으로 결합할 수 있는 항체일 수 있다.
메틸화 DNA 항체는 메틸화된 염기, 메틸화 DNA 등을 항원으로 하여 통상의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 메틸사이토신 항체를 제조하기 위해서는, 5-메틸사이티딘, 5-메틸사이토신, 또는 5-메틸사이토신을 포함하는 DNA 등을 항원으로 하여 항체를 제조한 후 DNA 중의 메틸사이토신으로의 특이적인 결합을 지표로서 선별할 수 있다.
또한, 메틸화된 CpG 결합 도메인(CpG binding domain: MBD) 또는 메틸화 DNA 항체를 이용하여 메틸화 수준을 측정하는 경우, 이들을 이용하여 메틸화된 DNA를 면역침강시킨 후, 서던블롯, PCR, 마이크로어레이, 또는 서열분석(sequencing) 등을 통해 특정 CpG 부위를 확인할 수 있다. 또한, 항체의 면역학적 검출 또는 정량을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질 표지, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 사용할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광 물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있고, 그 외 방사성 동위원소 표지, 라텍스 비드 표지, 콜로이드 표지, 비오틴 표지 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 비알코올성 지방간 질환의 구체적인 예시는 단순 지방간 질환, 영양성 지방간 질환, 기아성 지방간 질환, 비만성 지방간 질환, 당뇨병성 지방간 질환, 지방간염, 간섬유화 및 간경화를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 조성물은 비알코올성 지방간 질환의 중증도 진단용 조성물일 수 있다. 상기 “중증도”란 비알코올성 지방간 질환에 걸린 환자의 위중한 정도를 의미하는 것으로, 경증의 지방간 질환으로부터 간 섬유화, 지방간염, 간경화 및 간암의 중증으로 증세가 위중해지는 정도를 의미한다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 "중증도"란 비알코올성 지방간염의 중증도를 의미하는 것으로, 비알코올성 지방간염은 간 섬유화의 진행 단계에 따라 F0, F1, F2, F3, F4 단계로 나뉘는데, 상기 "중증도"는 NASH-F1(F1 및 F2)에서 NASH-F2(F3 및 F4), 더 나아가 간경변 및 간암으로 병변이 악화되는 것을 의미하는 것일 수 있다.
상기 조성물 및 키트에는 상기 제제 이외에도, 중합효소 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 키트는 DNA 메틸화 마이크로어레이 형태로 구현될 수 있다.
본 발명은 또한 비알코올성 지방간 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준 측정 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 (a) 피검체로부터 제공된 생물학적 시료 내 게놈 DNA를 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염, 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및 (b) 상기 처리된 DNA를 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 비알코올성 지방간 질환에 의해 유전자의 메틸화 수준이 차이 나는 세포, 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료를 포함하나, 상기 예시에 제한되지 않고 DNA 추출이 가능한 모든 시료를 사용할 수 있다.
비알코올성 지방간 질환 환자의 시료로부터 게놈 DNA를 수득하여 메틸화 수준을 검출하기 위하여, 게놈 DNA의 수득은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB 분리법 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 단계는, 메틸화된 염기와 메틸화되지 않은 염기의 차이를 이용한, 제한효소 또는 바이설파이트를 이용하는 방법, 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강방법(예, MIRA, MeDIP), DNA 메틸레이션 마이크로어레이를 이용한 방법 등을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱, 바이설파이트 시퀀싱, DNA 메틸레이션 마이크로어레이, 또는 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강법 등을 사용하여 메틸화 수준을 측정 내지 검출할 수 있다.
일예로, 본 발명의 방법은 (a) 수득된 시료 내 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및 (b) 상기 처리된 DNA를 해당 유전자의 특정 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계에서 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트일 수 있으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
또한, 상기 (a) 단계에서 메틸화 민감성 제한효소는 상기에서 설명한 바와 같이, 특정 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있으며, 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 단계에서 증폭은 통상적인 PCR 방법에 의해 수행될 수 있다. 이때 사용되는 프라이머는 상기에서 설명한 바와 같이, 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.
상기 유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 단계는, (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물의 존부는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면 전기영동을 수행하여 원하는 위치의 밴드의 검출 여부에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들면, 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시키는 화합물을 사용한 경우 상기 (a) 단계에서 사용한 두 종류의 프라이머쌍, 즉 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 의해 각각 증폭된 PCR 결과물의 존부에 따라 메틸화 정도를 판단할 수 있다. 바람직하게, 샘플 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리하고, 해당 유전자의 CpG 부위를 PCR로 증폭하고, 증폭된 부위의 염기서열을 분석하는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법을 사용하여 메틸화 여부를 판단할 수 있다.
