WO2023027418A1 - 구강질환 유발 세균 검출용 조성물 내지 이의 용도 - Google Patents

구강질환 유발 세균 검출용 조성물 내지 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2023027418A1
WO2023027418A1 PCT/KR2022/012337 KR2022012337W WO2023027418A1 WO 2023027418 A1 WO2023027418 A1 WO 2023027418A1 KR 2022012337 W KR2022012337 W KR 2022012337W WO 2023027418 A1 WO2023027418 A1 WO 2023027418A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pcr
seq
nucleotide sequence
composition
oral disease
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/012337
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
허정욱
허대욱
Original Assignee
주식회사 덴오믹스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 덴오믹스 filed Critical 주식회사 덴오믹스
Publication of WO2023027418A1 publication Critical patent/WO2023027418A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention provides a first primer set consisting of a primer pair including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
  • It provides an information providing method for diagnosing oral diseases, including.
  • the detection of step iii) may be detection using PCR (polymerase chain reaction).
  • Figure 1 comprehensively shows the detection results of Aggregatibacter actinomycetemcomitans using real-time PCR.
  • Figure 3 comprehensively shows the detection results of Treponema denticola using real-time PCR.
  • SEQ ID NO: 1 represents the forward nucleotide sequence of a primer for detecting Aggregatibacter actinomycetemcomitans .
  • SEQ ID NO: 4 represents a forward nucleotide sequence of a primer for detecting Porphyromonas gingivalis .

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 구강질환 유발 세균을 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물 내지 이의 용도에 대한 것이다. 본 발명의 프라이머 내지 프로브를 포함하는 조성물을 이용하는 경우 높은 민감도(sensitivity), 직선성(linearity) 및 특이도(specificity) 로 신속하게 구강질환 유발 세균을 검출할 수 있으므로, 구강질환 유발 세균 검출 내지 구강질환 진단을 위해 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

구강질환 유발 세균 검출용 조성물 내지 이의 용도
본 출원은 2021년 08월 25일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2021-0112573호 를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 출원은 과제번호 202011B17(KMDF_PR_20200901_0023-02; 1711137929) 및 과제번호 S2796532(1425152100) 의 국가연구개발사업의 지원을 받은 것이다.
본 발명은 구강질환 유발 세균을 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물 내지 이의 용도에 대한 것이다.
중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 검사는 DNA의 특정 부분을 반복적으로 복제하여 DNA를 증폭시키는 기술로써, 아주 적은 양으로도 특정세균이나 세포내 표적 유전자만 골라내어 다량을 복제할 수 있으므로 유전적 질병이나 바이러스 감염 등 질환의 진단에 폭넓게 활용되고 있다. 최근에는 실시간 PCR(real time PCR)을 활용해 정량적 분석까지 가능한 단계에 이르렀다. 이러한 유전자 증폭기술인 PCR을 이용해 유전자를 직접 검사하여, 바이러스나 세균에 감염된 사람의 타액, 혈액 등에서 병원체의 유전자 정보를 담고 있는 DNA, RNA를 추출한 후 증폭해 질병 감염 여부를 특이적 바이오마커로 확인하는데, 이처럼 질병의 조기 진단을 통한 예방과 효율적인 치료를 가능하게 하는 것이 바로 분자진단 기술이다.
이러한 분자진단 기술 중에서도 타액을 이용한 진단 기술은 종래의 혈액을 분석하는 방법에 비하여 비침습적이고 간편하며 효율적인 장점이 있으며, 구강질환의 진단 뿐 아니라 전신질환을 예방하고 조기에 진단할 목적으로 타액 사용의 타당성에 대한 다수의 연구가 보고되고 있다.
한편, 구강 내에는 약 700여 종의 세균이 존재한다고 보고되었다. 구강 내 세균으로 검출된 종들 중 현재의 세균 배양법으로는 약 50% 정도의 구강 세균만 배양이 가능하며 구강 감염 병소에서 분리 및 동정된 균종은 더욱 부족한 실정이다. 또한, 지금까지의 구강질환 치료는 치석 제거, 치근의 표면 청소, 잇몸을 절개하고 치근을 노출시켜 수술하는 방식으로 이루어져 왔으나, 이는 치료라는 명목의 응급처치일 뿐이어서 근본적인 구강질환의 해결책은 될 수 없다. 구강질환의 원인과 다양한 위험 요인을 조사하고, 같은 질환 경로가 다시 반복되지 않도록 구강질환을 진단 내지 그 치료 방향을 제시할 수 있는 체계적 구강건강 관리 시스템이 요구되고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 대한민국 특허출원 제10-2012-0018161호 (2012.02.22)
(특허문헌 2) 대한민국 특허출원 제10-2010-0123454호 (2010.12.06)
이에 본 출원인은 구강질환 유발 세균을 현장에서 비침습적인 방법으로 신속하게 검출 내지 진단할 수 있는 조성물 내지 방법을 제공하고자 예의 노력한 결과, PCR 을 이용하여 1시간 이내로 구강질환 유발 세균을 특이적으로 검출 내지 진단할 수 있는 프라이머 및 프로브를 도출하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 구강질환 유발 세균을 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물 내지 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1 의 염기서열 및 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제1프라이머 세트;
서열번호 4 의 염기서열 및 서열번호 5 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제2프라이머 세트;
서열번호 7 의 염기서열 및 서열번호 8 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제3프라이머 세트; 및
서열번호 10 의 염기서열 및 서열번호 11 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제4프라이머 세트;
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제1프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 3 의 염기서열을 포함하는 프로브;
제2프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 6 의 염기서열을 포함하는 프로브;
제3프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 9 의 염기서열을 포함하는 프로브; 또는
제4프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 12 의 염기서열을 포함하는 프로브; 를 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 PCR(polymerase chain reaction)에 사용되는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 구강질환 유발 세균은 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 및 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 구강질환은 치은염, 침습성 치주염, 임플란트 주위염, 소아성 치주염, 괴사 궤양성 치주염 및 만성염증성 치주질환 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명은 또한, 상기 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 구강질환 유발 세균 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명은 또한, i) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 세균 DNA를 분리하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 세균 DNA와 상기 조성물을 이용하여 구강질환 유발 세균을 검출하는 단계;
를 포함하는 구강질환 유발 세균 검출방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 생물학적 시료는 혈액, 소변, 뇌척수액 및 타액 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 검출은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 검출하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 구강질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 구강질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, i) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 세균 DNA를 분리하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 세균 DNA와 상기 조성물을 이용하여 구강질환 유발 세균을 검출하는 단계;
를 포함하는 구강질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 '프라이머 및 프로브 세트(프라이머/프로브 세트)'는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브의 3가지 서열이 하나의 세트로 구성된 것을 의미한다. 본 발명에서는 제1프라이머 세트 내지 제4프라이머 세트에 각각 서열번호 3, 6, 9 또는 12의 염기서열을 포함하는 프로브가 포함된 세트를 의미한다.
