KR101706070B1

KR101706070B1 - 멀티플렉스 실시간 pcr을 이용한 다수의 구강질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법

Info

Publication number: KR101706070B1
Application number: KR1020160093983A
Authority: KR
Inventors: 이진우; 김민배; 박복리; 윤영민
Original assignee: (주) 와이디생명과학
Priority date: 2016-06-28
Filing date: 2016-07-25
Publication date: 2017-02-13

Abstract

본 발명은 멀티플렉스 실시간 PCR을 이용한 구강질환 원인 세균 18종의 동시 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 구강질환의 원인 세균 18종 각각에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 다른 균주에 대한 교차 반응 없이 18종의 균주를 동시에 검출하는 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프라이머 세트 및 멀티플렉스 실시간 PCR 분석법에 의해 샘플 내 구강질환에 관련된 주요 원인 세균 18종을 동시에 신속하고 정확하게 검출할 수 있다. 또한 정량적인 분석이 가능하여 구강 내 세균 분포 및 세균량을 정확하게 판단할 수 있다. 따라서, 치주질환, 치아우식증 및 임플란트 주위염 등이 있는 환자들에 대하여 구강질환 원인 세균의 분포 및 양을 측정함으로써 치료 과정을 확인하는 지표로 활용할 수 있어서 구강질환 치료 후에 예후 관찰 지표로서 활용이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 분석법을 환자가 아닌 일반인에 적용하여 구강 질환(치주 질환, 치아우식증, 임플란트주위염 등)의 발병 가능성을 예측하고 관리할 수 있다.

Description

멀티플렉스 실시간 PCR을 이용한 다수의 구강질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법{Simultaneous detecting composition of multiple oral disease bacteria with multiplex real-time PCR and method thereof}

본 발명은 멀티플렉스 실시간 PCR을 이용한 다수의 구강질환 원인 세균의 동시 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 구강질환의 원인 세균 18종 각각에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 다른 균주에 대한 교차 반응 없이 18종의 균주를 동시에 검출하는 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.

치주질환(Periodontal Disease)은 치주 조직 내 세균성 치태의 침착으로 인한 숙주 반응에 의해 조직 파괴가 발생되는 만성, 감염성 질환(치조골의 흡수를 동반하는 염증성 질환)이다. 치아와 잇몸 경계 부위에 있는 미세한 틈인 치은열구(잇몸 고랑)내에 음식물들이 잘 제거되지 않으면 세균들이 덩어리를 이룬 채로 치면세균막(dental plaque and dental biofilm)을 형성하고, 치은열구 주변에 치석이 쌓이면 세균은 독성인자(염증유발물질)들을 분비한다. 세균 내 독소로 인해, 잇몸을 자극하고 잇몸염증을 일으켜 잇몸 뼈가 무너지면 치은열구가 자연적으로 깊어진다. 이러한 염증은 깊이가 깊어지면서 치주낭 속에 더 많은 세균이 증식하게 되며, 치태 및 치석의 침착이 용이해지고 염증이 악화된다. 결과적으로 치아가 흔들리게 되고, 흔히 풍치라고 알려져 있는 치주염이 발생하는 것이다.

상기 기재된 치주질환(Periodontal Disease)은 치아를 지지하는 치은에 염증이 생기는 치은염(gingivitis)과 치주인대 및 치조골에 염증이 생기는 치주염(Periodontitis)으로 나뉘며, 치면세균막에 존재하는 세균들이 만들어 내는 단백질 분해효소와 내독소에 의해 일어난다(비특허문헌 1 및 비특허문헌 2).

한편, 구강 내에는 약 500여 종의 세균이 존재한다고 보고되었다. 구강 세균은 구강상태가 양호하거나 치주질환을 가지고 있는 사람의 치은연하 치면세균막, 면역력이 결핍된 사람의 괴사궤양성 치주염, 충치를 가지고 있는 어린이의 치면세균막, 구내염, 구취가 있는 혀의 후면 부위, 타액, 치은염을 가지고 있는 치은연하 치면세균막 및 치아치조 농양에서 검출되었다. 검출된 종들 중 현재의 세균 배양법으로는 약 50% 정도의 구강 세균만 배양이 가능하며 구강 감염 병소에서 분리 동정된 균종은 더욱 부족한 실정이다(비특허문헌 3 및 비특허문헌 4).

따라서, 구강 질환 유발 미생물의 신속한 동정을 위하여 세균 배양 이외의 다양한 기술의 개발이 지속적으로 이루어져 왔으나 낮은 민감도 및 다양한 원인으로 인해 상업화되지 못하고 있으며, 구강 질환을 유발하는 다종의 미생물을 동시에 그리고 정확하게 분석하기 위한 기술 역시 부족한 실정이다.

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본 발명은 상기와 같은 종래의 기술 상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 구강 질환을 유발하는 18종 균주에 대하여 비특이적인 교차 반응 없이 높은 민감도를 가지고 18종 균주의 동시 검출에 사용가능 한 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 검출 키트 및 검출 방법을 제공하는데 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 구강 질환을 유발하는 18가지 균주 내 목적 유전자에 특이적으로 결합하는 18가지의 프라이머 세트를 제작하였고, 각 프라이머 세트의 대상 균주에 대한 결합 특이성을 PCR을 통해 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 각각의 프라이머 세트가 대상 균주 외의 다른 17가지 균주에 대한 교차 반응성이 없음을 균주 혼합물 및 각각의 프라이머 세트 또는 프라이머 세트 혼합물 및 각각의 균주를 사용한 PCR 반응에 의해 검증하였고, 대상 균주에 대한 본 발명의 프라이머 세트와 서열이 상이한 프라이머 세트는 대상 균주 외의 다른 균주에 대한 교차 반응이 발생한다는 것을 추가적으로 확인하였다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. “한 가지 구체예” 또는 “구체예”에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 “한 가지 구체예에서” 또는 “구체예”의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

출원서 내 특별한 정의가 없으면 본 출원서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 목적은 구강 질환을 유발하는 18종의 균주를 교차 반응 없이 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 구강 질환을 유발하는 18종의 균주에 대한 동시 검출용 조성물 및 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구체예에서, 구강에서 채취한 생물학적 시료로부터 획득한 DNA에 특이적으로 결합하는, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 1 프라미머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 2 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 3 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 4 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호10의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 5 프라이머 세트, 서열번호11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 6 프라이머 세트, 서열번호13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 7 프라이머 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 8 프라이머 세트, 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 9 프라이머 세트, 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 10 프라이머 세트, 서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 11 프라이머 세트, 서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 12 프라이머 세트, 서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 13 프라이머 세트, 서열번호 27 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 14 프라이머 세트, 서열번호 29 및 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 15 프라이머 세트, 서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 16 프라이머 세트, 서열번호 33 및 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 17 프라이머 세트, 및 서열번호 35 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 18 프라이머 세트를 포함하는, 구강 질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 아그레가티빅티 액티노마이세텀코마란스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 타너렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸소박테리움 누클레이툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 프레보텔라 니그레스센스(Prevotella nigrescens), 파비모나스 미크라(Parvimonas micra), 캄필로박터 렉투스(Campylobacter rectus), 유박테리움 노다툼(Eubacterium nodatum), 익케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 스트랩토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 소비너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 스테피로코쿠스 우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코쿠스 패카리스(Enterococcus faecalis), 및 엑티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 구강 질환 원인 세균을 특이적으로 검출할 수 있는 구강 질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물을 제공하였다.