또한, 제한효소를 이용한 경우에도 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 있는 경우는 CpG가 메틸화된 것으로 판단하고, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 CpG가 비메틸화 한 것으로 판단하는 것에 따라 그 메틸화 여부를 판단할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다. 상기에서 mock DNA란 시료에서 분리되고 아무런 처리를 하지 않은 상태의 시료 DNA를 의미한다.
유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 다른 예로, 메틸화 DNA 항체, 예를 들어 메틸화된 CpG 결합 도메인(CpG binding domain: MBD) 또는 메틸사이토신에 대한 항체를 이용한 면역침강방법을 예시할 수 있다. 예를 들어, 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 5-메틸사이토신을 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 면역침강한 후 서던블롯, PCR, 마이크로어레이, 또는 서열분석(sequencing)등을 통해 특정 CpG 부위를 확인할 수 있다.
이와 같은 방법에 따라, 생물학적 시료 내 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A 및 TNS2로 이루어진 군에서 선택된 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 정상인과 비교해 증가했거나(과메틸화), 또는 TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 정상인과 비교해 감소(저메틸화)한 경우, 비알코올성 지방간 질환에 걸린 것으로 판단할 수 있는 것이다.
따라서, 상기 본 발명에 따를 경우, 전술한 유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 변화는 비알코올성 지방간 질환 환자의 시료에서 특이적으로 나타나므로, 유전자의 메틸화 변화를 바이오마커로 사용하여 비알코올성 지방간 질환의 진단 또는 예후 예측에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 생물학적 시료 내 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A 및 TNS2로 이루어진 군에서 선택된 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 정상인과 비교해 증가한 정도(과메틸화 수준), 또는 TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 정상인과 비교해 감소한 정도(저메틸화 수준)를 평가함으로써, 비알코올성 지방간 질환의 중증도를 진단하는 것이 가능할 수 있다.
본 발명은 환자의 시료에서 채취한 게놈 DNA의 특정 유전자 CpG 부위의 메틸화 정도를 측정하여 비알코올성 지방간 질환을 진단하거나 예후를 예측하는 분자생물학적 진단법을 제공하며, 이는 간편하고 비침습적이며 경제적인 장점이 있다. 또한, DNA 메틸화 변화는 검출이 용이하고, 종래 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며 분석이 쉬운 장점이 있다.
전술한 본 발명의 상기 조성물, 키트 및 방법은 비알코올성 지방간 질환 환자 중에서 질환에 걸린 환자를 선별하여 특별하고 적절한 관리를 통하여 그 진행 속도를 정지시키거나 최대한 지연시켜, 종국적으로는 보다 나은 삶의 질을 영위하도록 하기 위하여 임상적으로 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 비알코올성 지방간 질환 환자에서 간기능을 평가하거나, 환자의 앞으로의 간 상태의 변화 가능성을 평가하거나, 간 기능 악화를 모니터링하거나, 앞으로의 간 기능 손상의 위험성을 결정하거나, 적절한 치료 요법을 결정하는 등 다양한 임상적 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 비알코올성 지방간 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유전자 발현 수준 측정 방법을 제공한다.
상기 각 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 방법 등은 전술한 바가 참고될 수 있다.
이와 같은 방법에 따라, 생물학적 시료 내 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A 및 TNS2로 이루어진 군에서 선택된 유전자 발현 수준이 정상인과 비교해 감소했거나, 또는 TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 발현 수준이 정상인과 비교해 증가한 경우, 비알코올성 지방간 질환에 걸린 것으로 판단할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한 비알코올성 지방간 질환 환자의 치료제로 EZH2 저해제를 선택하는데 유용한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준 측정 방법을 제공한다.
EZH2 저해제의 비제한적 예에는 EZH2의 발현 및/또는 활성을 저해하고/하거나 감소시키는 화합물, 분자, 화학물질, 폴리펩타이드, 단백질이 포함된다. EZH2 저해제의 추가적인 비제한적 예에는 S-아데노실-메티오닌-경쟁적 소분자 저해제가 포함된다. 특정한 비제한적 구현예에서, EZH2 저해제는 테트라메틸피페리디닐 화합물로부터 유래된다. 추가적인 비제한적 예에는 UNC1999, 3-데아자네플라노신 A(DZNep), EI1, EPZ-5676, EPZ-6438, GSK343, EPZ005687, EPZ011989 및 GSK126이 포함된다.