본 발명의 '프라이머'는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 즉, 프라이머는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, DNA 폴리머라제 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성을 개시할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명의 '진단(diagnosis)'은 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 바람직하게는 세균에 의하여 구강질환 및 이의 발병 위험성을 판단하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1 의 염기서열 및 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제1프라이머 세트;
서열번호 4 의 염기서열 및 서열번호 5 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제2프라이머 세트;
서열번호 7 의 염기서열 및 서열번호 8 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제3프라이머 세트; 및
서열번호 10 의 염기서열 및 서열번호 11 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제4프라이머 세트;
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제1프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 3 의 염기서열을 포함하는 프로브;
제2프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 6 의 염기서열을 포함하는 프로브;
제3프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 9 의 염기서열을 포함하는 프로브; 또는
제4프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 12 의 염기서열을 포함하는 프로브; 를 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 PCR(polymerase chain reaction)에 사용되는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. 바람직하게는 상기 PCR 은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR) 또는 실시간 PCR(real-time PCR) 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 구강질환 유발 세균은 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 및 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 구강질환은 치은염, 침습성 치주염, 임플란트 주위염, 소아성 치주염, 괴사 궤양성 치주염 및 만성염증성 치주질환 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 구강질환 유발 세균 검출용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. 바람직하게는 상기 PCR 은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR) 또는 실시간 PCR(real-time PCR) 일 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 PCR 증폭 반응을 수행하기 위해 DNA 폴리머라제, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한, i) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 세균 DNA를 분리하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 세균 DNA와 상기 조성물을 이용하여 구강질환 유발 세균을 검출하는 단계;
를 포함하는 구강질환 유발 세균 검출방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 생물학적 시료는 혈액, 소변, 뇌척수액 및 타액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. 상기 타액은 개체가 가글링으로 뱉어낸 타액일 수 있다.
상기 세균 DNA 는 상기 구강질환 유발 세균의 DNA 를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 검출은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 검출하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. 바람직하게는 상기 PCR 은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR) 또는 실시간 PCR(real-time PCR) 일 수 있다
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 구강질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 구강질환 진단용 키트를 제공한다. 상기 PCR 및 키트는 상기 구강질환 유발 세균 검출용 키트에서 사용된 개념과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
본 발명은 또한, i) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 세균 DNA를 분리하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 세균 DNA와 상기 조성물을 이용하여 구강질환 유발 세균을 검출하는 단계;
를 포함하는 구강질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 시료, 구강질환 유발 세균 및 검출은 상기 구강질환 유발 세균 검출방법에서 사용된 개념과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
본 발명의 프라이머 내지 프로브를 포함하는 조성물을 이용하는 경우 높은 민감도(sensitivity), 직선성(linearity) 및 특이도(specificity) 로 신속하게 구강질환 유발 세균을 검출할 수 있으므로, 구강질환 유발 세균 검출 내지 구강질환 진단을 위해 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1 은 실시간 PCR 을 이용한 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 검출 결과를 종합적으로 나타낸다.
도 2 는 실시간 PCR 을 이용한 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 검출 결과를 종합적으로 나타낸다.
도 3 은 실시간 PCR 을 이용한 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 검출 결과를 종합적으로 나타낸다.
도 4 는 실시간 PCR 을 이용한 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 검출 결과를 종합적으로 나타낸다.
도 5 는 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aa) 검출 효율에 대한 직선성 분석 결과이다.
도 6 은 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis, Pg) 검출 효율에 대한 직선성 분석 결과이다.
도 7 은 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola, Td) 검출 효율에 대한 직선성 분석 결과이다.
도 8 은 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia, Tf) 검출 효율에 대한 직선성 분석 결과이다.
[실시예 1]
아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작
<1-1> 타겟 영역 선정
아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, 이하 A.a) 검출과 관련하여 공개된 논문들에서는 16s RNA 를 이용한 A.a 검출을 제시하고 있었으나, 본 출원인은 프라이머 및 프로브의 특이도를 높이기 위해 단백질 유전자(cpn60)를 타겟하여 프라이머 및 프로브를 디자인하고자 하였다.