상기 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 상기 표에 기재된 유전자 영역에 특이적으로 결합하는, 구강 질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 구강 질환 원인 세균에 의해 발생하는 구강 세균 감염성 질환은 치주질환(치은염, 치주염, 만성치주염), 충치(치아우식증), 임플란트주위염, 치수, 치근관질환, 및 악골 골수염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 상기 균주에 의하여 유발될 수 있는 질환이라면 이에 제한되지 않는다. 상기 구체예에서, 제 1 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1522bp 내지 1644bp이고, 제 2 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 5493bp 내지 5611bp이며, 제 3 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1117bp 내지 1256bp이며, 제 4 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1515bp 내지 1641bp이며, 제 5 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 994bp 내지 1107bp이며, 제 6 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 782bp 내지 924bp이며, 제 7 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 704bp 내지 835bp이며, 제 8 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 651bp 내지 794bp이며, 제 9 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1887bp 내지 2018bp이며, 제 10 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 2543bp 내지 2672bp이며, 제 11 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 2141bp 내지 2250bp이며, 제 12 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1148bp 내지 1296bp이며, 제 13 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1480bp 내지 1582bp이며, 제 14 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 516bp 내지 651bp이며, 제 15 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 445bp 내지 574bp이며, 제 16 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 99bp 내지 230bp이며, 제 17 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1954bp 내지 2054bp이며, 제 18 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 734bp 내지 873bp인 구강 질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물을 제공하였다.

본 발명의 다른 일 구체예에서 구강 질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물을 포함하는 구강 질환 원인 세균의 동시 검출용 키트로서, 상기 세균은 아그레가티빅티 액티노마이세텀코마란스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 타너렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸소박테리움 누클레이툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 프레보텔라 니그레스센스(Prevotella nigrescens), 파비모나스 미크라(Parvimonas micra), 캄필로박터 렉투스(Campylobacter rectus), 유박테리움 노다툼(Eubacterium nodatum), 익케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 스트랩토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 소비너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 스테피로코쿠스 우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코쿠스패카리스 (Enterococcus faecalis), 및 엑티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 키트를 제공하였다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 제 1항에 따른 조성물을 이용한 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)을 실시하여 구강 질환 원인 세균을 탐지하는 단계를 포함하는 구강 질환 원인 세균의 동시 검출 방법으로서, 상기 세균은 아그레가티빅티 액티노마이세텀코마란스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 타너렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸소박테리움 누클레이툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 프레보텔라 니그레스센스(Prevotella nigrescens), 파비모나스 미크라(Parvimonas micra), 캄필로박터 렉투스(Campylobacter rectus), 유박테리움 노다툼(Eubacterium nodatum), 익케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 스트랩토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 소비너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 스테피로코쿠스 우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코쿠스패카리스(Enterococcus faecalis), 및 엑티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 구강 질환 원인 세균의 동시 검출 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 탐지는 제 1 프라이머 세트 내지 제 18 프라이머 세트에 의해 증폭되는 각각의 DNA 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제 1 탐침 내지 제 18 탐침(각각 서열번호 37 내지 서열번호 54)을 이용한 멀티플렉스 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 구강 세균감염성 질환의 원인균을 탐지하는 단계를 추가로 포함하는, 구강 질환 원인 세균의 동시 검출 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 표지물질은 바람직하게는 텍사스레드 (TexasRed), 6-카복시플루오르세인 (6-carboxyfluorescein, FAM), HEX, Cy5 등 일 수 있으나, 표지를 통하여 DNA 농도를 확인할 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "혼성화(hybridization)"는 이중가닥, 삼중가닥, 또는 기타 고차 구조의 형태를 초래하는, 핵산과 또 다른 핵산의 염기쌍 상호작용을 의미한다. 특정한 구체예에서, 일차적 상호작용은 왓슨/크릭(Watson/Crick) 및 후그스틴형 수소 결합(Hoogsteen-type hydrogen bonding)에 의한, 염기 특이적 상호작용, 예를 들면 A/T 및 G/C이다.

본 발명에서 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 갖는 핵산서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphosphate)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 "프로브(probe)"란 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 핵산단편을 의미하며 라벨링(labelling)되어 있어 특정 핵산 존재 여부를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 5’-말단 및 3’-말단에 각각 형광물질이 표지될 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 상기 5’-말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 3’-말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 black holequencher-1,2,3(BHQ-1,2,3)일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 프로브의 5’-말단 및 3’-말단에 표지된 각각의 형광물질은 상호 간섭 현상을 나타내는 것일 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 표적 염기서열에 결합된 상태에서는 3’-말단의 형광물질 에너지에 의해 5’-말단의 형광물질이 억제되어 발색이 제한되고, 중합효소 연쇄 반응의 수행시 프로브가 분해되면서 5’-말단의 형광물질이 유리되면서 3’-말단의 형광물질에 의한 억제가 해제되어 형광물질이 발색 반응을 하게 된다.