EZH2 저해제의 추가적인 비제한적 예는 문헌[Garapaty-Rao et al., Chemistry and Biology, 20: pp. 1-11(2013), PCT 특허 출원 번호 WO 2013/138361, WO 2013/049770 및 WO 2003/070887, 및 US 특허 출원 번호 US 2014/0275081, US 2012/0071418, US 2014/0128393 및 US 2011/0251216]에 기재되며, 그 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
이와 같은 방법에 따라, 생물학적 시료 내 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A 및 TNS2로 이루어진 군에서 선택된 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 정상인과 비교해 증가했거나(과메틸화), 또는 TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 정상인과 비교해 감소(저메틸화)한 경우, 해당 생물학적 시료가 분리된 피검체의 비알코올성 지방간 질환 치료제로서 EZH2 저해제를 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 비알코올성 지방간 질환 진단용 제제제를 제조하기 위한 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준 또는 이들 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제의 용도를 제공한다.
본 발명은
(a) 피검체로부터 제공된 생물학적 시료 내 게놈 DNA를 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염, 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계;
(b) 상기 처리된 DNA를 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계;
(c) 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
(d) 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 정상 개체와 비교하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 정상 개체 대비 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 증가한 경우 감염성 비알코올성 지방간 질환인 것으로 진단하는 단계를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 개체의 비알코올성 지방간 질환을 진단 및 치료하는 방법을 제공한다:
(i) 피검체로부터 제공된 생물학적 시료 내 게놈 DNA를 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염, 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계;
(ii) 상기 처리된 DNA를 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계;
(iii) 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
(iv) 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 정상 피검체와 비교하는 단계; 및
(v) 상기 (iv) 단계에서 정상 피검체 대비 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 증가한 경우 감염성 비알코올성 지방간 질환인 것으로 진단하는 단계; 및
(vi) 상기 진단된 피검체에 비알콜성 지방간 질환을 치료하기 위한 치료 약물을 투여하거나 수술을 통해 상기 질환을 치료하는 단계.
상기 i) 내지 vi) 단계를 포함하는 방법들은, 전술한 a) 내지 e) 단계를 포함하는 방법에 준하여 이해된다.
상기 vi) 단계는 상기 v) 단계에서 질환이 진단된 개체에 피오글리타존(pioglitazone), 메트포르민(metformin), 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid, UDCA), 카르니틴(carnitine), 밀크시슬(milk thistle) 등과 같은 치료 약물 투여, 수술 등의 수단을 통해 상기 질환의 치료를 수행하는 단계이다.
본 발명의 상기 '치료'는 비알콜성 지방간 질환 또는 상기 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 '시료'는 질환이 의심되는 개체로부터 분리 수득되는 것으로서, 이에 제한되지는 않으나, 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담. 점막액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 '개체' 또는 '피검체'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 치료 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "을 포함하는(comprising)"이란 "함유하는(including)" 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 "로 이루어지는(consisting of)"이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 "필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)"이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 환자로부터 제공된 시료에서 채취한 게놈 DNA의 특정 유전자 CpG 부위의 메틸화 정도를 측정하여 비알코올성 지방간 질환을 진단하는 방법을 제공하며, DNA 메틸화 변화는 검출이 용이하고, 종래 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며 분석이 쉬운 장점이 있다.
도 1a 내지 1e는 비알코올성 지방간 질환 특이적 DNA 메틸화 마커를 탐색하기 위해, 정상 대조군, 지방간 환자, 지방간염 환자 유래의 간 조직에서 추출한 DNA를 분석한 결과이다.
도 2는 비알코올성 지방간 질환 특이적으로 DNA 과-메틸화가 나타나는 상위 12개 유전자의 메틸화 양상을 비알코올성 지방간 질환(NAFL) 및 비알코올성 지방간염(NASH)의 섬유화 정도(F1~F4)에 따라 나타낸 결과이다.
도 3은 비알코올성 지방간 질환 특이적으로 유전자 발현 증가가 나타나는 상위 12개 유전자의 발현 양상을 비알코올성 지방간 질환(NAFL) 및 비알코올성 지방간염(NASH)의 섬유화 정도(F1~F4)에 따라 나타낸 결과이다.
도 4는 비알코올성 지방간 질환 특이적으로 DNA 저-메틸화가 나타나는 상위 5개 유전자의 메틸화 양상을 비알코올성 지방간 질환(NAFL) 및 비알코올성 지방간염(NASH)의 섬유화 정도(F1~F4)에 따라 나타낸 결과이다.
도 5는 비알코올성 지방간 질환 특이적으로 DNA 저-메틸화가 나타나는 상위 5개 유전자의 발현 양상을 비알코올성 지방간 질환(NAFL) 및 비알코올성 지방간염(NASH)의 섬유화 정도(F1~F4)에 따라 나타낸 결과이다.