GenBank No. AY123712 (Actinobacillus actinomycetemcomitans strain ATCC 33384 (cpn60) gene, partial cds)을 기준으로 이와 유사한 서열을 genious software 11.1.5 를 이용하여 수집하였다. 최종적으로 수집된 총 927 개의 서열을 다중서열정렬(multiple alignment) 방법으로 정렬한 결과, 927 개의 서열 중 12 개가 A.a 임을 확인하였다.
<1-2> 프라이머 및 프로브 디자인
상기 실시예 <1-1> 에서 정렬한 데이터를 기반으로 primer express 3.0.1 을 이용하여 A.a 에 특이적인 프라이머 및 프로브를 디자인하였다(표 1).
서열 (5'->3') 크기(bp) PCR 산물 크기(bp) 서열번호
A.a 프라이머 F CTCTCCAAACCATGCGAAACC 21 99 1
A.a 프라이머 R CATGGCTTGAGCGATTAATTGAC 23 2
A.a 프로브 CACGATCTCTGCAAATTCCGACAGCATT 28 3
상기 A.a 프로브 서열은 NCBI blast 에서 다시 검증한 결과 모든 A.a 종에 대하여 특이적이고, 다른 세균 종에 대하여는 비특이적인 것을 확인할 수 있었다.
[NCBI blast searching 조건]
Max target sequences : 1000
Program selection optimize for Highly similar sequences (blastn)
Database : Others (nr etc.)_nucleotide collection (nr/nt)
Tm 과 self- & hetero- dimer 는 IDT 의 Oligo analyzer 를 이용하여 확인하였다.
[정방향 프라이머_A.a 프라이머 F]
GC 52.4% / Melt temp: 56.5℃MOLECULAR WEIGHT: 6304.2 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 194900 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 1 개 (Δ
Self-dimer : Maximum Δkcal/mole -> Max. 4 bases 결합
[역방향 프라이머_A.a 프라이머 R]
GC 43.5% / Melt temp: 54.6℃MOLECULAR WEIGHT: 7078.6 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 222500 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 2 개 (Δ-0.06)
Self-dimer : Maximum Δ43.2 kcal/mole -> Max. 6 bases 결합
[프로브_A.a 프로브]
GC 46.4% / Melt temp: 61.1℃MOLECULAR WEIGHT: 8492.6 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 262600 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 4 개 (Δ-0.38, -0.32, -0.15)
Self-dimer : Maximum Δ53.89 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합
[Dimer analysis]
Hetero-dimer(F-R) : Maximum Δkcal/mole -> Max. 5 bases 결합
Hetero-dimer(F-P) : Maximum Δkcal/mole -> Max. 4 bases 결합
Hetero-dimer(R-P) : Maximum Δkcal/mole -> Max. 4 bases 결합
양성 대조군(positive control)을 주문함에 있어서 필요로 하는 앰플리콘(amplicon) 을 기준으로 NCBI blast 를 이용하여 재검증한 결과 A.a 종(strain) 에 대해 100% cover, 96.97% 이상의 동일성을 지니는 것을 확인하였고, 그 외의 다른 종 에 대해서는 동일성이 90.62% 이하로 떨어지는 것을 확인하였다. 결과적으로 본 발명의 프라이머 및 프로브는 A.a 양성 대조군을 합성하는 데에도 문제가 없는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 2]
포필로모나스 진지발리스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작
<2-1> 타겟 영역 선정
해외에서 상용화 되고 있는 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis, 이하 P.g) 를 검출할 수 있는 진단 키트는 P.g 의 fimA 유전자를 이용하여 검출하고 있었으나, 본 출원인이 fimA 를 타겟 유전자로 검출한 결과 특이도가 낮았다. 이에 본 출원인은 프라이머 및 프로브의 특이도를 높이기 위해 단백질 유전자(rgpB)를 타겟하여 프라이머 및 프로브를 디자인하고자 하였다.
GenBank No. AP009380 (Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 DNA, complete genome)을 기준으로 이와 유사한 서열을 genious software 11.1.5 를 이용하여 수집하였다. 최종적으로 수집된 총 54 개의 서열을 다중서열정렬(multiple alignment) 방법으로 정렬한 결과, 54 개의 서열 모두 P.g 임을 확인하였다.
<2-2> 프라이머 및 프로브 디자인
상기 실시예 <2-1> 에서 정렬한 데이터를 기반으로 primer express 3.0.1 을 이용하여 P.g 에 특이적인 프라이머 및 프로브를 디자인하였다(표 2).
서열 (5'->3') 크기(bp) PCR 산물 크기(bp) 서열번호
P.g 프라이머 F TAGCATTCTCCTCTCTGTTGGGAG 24 119 4
P.g 프라이머 R CATACGGAATTGCACCTTGGAC 22 5
P.g 프로브 CGCAACCCACAAGTACGACTGCTCTCC 27 6
상기 P.g 프로브 서열은 NCBI blast 에서 다시 검증한 결과 모든 P.g 종에 대하여 특이적이고, 다른 세균 종에 대하여는 비특이적인 것을 확인할 수 있었다.
[NCBI blast searching 조건]
Max target sequences : 1000
Program selection optimize for Highly similar sequences (blastn)
Database : Others (nr etc.)_nucleotide collection (nr/nt)
Tm 과 self- & hetero- dimer 는 IDT 의 Oligo analyzer 를 이용하여 확인하였다.