본 발명에서 "표지물질"은 유전자 마커를 탐지하는 검출 가능한 수단의 하나로서, 탐침(프로브)에 연결, 결합 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 모방체 등을 의미한다. 그 예로, 통상적으로 사용되는 형광물질, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으며 형광물질이 가장 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 형광물질은 현재 다양한 제품이 시판되고 있다. 형광물질의 예로는, 6-카복시플루오르세인(6-carboxyfluorescein, FAM), SYBR　Green®, VIC®, 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카복시로다민(2',7'-dimethoxy-4',5'-dichloro-6-carboxyrhodamine, JOE), NED™, 6-카복시테트라메틸 로다민(6-carboxytetramethyl rhodamine, TAMRA), Cy3™, ROX™, Texas Red®, Cy5™ 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 형광물질은 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르면 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 검체에 대하여 함께 사용하는 형광물질은 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 한다. 형광물질의 검체로의 표지 방법은 인터컬레이팅(interchelating) 방법, TaqManTM 프로브법 및 분자 비콘(Molecular beacon) 방법들이 있다. 인터컬레이팅 방법은 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(inter-chelator: SYBR　Green I, EtBr 등)을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로, 인터컬레이터가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5' 말단을 형광물질(6-카복시플루오르세인(6-carboxyfluorescein, FAM) 등)로 3' 말단을 quencher 물질(6-카복시테트라메틸 로다민(6-carboxytetramethyl rhodamine, TAMRA)등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3' 엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. 분자 비콘 방법은 양 말단을 형광물질(6-카복시플루오르세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 6-카복시테트라메틸 로다민(6-carboxytetramethyl rhodamine, TAMRA) 등)과 quencher 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 올리고뉴클레오티드 프로브(Molecular Beacon probe)를 PCR 반응계에 첨가하는 방법이다. 분자 비콘 프로브는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하며 형광물질과 quencher 물질에 근접해 있어 형광발생이 억제되지만, 어닐링 단계에서 주형 DNA와 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화할때 형광물질과 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소됨으로써 프로브상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. 그러나, 혼성화되지 않은 분자 비콘 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않게 된다.

본 발명에서 "중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)"은 아주 적은 양의 DNA 만으로도 특정 부위의 DNA 염기서열을 기하급수적으로 증폭시킬 수 있는 간단하고 편리한 방법으로, 증폭하고자 하는 DNA에 특이적으로 결합하여 고온에서도 안정한 Taq DNA 중합효소를 사용하여 변성(denaturation), 어닐링(annealing), 연장(extension)의 과정을 반복적으로 실행함으로써 특정 DNA를 증폭시키게 된다. PCR을 이용한 목적 유전자의 검출은 유전자를 인식하는 프라이머를 이용하여 이를 증폭 및 확인하는 것이다.

본 발명에서 "리얼타임(real-time) PCR"이란 형광물질을 PCR 기법에 응용한 것으로, 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission)정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 전통적인 PCR 기법에 비해, PCR 증폭 산물을 분석하기 위한 gel 전기영동, DNA-DNA 혼성화, 서열분석 같은 추가적인 실험을 필요로 하지 않는다는 장점이 있다.

본 발명에서 real-time PCR을 이용한 정량은 일반적으로 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한, PCR을 이용한 일련의 반응을 의미한다. 정량적 PCR에는 기준이 되는 표준시료를 사용하는 내부 표준법과 증폭반응에 있어서 경쟁하는 분자를 사용하는 경쟁법이 포함된다. 또한, 각 서열의 분자 수를 정확하고 간편하게 결정하기 위해서 표준시료라고 불리는 기준이 되는 주형 DNA 서열을 이용한 PCR 방법을 사용하고, 반응 중 임의의 시점에서 반응의 진행상황, 즉 증폭의 정도를 확인한다. 따라서, 본 발명에서 "정량"이란 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한 PCR로서, 반응 중 임의의 시점에서 증폭대상의 분자에 대해 증폭을 확인할 수 있는 PCR을 의미한다. 정량을 위해서는 일반적으로 그와 같은 PCR과 반응 개시 시의 주형 DNA 분자 수와 그 증폭의 지표가 되는 신호를 관련짓는 검량선이 조합된다. 이 검량선은 분자 수가 알려진 표준 시료를 이용하여 제작할 수 있다. 이러한 real-time PCR 분석은 시판되고 있는 real-time PCR 기기를 사용하여 수행될 수 있는 바, real-time 기기는, SLAN real time PCR detectionsystem(LG 생명과학, 한국), LightCycler 96/480(Roche, Germany), ABI 7500 fast/7500/PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems, USA), iCyclerTM/CFX96TM(Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia), OpticonTM(PharmaTech, USA) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 "멀티플렉스 리얼타임(multiplex real-time) PCR"이란 한 번의 실시간 PCR 반응으로 여러 개의 목적 유전자를 동시에 증폭시킬 수 있어서, 이를 이용하여 여러 미생물을 동시에 검출하고 확인하는 많은 연구에 활용되고 있다.

본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 실시간 PCR 분석법에 의해 시료 내 구강질환에 관련된 주요 원인 세균 18종을 동시에 신속하고 정확하게 검출할 수 있다. 또한, 정량적인 분석이 가능하여 구강 내 세균 분포 및 세균량을 정확하게 판단할 수 있다. 따라서, 치주질환, 치아우식증, 임플란트 주위염 등이 있는 환자들에 대하여 구강질환 원인 세균의 분포 및 양을 측정함으로써 치료 과정을 확인하는 지표로 활용할 수 있어서 구강질환 치료 후에 예후 관찰 지표로서 활용이 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 분석법을 환자가 아닌 일반인에 적용하여 구강 질환(치주 질환, 치아우식증, 임플란트주위염 등)의 발병 가능성을 예측하고 관리할 수 있다.

도 1은 구강 질환의 원인 18종 균주에 대한 프라이머 세트를 이용하여 각 균주에 대한 PCR을 실시한 결과에 관한 것이다.
도 2는 본 발명의 18종 프라이머 세트에 대한 각각의 대상 균주 외에 다른 균주에 대한 교차반응에 관한 것으로, 도 2a는 18종의 세균 균주 DNA 혼합물에 각각의 프라이머 세트 1을 사용하여 시험한 결과에 관한 것이고, 도 2b는 18종의 세균 균주 DNA 혼합물에 각각의 프라이머 세트 2를 사용하여 시험한 결과에 관한 것이며, 도 2c는 18종의 프라이머 세트 1을 혼합한 후 단일 균주 DNA를 사용하여 시험한 결과에 관한 것이며, 도 2d는 18종의 프라이머 세트 2를 혼합한 후 단일 균주 DNA를 사용하여 시험한 결과에 관한 것이다.
도 3은 본 발명에서 각 균주에 대한 탐침(probe)을 사용하여 실시간 PCR을 실시한 결과에 관한 것이다.
도 4 는 본 발명에서 18종의 균주 DNA 및 균주별 프라이머 세트를 혼합한 후, 멀티플렉스 실시간 PCR을 실시한 결과에 관한 것이다.
도 5는 본 발명에서 18종의 균주 플라스미드 DNA의 농도를 다양한 배율로 희석하여 실시간 PCR을 실시한 결과에 관한 것이다.
도 6 은 본 발명에서 각각의 프라이머 세트가 특이적으로 결합하는 하나의 대상 균주 내 표적 유전자 서열에 대하여 계통분류상 상위 단계인 속(genus) 단위에 속하는 다른 균주 내 상응하는 서열과 비교한 결과에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

분석 시료

본 발명에서 사용하는 생물학적 시료는 검사 대상의 구강으로부터 페이퍼포인트나 스왑, 프로브 등을 이용하여 채취한 조직, 타액, 치태('Plaque' 또는 '플라그'라고도 함) 등을 사용할 수 있으나, 전체 구강 내에 분포하는 세균을 효과적으로 확인하기 위해서 가글액(또는 물, 식염수 등 용액 포함)으로 입을 헹궈 뱉어낸 것을 준비하였다.