도 6은 비알코올성 지방간 질환 특이적으로 DNA 과-메틸화가 나타나는 상위 12개 유전자의 메틸화 양상과 EZH2 발현량의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 7은 비알코올성 지방간 질환 특이적으로 DNA 저-메틸화가 나타나는 상위 5개 유전자의 메틸화 양상과 EZH2 발현량의 상관관계를 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 비알코올성 지방간 질환 특이적 DNA 메틸화 마커의 탐색
비알코올성 지방간 질환 코호트의 정상 대조군 (31례), 지방간 (17례), 지방간염 (58례) 환자 유래 간 조직 대상으로, 전장 DNA를 추출하였다.
각 샘플 당 1νg의 DNA를 EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research,Orange, CA)을 이용하여 sodium bisulfite 처리 하였다. Bisulfite 변형된 DNA를 EPIC BeadChip (Illumina)에 hybridization한 후, Illumina iSCAN system으로 스캔하여 인간 유전체 850,000 CpG site의 DNA 메틸화 데이터를 생산하였다. CpG 메틸화 정도는 R 소프트웨어의 minfi package (version 1.26.2)를 이용하여 평균 β-value로 구하였다.
생산된 DNA 메틸화 데이터와 전사체 데이터 및 임상 데이터 (Fibrosis, Steatosis, Ballooning, NASH score 등)의 통합분석에 의해 지방간염 및 간 섬유화 특이적으로 메틸화가 유의미하게 증가 혹은 감소하는 DNA 메틸화 마커를 선별하였다(도 1a 내지 1e).
구체적으로, 지방간질환에서 저-메틸화되는 CpG 중에서 간 섬유화에서도 메틸화가 감소하는 568개 CpG를 발굴하였다(도 1a). 지방간질환에서 과-메틸화되는 CpG 중에서 간 섬유화에서도 메틸화가 증가하는 1,157개 CpG를 발굴하였다(도 1b). 발굴된 1,725 CpG의 질환 중증도에 따른 DNA 메틸화 히트맵을 작성하고(도 1c), 568개 CpG에 상응하는 492개 유전자의 DNA 메틸화와 유전자 발현의 상관관계를 Pearson correlation coefficient로 분석하였다(도 1d). 질환 중증도에 따라 저-메틸화 되고 발현이 증가하는 77개 유전자를 선별하였다(R < -0.4)(도 1e). 1,157개 CpG에 상응하는 924개 유전자의 DNA 메틸화와 유전자 발현의 상관관계를 Pearson correlation coefficient로 분석하고, 중증도에 따라 과-메틸화 되고 발현이 감소하는 143개 유전자를 선별하였다(R < -0.4).
상기 도 1a 내지 1e에 따라 선별된 DNA 메틸화 마커들 중에서 과-메틸화된 유전자 상위 12개(SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A 및 TNS2)를 선별하고, 이의 메틸화 정도를 도 2에, 각 유전자의 발현 정도를 도 3에 나타내었으며,
저-메틸화된 유전자 상위 5개(TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2)를 선별하고 이의 메틸화 정도를 도 4에, 각 유전자의 발현 정도를 도 5에 나타내었다.
[과-메틸화 마커]
SALL1: cg08304084
IGFBP1: cg18463453
NCOR1: cg14044233
MGMT: cg00639517
CYP2C19: cg27505447
NR5A2: cg20406878
MTSS1: cg24838345
WBP1L: cg05809484
ARHGEF26: cg06465407
TBC1D14: cg04470688
ANKS1A: cg08194377
TNS2: cg06149155
[저-메틸화 마커]
TP63: cg15007954
LIMA1: cg19342791
ARHGEF12: cg05099464
GLIS3: cg15089921
TGFB2: cg24000206
도 2를 참고하면, 비알코올성 지방간 질환 환자의 간 조직에서 간 섬유화가 더 진행될수록, 상기 12개의 과메틸화 마커의 메틸화 정도가 증가하는 경향성을 나타냈으며,
도 3을 참고하면, 이들 12종 마커 유전자의 발현 정도는 간 섬유화가 더 진행될수록 발현 정도가 감소하는 경향성을 나타내는 것으로 확인되었다.
한편, 도 4를 참고하면, 지방간 질환 환자의 간 조직에서 간 섬유화가 더 진행될수록 상기 5개의 저메틸 마커의 메틸화 정도는 감소하는 경향성을 나타냈으며,
도 5를 참고하면, 이들 5종 유전자의 발현 정도는 간 섬유화가 더 진행될수록 발현 정도가 증가하는 경향성을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 2: 각 마커의 메틸화 정도와 EZH2 발현과의 상관관계 분석
EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2)는 히스톤 H3의 Lys 27의 메틸화를 촉매하는데, EZH2의 비정상적인 활성화는 비알코올성 지방간 질환을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 다양한 EZH2 저해제가 비알코올성 지방간 질환에 치료 효과를 나타낼 수 있다는 것이 여러 연구를 통해 확인된 바 있다.
이에, 본 발명자는 상기 실시예 2에서 선별한 과-메틸화 마커 12종과 저-메틸화 마커 5종의 메틸화 정도와 EZH2의 상관관계를 분석하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 12종의 과-메틸화 마커의 메틸화 정도는 EZH2의 발현과 양의 상관관계를, 상기 5종의 저-메틸화 마커의 메틸화 정도는 EZH2 발현과 음의 상관관계를 나타내는 것으로 확인되었다.
따라서, 상기 12종의 과-메틸화 마커의 메틸화 정도가 높은 비알코올성 지방간 환자 또는 상기 5종의 저-메틸화 마커의 메틸화 정도가 낮은 비알코올성 지방간 환자는 EZH2 저해제에 높은 치료 반응성을 나타낼 가능성이 높다고 판단될 수 있다.
본 발명은 환자로부터 제공된 시료에서 채취한 게놈 DNA의 특정 유전자 CpG 부위의 메틸화 정도를 측정하여 비알코올성 지방간 질환을 진단하는 방법을 제공하며, DNA 메틸화 변화는 검출이 용이하고, 종래 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며 분석이 쉬운 장점이 있어 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (15)

  1. SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준 또는 이들 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자 CpG 부위는 SALL1: cg08304084, IGFBP1: cg18463453, NCOR1: cg14044233, MGMT: cg00639517, CYP2C19: cg27505447, NR5A2: cg20406878, MTSS1: cg24838345, WBP1L: cg05809484, ARHGEF26: cg06465407, TBC1D14: cg04470688, ANKS1A: cg08194377, TNS2: cg06149155, TP63: cg15007954, LIMA1: cg19342791, ARHGEF12: cg05099464, GLIS3: cg15089921 및 TGFB2: cg24000206인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제는, 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염, 메틸화 민감성 제한효소, 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 메틸화된 CpG 결합 도메인, 또는 메틸사이토신에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI 또는 NotI 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 비알코올성 지방간 질환은 단순 지방간 질환, 영양성 지방간 질환, 기아성 지방간 질환, 비만성 지방간 질환, 당뇨병성 지방간 질환, 지방간염, 간섬유화 및 간경화로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 비알코올성 지방간 질환의 중증도 진단용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 비알코올성 지방간 질환 진단용 키트.
  8. 비알코올성 지방간 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준 측정 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는
    (a) 피검체로부터 제공된 생물학적 시료 내 게놈 DNA를 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염, 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 처리된 DNA를 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 메틸화 수준을 측정하는 방법은 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱, 바이설파이트 시퀀싱, DNA 메틸레이션 마이크로어레이, 및 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강법으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 측정된 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A 및 TNS2로 이루어진 군에서 선택된 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 정상인과 비교해 증가했거나, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 정상인과 비교해 감소한 경우, 상기 피검체는 비알코올성 지방간 질환에 걸린 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 비알코올성 지방간 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유전자 발현 수준 측정 방법.
  13. 비알코올성 지방간 질환 환자의 치료제로 EZH2 저해제를 선택하는데 유용한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 제공된 생물학적 시료에서 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준 측정 방법.
  14. 비알코올성 지방간 질환 진단용 제제제를 제조하기 위한 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현 수준 또는 이들 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제의 용도.
  15. (a) 피검체로부터 제공된 생물학적 시료 내 게놈 DNA를 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염, 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계;
    (b) 상기 처리된 DNA를 SALL1, IGFBP1, NCOR1, MGMT, CYP2C19, NR5A2, MTSS1, WBP1L, ARHGEF26, TBC1D14, ANKS1A, TNS2, TP63, LIMA1, ARHGEF12, GLIS3 및 TGFB2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계;
    (c) 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
    (d) 상기 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 정상 개체와 비교하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 정상 개체 대비 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준이 증가한 경우 감염성 비알코올성 지방간 질환인 것으로 진단하는 단계를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단 방법.
PCT/KR2022/005162 2021-04-09 2022-04-08 Dna 메틸화 마커 검출을 이용한 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물 및 이의 활용 WO2022216125A1 (ko)

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