[정방향 프라이머_P.g 프라이머 F]
GC 50% / Melt temp: 57.8℃MOLECULAR WEIGHT: 7325.8 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 217500 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 3 개 (Δ-1.21, -0.89)
Self-dimer : Maximum Δkcal/mole -> Max. 4 bases 결합
[역방향 프라이머_P.g 프라이머 R]
GC 50% / Melt temp: 56.3℃MOLECULAR WEIGHT: 6719.4 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 210000 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 3 개 (Δ0.84, 0.97)
Self-dimer : Maximum Δ42.29 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합
[프로브_P.g 프로브]
GC 59.3% / Melt temp: 64.5℃MOLECULAR WEIGHT: 8134.3 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 246200 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 4 개 (Δ0.21, 0.35, 0.38)
Self-dimer : Maximum Δ53.2 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합
[Dimer analysis]
Hetero-dimer(F-R) : Maximum Δkcal/mole -> Max. 4 bases 결합
Hetero-dimer(F-P) : Maximum Δkcal/mole -> Max. 4 bases 결합
Hetero-dimer(R-P) : Maximum Δkcal/mole -> Max. 4 bases 결합
양성 대조군(positive control)을 주문함에 있어서 필요로 하는 앰플리콘(amplicon) 을 기준으로 NCBI blast 를 이용하여 재검증한 결과 P.g 종(strain) 에 대해 99% 이상 커버되는 것을 확인하였고, 그 외의 다른 종 에 대해서는 동일성이 73.3% 이하로 떨어지는 것을 확인하였다. 결과적으로 본 발명의 프라이머 및 프로브는 P.g 양성 대조군을 합성하는 데에도 문제가 없는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 3]
트레포네마 덴티콜라 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작
<3-1> 타겟 영역 선정
트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola, 이하 T.d) 의 검출을 위하여 본 출원인은 프라이머 및 프로브의 특이도를 높이고자 단백질 유전자(cfpA)를 타겟하여 프라이머 및 프로브를 디자인하고자 하였다.
GenBank No. AF062737 (Treponema denticola cytoplasmic filament protein A (cfpA) gene, partial cds)을 기준으로 이와 유사한 서열을 genious software 11.1.5 를 이용하여 수집하였다. 최종적으로 수집된 총 14 개의 서열을 다중서열정렬(multiple alignment) 방법으로 정렬한 결과, 14 개의 서열에는 T.d 이외에 T. putidum, T. pedis, T. phagedenis, T. vincentii 등이 포함되어 있었다.
<3-2> 프라이머 및 프로브 디자인
상기 실시예 <3-1> 에서 정렬한 데이터를 기반으로 primer express 3.0.1 을 이용하여 T.d 에 특이적인 프라이머 및 프로브를 디자인하였다(표 3).
서열 (5'->3') 크기(bp) PCR 산물 크기(bp) 서열번호
T.d 프라이머 F GCGCGGTGTTAATGATTTGG 20 99 7
T.d 프라이머 R ACGATTGAGTATGCGTTTTCACCT 24 8
T.d 프로브 AGGCAGAAGACGGACGTAGGTGCCTTC 27 9
상기 T.d 프로브 서열은 NCBI blast 에서 다시 검증한 결과 모든 T.d 종에 대하여 특이적이고, 다른 세균 종에 대하여는 비특이적인 것을 확인할 수 있었다.
[NCBI blast searching 조건]
Max target sequences : 1000
Program selection optimize for Highly similar sequences (blastn)
Database : Others (nr etc.)_nucleotide collection (nr/nt)
Tm 과 self- & hetero- dimer 는 IDT 의 Oligo analyzer 를 이용하여 확인하였다.
[정방향 프라이머_T.d 프라이머 F]
GC 50% / Melt temp: 55.1℃MOLECULAR WEIGHT: 6219.1 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 192500 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 8 개 (Δ1.03, 1.46, 1.53, 1.63, 1.79, 1.84, 1.9)
Self-dimer : Maximum Δkcal/mole -> Max. 4 bases 결합
[역방향 프라이머_T.d 프라이머 R]
GC 41.7% / Melt temp: 56.9℃/ MOLECULAR WEIGHT: 7333.8 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 227100 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 2 개 (Δ-0.19)
Self-dimer : Maximum Δ44.27 kcal/mole -> Max. 3 bases 결합
[프로브_T.d 프로브]
GC 59.3% / Melt temp: 65.2℃MOLECULAR WEIGHT: 8374.5 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 268600 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 1 개 (Δ
Self-dimer : Maximum Δ 54.2 kcal/mole -> Max. 5 bases 결합
[Dimer analysis]
Hetero-dimer(F-R) : Maximum Δkcal/mole -> Max. 4 bases 결합
Hetero-dimer(F-P) : Maximum Δkcal/mole -> Max. 2 bases 결합
Hetero-dimer(R-P) : Maximum Δkcal/mole -> Max. 5 bases 결합
양성 대조군(positive control)을 주문함에 있어서 필요로 하는 앰플리콘(amplicon) 을 기준으로 NCBI blast 를 이용하여 재검증한 결과 T.d 종(strain) 에 대하여 특이적이고, 그 외의 다른 종 에 대해서는 동일성이 92.93% 이하로 떨어지는 것을 확인하였다. 결과적으로 본 발명의 프라이머 및 프로브는 T.d 양성 대조군을 합성하는 데에도 문제가 없는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 4]
터너렐라 포시티아 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작
<4-1> 타겟 영역 선정
터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia, 이하 T.f) 의 검출을 위하여 본 출원인은 프라이머 및 프로브의 특이도를 높이고자 단백질 유전자(hsp60)를 타겟하여 프라이머 및 프로브를 디자인하고자 하였다.