프라이머 제작

2.1 표적 균주의 선택

구강 질환을 유발하는 18종의 대표적인 표적 균주는 선행문헌을 검색하여 하기와 같이 선별하였다.

균주(A 세트) 및 선행문헌

대상 균주	선행문헌
아그레가티빅티 액티노마이세텀코마란스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aa)	비특허문헌 5
포피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis, Pg)	비특허문헌 6
타너렐라 포시티아 (Tannerella forsythia, Tf)	비특허문헌 4
트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola, Td)	비특허문헌 8

균주(B 세트) 및 선행문헌

대상 균주	선행문헌
푸소박테리움 누클레이툼 (Fusobacterium nucleatum, Fn)	비특허문헌 9
프레보텔라 인터미디아 (Prevotella intermedia, Pi)	비특허문헌 5
프레보텔라 니그레스센스 (Prevotella nigrescens, Pn)	비특허문헌 10

균주(C 세트) 및 선행문헌

대상 균주	선행문헌
파비모나스 미크라 (Parvimonas micra, Pm)	비특허문헌 5
캄필로박터 렉투스 (Campylobacter rectus, Cr)	비특허문헌 10
유박테리움 노다툼 (Eubacterium nodatum, En)	비특허문헌 10
익케넬라 코로덴스 (Eikenella corrodens, Ec)	비특허문헌 10

균주(D 세트) 및 선행문헌

대상 균주	선행문헌
스트랩토코쿠스 미티스 (Streptococcus mitis, Sm)	비특허문헌 11
스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans, Smu)	비특허문헌 12
스트렙토코쿠스 소비너스 (Streptococcus sobrinus, Ss)	비특허문헌 13
락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei, Lc)	비특허문헌 14

균주(E 세트) 및 선행문헌

대상 균주	선행문헌
스테피로코쿠스 우레우스 Staphylococcus aureus (Sa)	비특허문헌 15
엔테로코쿠스 패카리스 Enterococcus faecalis (Ef)	비특허문헌 16
엑티노마이세스 비스코서스 Actinomyces viscosus (Av)	비특허문헌 12

2.2 프라이머 디자인

각 선행문헌으로부터 각각의 균주별 타겟 영역 및 균주별로 공개된 프라이머 서열을 확인하였다. 이후, NCBI 또는 BLAST 에서 각 균주의 이름을 검색하여 타겟이 명명된 뉴클레오티드 공개 서열(1kb 이내의 특이영역)을 선정하였고, 공개된 프라이머 서열에 대한 blast를 실시하여 해당 전체 서열과 비교하여 유사성이 없는 서열을 선정하였다.

상기 선정된 서열에 대하여 프라이머 3 프로그램을 사용하여 프라이머 온도(58도), 프로브 온도(63도), PCR 생성물 크기(100~200bp 내외)에 대한 동일한 조건을 선정하여 프라이머 서열을 디자인하였다.

디자인된 프라이머 서열에 대하여, 각 대상 균주별 특이적 검출은 선정된 서열 전체에 대한 NCBI BLAST에 의해 검증하였다.

실제 실험 조건을 설정하여 각 균주별 프라이머 세트의 대상 균 외에 다른 균주에 대한 비특이적인 검출 결과를 cross check하였고, 비특이적 검출이 발생하는 프라이머는 영역 또는 표적에 대한 수정 작업을 실시한 후 각각의 균주에 대하여 최종 프라이머 서열 2 세트(set 1 및 set 2)를 확정하였다(하기 표 6 내지 표 10 참조).

프라이머 세트 및 프로브 서열(A 세트 균주)

균주	표적 유전자 (NCBI접속번호)	프라이머 &프로브		서열(5?-3?)	위치 (길이bp)	PCR 생성물 크기 (bp)
Aa	Leukotoxin Gene (AAA21922)	Set 1	AaLtF01	CGGGGCTTTCTACTACGGGA(서열번호1)	1522(20)	123
			AaLtR01	ATGCCTCAAGCATTCTCGCA(서열번호2)	1644(20)
			AaLtP01	[5FAM]GGTCAGCTTGGCAATCAGCCC[3BHQ1] (제1 탐침, 서열번호 37)	1568(21)
		Set 2	AaLtF02	ATTGCTCAACGTGCTGCAG	1503(19)	111
		Set 2	AaLtR02	GTCTTTCCTAGGTATTGCGAAA	1614(22)	111
Pg	Hemagglutinin gene (U68468)	Set 1	PghaF01	ACACGGTGTATCGTGACGGC(서열번호3)	5493(20)	119
			PghaR01	GCCGGCTGCGTACTTAACCT(서열번호4)	5611(20)
			PghaP01	[5HEX]CGACCTACCGCGATGCAGGA[3BHQ1] (제2 탐침, 서열번호 38)	5541(20)
		Set 2	PghaF02	CGAAGGTCCCAGTTACACCT	5473(20)	122
		Set 2	PghaR02	CATGAGTATTGCGTAGAGGTTAAG	5595(24)	122
Tf	karilysin protease gene (GQ856797)	Set 1	TfKpF01	TGGCAAATCGCTCATCATCC(서열번호5)	1117(20)	140
			TfKpR01	TTCCATGTTCCCCAACCACA(서열번호6)	1256(20)
			TfKpP01	[5TexasRed]CCATTAAGCCCATTGCCCGG[3BHQ2](제3 탐침, 서열번호 39)	1183(20)
		Set 2	TfKpF02	GGTTGGCAAATCGCTCATCATCC	1114(23)	136
		Set 2	TfKpR02	AGTGAATGTGGTTGGGGAACATG	1250(23)	136
Td	OpdB gene (AF355459)	Set 1	TdopF11	AGAAAGGCTTTGGGCGACAG(서열번호7)	1515(20)	127
			TdopR11	GCTGGAGCCGTAGCTTCCAT(서열번호8)	1641(20)
			TdopP11	[5Cy5]CGGGTCCTCACCCGCTCTTC[3BHQ2] (제4 탐침, 서열번호 40)	1593(20)
		Set 2	TdopF12	AATCCAGATGATTACACTGT	1494(20)	126
		Set 2	TdopR12	CACCCGCTCTTCTTTATTCTT	1620(21)	126
Aa: A.actinomycetemcomitans, Pg: Porphyromonas gingivalis, Tf: Tannerella forsythia, Td: Treponema denticola.