GenBank No. AB547635 (Tannerella forsythia hsp60 gene for heat shock protein 60, partial cds, strain: JCM 10827)을 기준으로 이와 유사한 서열을 genious software 11.1.5 를 이용하여 수집하였다. 최종적으로 수집된 총 35 개의 서열을 다중서열정렬(multiple alignment) 방법으로 정렬한 결과, 35 개의 서열 중 6 개가 T.f 임을 확인하였다.
<4-2> 프라이머 및 프로브 디자인
상기 실시예 <4-1> 에서 정렬한 데이터를 기반으로 primer express 3.0.1 을 이용하여 T.f 에 특이적인 프라이머 및 프로브를 디자인하였다(표 4).
서열 (5'->3') 크기(bp) PCR 산물 크기(bp) 서열번호
T.f 프라이머 F AGGCGTCATCACGGTAGAAGAAG 23 94 10
T.f 프라이머 R ATAAGCGGAGATATAACCGCGATC 24 11
T.f 프로브 CAAGGGAACGGAAACGACCGTGGAG 25 12
상기 T.f 프로브 서열은 NCBI blast 에서 다시 검증한 결과 모든 T.f 종에 대하여 특이적이고, 다른 세균 종에 대하여는 비특이적인 것을 확인할 수 있었다.
[NCBI blast searching 조건]
Max target sequences : 1000
Program selection optimize for Highly similar sequences (blastn)
Database : Others (nr etc.)_nucleotide collection (nr/nt)
Tm 과 self- & hetero- dimer 는 IDT 의 Oligo analyzer 를 이용하여 확인하였다.
[정방향 프라이머_T.f 프라이머 F]
GC 52.2% / Melt temp: 58.6℃MOLECULAR WEIGHT: 7146.7 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 240200 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 1 개 (Δ
Self-dimer : Maximum Δkcal/mole -> Max. 3 bases 결합
[역방향 프라이머_T.f 프라이머 R]
GC 45.8% / Melt temp: 56.4℃MOLECULAR WEIGHT: 7394.9 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 248000 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 1 개 (Δ
Self-dimer : Maximum Δ46.76 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합
[프로브_T.f 프로브]
GC 60% / Melt temp: 63.4℃MOLECULAR WEIGHT: 7799.1 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 258800 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 3 개 (Δ-2.82, -1.92)
Self-dimer : Maximum Δ52.73 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합
[Dimer analysis]
Hetero-dimer(F-R) : Maximum Δ6 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합
Hetero-dimer(F-P) : Maximum Δkcal/mole -> Max. 6 bases 결합
Hetero-dimer(R-P) : Maximum Δkcal/mole -> Max. 3 bases 결합
양성 대조군(positive control)을 주문함에 있어서 필요로 하는 앰플리콘(amplicon) 을 기준으로 NCBI blast 를 이용하여 재검증한 결과 T.f 종(strain) 에 대하여 100% 특이적이고, 그 외의 다른 종 에 대해서는 동일성이 떨어지는 것을 확인하였다. 결과적으로 본 발명의 프라이머 및 프로브는 T.f 양성 대조군을 합성하는 데에도 문제가 없는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 5]
프라이머 및 프로브의 민감도 확인
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 4> 에서 제작한 프라이머 및 프로브의 분석적 민감도(sensitivity)를 평가하고자 하였다.
구체적으로, 생물자원센터에서 분양받은 표준균주(Aggregatibacter actinomycetemcomitans KCTC 2581(Aa), Porphyromonas gingivalis KCTC 5352 (Pg), Treponema denticola KCTC 15104 (Td) 및 Tannerella forsythia KCTC 5666 (Tf))는 멸균된 20%의 glycerol stock 과 1:1 로 혼합하여 초저온 냉동고(-70℃이하)에 보관하였다. 표준균주를 초저온 냉동고(-70℃이하)로부터 꺼내 해동한 후, 제조사(Qiagen) 프로토콜에 따라 QIAamp DNA mini prep kit 으로 핵산을 추출하였다. 추출된 핵산은 NanoDrop 2000 분광분석기 (Thermo Fisher)를 이용하여 수율을 측정한 뒤, copy number 로 단위를 환산하여 106 copies/㎕ 부터 1/10X 배수로 연속희석을 진행하여 100 copy/㎕ 까지 제조하였다 (균주별 농도 구간 상이). 희석/제조된 핵산은 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 4> 에서 제작한 프라이머 및 프로브를 각각 사용하여 Gene Checker UF-300(PCR thermocycler, Genesystem)로 실시간 PCR(real time PCR) 분석을 수행하였다(표 5). 리포트 창에서 Ct 값 결과를 해석하고, CV(%) 분석값과 검출정도(유무)를 통해 시험 결과가 유효한지 확인하였다. 그 후 IBM SPSS Statistics (Ver. 28.0.0.0) Probit 분석을 통해 민감도를 결정하였다. 최소한의 테스트 수는 60회 이었다(균주별 6개 농도 X 10회 반복).
온도(℃) 시간(s) 사이클
98 30 1
98 3 40
60 15
주형(1 ㎕), Pp mix(1 ㎕), 2x MM(5 ㎕), D.W(3 ㎕); 총 10 ㎕
장비 : UF-300 (Genesystem)시약 : Rapi:Spec Probe Mastermix (Genesystem)Oligo (Primer&Probe) : macrogene
그 결과, Aa 와 Td 의 경우, 10 copies/㎕ 까지 100% 검출되었으며 Pg 는 20%, Tf 는 30% 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 실험 결과의 유효성 정도를 확인할 수 있는 CV(Coefficient of Variation, 변동계수) 역시 모두 5% 이내의 수치를 나타냈으며, PCR 자체의 performance 를 확인할 수 있는 지표인 IPC(Internal Positive Control, 서열번호 13 ~15)는 4 개의 target 에서 100% 검출된 것을 확인할 수 있었다(도 1 ~ 도 4). 상기 데이터를 기반으로 SPSS probit 분석을 진행하여 각 target 별 q-PCR reagents 의 분석적 민감도를 확인한 결과는 하기 [표 6] 에 기재하였다(copies/㎕, 95% 신뢰구간 기준).
타겟 Aa Pg Td Tf
민감도 8.613 81.993 8.613 44.751
[실시예 6]
프라이머 및 프로브의 직선성 확인
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 4> 에서 제작한 프라이머 및 프로브의 효율의 직선성(linearity)을 평가하고자 상기 <실시예 5> 와 동일한 방법으로 표준균주들을 정량한 후, 리포트 창에서 Ct 값 결과를 해석하여 직선성을 평가하였다.
그 결과, [도 5] 내지 [도 8] 에서 나타나는 바와 같이 Aa, Td 및 Tf 의 상관계수값이 0.99 이상으로 확인되었으며 Pg 역시 0.9873 의 높은 상관계수값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이는 표적 핵산의 농도에 따라 일정한 값을 재현성 있게 도출하는 것을 의미하였다.
[실시예 7]
프라이머 및 프로브의 특이도 확인
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 4> 에서 제작한 프라이머 및 프로브의 분석적 특이도(specificity)를 평가하고자 하였다.
구체적으로, 생물자원센터에서 분양받은 표준균주(표 7) 들은 멸균된 20%의 glycerol stock 과 1:1 로 혼합하여 초저온 냉동고(-70℃ 이하)에 보관하였다. 표준균주를 초저온 냉동고(-70℃ 이하)로부터 꺼내 해동한 후, 제조사(Qiagen)의 프로토콜에 따라 QIAamp DNA mini prep kit 으로 핵산을 추출하였다. 추출된 핵산은 NanoDrop 2000 분광분석기 (Thermo Fisher)를 이용하여 수율을 측정한 뒤, copy number 로 단위를 환산하여 희석하고, 105 copies/㎕ 를 q-PCR 실험에 사용하였다. 희석/제조된 핵산은 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 4> 에서 제작한 프라이머 및 프로브를 각각 사용하여 Gene Checker UF-300(PCR thermocycler, Genesystem)에서 실시간 PCR(real time PCR) 분석을 수행하였다. 리포트 창에서 Ct 값 결과를 해석하고, PC(Positive control), NC(Negative control) 및 IPC(Internal Positive Control)의 CV(%) 분석값과 검출정도(유무)를 통해 시험 결과가 유효한지 확인하였다. 각 타겟 별 35 종의 다른 균의 핵산을 주형(template)으로 이용하여 q-PCR 1 회 반복하였다.
No. Strain ID
1 Tannerella forsythia KCTC5666
2 Treponema denticola KCTC15104
3 Aggregatibacter actinomycetemcomitans KCTC2581
4 Porphyromonas gingivalis KCTC5352
5 Streptococcus sobrinus KCTC-5809
6 Streptococcus mutans KCTC3065
7 Streptococcus mitis KCTC5650
8 Lactobacillus casei KCTC3109
9 Prevotella intermedia KCTC15693
10 Prevotella nigrescens KCTC5081
11 Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC25586
12 Bacteroides fragilis KCTC5013
13 Bacteroides ovatus KCTC5827
14 Bacteroides thetaiotaomicron KCTC5015
15 Campylobacter gracilis KCTC15224
16 Campylobacter rectus KCTC5636
17 Eubacterium limosum KCTC3266
18 Fusobacterium varium KCTC15085
19 Parvimonas micra KCTC15021
20 Peptostreptococcus anaerobius KCTC5973
21 Porphyromonas asaccharolytica KCTC5471
22 Porphyromonas endodontalis KCTC15043
23 Prevotella corporis KCTC15680
24 Prevotella loescheii KCTC5076
25 Prevotella melaninogenica KCTC5457
26 Porphyromonas uenonis KCTC15092
27 Selenomonas flueggei KCTC5748
28 Streptococcus gordonii KCTC3286
29 Streptococcus sanguinis KCTC3284
30 Parabacteroides merdae ATCC43184
31 Bacteroides vulgatus ATCC8482
32 Prevotella oralis ATCC33269
33 Veillonella parvula ATCC10790
34 Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum ATCC25286
35 Eikenella corrodens KCTC 15198
36 Eubacterium nodatum KCTC 15015
그 결과, 하기 [표 8] 에서 나타나는 바와 같이 100% 의 특이도를 나타냈으며, 실험 결과에 유효성 정도를 확인할 수 있는 CV(Coefficient of Variation, 변동계수) 역시 모두 5% 이내의 수치를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
검출 비율(총 35 종)
검출 제제 타겟 IPC PC IPC NC IPC
Aa 0/35 35/35 5/5 5/5 0/5 5/5
Pg 0/35 35/35 5/5 5/5 0/5 5/5
Td 0/35 35/35 5/5 5/5 0/5 5/5
Tf 0/35 35/35 5/5 5/5 0/5 5/5
% 0% 100% 100% 100% 100% 100%
본 발명의 프라이머 내지 프로브를 포함하는 조성물을 이용하는 경우 높은 민감도(sensitivity), 직선성(linearity) 및 특이도(specificity) 로 신속하게 구강질환 유발 세균을 검출할 수 있으므로, 구강질환 유발 세균 검출 내지 구강질환 진단을 위해 효과적으로 사용될 수 있다.