프라이머 세트 및 프로브 서열(B 세트 균주)

균주	표적 유전자 (NCBI 접속번호)	프라이머 &프로브		서열(5?-3?)	위치 (길이bp)	PCR 생성물 크기 (bp)
Fn	16S ribosomal RNA gene (FJ471640)	Set 1	FnChF01	GGCTGTCGTCAGCTCGTGTC(서열번호9)	994(20)	114
			FnChR01	CTCATCGCAGGCAGTATCGC(서열번호10)	1107(20)
			FnChP01	[5FAM]AACGAGCGCAACCCCTTTCG[3BHQ1] (제5 탐침, 서열번호 41)	1038(20)
		Set 2	FnChF02	GGTGCATGGCTGTCGTCAGCT	987(21)	115
		Set 2	FnChR02	CCCATGCGATACTGCCTGCG	1102(20)	115
Pi	hemagglutinin(phg) gene (AF017417)	Set 1	PiphgF01	CACACGCTGGCGAAACCTAC(서열번호11)	782(20)	143
			PiphgR01	CACGTGGCGTTGCTTCTTTC(서열번호12)	924(20)
			PiphgP01	[5HEX]CCGAAGATGCGCCGTTGAAC[3BHQ1] (제6 탐침, 서열번호 42)	863(20)
		Set 2	PiphgF02	CCTTACGGCACACGCTGGC	774(19)	143
		Set 2	PiphgR02	TGGCTGAGAAAGAAGCAACGC	917(21)	143
Pn	gyrase subunit B (gyrB) gene (KF186729)	Set 1	PngyF01	AGCAAGCTGTAGGCGAGGCT(서열번호13)	704(20)	132
			PngyR01	GCTGAACACTTTCGCGTGCT(서열번호14)	835(20)
			PngyP01	[5TexasRad]GCTCGTATTGCAGCCCGCAA[3BHQ2] (제7 탐침, 서열번호 43)	796(20)
		Set 2	PngyF02	TCAGCAAGCTGTAGGCGAGG	702(20)	132
		Set 2	PngyR02	AAAGCACGCGAAAGTGTTCA	833(20)	132
Tb	16S ribosomal RNA gene	KT899863	Total16F01	TGTCGTCAGCTCGTGTCGTG	266(20)	141
			Total16R01	TGATTTGACGTCGTCCCCAC	406(20)
			Total16P01	[5Cy5]TTAAGTCCCGCAACGAGCGC[3BHQ2]	196(21)
Fn: Fusobacterium nucleatum, Pi: Prevotella intermedia, Pn: Prevotella nigrescens, Tb: Total Bacterial.

프라이머 세트 및 프로브 서열(C 세트 균주)

균주	표적유전자 (NCBI 접속번호)	프라이머 &프로브		서열(5?-3?)	위치 (길이bp)	PCR 생성물 크기 (bp)
Pm	16S ribosomal RNA gene (AF542231)	Set 1	Pm16sF01	GAGGAATACCGGTGGCGAAG(서열번호15)	651(20)	148
			Pm16sR01	GGCACCGAGATTTGACTCCC(서열번호16)	794(20)
			Pm16sP01	[5FAM]GGTACGAAAGCGTGGGGAGCA[3BHQ1] (제8 탐침, 서열번호 44)	700(21)
		Set 2	Pm16sF02	ACCGGTGGCGAAGGCGACT	658(19)	148
		Set 2	Pm16sR02	TCTCGGTGCCGAAGTTAACAC	805(21)	148
Cr	groEL gene (AB071388)	Set 1	CrgrF01	AAATTTAAGCGGCGACGAGG(서열번호17)	1887(20)	132
			CrgrR01	TCCTTGCTCACGCTTACGGA(서열번호18)	2018(20)
			CrgrP01	[5HEX]GGCTTTGACGCGGGCGTAGT[3BHQ1] (제9 탐침, 서열번호 45)	1972(20)
		Set 2	CrgrF02	GAGCGCATCGCTCTTCAAAA	2098(20)	120
		Set 2	CrgrR02	CATACCGCTCATATCGGGCA	2217(20)	120
En	hypothetical protein (NZ_AZKM01000021)	Set 1	EnhpF01	TGCTTGCCGGTGACTTAGGA(서열번호19)	2543(20)	130
			EnhpR01	AAACCGGGCTCAACAACCAT(서열번호20)	2672(20)
			EnhpP01	[5TexasRad]TTGAGGAGCCGGTGACTTTGG[3BHQ2] (제10 탐침, 서열번호 46)	2568(20)
		Set 2	En16F02	GAGTTTGATCATGGCTCAGGATG	3(22)	140
		Set 2	En16R02	GCGTGGGAAACCTGCCC	98(17)	140
Ec	proline iminopeptidase (pip) (AY198131)	Set 1	EcpiF01	GCCAACTGCTGCTGGAAGTG(서열번호21)	2141(20)	110
			EcpiR01	GCCGCTGATTTCGGAGAGTT(서열번호22)	2250(20)
			EcpiP01	ACAGCCATCGGCACAGGCAT (제11 탐침, 서열번호 47)	2173(20)
		Set 2	EcpiF02	CAACGTGATGGAGCCGGTTA	2557(20)	123
		Set 2	EcpiR02	TTCGCAGATTTCGCGGTTTA	2679(20)	123
Pm:Parvimonas micra, Cr:Campylobacter rectus En: Eubacterium nodatum, Ec: Eikenella corrodens.

프라이머 세트 및 프로브 서열(D 세트 균주)

균주	표적유전자 (NCBI 접속번호)	프라이머 &프로브		서열(5?-3?)	위치 (길이bp)	PCR 생성물 크기 (bp)
Sm	16S ribosomal RNA gene (KC589357)	Set 1	Sm16F01	GTACAACGAGTCGCAAGCCG(서열번호23)	1148(20)	149
			Sm16R01	TACAAGGCCCGGGAACGTAT(서열번호24)	1296(20)
			Sm16P01	[5FAM]TAATCGCGGATCAGCACGCC[3BHQ1] (제12 탐침, 서열번호 48)	1250(20)
		Set 2	Sm16F02	GTCCACGCCGTAAACGATGA	705(20)	128
		Set 2	Sm16R02	CCCCCGTCAATTCCTTTGAG	832(20)	128
Smu	PTS EII (mtlA) (AF210133)	Set 1	SmumtF01	CAGCGCATTCAACACAAGCA(서열번호25)	1480(20)	103
			SmumtR01	TGTCCCATCGTTGCTGAACC(서열번호26)	1582(20)
			SmumtP01	[5HEX]TGCGGTCGTTTTTGCTCATGG[3BHQ1] (제13 탐침, 서열번호 49)	1532(21)
		Set 2	SmumtF02	GCAAAAGCCGAGTCTAAAGG	1064(20)	123
		Set 2	SmumtR02	GGGAAGTTCAGCCATGGGC	1168(19)	123
Ss	FtsK (ftsK) gene (AF434671)	Set 1	SsftF01	GGCCTCATGCTGATTTTCCC(서열번호27)	516(20)	136
			SsftR01	ACCACCACCCAGAAAATGGG(서열번호28)	651(20)
			SsftP01	[5TexasRed]AGGAGCGGCCCATCCTTGC[3BHQ2] (제14 탐침, 서열번호 50)	566(19)
		Set 2	SsftF02	CGAGTCAATCGGATTTCCAATCT	1377(23)	128
		Set 2	SsftR02	TTGAAGTACCTAACTCAGAGATTGC	1480(25)	128
Lc	att gene (AB023773)	Set 1	La.cattF01	CAACTGATCGTGCCAAGGGT(서열번호29)	445(20)	130
			La.cattR01	ACAGCGATTGGCAACAGACC(서열번호30)	574(20)
			La.cattP01	[5Cy5]TGATGATGTCGGCGGTCGGT[3BHQ2] (제15 탐침, 서열번호 51)	515(20)
		Set 2	La.cattF02	TGGCTGGCAAGAAGATGTCC	970(20)	112
		Set 2	La.cattR02	GCATCCTGCTTTGGAATGGA	1081(20)	112
Sm: Streptococcus mitis, Smu: Streptococcus mutans, Ss: Streptococcus sobrinus, Lc: Lactobacillus casei.

균주	표적유전자 (NCBI 접속번호)	프라이머 &프로브		서열(5?-3?)	위치 (길이bp)	PCR 생성물 크기 (bp)
Sa	clumping factor A (clfA) gene (JX298874)	Set 1	SA_1F01	GCGCAAGTAACGAAAGCAAAA(서열번호31)	99(21)	132
			SA_1R01	GATTTTGCGCCACACTCGTT (서열번호 32)	230(20)
			SA_lP01	[5FAM]TGCTGCACCTAAAACAGACGACACA[3BHQ1] (제16 탐침, 서열번호 52)	142(25)
		Set 2	SA_1F02	AATGGCGAAACGAGTGTGGCGC	181(22)	104
		Set 2	SA_1R02	GTAGCTTCACCAGTTACCGGCG	285(22)	104
Ef	gelE-sprE operon (JQ815406)	Set 1	EfgeF01	GATGGCAGTGCGACACCATT (서열번호 33)	1954(20)	101
			EfgeR01	CGATCGTTTTGTTTGCCGAC (서열번호 34)	2054(20)
			EfgeP01	[5HEX]GCTTTTTCCCCGAATGCGGA[3BHQ1] (제 17탐침, 서열번호 53)	1999(20)
		Set 2	EfgeF02	AAGCATCTTAAGTTAGAAAA	208(20)	77
		Set 2	EfgeR02	TTTTTATTTAAATGAATAAT	285(20)	77
Av	nanH gene (L06898)	Set 1	AvHanF01*	GCTCCCTCATGCTCAACTCG (서열번호 35)	734(20)	140
			AvHanR01*	GATGATCTGGGCGTTGTCCA (서열번호 36)	873(20)
			AvHanP01*	[5TexasRed]GAGCCGGTCCCCGACAAGAA[3BHQ2] (제18 탐침, 서열번호 54)	820(20)
		Set 2	AvHanF02	GGCAAGACGTGGTCGGCGC	245(19)	100
		Set 2	AvHanR02	CCGTCTGGTTGACGACG	345(17)	100
Sa:Staphylococcus aureus, Ef: Enterococcus faecalis, Av:Actinomyces viscosus.

PCR

3.1 프라이머 세트의 작동 시험

각 대상 균주에 대하여 제조된 프라이머의 작동 여부 및 동시 진단을 위하여 동일한 조건에서 다수의 균주에 대한 프라이머가 작동되는지를 확인하기 위해 대상 균주에 대한 실시예 2의 프라이머를 각각 사용하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응에 사용한 PCR master mix(2x AmpMaster Taq)는 GeneAll 사로부터 구입하였다. PCR 반응을 위한 조성물의 구성 및 PCR 조건은 하기 표와 같다.

프라이머 세트 작동 시험용 PCR 조성물

구분	부피
2x AmpMaster Taq	10 ㎕
프라이머 F(정방향, 10pmol)	1 ㎕
프라이머 R(역방향, 10pmol)	1 ㎕
템플레이트 DNA (10^-1)	1 ㎕
증류수	7 ㎕
전체 부피	20 ㎕

프라이머 세트 작동 시험용 PCR 조건

단계별 온도	시간
94℃	3 min
94℃	30 sec
58℃	30 sec
72℃	30 sec
72℃	5 min
12℃	8
사이클 수: 30

18종의 균주에 대하여 각 균주별로 제조된 프라이머 세트 1 및 세트 2를 사용한 PCR을 실시하여 제조된 프라이머 세트는 동일한 PCR 조건에서 각각의 균주에 대해서는 제대로 작동함을 확인하였다(도 1).

3.2 프라이머 세트의 교차반응 테스트 PCR 조성물

대상 균주 특이적으로 제조된 프라이머가 다른 균주에 대하여 작동(교차 반응 발생)하는지를 시험하기 위해 하기와 같은 조성물을 제조하여 PCR을 실시하였다.

프라이머 세트의 교차반응 테스트 PCR 조성물

구분	부피
2x AmpMaster Taq	10 ㎕
프라이머 F+R(10pmol)	2 ㎕
(프라이머 세트별 5종 mix)	(2 ㎕)
템플레이트 DNA (10^-1)	1 ㎕
(DNA 세트별 5종 mix)	(2 ㎕)
증류수	7 ㎕
전체 부피	20 ㎕

프라이머 세트의 교차반응 테스트 PCR 조건

18종 균주에 대한 세균 표준 DNA를 혼합한 후 18개의 단일 프라이머 set 1을 사용하여 프라이머 각각에 대하여 시험한 결과, 각각의 프라이머가 18개 균주DNA 혼합물 내 해당 균주만을 특이적으로 검출함을 확인하였다(도 2a). 하지만, 상기 균주 DNA 혼합물에 대하여 프라이머 set 2를 사용하여 프라이머 각각에 대하여 시험한 결과, 균주 혼합물에서 프라이머가 목적 균주 외의 교차 반응이 발생함을 확인하였다(도 2b).

또한, 18종 균주에 대한 각각의 프라이머 set 1을 혼합한 후 단일 균주 DNA를 사용하여 시험한 결과, 18종 세균의 표준 DNA에 대하여 프라이머 혼합물 내 각각의 프라이머 세트는 대상 균주에 대하여 특이적으로 작동함을 확인하였다(도 2c). 하지만, 18종 균주에 대한 각각의 프라이머 set 2를 혼합한 후 18종 세균의 표준 DNA에 대한 PCR을 시행한 결과, 프라이머의 혼합 세트는 목적 균주 외의 다른 균주에 대한 비특이적인 교차반응이 발생함을 확인하였다(도 2d).

상기 결과는 프라이머 제작 프로그램을 사용하여 제작한 프라이머 서열에 대한 NCBI BLAST에 의한 예측만으로는 정확한 검출 결과를 확신할 수 없다는 것을 알 수 있을 뿐만 아니라, 본원 발명의 18종 균주에 대한 프라이머 세트 1은 프라이머 혼합물을 사용해도 각각의 해당 균주만을 정확하게 검출할 수 있다는 것을 확인하였고, 각각의 프라이머 세트 1은 섞여있는 균주 시료에 대해서도 해당 균주만을 정확하게 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

이하의 실시예에서는 18종 균주에 대한 프라이머 set 1만을 사용하여 실험을 실시하였다.

실시간( Real - time ) PCR

4.1 프로브 테스트

본 발명의 18종의 균주 검출용 프로브를 테스트하기 위해 실시간-PCR을 진행하였다. 실시간-PCR에 필요한NEXproqTMPCR 2X MASTER MIX는 Geneslabs(korea)로부터 구입하였다. 실시간-PCR의 조성물 및 조건은 하기 표와 같다.

실시간-PCR용 조성물

구분	부피
NEX pro^TM qPCR 2xMaster Mix	25 ㎕
프라이머 F+R(10pmol)	2 ㎕
프로브 (5pmol)	1 ㎕
템플레이트 DNA	3 ㎕
증류수	19 ㎕
전체 부피	50 ㎕

실시간-PCR 조건

단계별 온도	시간
95℃	10 min
95℃	15 sec
63℃	40 sec
사이클 수: 45

18종의 균주에 대하여 실시간-PCR을 실시한 결과, 본 발명에 따른 균주별 프로브가 제대로 작동함을 확인하였다(도 3).

4.2 멀티플렉스 실시간-PCR

18종의 균주에 대한 프라이머를 세트(5세트)별로 혼합하여 동시에 검출가능한지를 테스트하였다. 멀티플렉스 실시간-PCR 조성물 및 PCR 조건은 하기 표와 같다.

멀티플렉스 실시간-PCR 조성물

구분	부피
NEX pro^TM qPCR 2xMaster Mix	25 ㎕
프라이머 F+R 혼합물(5종, 10pmol)	5 ㎕
프로브 혼합물(5종, 5pmol)	2.5 ㎕
템플레이트 DNA (각 세트별 5종 혼합물)	3 ㎕
증류수	14.5 ㎕
전체 부피	50 ㎕

멀티플렉스 실시간-PCR 조건

18종 균주 DNA 및 균주별 프라이머를 세트별로 혼합한 후, 멀티플렉스 실시간-PCR을 진행하였다. 균주 DNA 혼합물에 대하여 프라이머 세트 혼합물이 정상적으로 작동함을 확인하였다(도 4).

민감도 테스트

18종 균주 플라스미드 DNA에 대하여 실시간-PCR에서 본 발명에 따른 프라이머 세트의 민감도를 테스트하였다. 균주 플라스미드 DNA의 농도를 다양한 배율로 희석하여 제조한 뒤, 실시간-PCR을 실시하였다.

모든 18종 균주에 대해 제조된 모든 프라이머 세트의 민감도가 높았고, 특히Ss 균주에 대한 프라이머 세트의 민감도가 가장 높았다(도 5).

균주 범위 확장

각 대상 균주(18종)에 대한 본 발명에 따른 프라이머 서열의 균주 확장성을 검증하기 위해, 하나의 대상 균주에 대한 프라이머를 사용하여 같은 속 내의 다른 균주의 유전자 표적 영역 서열에 대한 유사도를 NCBI에서 BLAST에 의해 검증하였다. 서열 비교 결과, 같은 속 내 여러 균주의 서열간 유사도가 높으므로 본 발명에서 하나의 균주에 대하여 특이적인 프라이머 서열은 상위 분류 단계인 속에 포함되는 다른 균주에 대하여 사용할 수 있음을 확인하였다(도 6).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> YD Global Life Science Company <120> Simultaneous detecting composition of eighteen oral disease bacteria with multiplex real-time PCR and method thereof <130> DPB162636 <160> 54 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 1 cggggctttc tactacggga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 2 atgcctcaag cattctcgca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 3 acacggtgta tcgtgacggc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 4 gccggctgcg tacttaacct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tannerella forsythia <400> 5 tggcaaatcg ctcatcatcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tannerella forsythia <400> 6 ttccatgttc cccaaccaca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Treponema denticola <400> 7 agaaaggctt tgggcgacag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Treponema denticola <400> 8 gctggagccg tagcttccat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum <400> 9 ggctgtcgtc agctcgtgtc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum <400> 10 ctcatcgcag gcagtatcgc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Prevotella intermedia <400> 11 cacacgctgg cgaaacctac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Prevotella intermedia <400> 12 cacgtggcgt tgcttctttc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Prevotella nigrescens <400> 13 agcaagctgt aggcgaggct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Prevotella nigrescens <400> 14 gctgaacact ttcgcgtgct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Parvimonas micra <400> 15 gaggaatacc ggtggcgaag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Parvimonas micra <400> 16 ggcaccgaga tttgactccc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Campylobacter rectus <400> 17 aaatttaagc ggcgacgagg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Campylobacter rectus <400> 18 tccttgctca cgcttacgga 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Eubacterium nodatum <400> 19 tgcttgccgg tgacttagga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Eubacterium nodatum <400> 20 aaaccgggct caacaaccat 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Eikenella corrodens <400> 21 gccaactgct gctggaagtg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Eikenella corrodens <400> 22 gccgctgatt tcggagagtt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Streptococcus mitis <400> 23 gtacaacgag tcgcaagccg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Streptococcus mitis <400> 24 tacaaggccc gggaacgtat 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Streptococcus mutans <400> 25 cagcgcattc aacacaagca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Streptococcus mutans <400> 26 tgtcccatcg ttgctgaacc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Streptococcus sobrinus <400> 27 ggcctcatgc tgattttccc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Streptococcus sobrinus <400> 28 accaccaccc agaaaatggg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 29 caactgatcg tgccaagggt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 30 acagcgattg gcaacagacc 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 31 gcgcaagtaa cgaaagcaaa a 21 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 32 gattttgcgc cacactcgtt 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 33 gatggcagtg cgacaccatt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 34 cgatcgtttt gtttgccgac 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Actinomyces viscosus <400> 35 gctccctcat gctcaactcg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Actinomyces viscosus <400> 36 gatgatctgg gcgttgtcca 20 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 37 ggtcagcttg gcaatcagcc c 21 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 38 cgacctaccg cgatgcagga 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tannerella forsythia <400> 39 ccattaagcc cattgcccgg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Treponema denticola <400> 40 cgggtcctca cccgctcttc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum <400> 41 aacgagcgca acccctttcg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Prevotella intermedia <400> 42 ccgaagatgc gccgttgaac 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Prevotella nigrescens <400> 43 gctcgtattg cagcccgcaa 20 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Parvimonas micra <400> 44 ggtacgaaag cgtggggagc a 21 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Campylobacter rectus <400> 45 ggctttgacg cgggcgtagt 20 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Eubacterium nodatum <400> 46 ttgaggagcc ggtgactttg g 21 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Eikenella corrodens <400> 47 acagccatcg gcacaggcat 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Streptococcus mitis <400> 48 taatcgcgga tcagcacgcc 20 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Streptococcus mutans <400> 49 tgcggtcgtt tttgctcatg g 21 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Streptococcus sobrinus <400> 50 aggagcggcc catccttgc 19 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 51 tgatgatgtc ggcggtcggt 20 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 52 tgctgcacct aaaacagacg acaca 25 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 53 gctttttccc cgaatgcgga 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Actinomyces viscosus <400> 54 gagccggtcc ccgacaagaa 20

Claims

구강에서 채취한 생물학적 시료로부터 획득한 DNA에 특이적으로 결합하는,
서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 1 프라미머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 2 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 3 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 4 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 5 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 6 프라이머 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 7 프라이머 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 8 프라이머 세트, 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 9 프라이머 세트, 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 10 프라이머 세트, 서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 11 프라이머 세트, 서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 12 프라이머 세트, 서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 13 프라이머 세트, 서열번호 27 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 14 프라이머 세트, 서열번호 29 및 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 15 프라이머 세트, 서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 16 프라이머 세트, 서열번호 33 및 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 17 프라이머 세트, 및
서열번호 35 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제 18 프라이머 세트를 포함하는, 구강 질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 아그레가티빅티 액티노마이세텀코마란스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 타너렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸소박테리움 누클레이툼 (Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 프레보텔라 니그레스센스(Prevotella nigrescens), 파비모나스 미크라 (Parvimonas micra), 캄필로박터 렉투스(Campylobacter rectus), 유박테리움 노다툼(Eubacterium nodatum), 익케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 스트랩토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 소비너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 스테피로코쿠스 우레우스 (Staphylococcus aureus), 엔테로코쿠스 패카리스(Enterococcus faecalis), 및 엑티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 구강 질환 원인 세균을 특이적으로 검출할 수 있는, 구강 질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 하기 표에 기재된 유전자 영역에 특이적으로 결합하는, 구강 질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물:
제 3항에 있어서,
제 1 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1522bp 내지 1644bp이고, 제 2 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 5493bp 내지 5611bp이며, 제 3 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1117bp 내지 1256bp이며, 제 4 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1515bp 내지 1641bp이며, 제 5 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 994bp 내지 1107bp이며, 제 6 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 782bp 내지 924bp이며, 제 7 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 704bp 내지 835bp이며, 제 8 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 651bp 내지 794bp이며, 제 9 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1887bp 내지 2018bp이며, 제 10 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 2543bp 내지 2672bp이며, 제 11 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 2141bp 내지 2250bp이며, 제 12 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1148bp 내지 1296bp이며, 제 13 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1480bp 내지 1582bp이며, 제 14 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 516bp 내지 651bp이며, 제 15 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 445bp 내지 574bp이며, 제 16 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 99bp 내지 230bp이며, 제 17 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 1954bp 내지 2054bp이며, 제 18 프라이머 세트의 표적 유전자 내 결합 위치는 734bp 내지 873bp인,
구강 질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 구강 질환 원인 세균에 의해 발생하는 구강 세균감염성 질환은 치주질환, 치은염, 치주염, 만성치주염, 충치(치아우식증), 임플란트주위염, 치수, 치근관질환, 및 악골 골수염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 구강 질환 원인 세균의 동시 검출용 조성물.
제 1항에 따른 조성물을 포함하는 구강 질환 원인 세균의 동시 검출용 키트로서, 상기 세균은 아그레가티빅티 액티노마이세텀코마란스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 타너렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸소박테리움 누클레이툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 프레보텔라 니그레스센스(Prevotella nigrescens), 파비모나스 미크라(Parvimonas micra), 캄필로박터 렉투스(Campylobacter rectus), 유박테리움 노다툼(Eubacterium nodatum), 익케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 스트랩토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 소비너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 스테피로코쿠스 우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코쿠스 패카리스 (Enterococcus faecalis), 및 엑티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 키트.
제 1항에 따른 조성물을 이용한 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)을 실시하여 구강 질환 원인 세균을 탐지하는 단계를 포함하는 구강 질환 원인 세균의 동시 검출 방법으로서, 상기 세균은 아그레가티빅티 액티노마이세텀코마란스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 타너렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸소박테리움 누클레이툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 프레보텔라 니그레스센스(Prevotella nigrescens), 파비모나스 미크라(Parvimonas micra), 캄필로박터 렉투스(Campylobacter rectus), 유박테리움 노다툼(Eubacterium nodatum), 익케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 스트랩토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 소비너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 스테피로코쿠스 우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코쿠스 패카리스(Enterococcus faecalis), 및 엑티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 구강 질환 원인 세균의 동시 검출 방법.
제 7항에서,
상기 탐지는 제 1 프라이머 세트 내지 제 18 프라이머 세트에 의해 증폭되는 각각의 DNA 농도를 확인할 수 있는 표지물질로 표지된 제 1 탐침 내지 제 18 탐침을 이용한 멀티플렉스 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 구강 세균감염성 질환의 원인균을 탐지하는 단계를 추가로 포함하는, 구강 질환 원인 세균의 동시 검출 방법에 있어서, 상기 제 1 탐침 내지 제 18 탐침은 각각 순서대로 서열번호 37 내지 서열번호 54로 표시되는 것을 특징으로 하는, 구강 질환 원인 세균의 동시 검출 방법.
제 8항에서,
상기 표지물질은 텍사스레드(TexasRed), 6-카복시플루오르세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(HEX, hexachloro-6-carboxyfluorescein) 및 Cy5로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인, 구강 질환 원인 세균의 동시 검출 방법.