서열번호 1 은 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 를 검출하기 위한 프라이머의 정방향 염기서열을 나타낸다.
서열번호 2 는 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 를 검출하기 위한 프라이머의 역방향 염기서열을 나타낸다.
서열번호 3 은 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 를 검출하기 위한 프로브의 염기서열을 나타낸다.
서열번호 4 는 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 를 검출하기 위한 프라이머의 정방향 염기서열을 나타낸다.
서열번호 5 는 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 를 검출하기 위한 프라이머의 역방향 염기서열을 나타낸다.
서열번호 6 은 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 를 검출하기 위한 프로브의 염기서열을 나타낸다.
서열번호 7 은 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 를 검출하기 위한 프라이머의 정방향 염기서열을 나타낸다.
서열번호 8 은 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 를 검출하기 위한 프라이머의 역방향 염기서열을 나타낸다.
서열번호 9 는 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 를 검출하기 위한 프로브의 염기서열을 나타낸다.
서열번호 10 은 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 를 검출하기 위한 프라이머의 정방향 염기서열을 나타낸다.
서열번호 11 은 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 를 검출하기 위한 프라이머의 역방향 염기서열을 나타낸다.
서열번호 12 는 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 를 검출하기 위한 프로브의 염기서열을 나타낸다.
서열번호 13은 IPC(Internal Positive Control) 를 검출하기 위한 프라이머의 정방향 염기서열을 나타낸다.
서열번호 14는 IPC(Internal Positive Control) 를 검출하기 위한 프라이머의 역방향 염기서열을 나타낸다.
서열번호 15는 IPC(Internal Positive Control) 를 검출하기 위한 프로브의 염기서열을 나타낸다.

Claims (15)

  1. 서열번호 1 의 염기서열 및 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제1프라이머 세트;
    서열번호 4 의 염기서열 및 서열번호 5 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제2프라이머 세트;
    서열번호 7 의 염기서열 및 서열번호 8 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제3프라이머 세트; 및
    서열번호 10 의 염기서열 및 서열번호 11 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제4프라이머 세트;
    로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 3 의 염기서열을 포함하는 프로브;
    제2프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 6 의 염기서열을 포함하는 프로브;
    제3프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 9 의 염기서열을 포함하는 프로브; 또는
    제4프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 12 의 염기서열을 포함하는 프로브;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 PCR(polymerase chain reaction)에 사용되는 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 구강질환 유발 세균은 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 및 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 구강질환은 치은염, 침습성 치주염, 임플란트 주위염, 소아성 치주염, 괴사 궤양성 치주염 및 만성염증성 치주질환 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물.
  7. 제1항의 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 구강질환 유발 세균 검출용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 세균 검출용 키트.
  9. i) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 세균 DNA를 분리하는 단계; 및
    iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 세균 DNA와 상기 제1항의 조성물을 이용하여 구강질환 유발 세균을 검출하는 단계;
    를 포함하는 구강질환 유발 세균 검출방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단계 i)의 생물학적 시료는 혈액, 소변, 뇌척수액 및 타액 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 세균 검출방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 단계 iii)의 검출은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 세균 검출방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 세균 검출방법.
  13. 제1항의 조성물을 포함하는 구강질환 진단용 조성물.
  14. 제13항의 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 구강질환 진단용 키트.
  15. i) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 세균 DNA를 분리하는 단계; 및
    iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 세균 DNA와 상기 제1항의 조성물을 이용하여 구강질환 유발 세균을 검출하는 단계;
    를 포함하는 구강질환 진단을 위한 정보제공방법.
PCT/KR2022/012337 2021-08-25 2022-08-18 구강질환 유발 세균 검출용 조성물 내지 이의 용도 WO2023027418A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210112573A KR102395651B1 (ko) 2021-08-25 2021-08-25 구강질환 유발 세균 검출용 조성물 내지 이의 용도
KR10-2021-0112573 2021-08-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023027418A1 true WO2023027418A1 (ko) 2023-03-02

Family

ID=81582687

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/012337 WO2023027418A1 (ko) 2021-08-25 2022-08-18 구강질환 유발 세균 검출용 조성물 내지 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (2) KR102395651B1 (ko)
WO (1) WO2023027418A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102395651B1 (ko) * 2021-08-25 2022-05-09 주식회사 덴오믹스 구강질환 유발 세균 검출용 조성물 내지 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101706070B1 (ko) * 2016-06-28 2017-02-13 (주) 와이디생명과학 멀티플렉스 실시간 pcr을 이용한 다수의 구강질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법
KR20170064613A (ko) * 2015-12-01 2017-06-12 주식회사 마이크로이즈 구강 질환 관련 세균의 실시간 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 리얼타임 pcr 방법
KR102395651B1 (ko) * 2021-08-25 2022-05-09 주식회사 덴오믹스 구강질환 유발 세균 검출용 조성물 내지 이의 용도

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102460593B (zh) 2009-04-16 2016-08-24 泰拉能源有限责任公司 由燃烧波释放的挥发性裂变产物和热量的受控移除
KR101129601B1 (ko) 2009-05-15 2012-04-12 이정훈 오답율에 따른 기출문제를 제공하는 시스템 및 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170064613A (ko) * 2015-12-01 2017-06-12 주식회사 마이크로이즈 구강 질환 관련 세균의 실시간 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 리얼타임 pcr 방법
KR101706070B1 (ko) * 2016-06-28 2017-02-13 (주) 와이디생명과학 멀티플렉스 실시간 pcr을 이용한 다수의 구강질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법
KR102395651B1 (ko) * 2021-08-25 2022-05-09 주식회사 덴오믹스 구강질환 유발 세균 검출용 조성물 내지 이의 용도

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUNG Y.-J., CHOI Y.-J., AN S.-J., LEE H.-R., JUN H.-K., CHOI B.-K.: "Tannerella forsythia GroEL induces inflammatory bone resorption and synergizes with interleukin-17", MOLECULAR ORAL MICROBIOLOGY, vol. 32, no. 4, 1 August 2017 (2017-08-01), pages 301 - 313, XP093039144, ISSN: 2041-1006, DOI: 10.1111/omi.12172 *
PETER M VESEY, HOWARD K KURAMITSU: "Genetic analysis of Treponema denticola ATCC 35405 biofilm formation", MICROBIOLOGY, SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY, READING, vol. 150, no. 7, 1 July 2004 (2004-07-01), Reading , pages 2401 - 2407, XP055263466, ISSN: 1350-0872, DOI: 10.1099/mic.0.26816-0 *
SAITO, D. ; COUTINHO, L.L. ; BORGES SAITO, C.P. ; TSAI, S.M. ; HOFLING, J.F. ; GONCALVES, R.B.: "Real-time Polymerase Chain Reaction Quantification of Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythia in Primary Endodontic Infections", JOURNAL OF ENDODONTICS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 35, no. 11, 1 November 2009 (2009-11-01), AMSTERDAM, NL , pages 1518 - 1524, XP026697984, ISSN: 0099-2399, DOI: 10.1016/j.joen.2009.08.005 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102616515B1 (ko) 2023-12-21
KR102395651B1 (ko) 2022-05-09
KR20230030509A (ko) 2023-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2023027418A1 (ko) 구강질환 유발 세균 검출용 조성물 내지 이의 용도
WO2010147372A2 (ko) 말라리아 원충 검출용 프라이머, 탐침 및 이를 이용한 검출방법
WO2020218831A1 (ko) 신규한 등온 단일 반응용 프로브 세트 및 이의 용도
WO2018139826A1 (ko) Dna 메틸화를 이용한 연령 예측 방법
WO2020105873A1 (ko) 인간 알파코로나바이러스 전장유전체 증폭을 통한 진단키트 및 전장 유전체 서열 확인 방법
WO2018080225A2 (ko) 시식성 파리의 종 구별용 snp 마커 및 이의 용도
WO2021182881A1 (ko) 유방암 진단용 다중 바이오마커 및 이의 용도
WO2011139032A2 (ko) 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물
WO2015105336A1 (ko) 5&#39;-플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 억제된 dna 폴리머레이즈를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법
WO2015167087A1 (ko) Dna 복제수 변이를 이용한 강직성 척추염 발병 위험도 예측 방법
WO2022045843A1 (en) Method for positive control reaction using pre-positive control composition
WO2021075750A1 (ko) 자가 증폭이 가능한 헤어핀 구조의 ｎｇｓ 라이브러리 제작용 어댑터 및 이를 이용한 ｎｇｓ 라이브러리 제조방법
WO2022163967A1 (ko) 라임병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트
WO2010077005A2 (en) Mycobacteria-derived polypeptide and polynucleotide, and method of screening anti-mycobacterial agent
WO2020122679A1 (en) Method for detecting a target analyte in a sample using an s-shaped function for a slope data set
WO2022216125A1 (ko) Dna 메틸화 마커 검출을 이용한 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물 및 이의 활용
WO2014157825A1 (ko) 스피드 멀티플렉스 pcr법을 이용한 hla 대립유전자 검사방법 및 검사키트
WO2016003047A1 (ko) 디지털 ｐｃｒ을 이용하여 임부의 혈액 또는 혈장으로부터 태아의 유전자 정보를 분석하는 방법
WO2022039336A1 (ko) 바이러스성출혈성패혈증 실시간 rt-pcr 법을 표준으로 하는 목적 질병의 병원체 유전자 검출에서 나타날 수 있는 거짓음성 및 거짓양성 반응 판별 방법
WO2012177089A2 (ko) 클로렐라의 종간 및 종 내의 균주 특이적 마이크로새틀라이트 분자 마커
WO2011081501A2 (ko) 핵내유전자적 웅성불임성 유전인자인 엠에스3 판별용 분자마커 및 이를 이용한 검정방법
WO2023177221A1 (en) Device for determining presence/absence of target nucleic acid, method for determining presence/absence of target by the device, server for distributing update information, and method for distributing update information by the server
WO2022124848A1 (en) Computer-implemented method for preparing oligonucleotides used to detect nucleotide mutation of interest
WO2023106680A1 (ko) 비타민 c를 포함하는 처방의 피부 밝기 변화 예측 방법 및 시스템
WO2020060003A1 (ko) 락토바실러스 애시도필러스 균주 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22861628

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE