CN111757942B - 利用与临床指标具有相关性的细菌群的信息的口腔内检查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种判定牙周病状态的口腔内检测方法。本发明的口腔内检测方法包括：测定口腔内试样中存在的口腔内细菌群来源的核酸的信号强度，根据该信号强度的测定值计算出所述细菌群的存在比例，将得到的计算值作为指标来判定牙周病的状态，其中，细菌群的存在比例是随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类的细菌量与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的细菌量的相关关系。
Description
技术领域
本发明涉及通过利用与临床指标具有相关性的细菌群的信息来判定牙周病状态的口腔内检查方法等。
背景技术
牙周病具有其是多种细菌相关的细菌感染症的一面、以及其是与病原性细菌(细菌因素)、免疫(宿主因素)和生活习惯相关而发展的多因素疾病的一面，其发病与牙周病原性细菌相关。
作为牙周病原性细菌，报道了牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、直肠弯曲杆菌、具核梭杆菌、中间普雷沃氏菌、伴放线菌团聚杆菌等(非专利文献1及2)，其中，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌及齿垢密螺旋体这3个菌种被称为“红色复合体(RedComplex)”，作为慢性牙周炎的致病菌而受到重视。已知如果存在“红色复合体”，则牙周病的恶性程度变高，构成“红色复合体”的细菌在临床上被认为是重要的细菌。
此外，报道了伴放线菌团聚杆菌为侵袭性牙周炎的致病菌，中间普雷沃氏菌为青春期性或妊娠性牙周炎的致病菌(非专利文献1及2)。
作为牙周病现有的细菌检测，已报道了菌斑或唾液中的“红色复合体”这3种细菌的总计值与牙周病的状态(发展程度)相关联。具体而言，将牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌及齿垢密螺旋体中的至少1种的细菌数总计相对于总菌数低于0.5％的情况判定为“低”，将相对于总菌数为0.5％以上且低于5％的情况判定为“中”，将相对于总菌数为0.5％以上的情况判定为“高”(非专利文献3)。
作为检测牙周病原性细菌并计算细菌数量的方法，例如报道了培养法、使用实时PCR、下一代测序、DNA微阵列的方法。更详细而言，还报道了：使用实时PCR法，单独检测唾液中的牙龈卟啉单胞菌和/或福赛斯坦纳氏菌(旧称Bacteroides forsythus)的菌体数(专利文献1、3及4)。
另外，还报道了一种T-RFLP法，该方法包括：回收细菌菌群的基因组DNA并进行限制性内切酶处理，从片段化后的DNA的信息中以模式的相似度作为指标识别细菌菌群(专利文献5)。根据该报告，鉴定出了与齿科临床指标具有相关性的细菌菌群来源的模式。然而，并未包括各个具体的细菌数量的信息，也没有得到进一步的解释。T-RFLP法虽然能够以峰型表示细菌群落的构成而可以容易地进行多检体的比较分析，但另一方面，由于各峰未必来源于1种细菌，因此难以掌握细菌群落的构成(非专利文献4)。
作为掌握细菌群的构成的方法，近些年可举出下一代测序仪的利用。例如，专利文献9中提供了通过随机确定从人被检者采集到的唾液检体中的细菌菌群的16S核糖体RNA基因的碱基序列来检测唾液细菌菌群的检查方法。在该检查方法中，提出了基于唾液的炎症性肠病的检测方法，UniFrac分析的结果是能够识别健康的人群和CD患者群，但另一方面，对各种细菌重复进行t检验来进行显著差异检验，分析的过程存疑。
另外，作为捕获全部细菌量的方法、即作为检测总细菌的方法，报道了利用选择了各微生物之间保守性高的区域的通用引物(专利文献6～8)。在利用了DNA微阵列的例子中，报道了在制备检体的PCR工序中设定1组通用引物来检测20种口腔内细菌(非专利文献5～8)。
迄今为止，已经大量报道了测定“红色复合体”中的至少1种细菌数量作为牙周病严重程度的指标的例子。然而，由于牙周病是由多种细菌引起的疾病，因此在有限种类的恶性细菌的测定中，只能获得与通过测定牙周袋而得到的信息同等的信息。另外，在牙周病的治疗效果的判断指标这方面，基本上是基于牙医的经验所获得的临床信息而进行的，大多数情况下没有确认至细菌菌群的信息。
另外，没有牙周病早期阶段的牙周病恶化的指标。因此，许多患者在意识到患有牙周病时，牙周病已经在发展，即使在意识到牙周病的症状后开始进行治疗，大多数情况下其治疗也不会起到效果，因此也要求与牙周病的恶化相关的有效的预测方法。作为具体例子，可列举出以下的情况。
作为牙周治疗结束后持续性的专业护理的“牙周支持治疗(Supportiveperiodontal therapy，SPT)”是保持“病情稳定”并使牙周治疗的预后保持良好的不可欠缺的治疗。目前，在临床现场转移至SPT时的判断基准是牙周袋探诊深度、BOP等。另一方面，如果将来有预测SPT转移后的进展的指标，则对判断治疗方案是非常有用的，但目前尚未确立明确的判断基准(非专利文献9)。
在这样的情况下，作为设定判断基准的尝试，研究了如下方法：基于唾液中的牙龈卟啉单胞菌菌数相对于总菌数的比率及丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)的组合的方法、在重新评价治疗时组合测定唾液中牙龈卟啉单胞菌比率及针对牙龈卟啉单胞菌的血清抗体效价的方法(非专利文献10)。另外，作为预知的指标，也对口腔内细菌检查有所期待(非专利文献11)，例如，Haffajee等人报道了关于伴放线菌团聚杆菌和牙龈卟啉单胞菌的菌数与发生2mm以上的附着丧失的风险的相关性(非专利文献12)，但如上所述，检查的菌种是有限的，尚未作为预知的指标而达到实际。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4252812号
专利文献2：日本特开2008-206516号公报
专利文献3：日本特开2004-229537号公报
专利文献4：国际公开第2002/010444号
专利文献5：日本特开2011-193810号公报
专利文献6：国际公开第03/106676号
专利文献7：日本特表2004-504069号公报
专利文献8：日本特开2007-068431号公报
专利文献9：日本专利第5863035号
非专利文献
非专利文献1：Socransky，S.S.et al.J ClinMicrobiol，37，1426-30，1999
非专利文献2：使用了细菌检查的牙周治疗的概念、医学信息社编著：三边正人、吉野敏明、P.3、平成17年6月发行
非专利文献3：牙周疾病患者的抗菌疗法的诊疗指南、日本牙周病学会编辑
非专利文献4：常驻细菌菌群控制的人的健康及疾病、羊土社编辑：大野博司、服部正平P.97、2014年3月发行
非专利文献5：Eberhard，J.et al.Oral Microbiol Immunol 2008；23：21-8.
非专利文献5：Shang、S et al.Pediatric Research 2005；58：143-148.
非专利文献6：Topcuoglu，N.et al.J Clin Pediatr Dent 2013；38：155-60.
非专利文献7：Topcuoglu，N.et al.Anaerobe2015；35：35-40.
非专利文献8：Henne，K.et al.J Oral Microbiol 2014；6：25874.
非专利文献9：特定非盈利活动法人日本牙周病学会指南牙周病治疗的指导方针2015
非专利文献10：根据唾液中细菌检测和血清抗体效价检测预知牙周炎进展：日本牙周病学会会刊.Vol.58(2016)No.4p.254-258.
非专利文献11：牙周病的细菌检测的可能性：日本牙周病学会会刊.Vol.55(2013)No.4p.294-299.
非专利文献12：Haffajee AD，Socransky SS.Microbial etiological agents ofdestructive periodontal diseases.Periodontol 2000.1994 Jun；5：78-111.Review.
发明内容
发明所要解决的课题
如上所述，目前牙周病恶化的预测指标、用于确定治疗方针的信息尚不充足。因此，本发明的目的在于提供通过利用简便的方法详细地检测口腔内细菌并进行定量化来判定牙周病的状态、牙周病的治疗效果的方法等。
用于解决课题的技术方法
本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，通过对口腔内试样中存在的细菌求出特定的细菌(群)之间的存在比例，能够判定牙周病的状态，从而完成了本发明。另外，本发明人发现，通过一次性全部测定菌斑中主要的口腔细菌群(包括牙周病相关细菌群和常驻细菌群)，并制作以牙周病相关细菌群和常驻细菌群的存在比例为基础的病情恶化的判定模型，从而能将相同牙周袋数值的病情进一步细分化并分类。
另外发现，通过求出与口腔内试样中存在的特定的细菌(群)之间的存在比例，可以判定牙周病的治疗效果、牙周病的病程等，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种口腔内检查方法，该方法包括：测定口腔内试样中存在的口腔内细菌群来源的核酸的信号强度，根据该信号强度的测定值计算出所述细菌群的存在比例，将得到的计算值作为指标来判定牙周病的状态，其中，
细菌群的存在比例是随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类的细菌量与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的细菌量的相关关系。
[2]根据[1]所述的方法，其中，通过对得到的计算值与细菌群的存在比例的截止值(cutoffvalue)进行比较来判定牙周病的状态。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述细菌群的存在比例是随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类的细菌量与伴牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的细菌量之比。
[4]根据[2]或[3]所述的方法，其中，所述截止值是基于ROC曲线而确定的，所述ROC曲线是根据基准制定用口腔内试样中存在的口腔内细菌群来源的核酸的信号强度的测定值计算出所述细菌群的存在比例、并由该计算值绘制的。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，所述细菌群的存在比例是具核梭杆菌菌种的细菌量与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的细菌量的相关关系。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，作为所述细菌群的存在比例，使用以下的(a)及(b)。
(a)随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类(其中，包含1种以上的除具核梭杆菌菌种以外的菌种)的细菌量与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的细菌量的相关关系
(b)具核梭杆菌菌种的细菌量与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的细菌量的相关关系
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类为选自牙龈卟啉单胞菌(Porphyromona gingivalis)、福赛斯坦纳氏菌(Tannerellaforsythia)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、纤细弯曲杆菌(Campylobactergracilis)、直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus)、昭和弯曲杆菌(Campylobactershowae)、具核梭杆菌文氏亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii)、具核梭杆菌多形亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.polymorphum)、具核梭杆菌动物亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.animalis)、具核梭杆菌具核亚种(Fusobacteriumnucleatum subsp.nucleatum)、牙周梭杆菌(Fusobacterium periodonticum)、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、星群链球菌(Streptococcus constellatus)、伴放线菌团聚杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenellacorrodens)、龈沟产线菌(Filifactor alocis)、牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonaendodontalis)、缠结真杆菌(Eubacterium nodatum)、隐藏真杆菌(Eubacteriumsaphenum)、中间密螺旋体(Treponema medium)及生痰月形单胞菌(Selenomonassputigena)中的至少一种。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类为选自变黑普雷沃氏菌(Prevotella nigrescens)、简明弯曲杆菌(Campylobacterconcisus)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga gingivalis)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)、生痰二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga sputigena)、戈氏链球菌(Streptococcus gordonii)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、缓症链球菌bv 2(Streptococcus mitis bv 2)、龋齿放线菌(Actinomyces odontolyticus)、小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)、内氏放线菌II(Actinomyces naeslundiiII)、有害月形单胞菌(Selenomonas noxia)、栖牙普雷沃氏菌(Prevotella denticola)、产黑色素普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)、溶血孪生球菌(Gemella sanguinis)、沟迹真杆菌(Eubacterium sulci)、马氏棒杆菌(Corynebacterium matruchotii)、胶胨罗斯氏菌(Rothia mucilaginosa)、卡托氏卟啉单胞菌(Porphyromona catoniae)、莫氏细小杆菌(Solobacterium moorei)、变黄奈瑟氏球菌(Neisseria flavescens)、洛氏普雷沃氏菌(Prevotella loescheii)、小核桃形巨球形菌(Megasphaera micronuciformis)、葛氏放线菌(Actinomyces graevenitzii)、非典型韦荣氏球菌(Veillonella atypica)、苍白普雷沃氏菌(Prevotella pallens)、夏氏普雷沃氏菌(Prevotella shahii)、巴斯德卟啉单胞菌(Porphyromona pasteri)、罗氏韦荣氏球菌(Veillonella rogosae)、拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella spp.)(A.rava，OT308)、龋齿罗斯氏菌(Rothia dentocariosa)、邻接短链小球菌(Granulicatella adiacens)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)及副血链球菌(Streptococcus parasanguinis)中的至少一种。
[9]根据[5]～[8]中任一项所述的方法，其中，具核梭杆菌菌种为选自具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种及具核梭杆菌具核亚种中的至少一种。
[10]一种口腔内检查方法，该方法包括：测定口腔内试样中存在的口腔内细菌群来源的核酸的信号强度，根据该信号强度的测定值计算出所述菌群的存在比例，将得到的计算值与牙周病的状态、病程或治疗效果相关联。
[11]根据[10]所述的方法，其中，通过计算出随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类、与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类和/或随牙周袋的数值的减少而增加的细菌种类之比，进行细菌群的存在比例与牙周病的状态的关联。
[12]根据[10]或[11]所述的方法，其中，通过计算出随牙周袋的数值的增大而增加的属于梭杆菌属的细菌种类、与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类和/或随牙周袋的数值的减少而增加的细菌种类之比，进行细菌群的存在比例与牙周病的病程的关联。
[13]根据[10]～[12]中任一项所述的方法，其中，通过对牙周病治疗前后的以下的(a)和/或(b)的值进行比较，进行细菌群的存在比例与牙周病的治疗效果的关联。
(a)随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类、与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类和/或随牙周袋的数值的减少而增加的细菌种类之比
(b)随牙周袋的数值的增大而增加的属于梭杆菌属的细菌种类、与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类和/或随牙周袋的数值的减少而增加的细菌种类之比。
[14]根据[12]或[13]所述的方法，其中，属于梭杆菌属的细菌种类为选自具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种及牙周梭杆菌中的至少一种。
[15]根据[11]～[14]中任一项所述的方法，其中，随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类为选自牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、纤细弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种、牙周梭杆菌、中间普雷沃氏菌、星群链球菌、伴放线菌团聚杆菌及啮蚀艾肯氏菌中的至少一种，
随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类和/或随牙周袋的数值的减少而增加的细菌种类为选自变黑普雷沃氏菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、缓症链球菌bv 2、龋齿放线菌、小韦荣氏球菌、内氏放线菌II及有害月形单胞菌中的至少一种。
[16]根据[12]～[15]中任一项所述的方法，其中，属于梭杆菌属的细菌种类为选自具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种及牙周梭杆菌中的至少一种，
随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类和/或随牙周袋的数值的减少而增加的细菌种类为选自变黑普雷沃氏菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、缓症链球菌bv 2、龋齿放线菌、小韦荣氏球菌、内氏放线菌II及有害月形单胞菌中的至少一种。
发明的效果
根据本发明，能够一次性总体对大量口腔内细菌(包括牙周病相关细菌、常驻菌)进行检测、定量化，可以比现有方法将牙周病的状态更细分化进行判定。另外，根据本发明，能够判定牙周病的状态、牙周病的治疗效果、牙周病的病程，可以将牙周袋大小相同的病情进一步细分化进行分类。另外，即使没有牙周袋的数值，也能够进行治疗效果、病情稳定的判定。此外，将来通过替换在判定时使用的细菌种类，还可以提高判定模型性能。
附图说明
图1-1是从牙周病治疗前的20多岁至70多岁的220名男女被检者采集的龈下菌斑的DNA芯片测定数据(SN比)：纵轴和牙周袋的深度(Pd)：横轴的散点图。将搭载于DNA芯片的28种细菌分别记载于图表。
图1-2是从牙周病治疗前的20多岁至70多岁的220名男女被检者采集的龈下菌斑的DNA芯片测定数据(SN比)：纵轴和牙周袋的深度(Pd)：横轴的散点图。将搭载于DNA芯片上的28种细菌分别记载于图表。
图1-3是从牙周病治疗前的20多岁至70多岁的220名男女被检者采集的龈下菌斑的DNA芯片测定数据(SN比)：纵轴和牙周袋的深度(Pd)：横轴的散点图。将搭载于DNA芯片上的28种细菌分别记载于图表。
图1-4是从牙周病治疗前的20多岁至70多岁的220名男女被检者采集的龈下菌斑的DNA芯片测定数据(SN比)：纵轴和牙周袋的深度(Pd)：横轴的散点图。将搭载于DNA芯片上的28种细菌分别记载于图表。
图1-5是从牙周病治疗前的20多岁至70多岁的220名男女被检者采集的龈下菌斑的DNA芯片测定数据(SN比)：纵轴和牙周袋的深度(Pd)：横轴的散点图。将搭载于DNA芯片上的28种细菌分别记载于图表。
图1-6是从牙周病治疗前的20多岁至70多岁的220名男女被检者采集的龈下菌斑的DNA芯片测定数据(SN比)：纵轴和牙周袋的深度(Pd)：横轴的散点图。将搭载于DNA芯片上的28种细菌分别记载于图表。
图1-7是从牙周病治疗前的20多岁至70多岁的220名男女被检者采集的龈下菌斑的DNA芯片测定数据(SN比)：纵轴和牙周袋的深度(Pd)：横轴的散点图。将搭载于DNA芯片上的28种细菌分别记载于图表。
图2是细菌群的平衡指标(“正相关菌”群15种，“负相关菌”群13种：纵轴)和牙周袋的深度(Pd)：横轴的散点图。图示出了220名的数据。
图3是示出牙周袋1～3mm(定义为非疾病组)、牙周袋5mm以上(定义为疾病组)的细菌群的平衡指标(LOG10转换)：纵轴的直方图的图(频率：横轴)。
图4是示出平衡指标的ROC分析的结果的图。
图5是用雷达图示出牙周袋数值4mm、平衡指标(LOG10)值1.516648的样品的各细菌的SN比的图。从中心朝向外侧的轴为平衡指标。
图6是菌群的平衡指标(“病程指标细菌”2种，“负相关菌”群13种)：纵轴和牙周袋探诊深度(Pd)：横轴的散点图。图示出了220名的数据。
图7是示出牙周袋1～3mm(定义为非疾病组)、牙周袋5mm以上(定义为疾病组)的菌群的平衡指标(LOG10转换)：纵轴的直方图的图(频率：横轴)。
图8是示出平衡指标的ROC分析的结果的图。
图9是用雷达图示出牙周袋数值4mm、平衡指标(LOG10)值0.883的样品的各细菌的SN比的图。从中心朝向外侧的轴为平衡指标。
图10是示出判定牙周病的状态并进行细分化而得到的结果的图。
图11-1是用雷达图示出细分化后的状态的样品的各细菌的SN比的图。从中心朝向外侧的轴为平衡指标。
图11-2是用雷达图示出细分化后的状态的样品的各细菌的SN比的图。从中心朝向外侧的轴为平衡指标。
图11-3是用雷达图示出细分化后的状态的样品的各细菌的SN比的图。从中心朝向外侧的轴为平衡指标。
图12是示出平衡指标的ROC分析的结果的图。
图13是示出平衡指标的ROC分析的结果的图。
图14是关于治疗前后的平衡指标、平衡指标、牙周袋的深度的散点图。
图15是关于治疗前后的平衡指标、平衡指标、牙周袋的深度的散点图(根据拷贝数制成)。
图16是示出由下一代测序仪分析结果得到的样品来源的各细菌的相对比率的图。
图17是平衡指标和牙周袋深度(Pd)的散点图。
图18是图17所示的数据中关于牙周袋深度1～3mm和牙周袋深度5mm以上的数据的直方图。
图19是示出进行ROC分析的结果的图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细地说明。本发明的范围不受这些说明的限制，在以下的示例以外，可以在不损害本发明主旨的范围内适宜变更并实施。另外，本说明书中所引用的全部刊物、例如现有技术文献及公开公报、专利公报、其它专利文献作为参照引入本说明书中。
本发明为口腔内检查方法，该方法包括：测定口腔内试样中存在的口腔内细菌群来源的核酸的信号强度，根据该信号强度的测定值计算出上述菌群的存在比例，将得到的计算值作为指标来判定牙周病的状态。在本发明中，上述菌群的存在比例是指随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类的细菌量与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的细菌量的相关关系。
作为该口腔内检查方法的具体方式，没有限定，在本说明书中，对于测定口腔内试样中的细菌的菌数的方法，以使用了DNA芯片的方法为主进行说明。
还可以通过除使用DNA芯片的方法以外的方法、例如侵染法、实时PCR法、侵染PCR法、下一代测序法等来实施口腔内试样中的细菌的检测、测定、定量化。
1.口腔内细菌检测用寡核苷酸探针
在本发明的方法中，在由从被检者采集到的口腔内试样来检测口腔内细菌时，可以使用DNA芯片，该DNA芯片可以搭载例如以下的探针(b)及(c)中的至少一种探针和探针(a)。
(a)由与检测对象的细菌的基因(或基因来源的扩增产物)分别特异性杂交的核酸组成的探针
(b)由与全部细菌的基因(或基因来源的扩增产物)杂交的核酸组成的总量指标探针
(c)由与1种或多种绝对量指标分别特异性杂交的核酸组成的探针
需要说明的是，通常DNA芯片是指配置有探针的基板的总称。另外，在本说明书中，对于DNA芯片和DNA微阵列等名称不进行区分，作为同义词处理。
(1)成为测定对象的口腔内细菌
在本发明的检测方法中，作为成为测定对象的口腔内细菌，没有限定，可以将属于卟啉单胞菌属、坦纳氏菌属、密螺旋体属、普雷沃氏菌属、弯曲杆菌属、梭杆菌属、链球菌属、团聚杆菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、艾肯氏菌属、放线菌属、韦荣氏球菌属、月形单胞菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、莫拉氏菌属(Moraxella)、真杆菌属(Eubacterium)、小单胞菌属(Parvimonas)、产线菌属(Filifactor)、拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、细小杆菌属(Solobacterium)、罗斯氏菌属(Rothia)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、孪生球菌属(Gemella)、棒杆菌属(Corynebacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、短链小球菌属(Granulicatella)、巨球形菌属(Megasphaera)、以及SR1门的细菌等作为检测对象菌种。
更详细而言，例如，优选将目前认为与牙周病、龋齿有关的牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、纤细弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种、牙周梭杆菌、中间普雷沃氏菌、变黑普雷沃氏菌、星群链球菌、伴放线菌团聚杆菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、啮蚀艾肯氏菌、戈氏链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、缓症链球菌bv 2、龋齿放线菌、小韦荣氏球菌、内氏放线菌II、有害月形单胞菌、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、黏放线菌(Actinomycesviscosus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(S treptococcuspneumoniae)、变异链球菌、缠结真杆菌、微小小单胞菌、龈沟产线菌、表兄链球菌、巴斯德卟啉单胞菌、非典型韦荣氏球菌、副流感嗜血杆菌、拟普雷沃氏菌属(A.rava，OT308)、副血链球菌、衣氏放线菌、苍白普雷沃氏菌、洛氏普雷沃氏菌、栖组织普雷沃氏菌、莫氏细小杆菌、产黑色素普雷沃氏菌、生痰月形单胞菌、龋齿罗斯氏菌、胶胨罗斯氏菌、罗氏韦荣氏球菌、胃消化链球菌、栖牙普雷沃氏菌、牙髓卟啉单胞菌、唾液链球菌、葛氏放线菌、中间密螺旋体、索氏密螺旋体、溶血孪生球菌、溶血孪生球菌、卡托氏卟啉单胞菌、马氏棒杆菌、隐藏真杆菌、变黄奈瑟氏球菌、邻接短链小球菌、沟迹真杆菌、小核桃形巨球形菌、夏氏普雷沃氏菌、SR1 sp.OT 345等细菌作为检测对象菌种，更优选为与病情相关而增减明确的细菌种类。
在为了检测口腔内的状态的情况下，例如可以列举出与牙周袋的数值一同增减明确的菌种。
需要说明的是，在本发明中，“牙周袋的数值”是指牙周袋的深度(Pd)的数值。牙周袋的深度(Pd)是指，将牙周探针插入袋中时从牙龈边缘至探针前端的距离。以1mm单位进行数值化。需要说明的是，这里所谓的“牙周探针”是指袋测定器具(perio-probe)。
对于增减而言，对于在牙周袋的数值变大时确认到增加的细菌群、或者在牙周袋的数值小时开始增加、随后增加并在牙周袋的数值变大时细菌量保持的细菌群等增减的模式没有限定。作为更简单的例子，为“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组和“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组。
随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类及随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类可以利用能够测定细菌量(或与SN比这样的细菌量成比例的测定量)的工具来确认。工具没有特别限定，例如可以使用DNA芯片。
使用DNA芯片进行确认时，用DNA芯片测定口腔内试样，然后计算出牙周袋的数值与各细菌的细菌量或SN比这样的测定量的相关系数，可以分类、鉴定为相关系数为正值的细菌群和为负值的细菌群。对于这些细菌而言，测定次数为40次以上的情况下，相关系数的绝对值优选为0.02以上，更优选为0.1以上，进一步优选为0.2以上，特别优选为0.4以上，最优选为0.6以上。
在牙周病的状态的判定中使用实验误差校正后的数据时，细菌群的分类也使用实验误差校正后的数据。
随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类(以下，有时记为“正相关菌”)即为伴随牙周病的恶化而增加的细菌。已知有牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体等，用于现有的牙周病细菌检查。
作为随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类，可列举出选自牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、纤细弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种、牙周梭杆菌、中间普雷沃氏菌、星群链球菌、伴放线菌团聚杆菌、啮蚀艾肯氏菌、龈沟产线菌、牙髓卟啉单胞菌、缠结真杆菌、隐藏真杆菌、中间密螺旋体及生痰月形单胞菌中的至少一种。
其中，以下有时将牙周袋的数值小时开始增加、随后增加并在牙周袋的数值变大时细菌量保持的细菌记为“病程指标细菌”。可以认为“病程指标细菌”发挥连接后述的“有害菌”和“有益菌”的作用，成为牙周病恶化的早期阶段的指标。作为“病程指标细菌”，具体可列举出具核梭杆菌菌种。
作为具核梭杆菌菌种，例如可列举出选自具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种及具核梭杆菌具核亚种中的至少1种。
另一方面，以下有时将牙周袋的数值变大时确认到增加的细菌群记为“有害菌”。作为“有害菌”，具体而言，可列举出随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类中除具核梭杆菌菌种以外的菌种。例如可列举出选自牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、纤细弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、牙周梭杆菌、中间普雷沃氏菌、星群链球菌、伴放线菌团聚杆菌、啮蚀艾肯氏菌、龈沟产线菌、牙髓卟啉单胞菌、缠结真杆菌、隐藏真杆菌、中间密螺旋体及生痰月形单胞菌中的至少1种。
作为随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类(以下，有时记为“负相关菌”)，可列举出属于链球菌属、放线菌属、韦荣氏球菌属等的细菌中的一部分菌种。
这些菌种包括：(i)随牙周袋的数值的增加(即，牙周病的恶化)而减少的细菌、(ii)随牙周袋的数值的减少(牙周病的改善)而增加的细菌种类、或者上述(i)及(ii)这两者。以下，有时将随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种群记为“有益菌”。
作为随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类和/或随牙周袋的数值的减少而增加的细菌种类，可列举出选自变黑普雷沃氏菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、缓症链球菌bv 2、龋齿放线菌、小韦荣氏球菌、内氏放线菌II、有害月形单胞菌、栖牙普雷沃氏菌、产黑色素普雷沃氏菌、溶血孪生球菌、沟迹真杆菌、马氏棒杆菌、胶胨罗斯氏菌、卡托氏卟啉单胞菌、莫氏细小杆菌、变黄奈瑟氏球菌、洛氏普雷沃氏菌、小核桃形巨球形菌、葛氏放线菌、非典型韦荣氏球菌、苍白普雷沃氏菌、夏氏普雷沃氏菌、巴斯德卟啉单胞菌、罗氏韦荣氏球菌、拟普雷沃氏菌属(A.rava，OT 308)、龋齿罗斯氏菌、邻接短链小球菌、唾液链球菌、副流感嗜血杆菌及副血链球菌中的至少一种。
(2)关于探针(a)
在本发明中，作为可用作探针(a)的寡聚DNA是能与口腔内细菌来源的核酸的碱基序列中的菌特异性区域(碱基序列根据菌的种类而变化的区域)的碱基序列进行杂交的寡聚DNA。这里，该核酸只要是包括染色体DNA、质粒DNA等的DNA及RNA中的任意一者即可，没有限定，优选为染色体DNA。具体而言，本发明中用作探针的寡核苷酸是能与上述口腔内细菌的染色体DNA中的16S rRNA基因的碱基序列进行杂交的寡核苷酸。
可用于本发明的探针优选选择对作为检测目标的各种上述口腔内细菌特异性的碱基序列的区域来设计该区域的碱基序列。通常，在进行探针的设计时，除了选择特异性的区域以外，还需要熔解温度(Tm)一致、不易形成二级结构。
例如，可以通过采用多序列比对在物种之间不同的区域设计探针等方法找到对应于各种口腔内细菌的特异性的碱基序列。用于进行比对的算法没有特别限定，作为更具体的分析程序，例如，可以利用ClustalX1.8等程序。进行比对时的参数可以在各程序的默认状态下实行，可以根据程序的种类等进行适当调整。
另一方面，探针的特异性可以是以属水平的特异性为基础一次性全部检测相同属的细菌的特异性，也可以是能够以各物种水平进行检测的特异性，可以根据细菌检测目的进行适当判断。根据检测的特异性的水平，可以将可检测的细菌种类限定为特定的1种，或者也可以是属水平的总和(总计)。
(3)关于探针(b)
总量指标探针是能够用特定的引物对扩增且用于捕捉检体中的全部细菌的探针。在检测细菌方面，从检测对象细菌在包含非检测对象细菌的全体细菌中为何种程度的比例、以及在原本检体中存在多少量的细菌这样的观点出发，检测细菌的总量也是极其重要的。非检测对象细菌可以理解为存在、种类已知但并非作为检测对象的细菌、以及存在、种类未知的细菌的总和(总计)。
为了检测细菌的总量，例如，还可以与DNA芯片分开独立地测定细菌的总量，但通过在DNA芯片中预先搭载作为细菌总量的指标的探针，可提高操作的简便性。对于探针，在利用引物对而扩增的碱基序列中，可以使用与多个菌种共通的碱基序列。在没有发现这样的序列的情况下，可以设计多个相对共通的序列，对它们进行综合地判断而用作总量指标探针。总量指标探针优选为与检体中包含的细菌来源的核酸进行杂交的探针，详细而言，为通过上述特定的引物对而扩增的碱基序列中与作为检测对象的多种细菌所共通具有的碱基序列进行杂交的探针。
总量指标表示各菌种特异性的扩增产物的总量，因此通常量很大，因而目标信号强度有时会超出可检测的信号强度的范围。为了防止这样的情况，期望限制供于杂交的检体量。或者，在设计探针时，例如降低该探针的Tm值。具体而言，可以考虑减少GC含量、缩短探针的序列长度本身的方法。
另外，在进行杂交时，通过添加对所扩增的核酸与总量指标探针的杂交具有竞争性作用的核酸，可以实现信号强度的降低。作为这样的核酸，例如可列举出具有与总量指标探针全部或部分相同的序列的核酸、或者全部或部分地具有总量指标探针的互补序列的核酸等。
(4)关于探针(c)
绝对量指标探针是仅与绝对量指标的核酸进行杂交的探针。在本说明书中，绝对量指标是指表示在扩增反应、杂交反应之前在检体中以一定量添加的核酸的量的指标。绝对量指标是只要进行通常的扩增反应就会可靠地进行扩增反应的核酸，发挥作为所谓的阳性对照的作用。因此，如果预先将绝对量指标特异性的探针搭载于DNA芯片，则可以根据其的检测结果确认是否适当地实施了扩增反应、杂交等。
如果在扩增反应前添加绝对量指标，则需要预先也将针对绝对量指标的特定的引物对也加入反应液中，也可以根据情况利用细菌用的引物对使其共通地扩增。另外，为了通过杂交独立于其它检测对象地进行检测，需要选择与检测对象细菌、非检测对象细菌均具有低相似性的碱基序列。
在将绝对量指标设定为1种时，在扩增效率、杂交效率稍有增减的情况下，也可以通过对绝对量指标的信号强度进行比较来计算出校正系数。在对多个DNA芯片的数据进行比较时，还可以根据用校正系数校正后的信号强度进行比较。
这里，作为探针(a)、(b)、(c)的具体例子，可以示例于表1。
将各细菌特异性的探针的例子示于表1。(序列号1～33)。
序列号34示出总量指标探针的例子。
序列号35示出绝对量指标用探针的例子。
序列号36示出绝对量指标的例子。
表1
序列号
<引物的设计>
在本发明的引物设计方法中，首先，至少选择一个显示分析对象细菌的多样性的可变区，在所选择的可变区的前后选择保守性高的通用引物设计区，设计引物序列。作为对象的可变区没有限定，在基因组序列中，可列举出全部细菌所具有的16S rRNA基因等。在16S rRNA基因中，希望以全长或可变区V1-V9中的一个以上区域作为对象。更优选希望以可变区V1-V6作为对象。进一步优选希望以可变区V3-V6作为对象。需要说明的是，已知16SrRNA基因的可变区由V1-V9区域组成，该区域已被鉴定。
为了评价引物的全面性，充分利用在广泛的范围内获得了细菌的基因组序列的数据库。具体而言，可列举出RDP、NCBI、KEGG、MGDB等。作为一个例子，在RDP的数据库的ProbeMatch中输入所设计的通用引物序列。在结果的一览中可获得总检索中的完全匹配数。完全匹配数越接近总检索，其全面性越高。此时，Strain可以选择“Type”作为条件。另外，Sourse可以选择“Isolates”。
在设计绝对量指标用序列和对其扩增的引物序列时，使用软件“EXCEL”(MICROSOFT公司制)的RNDB19ETWEEN函数随机生成X个(X为任意的数)1～4的整数，将它们连接起来成为仅由1～4的数值构成的X位的数值，通过将1～4的数值置换为A、G、C及T中的任意字母，可以得到随机序列。例如，通过将1置换为A、将2置换为T、将3置换为C、将4置换为G，可以得到大量基于X个碱基的ATGC的随机序列。
对于这些序列，仅挑选G与T之和跟A与T之和相同的序列，使用NCBI的GenBank等数据库对挑选的序列进行Blast检索，针对生物来源的核酸选择相似序列少的核酸。
为了使扩增反应时的反应效率尽可能恒定，希望在检测对象细菌中被扩增的碱基长度与绝对量指标的扩增碱基长度没有很大差异。例如，如果检测对象细菌的扩增产物为500bp左右，则希望绝对量指标的扩增产物为300bp～1000bp左右。
另一方面，对于在扩增后通过电泳等对扩增链长度进行确认的情况，可以设计成成为与检测对象细菌的长度不同的扩增产物，并在此基础上在与检测对象细菌的条带不同的位置检测出绝对量指标来源的扩增产物，在杂交之前确认扩增反应的成败。
最后，在检体中包含的绝对量指标的浓度过高时，在扩增反应中与检测对象的细菌的竞争变得激烈，原本应检测出的检测对象细菌也可能变得无法检测出来，因此需要根据应用而进行适当调整浓度。
在分别扩增细菌来源的核酸和绝对量指标时，可以根据需要应用使用2对以上的引物对的多重方法。反之，也可以根据需要应用通过引物对在共通的一组中使其竞争的方法。
将引物序列的例子示于表2。可以利用细菌扩增用引物对(序列号37、38)、绝对量指标用引物对(序列号39、40)。此外，还可以利用表3所示的引物。
表2
| 序列号 | 备注 | ||
| 37 | 正向引物(细菌扩增用) | 在5’进行荧光标记 | TCCTACGGGAGGCAGCAGT |
| 38 | 反向引物(细菌扩增用) | CAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACC | |
| 39 | 正向引物(绝对量指标扩增用) | 在5’进行荧光标记 | GAGAAGCCTACACAAACGTAACGTC |
| 40 | 反向引物(绝对量指标扩增用) | CTCTAAGACCGCTCTATCTCGG |
表3
| 序列号 | 引物名称 | 备注 | 序列 |
| 41 | Cy5-Universal16S-FWD | 在5’进行荧光标记 | TCCTACGGGAGGCAGCAGT |
| 42 | Cy5-Universal16S-FWD1 | 在5’进行荧光标记 | TCCTACGGGAGGCAGCAG |
| 43 | Cy5-Universal16S-FWD2 | 在5’进行荧光标记 | TCCTACGGGAGGCAGCA |
| 44 | Cy5-Universal16S-FWD3 | 在5’进行荧光标记 | TCCTACGGGAGGCAGC |
| 45 | Cy5-Universal16S-FWD4 | 在5’进行荧光标记 | CCTACGGGAGGCAGC |
| 46 | Cy5-Universal16S-FWD5 | 在5’进行荧光标记 | CTACGGGAGGCAGCAG |
| 47 | Cy5-Universal16S-FWD6 | 在5’进行荧光标记 | TACGGGAGGCAGCAG |
| 48 | SidneyU RVS | GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT | |
| 49 | Universa RVS2 2014 | CAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACC | |
| 50 | Universal RVS1 2016 | CAGGGTATCTATCCTGTTYG | |
| 51 | Universal RVS2 2016 | CAGGGTATGTATCCTGTT | |
| 52 | Universa RVS3 2016 | GGGTATCTATCGYGTT | |
| 53 | Universal RVS4 2016 | CRGGGTATCTATCCYGTT |
<探针的设计>
设计本发明中使用的探针时，探针的长度没有限定，例如，优选为10个碱基以上，更优选为16～50个碱基，进一步优选为18～35个碱基。如果探针的长度适当(如果为上述范围)，则能够抑制非特异性的杂交(错配)，用于特异性的检测。另外，在设计本发明中使用的探针时，优选预先确认Tm。Tm是指任意的核酸链的50％与其互补链形成杂交体的温度，为了使模板DNA或RNA与探针形成双链而进行杂交，需要将杂交的温度最优化。另一方面，如果该温度降低，则容易发生非特异性的反应，因此希望温度尽可能高。
因此，想要设计的核酸片段的Tm在进行杂交方面是重要的因素。Tm的确认可以利用公知的探针设计用软件，作为本发明中可以利用的软件，例如可列举出Probe Quest(注册商标；DYNACOM公司)等。另外，Tm的确认还可以在不使用软件的情况下通过自行计算来进行。在该情况下，可以利用基于最近邻法(Nearest Neighbor Method)、Wallance法、GC％法等的计算式。本发明的探针没有限定，平均Tm优选为约35～70℃或45～60℃。需要说明的是，作为能够以探针的形式进行特异性杂交的条件，除此以外还有GC含量等，其条件是本领域技术人员公知的。
另外，本发明的探针中可以包含例如标签序列等附加序列。作为标签序列，可举出例如“AAAAAAA”这样的间隔序列作为一个例子。在本发明的方法中，作为检测目标的上述口腔内细菌所具有的核酸的碱基序列在所有情况下均不必是该碱基序列本身，可以是碱基序列的一部分通过缺失、置换、插入等而发生了突变的碱基序列。因此，检测目标的核酸的碱基序列可以以和与该碱基序列互补的序列在严格的条件下进行杂交、且具有源自各碱基序列的功能、活性的突变型基因作为对象，探针也可以以这样的突变型基因的碱基序列作为基础进行设计。
作为设计的探针，具体而言，包含上述的探针(a)的序列。另外，可优选举出包含具有如下DNA的物质，所述DNA具有和由与这些DNA互补的碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交、且能够检测口腔内细菌来源的核酸的碱基序列中的至少一部分碱基序列的功能。作为这样的DNA的碱基序列，优选为与探针(a)至少具有60％以上的相同性的碱基序列，更优选为80％以上、进一步优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为97％以上。
实际上在将探针用于检测时，也需要考虑杂交中的严格性。通过将严格性在一定程度上设得严苛，即使各种口腔内细菌在各自的核酸中的特定区域间存在相似的碱基序列区域，也能够与其它的不同区域相区别地进行杂交。另外，在该特定区域间的碱基序列基本上不相同的情况下，可以缓和地设定严格性。
作为这样的严格的条件，例如，严苛条件的情况是在50～60℃的条件下的杂交，温和条件的情况是在30～40℃的条件下的杂交。杂交的条件中，作为严格的条件，例如可以列举出“0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、40℃”、“0.24M Tris.HCl/0.24MNaCl/0.05％Tween-20、37℃”、“0.24M Tris.HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、30℃”，作为更严格的条件，例如可以列举出“0.24M Tris.HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、50℃”，“0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、55℃”，“0.06M Tris·HCl/0.06M NaCl/0.05％Tween-20、60℃”等条件。
更详细而言，还有如下方法：添加探针并在50℃保持1小时以上，使其形成杂交体，然后，在0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20中以50℃进行4次20分钟的清洗，最后，用0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl以50℃进行1次10分钟的清洗。通过提高杂交或清洗时的温度，可以设定更严格的条件。作为本领域技术人员，除了这样的缓冲剂的盐浓度、温度等条件以外，还可以考虑其它探针浓度、探针的长度、反应时间等各种条件来设定条件。对于杂交方法的详细的步骤，可以参照“Molecular Cloning，A Laboratory Manual 4thed.”(Cold Spring Harbor Press(2012)、“Current Protocols in Molecular Biology”(John Wiley&Sons(1987-1997))等。
另外，构成本发明中使用的探针的核苷酸可以是DNA及RNA、或PNA中的任一者，也可以是DNA、RNA及PNA中2种以上的杂交体。例如可以通过使用通常的寡核苷酸合成法进行化学合成(纯化通过HPLC等进行)来制作。另外，也可以使用将上述核苷酸的末端、中间进行化学修饰而成的核苷酸。
2.口腔内细菌量的测定所使用的口腔内细菌基因检测用DNA芯片
如上所述，在本发明的方法中，可以使用DNA芯片，该DNA芯片是多个上述1.项中说明的各种寡核苷酸探针配置于作为支撑体的基板上而成的。作为成为支撑体的基板的形态，可以使用平板(玻璃板、树脂板、有机硅板等)、棒状、珠等任意的形态。在使用平板作为支撑体的情况下，可以在该平板上隔开给定间隔按种类来固定给定的探针(斑点法等；参照Science270，467-470(1995)等)。另外，还可以在平板上的特定位置按种类依次合成给定的探针(光刻法等；参照Science 251，767-773(1991)等)。
作为其它优选的支撑体的形态，可列举出使用中空纤维的形态。在使用中空纤维作为支撑体的情况下，可以优选示例出：按种类将给定的探针固定于各中空纤维，将全部中空纤维聚集成束并固定后，通过沿纤维的长度方向反复切断而得到的DNA芯片(以下也称为“纤维型DNA芯片”)。还可以将该微阵列描述为将核酸固定于通孔基板的类型，也称为所谓的“通孔型DNA芯片”(参照日本特许第3510882号公报等)。
将探针固定于支撑体的方法没有限定，可以是任何结合方式。另外，并不限定于直接固定于支撑体的情况，例如，也可以是预先用聚赖氨酸等聚合物对支撑体进行涂层处理，将探针固定在处理后的支撑体上。另外，在使用中空纤维等管状体作为支撑体的情况，也可以使凝胶状物保持在管状体中，将探针固定于该凝胶状物。以下，对作为DNA芯片的一个方式的纤维型DNA芯片进行详细说明。该DNA芯片例如可以经过下述的工序(i)～(iv)来制作。
(i)以中空纤维的长度方向为相同方向的方式将多根中空纤维三维地排列来制造排列体的工序
(ii)包埋上述排列体，制造块体的工序
(iii)将包含寡核苷酸探针的凝胶前体聚合性溶液导入上述块体的各中空纤维的中空部中，进行聚合反应，使包含探针的凝胶状物保持于中空部的工序
(iv)沿与中空纤维的长度方向交叉的方向切断而使块体薄片化的工序
作为中空纤维中使用的材料，没有限定，例如可优选列举出日本特开2004-163211号公报等中记载的材料。
中空纤维以其长度方向的长度相同的方式被三维地排列(工序(i))。
作为排列方法，例如可列举出如下方法：将多根中空纤维以隔开给定间隔的方式平行地配置于粘合片等片状物，制成片状后，将该片卷绕成螺旋状的方法(参照日本特开平11-108928号公报)；将2片隔开给定间隔设有多个孔的多孔板重叠，使得孔部对齐，使中空纤维通过这些的孔部，然后打开2片多孔板的间隔并进行临时固定，使固化性树脂原料充满2片多孔板间的中空纤维的周边并使其固化(参照日本特开2001-133453号公报)等。制得的排列体以不使其排列混乱的方式被包埋(工序(ii))。
作为包埋的方法，除了将聚氨酯树脂及环氧树脂等流入纤维之间的间隙的方法以外，还可以优选举出通过热熔粘将纤维彼此粘接的方法等。
对于被包埋的排列体，在各中空纤维的中空部填充包含寡核苷酸探针的凝胶前体聚合性溶液(凝胶形成溶液)，在中空部内进行聚合反应(工序(iii))。由此，可以使固定有探针的凝胶状物保持于各中空纤维的中空部。凝胶前体聚合性溶液是含有凝胶形成聚合性单体等反应性物质的溶液，是能够通过使该单体等聚合、交联而使该溶液成为凝胶状物的溶液。作为这样的单体，例如可列举出丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、乙烯基吡咯烷酮、亚甲基双丙烯酰胺等。在该情况下，溶液中可以包含聚合引发剂等。将探针固定于中空纤维内之后，在与中空纤维的长度方向交叉的方向(优选正交的方向)上切断块体来进行薄片化(工序(iv))。由此得到的薄片可以用作DNA芯片。该DNA芯片的厚度优选为0.01mm～1mm左右。块体的切断例如可以利用切片机及激光等来进行。作为上述的纤维型DNA芯片，例如可优选列举出三菱化学株式会社制DNA芯片(Genopal TM)等。
在纤维型DNA芯片中，如上所述，探针在凝胶内被三维地排列，能够保持三维结构。因此，与探针结合到表面经涂层的载玻片上的平面DNA芯片相比，检测效率提高，能够以高灵敏度进行高重现性的检查。另外，配置于DNA芯片中的探针种类的数量优选1个DNA芯片为500种以下、优选为250种以下、进一步优选为100种以下。通过在一定程度上限制这样配置的探针数(种类)，能够以更高灵敏度检测目标的口腔内细菌。需要说明的是，探针的种类可通过碱基序列进行区分。因此，通常即使是来自于相同基因的探针，只要碱基序列有1个不同，就鉴定为其它种类。
3.口腔内细菌基因的检测
在本发明的方法中，为了检测口腔内细菌而检测该细菌的基因的方法例如是包括下述工序的方法。
(i)将从被检者采集到的口腔内试样作为检体，提取检体中的核酸的工序
(ii)使提取的核酸与上述的本发明的寡核苷酸探针或本发明的DNA芯片接触的工序
(iii)根据由DNA芯片得到的信号强度计算出SN比的工序、或者计算出细菌量的工序
以下，按照工序对该检测方法的详情进行说明。
(1)关于工序(i)
在本工序中，将从被检者或被检生物采集到的口腔内试样作为检体，提取检体中包含的细菌的核酸。采集的口腔内试样的种类没有特别限定。例如可以使用唾液、菌斑(龈下菌斑、龈上菌斑)、舌苔、口腔清洗液等，其中，优选为菌斑，其中，更优选为从牙周病细菌栖息最多的部位采集的龈下菌斑。
采集口腔内试样的方法没有特别限定，可以根据试样的种类适当选择。例如，在使用唾液作为口腔内试样时，例如可列举出如下方法：利用市售的唾液采集试剂盒的方法、用棉棒采集口中所含唾液的方法、将唾液直接采集至容器中的方法等。
使用菌斑作为口腔内试样时，可列举出如下方法：利用牙刷进行的牙面、牙间的刷牙、利用棉棒进行的牙面摩擦、利用牙间刷进行的牙间摩擦、纸尖(paper point)法等。菌斑采集所用的牙刷、棉棒、牙间刷或纸尖浸渍于灭菌水中并根据需要进行搅拌等，由此使菌斑溶解或悬浮，可以将得到的溶液或悬浮液作为检体。采集的菌斑的量没有特别限定，例如，为1个纸尖的量即可。使用舌苔作为口腔内试样时，可列举出用棉棒摩擦舌面的方法等。将菌斑采集所用的棉棒溶解或悬浮，可以将得到的溶液或悬浮液作为检体。采集的舌苔的量没有特别限定，例如为1根棉棒的量即可。
使用口腔清洗液作为口腔内试样时，可列举出如下方法：将口腔清洗液或水含于口中，将唾液与口腔清洗液或水一同采集于容器中，将得到的溶液作为检体。作为口腔清洗液，例如可列举出经灭菌的生理盐水等。接着，进行得到的口腔内试样中存在的细菌的核酸提取。提取的方法没有限定，可以使用公知的方法。例如可列举出如下方法：利用设备进行的自动提取法、利用市售的核酸提取试剂盒的方法、利用珠进行破碎的方法、在蛋白酶K处理后进行酚提取的方法、利用氯仿的方法、或作为简易提取方法而将试样加热、溶解的方法等。还可以将它们组合来进行处理。另外，特别是可以在不从检体中提取核酸的情况下进行下一工序。
从检体得到的核酸可以直接与DNA芯片等接触，也可以通过PCR等将希望的碱基序列区域扩增，使该扩增片段与DNA芯片等接触，没有限定。将得到的核酸作为模板进行扩增的区域是编码包含本发明所使用的探针或DNA芯片中配置的寡核苷酸的碱基序列的核酸区域的部位。进行扩增的希望区域没有限定，可以利用无论上述口腔内细菌的种类如何均保守性高的区域的碱基序列，一次性对多种混合物进行扩增。用于进行这样的扩增的序列可以通过实验进行分离、纯化，对分离后的多聚核苷酸的碱基序列进行分析，基于该序列来确定，另外，也可以用碱基序列等各种数据库对已知的碱基序列进行检索，进行比对等，从而根据计算机模拟(In Silico)来确定。核酸或氨基酸等数据库没有特别限定，例如，可以利用日本DNA数据库(DDBJ：DNA Data Bank of Japan)、欧洲分子生物学实验室(EMBL：European Molecular Biology Laboratry，EMBL核酸序列数据库(EMBL nucleic acidsequence data library)、遗传序列数据库(GenBank：Genetic sequence data bank)、美国国家生物技术信息中心(NCBI：National Center for Biotechnology Information)的分类数据库等。
具体而言，作为进行扩增的希望的位点，优先为上述口腔内细菌的染色体DNA中的核糖体RNA(16S rRNA)基因。作为可用于扩增该区域的PCR引物，例如可优选列举出表2(序列号37、38)、表3(序列号41～53)。需要说明的是，基于PCR法的核酸的扩增可以依据常规方法进行。
本工序中提取的核酸及其扩增片段也可以适当标记化并在使其杂交后的检测过程中使用。具体而言，可以考虑：用各种报告色素预先标记PCR引物的末端的方法、在逆转录反应时导入反应性的核苷酸类似物的方法、导入生物素标记后的核苷酸的方法等。另外，还可以在制备后与荧光标记试剂反应而进行标记。作为荧光试剂，例如可以使用各种报告色素(例如，Cy5、Cy3、VIC、FAM、HEX、TET、荧光素、FITC、TAMRA、Texas red、Yakima Yellow等)。
(2)关于工序(ii)
在本工序中，使工序(i)中得到的核酸或其扩增片段与本发明中使用的探针或DNA芯片接触，具体而言，制备包含该核酸等的杂交溶液，使该溶液中的核酸等与DNA芯片上搭载的寡核苷酸探针结合(杂交)。杂交溶液可以使用SDS、SSC等缓冲液依据常规方法适当进行制备。杂交反应可以适当设定反应条件(缓冲液的种类、pH、温度等)，使得能够使杂交溶液中的核酸等在严格的条件下与DNA芯片上搭载的寡核苷酸探针进行杂交。需要说明的是，这里所谓的“严格的条件”是指不易发生由类似序列所致的交叉杂交或由于类似序列而使交叉杂交的核酸解离的条件，具体而言，是指杂交反应时或杂交后的DNA芯片的清洗条件。
例如，作为杂交反应时的条件，反应温度优选为35～70℃，更优选为40～65℃，进行杂交时的时间优选为约1分钟～16小时。另外，作为杂交后的DNA芯片的清洗条件，清洗液组成优选为0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20，清洗时的温度优选为35～80℃或40～65℃，更优选为45～60℃。更具体而言，优选盐(钠)浓度为48～780mM、温度为37～80℃的条件，更优选盐浓度为97.5～390mM、温度为45～60℃的条件。
在清洗后，利用能够检测出与探针结合的核酸等的标记的装置，按斑点测定检测强度。例如，在对上述核酸等进行了荧光标记化的情况下，可以使用各种荧光检测装置、例如CRBIO(Hitachi Software Engineering公司制)、arrayWoRx(GE Healthcare公司制)、Affymetrix 428 Array Scanner(Affymetrix公司制)、GenePix(Axon Instruments公司制)、ScanArray(PerkinElmer公司制)、GenoPearlReader(三菱化学株式会社制)等来测定荧光强度。对于这些装置，在荧光扫描仪的情况下，例如，可以适当调整激光的输出功率、检测部的灵敏度来进行扫描，在CCD照相机型的扫描仪的情况下，可以适当调节曝光时间来进行扫描。基于扫描结果的定量方法利用定量软件来进行。定量软件没有特别限定，可以使用斑点的荧光强度的平均值、中值等进行定量。另外，在定量时，优选考虑到DNA片段的斑点范围的尺寸精度等，进行将未搭载探针的斑点的荧光强度用作背景等的调整。
(3)关于工序(iii)
在本工序中，根据上述的步骤得到的信号强度计算出检测对象菌种的细菌的细菌量。例如，有根据用于对检测对象细菌进行检测的探针的信号强度与背景的信号强度之比以SN比的形式进行表示的方法。由于信号强度与细菌的存在量成比例，因此在无需计算拷贝数的情况下，也可以将SN比直接用于分析。
或者，还可以使用如下方法：预先对各细菌改变细菌的染色体DNA的浓度并在多个条件下进行检测，以在各浓度条件下得到的信号强度为基础，预先获得按照各细菌对染色体DNA浓度进行计算的换算系数(校准曲线)，根据各条件下得到的信号强度计算出染色体DNA的浓度的方法等。在该情况下，还可以以细菌的拷贝数的形式计算结果。
另外，在任意的情况下，可以通过对于各DNA芯片的检测对象细菌的信号强度考虑校正系数来校正信号强度、拷贝数。校正和信号强度/拷贝数换算的顺序不受限制。
4.牙周病的状态的判定
在本发明中，测定口腔内试样中存在的口腔内细菌群来源的核酸的信号强度，并根据该信号强度的测定值计算出上述细菌群的存在比例，将得到的计算值作为指标来判定牙周病的状态。
口腔内试样中存在的口腔内细菌群来源的核酸的信号强度的测定可以使用任意的工具，可列举出：如上述3.项中说明的那样使用DNA芯片的方法、以及使用实时PCR的方法、使用FISH法的方法。
作为信号强度的测定值，可列举出由DNA芯片得到的SN比、通过实时PCR得到的Ct值、由FISH法得到的荧光强度等。
细菌群的存在比例是指随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类(正相关菌)的细菌量与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类(负相关菌)的细菌量的相关关系。
作为相关关系的例子，可列举出：正相关菌的细菌量的总和与负相关菌的细菌量的总和之比(∑正相关菌的细菌量/∑负相关菌的细菌量)、将负相关菌的细菌量的总和减去正相关菌的细菌量的总和而得到的值(∑负相关菌的细菌量-∑正相关菌的细菌量)、用正相关菌的细菌量的总和乘以给定系数而得到的值与用负相关菌的细菌量的总和乘以给定系数而得到的值之比(∑系数×正相关菌的细菌量/∑系数×负相关菌的细菌量)、用正相关菌的细菌量的总和乘以给定的正的系数而得到的值与用负相关菌的细菌量的总和乘以给定的负的系数而得到的值之和(∑正的系数×正相关菌的细菌量+∑负的系数×负相关菌的细菌量)的值等。
需要说明的是，在正相关菌的种类数量与负相关菌的种类数量不同的情况下，优选对两者进行校正，以便获得由相同的细菌种类数量计算出的结果。
例如，通过计算出“正相关菌”群的SN比的总和后，除以“正相关菌”群的种类数量，从而计算出“正相关菌”群的平均SN比。同样地，通过计算出“负相关菌”群的SN比的总和后，除以该“负相关菌”群的种类数量，从而计算出“负相关菌”群的平均SN比。
最后通过得到“正相关菌”组的平均SN比与“负相关菌”组的平均SN比的比率，而能够获得平衡指标。
作为菌群的存在比例，优选使用随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类的细菌量与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的细菌量之“比”。
将由此得到的存在比例的计算值称为平衡指标。
用于计算平衡指标的分子及分母是任意的，可以将任一者作为分母或分子。例如，可以将随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类群的SN比作为分母、将随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类群的SN比作为分子，还可以将随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类群的SN比作为分母、将随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类群的SN比作为分子。
在目前为止的细菌检测中，通过检测相当于“有害菌”的细菌来判定牙周病的状态。由于它们是牙周袋增大到一定程度后而增加的细菌种类，因此只能获得恶化后的信息。在本发明中，由于使用相当于“有益菌”的细菌群来计算平衡指标，判定牙周病的状态，因此也能够判定健康的状态。
更详细地说明，考虑如下。
“有害菌”的细菌量相对于牙周袋的数值为单调增加函数，另一方面，“有益菌”的细菌量相对于牙周袋的数值为单调减少函数。
将“有害菌”的细菌量作为纵轴、将牙周袋的数值作为横轴时，则会发生牙周袋的数值在0-3mm之间没有能够判定的数值的情况。
另一方面，将“有害菌”的细菌量/“有益菌”的细菌量的指标作为纵轴、将牙周袋的数值作为横轴时，该函数明确地显示出拐点，可以在其附近进行判定，从这一点考虑是优异的。另外，牙周袋的数值在0-3mm之间存在能够判定的数值，利用该数值也可以判定健康的状态。
另外，在本发明中，优选通过将平衡指标与截止值进行比较来判定牙周病的状态。
截止值是具有作为细菌群的存在比例(平衡指标)的阈值或基准值的功能的值。
可以预先测定基准制定用口腔内试样中存在的口腔内细菌群来源的核酸的信号强度，并根据该信号强度的测定值计算出上述菌群的存在比例，由得到的计算值(平衡指标)绘制ROC曲线，然后由该ROC曲线来确定。截止值优选以减小距ROC曲线图的左上方的距离的方式进行选择。但是，可以根据目的(所需的灵敏度、特异性的大小)而适当变更。
另外，除了上述ROC曲线之外，截止值也可以通过聚类分析来确定。更具体而言，可以考虑：在利用k-means法进行聚类分析时，通过肘部法则(Elbow Method)来研究、确定最优的聚类数，或者在利用x-means法自动输出聚类数等之后，将对应于该聚类之间的边界的指标作为截止值。
作为判定模型制作的第一方式，可以考虑出基于“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”和“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”的存在比例(平衡指标)的判定模型。
各种细菌的例子如项目1.中记载所述。
作为随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类，没有特别限定，优选包含1种以上的除具核梭杆菌菌种(“病程指标细菌”)以外的细菌种类。具体而言，优选为选自牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、纤细弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、牙周梭杆菌、中间普雷沃氏菌、星群链球菌、伴放线菌团聚杆菌、啮蚀艾肯氏菌、生痰月形单胞菌、中间密螺旋体、隐藏真杆菌、缠结真杆菌、牙髓卟啉单胞菌、龈沟产线菌、胃消化链球菌、以及索氏密螺旋体中的1种以上，更优选为选自牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、纤细弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、牙周梭杆菌、中间普雷沃氏菌、星群链球菌、伴放线菌团聚杆菌、啮蚀艾肯氏菌、生痰月形单胞菌、中间密螺旋体、隐藏真杆菌、缠结真杆菌、牙髓卟啉单胞菌、以及龈沟产线菌中的1种以上。
使用的细菌种类优选为4种以上，更优选为8种以上、进一步优选为12种以上，特别优选为14种以上。使用的细菌种类优选为100种以下，更优选为75种以下，进一步优选为50种以下，特别优选为25种以下。
作为伴随周袋的数值的增加而减少的细菌种类，没有特别限定，具体而言，优选为选自副血链球菌、副流感嗜血杆菌、唾液链球菌、邻接短链小球菌、龋齿罗斯氏菌、拟普雷沃氏菌属(A.rava，OT 308)、罗氏韦荣氏球菌、巴斯德卟啉单胞菌、夏氏普雷沃氏菌、苍白普雷沃氏菌、非典型韦荣氏球菌、葛氏放线菌、小核桃形巨球形菌、洛氏普雷沃氏菌、变黄奈瑟氏球菌、莫氏细小杆菌、卡托氏卟啉单胞菌、胶胨罗斯氏菌、马氏棒杆菌、沟迹真杆菌、溶血孪生球菌、产黑色素普雷沃氏菌、栖牙普雷沃氏菌、变黑普雷沃氏菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、缓症链球菌bv 2、龋齿放线菌、小韦荣氏球菌、内氏放线菌II、有害月形单胞菌、SR1 sp.OT 345、微小小单胞菌、表兄链球菌、衣氏放线菌及栖组织普雷沃氏菌中的1种以上，更优选为选自副血链球菌、副流感嗜血杆菌、唾液链球菌、邻接短链小球菌、龋齿罗斯氏菌、拟普雷沃氏菌属(A.rava，OT 308)、罗氏韦荣氏球菌、巴斯德卟啉单胞菌、夏氏普雷沃氏菌、苍白普雷沃氏菌、非典型韦荣氏球菌、葛氏放线菌、小核桃形巨球形菌、洛氏普雷沃氏菌、变黄奈瑟氏球菌、莫氏细小杆菌、卡托氏卟啉单胞菌、胶胨罗斯氏菌、马氏棒杆菌、沟迹真杆菌、溶血孪生球菌、产黑色素普雷沃氏菌、栖牙普雷沃氏菌、变黑普雷沃氏菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、缓症链球菌bv 2、龋齿放线菌、小韦荣氏球菌、内氏放线菌II及有害月形单胞菌中的1种以上。
使用的细菌种类优选为2种以上，更优选为10种以上，进一步优选为20种以上。使用的细菌种类优选为100种以下，更优选为75种以下，进一步优选为50种以下，特别优选为25种以下。
根据牙周病的状态已知的基准制定用口腔内试样中存在的上述细菌群来源的核酸的信号强度的测定值，计算出上述细菌群的存在比例，由该算出值(平衡指标)求出截止值。
然后，在牙周病的状态不明确的试样的判定中，一次性全部检测上述的细菌群，然后同样地计算出平衡指标，并与上述的截止值进行比较，由此对状态进行判定。
根据第一方式的判定模型，可以根据截止值将牙周病的状态未知的样品判定为2组。
作为一个例子，对判定非疾病状态和疾病状态的模型进行说明。
非疾病状态和疾病状态可以适当定义，在本申请中，将非疾病状态定义为牙周袋深度1～3mm，将疾病状态定义为牙周袋深度5mm以上。即，牙周袋深度4mm是疾病状态或非疾病状态的不明确的状态。
对于牙周袋深度1～3mm的试样和牙周袋深度5mm以上的试样，测定各种细菌群来源的核酸的信号强度，根据测定值计算出各种细菌群的存在比例，由该算出值(平衡指标)求出截止值。然后，对于牙周袋深度4mm的试样，同样地计算出平衡指标，通过将其与先前的截止值进行比较，可以将疾病状态不明确的牙周袋深度4mm组判定为非疾病状态(与牙周袋深度1～3mm组相同程度)和疾病状态(与牙周袋深度5mm组相同程度)。从能够进行目前难以判定的牙周袋深度4mm组的判定这方面考虑，本发明的方法是非常有用的。
作为判定模型制作的第二方式，可以考虑基于“病程指标细菌(具核梭杆菌菌种)”和“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”的存在比例的判定模型。将第一方式中的“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组置换为作为“病程指标细菌”的具核梭杆菌菌种。
各种细菌的例子如项目1.中记载所述。
作为具核梭杆菌菌种，没有特别限定，具体而言，优选为选自具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种、具核梭杆菌文氏亚种及具核梭杆菌多形亚种中的1种以上，更优选为选自具核梭杆菌动物亚种及具核梭杆菌具核亚种中的1种或2种。
作为伴随周袋的数值的增加而减少的细菌种类，可优选使用与第一方式相同的菌种。
可以与第一方式的判定模型同样地计算出截止值，由此判断为2个组。
根据第二方式的判定模型，与第一方式相比能够更良好地得到牙周袋的数值小时的状态。
作为与本发明类似的指标，有将作为“有害菌”的牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体的细菌量的总计与作为“病程指标细菌”的具核梭杆菌的细菌量的比率作为指标的例子。本发明中，在将与“有益菌”群的比率作为指标这方面是不同的。根据本发明的指标，能够更明确地判定恶化的经过。
更详细地说明，考虑如下。
“有害菌”的细菌量相对于牙周袋的数值为单调增加函数，另一方面，“有益菌”的细菌量相对于牙周袋的数值为单调减少函数
在将“有害菌”的细菌量/“病程指标细菌”的细菌量的指标作为纵轴、将牙周袋的数值作为横轴时，健康的状态的样品中“有害菌”细菌量少，也会发生完全未检测到的结果。即，会发生牙周袋的数值在0-3mm之间没有能够判定的数值的情况。
另一方面，将“有害菌”、“病程指标细菌”的细菌量/“有益菌”的细菌量的指标作为纵轴、将牙周袋的数值作为横轴时，该函数明确地表现出拐点，可以在其附近进行判定，从这一点考虑是优异的。另外，牙周袋的数值在0-3mm之间存在能判定的数值，利用该数值也能够判定健康的状态。
另外，在本发明中，作为上述细菌群的存在比例，可以组合以下的(a)及(b)来使用。
(a)随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类(其中，包含1种以上的除具核梭杆菌菌种以外的细菌种类)的细菌量与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的细菌量的相关关系
(b)具核梭杆菌菌种的细菌量与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的相关关系
在使用DNA芯片时，由于能够一次性全部检测多个细菌群，因此可以同时计算出多个平衡指标。因此，还可以将2个平衡指标作为轴同时进行判定，可以分类为2×2＝4组。
通过本发明得到的牙周病的状态判定仅仅是根据细菌数量、或与细菌量成比例的SN比而推定出状态的判定，并非表示准确的病情。即，准确的病情的诊断需要通过牙医来进行诊断。但是，根据本发明，由于能够独立于牙周袋的数值地进行判定，因此从新型的观点出发，能够进行牙周病的早期发现/早期治疗，而且也可以有助于它们的预防。
5.牙周病的治疗效果的判定
治疗是指在牙科一线牙医、牙科保健师通常实施的治疗，例如，作为牙周基本治疗，可列举出菌斑控制(刷牙指导)、牙石的去除(根面平整术(Scaling and rootplaning))及咬合的调整等。另外，可列举出，经过牙周基本治疗后的再评价检查，结果是牙石已进入袋的较深部位而无法去除、未治愈的情况下，实施的外科治疗。具体的外科治疗例如为翻瓣术、牙周组织再生疗法及整形外科(牙周形成外科手术)等。另外，作为牙周治疗结束后的持续性专业护理的“牙周支持治疗(Supportive periodontal therapy，SPT)”作为用于保持“病情稳定”而良好地保持牙周治疗的预后的不可缺少的治疗也是很重要的。
通过在牙周病治疗前及治疗后采集检体并对数据进行比较研究来判定牙周病的治疗效果。
作为最基本的想法，通过充分利用检体的临床信息、且明确在治疗前后增减的细菌，可以客观地判定其治疗效果。另外，利用治疗后的细菌数据，能够明确不容易通过治疗而减少的细菌，可以进行特异性治疗。
根据本发明的方法，通过在治疗前后进行上述的“4.牙周病的状态的判定”中记载的判定，能够根据多个细菌的平衡指标来判定牙周病的治疗效果。特别是可以将显示出相同牙周袋数值的牙周病的状态进一步分为4个分类。
在还考虑到牙周袋的数值信息来进行判定时，也可以进行病情稳定的判定。例如，即使牙周袋的数值为4mm以上，如果上述的“4.牙周病的状态的判定”中记载的平衡指标判定为“轻度”，则可以认为病情稳定。反之，即使牙周袋的数值为3mm以下，如果平衡指标判定为“重度”，则可以判断有探讨进行治疗的可能性。
截至目前的说明中，作为表示细菌量的测定值，使用DNA芯片的SN比进行了说明，但只要是可作为与DNA芯片的SN比相同含义的数值而使用的测定值，就包含在本发明的范围内。例如，可以考虑由DNA芯片的SN比换算得到的细菌的拷贝数、利用实时PCR定量得到的细菌的拷贝数、表示量的程度的Ct值、由下一代测序仪的结果得到的读取数、由读取数换算出的相对量百分比等。
6.寡核苷酸探针组
本发明提供口腔细菌检测用寡核苷酸探针组，其包含以下的(a)或(b)的DNA。
(a)由序列号1～33所示的碱基序列组成的DNA
(b)与序列号1～33所示的碱基序列具有90％以上的同一性、且与口腔细菌的染色体DNA中的16SrRNA基因或其互补链的一部分碱基序列杂交的DNA
本发明中使用的探针可以使用由序列号1～33所示的33种碱基序列组成的DNA中任意组合的DNA。例如，可以是由序列号1～33所示的碱基序列组成的DNA中的任意1种DNA，也可以是2种DNA的组合，也可以是32种DNA的组合，还可以是33种DNA的组合。
“杂交”的严格的条件等与上述的内容相同。
另外，作为成为检测对象的口腔细菌，与上述同样地可列举属于以下任意属中的至少一种细菌：卟啉单胞菌属、坦纳氏菌属、密螺旋体属、普雷沃氏菌属、弯曲杆菌属、梭杆菌属、链球菌属、团聚杆菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、艾肯氏菌属、放线菌属、韦荣氏球菌属及月形单胞菌属。
另外，本发明提供配置有上述寡核苷酸探针组的口腔细菌检测用微阵列。在本发明中，作为微阵列，可以使用“2.口腔内细菌量的测定所使用的口腔内细菌基因检测用DNA芯片”项目中记载的微阵列。
以下，列举实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明并不限定于此。
实施例
[实施例1-1]
牙周病的状态的判定方法
龈下菌斑检体中的口腔内细菌的检测
<龈下菌斑检体的制备>
在大阪大学齿学部附属医院，从牙周病治疗前的状态的20多岁～70多岁的220名男女被检者采集了龈下菌斑。将2个吸潮纸尖(absorbent paper point)(ISO Color-Coded)#40(DENTSPLY MAILLEFER公司制)插入牙周袋中放置30秒钟。然后，将纸尖投入装有0.15mL灭菌蒸馏水的微型管中，进行20秒钟的涡旋混合。用灭菌的镊子取出纸尖，在-20℃下冷冻保管至检测为止。
<临床信息的获得>
对于全部检体，按照下述的基准将临床信息进行了数值化。下述4个项目是在牙科中广泛使用的指标。
(i)牙周袋的深度(Pd)：表示将牙周探针插入袋时从牙龈边缘至探针前端的距离。以1mm单位进行数值化。需要说明的是，这里所谓的“牙周探针”是指袋测定器具(perio-probe)。
(ii)探诊时的出血(BOP)：表示将牙周探针插入袋时有无出血。将没有出血的情况作为0，将有出血的情况作为1。
(iii)牙龈指数(Gingival Index，GI)：表示牙龈的炎症程度。将未确认到炎症的情况作为0，将轻度炎症的情况作为1，将中度炎症的情况作为2，将重度炎症的情况作为3。
(iv)菌斑指数(Plaque Index，PlI)：表示与牙龈邻接的齿面的菌斑沉积量。将未确认到菌斑的情况作为0，将肉眼未确认到菌斑但用探针擦过确认到菌斑的情况作为1，将能够辨认出菌斑的情况作为2，将确认到大量菌斑的情况作为3。
<PCR>
将上述的冷冻保管的全部检体融化，作为PCR模板。为了扩增检体中的口腔内细菌的16SrRNA的检测对象区域的序列，通过以下的反应液组成及反应条件实施了PCR。PCR用试剂盒使用了Premix Ex TaqTM热启动版本(Takara公司制)，通过GeneAmp9700(AppliedBiosystems公司制)来进行。引物使用了具有下述序列的引物。需要说明的是，正向引物使用5’末端被Cy5标记的引物。
正向引物(细菌扩增用)：
5’-Cy5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’(序列号37)
反向引物(细菌扩增用)：
5’-CAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACC-3’(序列号38)
正向引物(绝对量指标扩增用)：
5’-Cy5-GAGAAGCCTACACAAACGTAACGTC-3’(序列号39)
反向引物(绝对量指标扩增用)：
5’-CTCTAAAGACCGCTCTATCTCGG-3’(序列号40)
<反应液组成>
2×Premix Ex Taq(注册商标)
热启动版本10μL
4μM正向引物(细菌扩增用)1μL
4μM反向引物(细菌扩增用)1μL
4μM正向引物(绝对量指标扩增用)1μL
4μM反向引物(绝对量指标扩增用)1μL
模板DNA 5μL
绝对量指标1μL
总计20μL
<反应条件>
在95℃下加热1分钟后，将“解离：98℃(10秒钟)→退火：60℃(30秒钟)→合成：72℃(20秒钟)”作为1次循环，总计进行40次循环，在4℃下冷却，得到了扩增产物。
<DNA芯片：口腔内细菌检测用DNA芯片的制造>
利用与日本特开2007-74950号公报(甲基化DNA和/或非甲基化DNA的检测方法)的实施例2-1中记载的方法相同的方法制造了通孔型的DNA芯片。
其中，搭载的寡核苷酸探针参考非专利文献1：Socransky，S.S.et al.J ClinMicrobiol，37，1426-30，1999的菌种的信息，使用了具有表4所示的序列信息的探针。
表4
序列号
| 1 | 牙龈卟啉单胞菌用探针 | TTCAATGCAATACTCGTATC |
| 2 | 福赛斯坦纳氏菌用探针 | CACGTATCTCATTTTATTCC |
| 3 | 齿垢密螺旋体用探针 | CCTCTTCTTCTTATTCTTCAT |
| 5 | 纤细弯曲杆菌用探针1 | GCCTTCGCAATAGGTATT |
| 7 | 直肠弯曲杆菌用探针2 | GTCATAATTCTTTCCCAAGA |
| 8 | 昭和弯曲杆菌用探针 | CAATGGGTATTCTTCTTGAT |
| 9 | 具核梭杆菌文氏亚种用探针 | TAGTTATACAGTTTCCAACG |
| 10 | 具核梭杆菌多形亚种用探针 | CCAGTACTCTAGTTACACA |
| 11 | 具核梭杆菌动物亚种用探针5 | TTTCTTTCTTCCCAACTGAA |
| 12 | 具核梭杆菌具核亚种用探针7 | TACATTCCGAAAMCGTCAT |
| 13 | 牙周梭杆菌用探针 | TATGCAGTTTCCAACGCAA |
| 14 | 中间普雷沃氏菌用探针 | GGGTAAATGCAAAAAGGCA |
| 15 | 变黑普雷沃氏菌用探针 | CTTTATTCCCACATAAAAGC |
| 16 | 星群链球菌用探针 | AAGTACCGTCACTGTGTG |
| 17 | 伴放线菌团聚杆菌用探针1 | GTCAATTTGGCATGCTATTA |
| 18 | 简明弯曲杆菌用探针 | CCCAAGCAGTTCTATGGT |
| 19 | 牙龈二氧化碳嗜纤维菌用探针 | TACACGTACACCTTATTCTT |
| 20 | 黄褐二氧化碳嗜纤维菌用探针 | CAACCATTCAAGACCAACA |
| 21 | 生痰二氧化碳嗜纤维菌用探针1 | TACACGTACACCTTATTCTT |
| 22 | 啮蚀艾肯氏菌用探针2 | CTCTAGCTATCCAGTTCAG |
| 23 | 戈氏链球菌用探针 | CACCCGTTCTTCTCTTACA |
| 25 | 中间链球菌用探针 | ACAGTATGAACTTTCCATTCT |
| 27 | 缓症链球菌用探针6 | TCTCCCCTCTTGCACTCA |
| 28 | 缓症链球菌bv 2用探针 | TCCCCTCTTGCACTCAAGT |
| 29 | 龋齿放线菌用探针 | AAGTCAGCCCGTACCCA |
| 30 | 小韦荣氏球菌用探针 | TATTCGCAAGAAGGCCTT |
| 31 | 内氏放线菌II用探针 | CCACCCACAAGGAGCAG |
| 32 | 有害月形单胞菌用探针1 | TTCGCATTAGGCACGTTC |
<与DNA芯片的杂交>
如下所述混合各溶液，制备了杂交溶液。
PCR后得到的DNA扩增产物20μL
1M Tris-HCl 48μL
1M NaCl 48μL
0.5％Tween20 20μL
水64μL
总计200μL
使200μL的杂交溶液与上述DNA芯片接触，在50℃下杂交2小时。杂交后，在下述的条件下清洗了DNA芯片。
用0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20溶液1000μL重复进行12次220秒钟的清洗，接着，用1000μL的0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl重复进行4次220秒钟的清洗。在清洗结束后，将各芯片移至室温的0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl混合溶液中。
<检测>
进行上述清洗后，使用GenoPearlReader(三菱化学株式会社制)在下述条件下测定了DNA芯片的各斑点的荧光强度。
<检测条件>
中心激发波长：633nm
曝光时间：0.1、1、4、40秒钟
<结果>
用搭载了检测对象细菌用探针的斑点的荧光强度除以背景值(未搭载探针的斑点的荧光强度的中值)，计算出源自杂交的SN比。对于全部220个检体，按照各检测对象细菌得到了SN比的数据。
<临床信息与细菌量(SN比)的相关性>
对于28种细菌，制作了牙周袋的数值(Pd)和表示各细菌量的SN比的数据的散点图，将其示于图1(图1-1～图1-7)。图1的纵轴表示各细菌的SN比，横轴表示袋的数值(Pd)。另外，对于全部28个种类，计算出相关系数(表5)。
表5
接着，基于相关系数的正值、负值将28种菌大致分为随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类和随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类。“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组为牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、纤细弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种、牙周梭杆菌、中间普雷沃氏菌、星群链球菌、伴放线菌团聚杆菌、啮蚀艾肯氏菌这15个菌种。
“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组为变黑普雷沃氏菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、缓症链球菌bv2、龋齿放线菌、小韦荣氏球菌、内氏放线菌II、有害月形单胞菌这13个菌种。
接下来，使用图1所示的图表的SN比的值，计算出“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组的SN比的总和，然后除以该“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组的种类数量，由此计算出“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组的平均SN比。同样地，计算出“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组的SN比的总和，然后除以该“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组的种类数量，由此计算出“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组的平均SN比。
最后，通过获得“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组的平均SN比与“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组的平均SN比的比率，计算出细菌群的平衡指标。将纵轴表示平衡指标(“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组15种/“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组13种)、横轴表示牙周袋数值(Pd)的散点图示于图2。
在本发明中，将非疾病状态定义为牙周袋深度1～3mm，将疾病状态定义为牙周袋深度5mm以上。图2所示的数据中，由牙周袋深度1～3mm和牙周袋深度5mm以上的数据制作判断模型，将牙周袋深度4mm的数据作为测试数据来判定非疾病状态/疾病状态。图2所示的数据中，对于牙周袋深度1～3mm和牙周袋深度5mm以上的数据制作直方图(图3)。图3的纵轴是将图2的平衡指标进行LOG10转换而得到的数值。横轴为频率。
以图3的数据为基础进行ROC分析(图4右)，将接近左上方的点(平衡指标(LOG10)＝0.566)作为截止值。在该情况下，通过相同的分析可知，为以灵敏度0.890、特异度0.913进行判定的检查(图4左)。
接着使用该检查，进行了牙周袋深度(Pd)为4mm的数据的判定。4mm的数据是图2的袋的深度4mm的数据，存在44人的数据。
以截止值0.566对这些数据进行判定时，18人为比截止值大的平衡指标(LOG10)值(表6：从下起18名)。可以判断这些病例的牙周病的状态进行到与牙周袋5mm以上的疾病状态相同的程度。
表6
作为判断与牙周袋5mm以上的疾病状态为相同程度的一个例子，将平衡指标(LOG10)值1.516648的样品的各细菌的SN比示于图5。由图5确认形成了“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组的菌种的SN比大、“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组的SN比小的模式。
[实施例1-2]
牙周病的病程状态的判定方法
使用与实施例1的数据相同的数据，制作了牙周病的病程状态的判定模型。
“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组、“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组与实施例1相同。
作为“病程指标细菌”，在“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组中选择了具核梭杆菌动物亚种和具核梭杆菌具核亚种。
接着，使用实施例的图1所示的图表的SN比的数值，计算出“病程指标细菌”(具核梭杆菌动物亚种和具核梭杆菌具核亚种)的SN比的总和，然后除以其种类数量“2”，由此计算出“病程指标细菌”组的平均SN比。同样地，计算出“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组的平均SN比。
最后，通过得到“病程指标细菌”组的平均SN比与“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组的平均SN比的比率，计算出细菌群的平衡指标。将纵轴表示平衡指标(“病程指标细菌”2种/“有益菌”组13种)、横轴表示牙周袋数值(Pd)的散点图示于图6。
图6所示的数据中，由牙周袋深度1～3mm、牙周袋深度5mm以上的数据制作判断模型，将牙周袋深度4mm的数据作为测试数据来判定非疾病状态/疾病状态。
图6所示的数据中，对于牙周袋深度1～3mm和牙周袋深度5mm以上的数据制作直方图(图7)。图7的纵轴是将图6的平衡指标进行LOG10转换而得到的数值。横轴为频率。
以图7的数据为基础进行ROC分析(图8右)，将接近左上方的点(平衡指标(LOG10)＝0.826)作为截止值。在该情况下，通过相同的分析可知，为以灵敏度0.932、特异性0.777进行判定的检查。
接着使用该检查，进行了牙周袋深度(Pd)为4mm的数据的判定。4mm的数据是图6的袋的深度4mm的数据，存在44人的数据。
用截止值0.826对这些数据进行判定时，27人为比截止值大的平衡指标(LOG10)值(表7：黄色的27名(从表7的下边起1～27名))。作为牙周病的病程，可以判断这些病例的牙周病的状态进行到与牙周袋5mm以上的疾病状态为相同程度。
表7
将平衡指标(LOG10)值0.883的样品的各细菌的SN比示于图9(与图5相同的样品)。由图9确认形成了“病程指标细菌”群的梭杆菌属的SN比大、“有益菌”群的SN比小的模式。
[实施例1-3]
牙周病的状态细分化
使用实施例1-1、实施例1-2的数据，将实施例1-1的平衡指标(LOG10)作为纵轴，将实施例1-2的平衡指标(LOG10)作为横轴，此外利用与实施例1-1及1-2同样的方法制作了判定模型。对目前为止以“袋4mm”统一处理的部位数据进行判定，结果分类为4组。
将结果归纳示于图10。
对于(a)、(b)、(d)的状态的样品，将各细菌的SN比示于图11。从上方起为状态(a)(需要再次治疗水平：n＝18)、状态(b)(目前为轻度但要注意病程：n＝19)、状态(d)(轻度：n＝17)
[实施例1-4]
基于选择的细菌的判定能力的差异
使用与实施例1-1相同的数据，与实施例1-1同样地基于相关系数的正值、负值将28种菌大致分为随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类和随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类。
其中，随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类群是作为牙周病相关细菌而已知的5个菌种和具核梭杆菌菌种这1个菌种。即，为牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、直肠弯曲杆菌、具核梭杆菌具核亚种、中间普雷沃氏菌这6个菌种。
另外，随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类群为SN比相对较大的牙龈二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、小韦荣氏球菌这4个菌种。即，在判定模型的制作中使用了总计10个菌种的数据。
与实施例1-1同样地计算出平衡指标(LOG10)后进行ROC分析，与实施例1-1的情况进行了比较。将该结果示于图12。
其结果可知，使用10个菌种而得到的截止值(0.566)的情况下，为以灵敏度0.877、特异度0.932进行判定的检查。(28个菌种的情况下，如上所述，灵敏度0.890、特异度0.913。)
另外，与实施例1-2同样地计算出平衡指标(LOG10)，进行ROC分析，与实施例1-2的情况进行了比较。将该结果示于图13。
其结果可知，使用10个菌种而得到的截止值(0.826)的情况下，为以灵敏度0.904、特异度0.806进行判定的检查。(28个菌种的情况下，如上所述，灵敏度0.932、特异度0.777。)
根据该结果可以认为，28种的情况为平滑的曲线，提高了判断的准确性。然而，即使在10种的情况下，通过适当选择细菌种类，灵敏度、特异性也不会大幅降低。
[实施例2-1]
治疗前及治疗后的菌斑检体的细菌检测和牙周病的治疗效果的判定
<菌斑检体的制备>
为了对治疗前及治疗后的菌斑检体的细菌量进行比较，在大阪大学齿学部附属医院从20多岁～70多岁的61个男女病例采集了牙周病治疗前及治疗后的龈下菌斑。治疗实施了作为牙周基本治疗的牙石去除(根面平整术(scaling and root planing))。
将2个吸潮纸尖(absorbent paper point)(ISO Color-Coded)#40(DEN TSPLYMAILLEFER公司制)插入牙周袋中并放置30秒钟。然后，将纸尖投入装有0.15mL的灭菌蒸馏水的微型管中，进行20秒钟涡旋混合。用灭菌的镊子取出纸尖，在-20℃下冷冻保管至检测为止。
<DNA芯片：口腔内细菌检测用DNA芯片的制造>
利用与日本特开2007-74950号公报(甲基化DNA和/或非甲基化DNA的检测方法)的实施例1-1中记载的方法相同的方法制造了通孔型的DNA芯片。搭载的寡核苷酸探针使用了具有表8所示的序列信息的探针。PCR、与DNA芯片的杂交、直至检测为止，与实施例1-1同样地实施。
表8
序列号
| 1 | 牙龈卟啉单胞菌用指针 | TTCAATGCAATACTCGTATC |
| 2 | 福赛斯坦纳氏菌用指针 | CACGTATCTCATTTTATTCC |
| 4 | 齿垢密螺旋体用指针1 | CTCTTCTTCTTATTCTTCAT |
| 6 | 直肠弯曲杆菌用指针 | ATTCTTTCCCAAGAAAAGGA |
| 12 | 具核梭杆菌具核亚种用指针7 | TACATTCCGAAAAACGTCAT |
| 14 | 中间普雷沃氏菌用指针 | GGGTAAATGCAAAAAGGCA |
| 15 | 变黑普雷沃氏菌用指针 | CTTTATTCCCACATAAAAGC |
| 17 | 伴放线菌团聚杆菌用指针1 | GTCAATTTGGCATGCTATTA |
| 19 | 牙龈二氧化碳嗜纤维菌用指针 | TACACGTACACCTTATTCTT |
| 24 | 戈氏链球菌用指针1 | CACCCGTTCTTCTCTTAC |
| 26 | 中间链球菌用指针1 | CAGTATGAACTTTCCATTCT |
| 30 | 小韦荣氏球菌用指针 | TATTCGCAAGAAGGCCTT |
| 33 | 变异链球菌用指针 | CACACGTTCTTGACTTAC |
| 34 | 总量指标用指针 | CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC |
| 35 | 绝对量指标15用指针 | CTATTCGACCAGCGATATCACTACGTAGGC |
<结果>
<SN比数据的计算>
用搭载了检测对象细菌用探针的斑点的荧光强度除以背景值(未搭载探针的斑点的荧光强度)，计算出源自杂交的SN比。然后，与实施例1-4相同的10种(即“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组为牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、直肠弯曲杆菌、具核梭杆菌具核亚种、中间普雷沃氏菌这6个菌种，“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组为牙龈二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、小韦荣氏球菌这4个菌种)，与实施例1-3同样地进行了利用2轴的判定。将其结果示于图14的上半部分的2个图。
左侧为治疗前的结果，右侧为治疗后的结果。观察治疗前后的曲线的位置，整体上从右上方((a)需要再次治疗水平)移向左下方((d)轻度)，可以判断治疗的效果。另外，图14的下半部分的2个图是牙周袋(纵轴)和平衡指标(横轴)的图。左侧为治疗前，右侧为治疗后。观察该结果，在治疗后牙周袋为4mm左右、平衡指标未超过判定值的曲线可以判定为病情稳定。反之，牙周袋为3mm、平衡指标超过判定值的曲线可以判断为进行治疗为宜。
[实施例2-2]
<拷贝数数据的计算>
由搭载了检测对象细菌用探针的斑点的荧光强度减去背景值(未搭载探针的斑点的荧光强度的中值及标准偏差的3倍)，计算出源自杂交的信号强度。接着，对于多个DNA芯片，比较绝对量指标探针的信号强度，求出各DNA芯片的校正系数，对检测对象细菌的信号强度进行校正，以便能够进行比较。然后，乘以预先确定的各细菌量计算系数，利用基因组拷贝数计算出各检测对象的细菌量。对于各细菌量计算系数而言，预先测定检测各细菌来源基因组DNA时的信号强度而制作校准曲线，求出根据各细菌的信号强度反算各细菌量的系数。最后，乘以用于PCR模板的检测80个检体的稀释率，计算出每一个纸尖的细菌数量。通过上述的计算，针对全部122个检体，按照各检测对象细菌得到了细菌数量的数据。需要说明的是，在初期信号强度为0以下的检测下限的情况一律为拷贝数1000。将该结果示于治疗前(表9(表9-1～表9-2))和治疗后(表10(表10-1～表10-2))。
接着，使用治疗前后的拷贝数的数据，进行与实施例2-1相同的分析。将结果示于图15。其中，由于SN比与拷贝数的数据确认到比例关系，因此截止值使用了与SN比的分析数值相同的值。
表9-1
表9-2
表10-1
表10-2
与实施例2-1同样地进行2轴的判定。将该结果示于图15的上半部分的2个图。左侧为治疗前的结果，右侧为治疗后的结果。观察治疗前后的曲线的位置，整体上从右上方((a)需要再次治疗水平)移至左下方((d)轻度)，可以判断治疗的效果。另外，图15的下半部分的2个图是牙周袋(纵轴)和平衡指标(横轴)的图。左侧为治疗前、右侧为治疗后。观察该结果，在治疗后牙周袋为4mm左右、平衡指标未超过判定值的曲线判定为病情稳定。反之，牙周袋为3mm、平衡指标超过判定值的图表判断为进行治疗为宜。
[实施例3]
利用下一代测序仪数据的判定
将实施例1-1的样品中的一个送至J-Bio21中心(目铁住金环境株式会社：茨城县筑波市梅园2-1-13筑波Kouken大厦2F)，进行了16SrRNA下一代测序分析。根据得到的结果计算出各细菌相对于总体菌数的相对比。将该结果示于图16。
接着，对实施例1-4所示的“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”和“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”的相对量进行了研究，结果如表11所示。另外，与实施例1-4、实施例2-2同样地计算出平衡指标为3.739(17.2％/4.6％)，通过LOG10换算为约0.5728，可以计算出判定数值，通过利用图15的X轴的值进行判定，可以将平衡指标判定为“轻度”。
表11
[实施例4]
为了对近年来新讨论的细菌种类进行研究，与实施例1-1同样地新制作了搭载有表12中记载的细菌探针的DNA芯片。
表12
对于与实施例1-1同样收集的321个样品，用表12中记载的DNA芯片新收集了荧光强度数据。实验条件与实施例1-1同样地实施，仅以下的2点进行了变更。
如下所示变更了PCR中使用的引物而实施。
R、Y表示混合碱基，R表示A和G，Y表示C和T。
正向引物(细菌扩增用)：
5’-Cy5-TACGGGAGGCAGCAG-3’(序列号90)
反向引物(细菌扩增用)：
5’-CRGGGTATCTAATCCYGTT-3’(序列号91)
正向引物(绝对量指标扩增用)：
5’-Cy5-GAGAAGCCTACACAAACGTAACGTC-3’(序列号39)
反向引物(绝对量指标扩增用)
5’-CTCTAAAGACCGCTCTATCTCGG-3’(序列号40)
另外，杂交温度、时间设为50℃下16小时。
接着，对得到的荧光强度进行如下处理。
用搭载了检测对象细菌用探针的斑点的荧光强度减去背景值(未搭载探针的斑点的荧光强度的中值)，计算出源自杂交的信号强度。此时，如果信号强度低于某个阈值，则判断为噪声并设为“0”。这里，作为阈值，使用了从30个未搭载探针的斑点的荧光强度中去除了前5个和后5个后的20个值的标准偏差的3倍的值。
另外，用检测对象细菌的探针的信号强度除以总菌量指标用探针的信号强度，计算出各细菌相对于总体细菌的相对比。在随后的分析中，使用了以log10对这些相对于总量的相对比进行变换而得到的值。其中，由于值为“0”的情况无法计算，因此将log10变换后的数值替换为-4。由此，得到了全部321个检体的数据。对于该结果和袋深度，按各检体归纳示于表13(表13-1～表13-16)。
表13-1
表13-2
表13-3
表13-4
表13-5
表13-6
表13-7
表13-8
表13-9
表13-10
表13-11
表13-12
表13-13
表13-14
表13-15
表13-16
对于全部36个种类，计算出牙周袋的数值(Pd)与各细菌的log10(相对于总量的相对比)的值的相关系数，进而对于它们的相关性的显著性，计算出p值、q值(表14)。
表14
有害菌6个菌种、有益菌23个菌种
| 相关系数 | p值 | q值 | |
| 龈沟产线菌 | 0.640 | 2.12E-38 | 7.63E-37 |
| 牙髓卟啉单胞菌 | 0.556 | 1.94E-27 | 3.49E-26 |
| 缠结真杆菌 | 0.532 | 8.13E-25 | 9.76E-24 |
| 隐藏真杆菌 | 0.468 | 7.74E-19 | 3.98E-18 |
| 中间密螺旋体 | 0.426 | 1.46E-15 | 5.84E-15 |
| 生痰月形单胞菌 | 0.203 | 0.000254 | 0.000366 |
| 栖牙普雷沃氏菌 | -0.163 | 0.003427 | 0.004254 |
| 产黑色素普雷沃氏菌 | -0.163 | 0.00334 | 0.004254 |
| 溶血孪生球菌 | -0.164 | 0.003243 | 0.004254 |
| 沟迹真杆菌 | -0.194 | 0.000475 | 0.000658 |
| 马氏棒杆菌 | -0.208 | 0.000177 | 0.000265 |
| 胶胨罗斯氏菌 | -0.209 | 0.000166 | 0.00026 |
| 卡托氏卟啉单胞菌 | -0.227 | 3.96E-05 | 6.48E-05 |
| 莫氏细小杆菌 | -0.260 | 2.29E-06 | 3.93E-06 |
| 变黄奈瑟氏球菌 | -0.262 | 1.91E-06 | 3.44E-06 |
| 洛氏普雷沃氏菌 | -0.274 | 6.32E-07 | 1.2E-06 |
| 小核桃形巨球形菌 | -0.274 | 6.1E-07 | 1.2E-06 |
| 葛氏放线菌 | -0.276 | 5.13E-07 | 1.09E-06 |
| 非典型韦荣氏球菌 | -0.279 | 3.64E-07 | 8.19E-07 |
| 苍白普雷沃氏菌 | -0.306 | 2.09E-08 | 5.02E-08 |
| 夏氏普雷沃氏菌 | -0.315 | 8.27E-09 | 2.13E-08 |
| 巴斯德卟啉单胞菌 | -0.328 | 1.65E-09 | 4.57E-09 |
| 罗氏韦荣氏球菌 | -0.357 | 4.17E-11 | 1.25E-10 |
| 拟普雷沃氏菌属(A.rava，OT 308) | -0.365 | 1.47E-11 | 4.81E-11 |
| 龋齿罗斯氏菌 | -0.400 | 8.94E-14 | 3.22E-13 |
| 邻接短链小球菌 | -0.433 | 4.59E-16 | 2.07E-15 |
| 唾液链球菌 | -0.469 | 6.3E-19 | 3.78E-18 |
| 副流感嗜血杆菌 | -0.493 | 4.58E-21 | 3.3E-20 |
| 副血链球菌 | -0.519 | 1.7E-23 | 1.53E-22 |
使用统计软件“R”(R Developmcnt Corc T cam)，分别使用cor函数计算出相关系数的值，使用cor.test函数计算出p值，使用p.adjust函数(在方法选项中指定“BH”)计算出q值。
对于表14所示的相关系数的显著性，在将显著性水平设为q值＜0.05时，为显示出显著的相关性的细菌。接着，对于这些具有显著相关性的细菌，基于相关系数的正负大致分为“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”和“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”。“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组为龈沟产线菌、牙髓卟啉单胞菌、缠结真杆菌、隐藏真杆菌、中间密螺旋体、生痰月形单胞菌这6个菌种。
“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组为栖牙普雷沃氏菌、产黑色素普雷沃氏菌、溶血孪生球菌、沟迹真杆菌、马氏棒杆菌、胶胨罗斯氏菌、卡托氏卟啉单胞菌、莫氏细小杆菌、变黄奈瑟氏球菌、洛氏普雷沃氏菌、小核桃形巨球形菌、葛氏放线菌、非典型韦荣氏球菌、苍白普雷沃氏菌、夏氏普雷沃氏菌、巴斯德卟啉单胞菌、罗氏韦荣氏球菌、拟普雷沃氏菌属(A.rava，OT 308)、龋齿罗斯氏菌、邻接短链小球菌、唾液链球菌、副流感嗜血杆菌、副血链球菌这23个菌种。
接下来，使用log10(相对于总量的相对比)的值计算出“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组和“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组的平均值。最后，对于该平均值，通过由“随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类”组的值减去“随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类”组的值，计算出细菌群的平衡指标。将其示于表15(表15-1～表15-7)。
表15-1
/>
表15-2
| -2.2614 | -3.11524 | 4 | 0.8538 |
| -2.61218 | -3.18576 | 9 | 0.5736 |
| -2.06611 | -2.73513 | 3 | 0.669 |
| -2.43207 | -2.50549 | 4 | 0.0734 |
| -2.96376 | -2.95071 | 3 | -0.013 |
| -2.31696 | -2.8179 | 4 | 0.5009 |
| -2.50696 | -2.36912 | 2 | -0.138 |
| -2.30178 | -2.2123 | 3 | -0.089 |
| -2.24343 | -1.93077 | 2 | -0.313 |
| -2.35569 | -2.30188 | 3 | -0.054 |
| -2.45441 | -2.55975 | 3 | 0.1053 |
| -2.0859 | -2.6802 | 8 | 0.5943 |
| -2.25358 | -2.62815 | 3 | 0.3746 |
| -2.23614 | -2.73713 | 2 | 0.501 |
| -2.45617 | -2.49485 | 3 | 0.0387 |
| -2.38646 | -2.5784 | 3 | 0.1919 |
| -2.29529 | -2.57963 | 3 | 0.2843 |
| -2.78851 | -2.84604 | 3 | 0.0575 |
| -2.94716 | -2.74888 | 3 | -0.198 |
| -1.69451 | -2.78791 | 6 | 1.0934 |
| -2.17616 | -2.32099 | 2 | 0.1448 |
| -1.2679 | -2.95606 | 5 | 1.6882 |
| -2.50638 | -2.40763 | 3 | -0.099 |
| -2.0615 | -3.1845 | 3 | 1.123 |
| -2.25845 | -1.97274 | 2 | -0.286 |
| -2.4779 | -2.48399 | 3 | 0.0061 |
| -2.59696 | -2.53369 | 3 | -0.063 |
| -1.9359 | -2.84744 | 3 | 0.9115 |
| -3.05524 | -2.40253 | 3 | -0.653 |
| -1.8986 | -2.90775 | 8 | 1.0092 |
| -2.43224 | -2.57159 | 3 | 0.1394 |
| -1.16576 | -3.14264 | 6 | 1.9769 |
| -2.93588 | -2.81319 | 3 | -0.123 |
| -1.98347 | -2.95364 | 8 | 0.9702 |
| -3.05666 | -2.61738 | 4 | -0.439 |
| -1.85972 | -3.07762 | 9 | 1.2179 |
| -2.7068 | -2.837 | 4 | 0.1302 |
| -2.19757 | -2.8783 | 7 | 0.6807 |
| -1.78529 | -3.10267 | 4 | 1.3174 |
| -1.69736 | -3.04882 | 8 | 1.3515 |
| -2.10323 | -3.19105 | 4 | 1.0878 |
| -1.22554 | -3.22888 | 11 | 2.0033 |
| -1.48753 | -3.04874 | 4 | 1.5612 |
| -1.27083 | -3.08447 | 6 | 1.8136 |
| -2.82728 | -2.72762 | 3 | -0.1 |
| -1.16697 | -3.16362 | 6 | 1.9966 |
| -1.33751 | -2.71029 | 4 | 1.3728 |
| -1.17428 | -3.09345 | 6 | 1.9192 |
| -2.1631 | -3.1223 | 4 | 0.9592 |
| -2.07357 | -3.2192 | 6 | 1.1456 |
表15-3
| -1.61276 | -2.90396 | 4 | 1.2912 |
| -1.02768 | -3.15445 | 9 | 2.1268 |
| -2.2846 | -2.95095 | 3 | 0.6664 |
| -3.15062 | -2.85584 | 3 | -0.295 |
| -2.61968 | -2.91849 | 2 | 0.2988 |
| -2.36883 | -2.70867 | 3 | 0.3398 |
| -2.83252 | -2.62098 | 2 | -0.212 |
| -2.49988 | -2.77529 | 3 | 0.2754 |
| -2.96629 | -2.57006 | 3 | -0.396 |
| -2.89198 | -2.59028 | 2 | -0.302 |
| -2.98929 | -2.6883 | 3 | -0.301 |
| -2.07897 | -2.68571 | 3 | 0.6067 |
| -2.80986 | -2.78343 | 2 | -0.026 |
| -2.77675 | -2.86664 | 3 | 0.0899 |
| -3.26311 | -2.9469 | 3 | -0.316 |
| -2.98315 | -2.56114 | 2 | -0.422 |
| -3.09606 | -2.63255 | 3 | -0.464 |
| -2.43866 | -2.80828 | 2 | 0.3696 |
| -2.84996 | -2.60525 | 2 | -0.245 |
| -2.89807 | -2.71355 | 2 | -0.185 |
| -3.14875 | -2.97835 | 3 | -0.17 |
| -2.71774 | -2.58371 | 3 | -0.134 |
| -3.0102 | -2.82419 | 3 | -0.186 |
| -2.92817 | -2.77711 | 3 | -0.151 |
| -3.07024 | -2.55146 | 2 | -0.519 |
| -2.88831 | -3.10258 | 3 | 0.2143 |
| -3.04819 | -2.64473 | 3 | -0.403 |
| -2.92893 | -2.6115 | 3 | -0.317 |
| -3.16087 | -2.76068 | 3 | -0.4 |
| -2.98668 | -2.75448 | 2 | -0.232 |
| -1.97652 | -2.01959 | 1 | 0.0431 |
| -2.90549 | -2.81259 | 3 | -0.093 |
| -3.13396 | -2.85051 | 3 | -0.283 |
| -3.0579 | -2.70823 | 3 | -0.35 |
| -2.51252 | -2.52236 | 2 | 0.0098 |
| -2.60388 | -2.36278 | 2 | -0.241 |
| -2.5635 | -2.54631 | 2 | -0.017 |
| -3.1192 | -2.82523 | 3 | -0.294 |
| -2.90629 | -2.79928 | 2 | -0.107 |
| -2.98854 | -2.58961 | 1 | -0.399 |
| -3.07648 | -2.55902 | 3 | -0.517 |
| -3.09666 | -2.73125 | 2 | -0.365 |
| -2.77892 | -2.54189 | 2 | -0.237 |
| -3.18293 | -2.75794 | 3 | -0.425 |
| -2.29004 | -2.62234 | 3 | 0.3323 |
| -2.62299 | -2.36626 | 2 | -0.257 |
| -2.82561 | -3.01902 | 3 | 0.1934 |
| -2.90146 | -2.30125 | 3 | -0.6 |
| -1.55856 | -3.01099 | 4 | 1.4524 |
| -3.10969 | -2.85991 | 3 | -0.25 |
表15-4
| -1.74497 | -3.05369 | 5 | 1.3087 |
| -3.11252 | -2.44418 | 2 | -0.668 |
| -3.01931 | -2.68253 | 4 | -0.337 |
| -2.88266 | -2.51429 | 3 | -0.368 |
| -2.95753 | -2.45588 | 4 | -0.502 |
| -2.84484 | -2.61565 | 2 | -0.229 |
| -2.49128 | -2.45287 | 2 | -0.038 |
| -1.93265 | -1.92646 | 3 | -0.006 |
| -2.30614 | -2.26629 | 3 | -0.04 |
| -2.92632 | -2.74299 | 3 | -0.183 |
| -3.1022 | -2.8651 | 3 | -0.237 |
| -2.53484 | -2.87738 | 3 | 0.3425 |
| -2.23569 | -2.98626 | 4 | 0.7506 |
| -2.88916 | -2.94229 | 9 | 0.0531 |
| -1.52217 | -3.21019 | 7 | 1.688 |
| -2.69787 | -2.78428 | 4 | 0.0864 |
| -1.55043 | -3.23491 | 6 | 1.6845 |
| -1.54407 | -3.15384 | 10 | 1.6098 |
| -2.78018 | -2.85494 | 4 | 0.0748 |
| -1.75262 | -3.03157 | 11 | 1.279 |
| -3.0007 | -2.75612 | 2 | -0.245 |
| -1.38995 | -3.21445 | 7 | 1.8245 |
| -1.33089 | -3.17929 | 6 | 1.8484 |
| -2.66298 | -2.9425 | 4 | 0.2795 |
| -2.09079 | -3.01419 | 6 | 0.9234 |
| -1.92008 | -3.18087 | 5 | 1.2608 |
| -1.62702 | -3.13566 | 9 | 1.5086 |
| -1.88114 | -3.24502 | 4 | 1.3639 |
| -2.73804 | -2.79818 | 6 | 0.0601 |
| -2.85521 | -2.96281 | 4 | 0.1076 |
| -1.50198 | -3.05984 | 7 | 1.5579 |
| -3.11181 | -3.05561 | 3 | -0.056 |
| -2.56168 | -2.31301 | 3 | -0.249 |
| -2.37802 | -2.29161 | 3 | -0.086 |
| -2.51559 | -2.43086 | 2 | -0.085 |
| -2.40015 | -2.23606 | 3 | -0.164 |
| -2.96823 | -2.71291 | 4 | -0.255 |
| -1.38574 | -2.93776 | 9 | 1.552 |
| -1.93934 | -3.11132 | 4 | 1.172 |
| -2.6136 | -3.33697 | 7 | 0.7234 |
| -2.17112 | -3.07174 | 4 | 0.9006 |
| -1.69448 | -2.79605 | 7 | 1.1016 |
| -1.80235 | -3.04831 | 4 | 1.246 |
| -1.03217 | -3.09124 | 6 | 2.0591 |
| -3.17378 | -2.81264 | 4 | -0.361 |
| -1.62173 | -2.98534 | 6 | 1.3636 |
| -2.97682 | -2.80163 | 4 | -0.175 |
| -1.95763 | -3.30036 | 7 | 1.3427 |
| -1.70783 | -3.00866 | 5 | 1.3008 |
| -1.3977 | -3.13119 | 7 | 1.7335 |
表15-5
| -2.31049 | -2.741 | 4 | 0.4305 |
| -1.39734 | -3.02262 | 6 | 1.6253 |
| -1.56521 | -3.00479 | 4 | 1.4396 |
| -1.40091 | -3.1692 | 11 | 1.7683 |
| -2.99819 | -2.77954 | 4 | -0.219 |
| -3.04912 | -2.85876 | 6 | -0.19 |
| -2.18025 | -2.94096 | 5 | 0.7607 |
| -1.42823 | -3.0238 | 9 | 1.5956 |
| -2.55502 | -2.38668 | 2 | -0.168 |
| -2.37639 | -2.53834 | 3 | 0.162 |
| -2.91531 | -2.85716 | 3 | -0.058 |
| -2.28695 | -3.13837 | 5 | 0.8514 |
| -2.91669 | -2.79558 | 3 | -0.121 |
| -2.95203 | -2.94623 | 2 | -0.006 |
| -2.98078 | -2.77888 | 3 | -0.202 |
| -3.05693 | -2.72108 | 2 | -0.336 |
| -2.95936 | -2.90014 | 4 | -0.059 |
| -2.89294 | -2.65514 | 3 | -0.238 |
| -2.99949 | -2.60494 | 2 | -0.395 |
| -2.62822 | -2.65248 | 3 | 0.0243 |
| -2.67253 | -2.63783 | 2 | -0.035 |
| -3.06522 | -2.51848 | 4 | -0.547 |
| -2.85541 | -2.71419 | 2 | -0.141 |
| -2.79269 | -2.63886 | 3 | -0.154 |
| -2.97369 | -2.69696 | 3 | -0.277 |
| -2.63062 | -2.59346 | 3 | -0.037 |
| -3.08003 | -2.75807 | 2 | -0.322 |
| -3.14048 | -2.89029 | 3 | -0.25 |
| -3.12796 | -2.67981 | 2 | -0.448 |
| -2.75991 | -2.62619 | 2 | -0.134 |
| -2.83907 | -2.70043 | 4 | -0.139 |
| -2.79717 | -2.58412 | 2 | -0.213 |
| -2.88845 | -2.73347 | 2 | -0.155 |
| -2.99859 | -2.88185 | 3 | -0.117 |
| -2.95209 | -2.59232 | 3 | -0.36 |
| -2.90339 | -2.78669 | 3 | -0.117 |
| -3.07107 | -3.01945 | 2 | -0.052 |
| -3.18989 | -2.61681 | 3 | -0.573 |
| -2.82469 | -2.98091 | 2 | 0.1562 |
| -3.03747 | -2.63461 | 2 | -0.403 |
| -3.17074 | -2.66961 | 2 | -0.501 |
| -2.56325 | -3.14549 | 3 | 0.5822 |
| -3.206 | -2.78731 | 2 | -0.419 |
| -3.05206 | -2.75452 | 2 | -0.298 |
| -3.139 | -2.79872 | 3 | -0.34 |
| -2.87429 | -2.91526 | 2 | 0.041 |
| -2.77786 | -2.91134 | 3 | 0.1335 |
| -2.86878 | -2.74124 | 3 | -0.128 |
| -3.11152 | -3.00032 | 2 | -0.111 |
| -2.83556 | -2.73102 | 3 | -0.105 |
表15-6
| -3.06834 | -2.7368 | 2 | -0.332 |
| -3.00759 | -2.67558 | 3 | -0.332 |
| -3.0015 | -2.60423 | 2 | -0.397 |
| -2.48119 | -2.88136 | 4 | 0.4002 |
| -2.99187 | -2.82763 | 3 | -0.164 |
| -2.91916 | -2.65907 | 2 | -0.26 |
| -3.06773 | -2.67588 | 2 | -0.392 |
| -2.83883 | -2.50211 | 3 | -0.337 |
| -3.01495 | -2.70258 | 3 | -0.312 |
| -2.67618 | -2.68039 | 3 | 0.0042 |
| -2.94842 | -2.6725 | 3 | -0.276 |
| -2.85091 | -2.64894 | 3 | -0.202 |
| -2.876 | -2.57074 | 3 | -0.305 |
| -3.09099 | -2.97411 | 2 | -0.117 |
| -3.12464 | -2.82697 | 4 | -0.298 |
| -2.75244 | -2.61944 | 2 | -0.133 |
| -2.98928 | -2.78854 | 2 | -0.201 |
| -3.12691 | -2.96833 | 3 | -0.159 |
| -2.79091 | -2.81374 | 2 | 0.0228 |
| -2.8707 | -2.7613 | 2 | -0.109 |
| -2.09971 | -2.83773 | 5 | 0.738 |
| -1.73823 | -3.23771 | 6 | 1.4995 |
| -1.71119 | -2.79827 | 4 | 1.0871 |
| -1.36962 | -3.09606 | 6 | 1.7264 |
| -2.99846 | -3.08676 | 4 | 0.0883 |
| -2.88005 | -3.07857 | 6 | 0.1985 |
| -3.16335 | -2.82608 | 4 | -0.337 |
| -1.9489 | -3.11594 | 6 | 1.167 |
| -2.40442 | -2.59622 | 4 | 0.1918 |
| -2.30992 | -3.06421 | 9 | 0.7543 |
| -1.63638 | -3.19198 | 4 | 1.5556 |
| -1.59255 | -3.05101 | 8 | 1.4585 |
| -3.04974 | -2.61031 | 2 | -0.439 |
| -2.56818 | -3.20144 | 5 | 0.6333 |
| -2.9884 | -2.81402 | 3 | -0.174 |
| -1.75537 | -3.08338 | 5 | 1.328 |
| -2.69499 | -2.9355 | 3 | 0.2405 |
| -2.52748 | -2.5124 | 4 | -0.015 |
| -2.49189 | -2.99176 | 5 | 0.4999 |
| -2.33864 | -2.80545 | 7 | 0.4668 |
| -1.65611 | -3.25413 | 2 | 1.598 |
| -1.67834 | -3.11246 | 6 | 1.4341 |
| -2.50223 | -2.95617 | 2 | 0.4539 |
| -1.87825 | -3.00886 | 6 | 1.1306 |
| -2.72511 | -2.54465 | 5 | -0.18 |
| -2.64227 | -2.81457 | 7 | 0.1723 |
| -3.17591 | -2.65342 | 4 | -0.522 |
| -2.36493 | -2.7181 | 7 | 0.3532 |
| -2.54643 | -2.936 | 4 | 0.3896 |
| -2.47714 | -2.39077 | 5 | -0.086 |
表15-7
| -2.96085 | -2.64602 | 4 | -0.315 |
| -2.96448 | -2.7951 | 6 | -0.169 |
| -2.81977 | -2.57271 | 2 | -0.247 |
| -2.8757 | -2.66374 | 3 | -0.212 |
| -1.64476 | -2.79419 | 4 | 1.1494 |
| -1.61521 | -2.92719 | 2 | 1.312 |
| -1.65071 | -3.05397 | 6 | 1.4033 |
| -1.44279 | -3.01932 | 9 | 1.5765 |
| -1.66116 | -3.04903 | 3 | 1.3879 |
| -1.67138 | -2.90231 | 9 | 1.2309 |
| -1.64294 | -3.19588 | 8 | 1.5529 |
| -1.86769 | -3.23059 | 7 | 1.3629 |
| -2.05321 | -2.90902 | 4 | 0.8558 |
| -1.99502 | -3.23821 | 7 | 1.2432 |
| -1.40419 | -3.23032 | 5 | 1.8261 |
| -1.14982 | -3.1628 | 9 | 2.013 |
| -3.09693 | -2.67017 | 4 | -0.427 |
| -1.79096 | -3.07276 | 7 | 1.2818 |
| -3.04563 | -2.81047 | 2 | -0.235 |
| -2.05409 | -2.80733 | 4 | 0.7532 |
| -2.27716 | -3.1028 | 6 | 0.8256 |
| -3.14541 | -2.55656 | 4 | -0.589 |
| -3.00901 | -2.49424 | 5 | -0.515 |
| -1.61182 | -2.82829 | 9 | 1.2165 |
| -1.59034 | -3.35001 | 12 | 1.7597 |
| -1.60409 | -2.93721 | 5 | 1.3331 |
| -1.7829 | -2.9896 | 8 | 1.2067 |
| -1.21329 | -3.07967 | 4 | 1.8664 |
| -1.22205 | -3.04508 | 6 | 1.823 |
| -1.74695 | -3.11769 | 3 | 1.3707 |
| -1.71419 | -3.14869 | 3 | 1.4345 |
将纵轴表示平衡指标、横轴表示牙周袋深度(Pd)的散点图示于图17。图17所示的数据中，由牙周袋深度1～3mm和牙周袋深度5mm以上的数据制作判断模型，将牙周袋深度4mm的数据作为测试数据来判定非疾病状态/疾病状态。
图17所示的数据中，对于牙周袋深度1～3mm和牙周袋深度5mm以上的数据制作直方图(图18)。图18的纵轴为将图17的平衡指标进行LOG10转换而得到的数值。横轴为频率。
以图18的数据为基础进行ROC分析(图19)，将接近左上方的点(平衡指标(LOG10)＝0.3182)作为截止值。在该情况下，通过相同的分析，可知为以灵敏度0.877、特异度0.884进行判定的检查。
接着，使用该检查，进行了牙周袋深度(Pd)为4mm的数据的判定。4mm的数据是图17的袋的深度4mm的数据，存在60人的数据。以截止值0.3182对这些数据进行判定时，31名为比截止值大的平衡指标值。可以判断这些病例的牙周病的状态进行到与牙周袋5mm以上的疾病状态相同的程度。
序列表自由文本
序列号1～91：合成DNA
序列表
<110> 三菱化学株式会社(Mitsubishi Chemical Corporation)
<120> 利用与临床指标具有相关性的细菌群的信息的口腔内检查方法
<130> G1908WO
<150> JP2017-212488
<151> 2017-11-02
<160> 91
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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<400> 10
ccagtactct agttacaca 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 11
tttctttctt cccaactgaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 12
tacattccga aaaacgtcat 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 13
tatgcagttt ccaacgcaa 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 14
gggtaaatgc aaaaaggca 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 15
ctttattccc acataaaagc 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 16
aagtaccgtc actgtgtg 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 17
gtcaatttgg catgctatta 20
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 18
cccaagcagt tctatggt 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 19
tacacgtaca ccttattctt 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 20
caaccattca agaccaaca 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 21
tacacgtaca ccttattctt 20
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 22
ctctagctat ccagttcag 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 23
cacccgttct tctcttaca 19
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 24
cacccgttct tctcttac 18
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 25
acagtatgaa ctttccattc t 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 26
cagtatgaac tttccattct 20
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 27
tctcccctct tgcactca 18
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 28
tcccctcttg cactcaagt 19
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 29
aagtcagccc gtaccca 17
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 30
tattcgcaag aaggcctt 18
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 31
ccacccacaa ggagcag 17
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 32
ttcgcattag gcacgttc 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 33
cacacgttct tgacttac 18
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 34
cgtattaccg cggctgctgg cac 23
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 35
ctattcgacc agcgatatca ctacgtaggc 30
<210> 36
<211> 488
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 36
gtgagaagcc tacacaaacg taacgtcagg gctaagacaa acgctaacgg tacaccctag 60
atgggagctt gtagctagat cgctaagtcc taccgacatg taggcatact cacgaaggca 120
attccctgaa agcctcgtct tatcccgaac ttggcatctg ctgatacgtc aggttgaacg 180
cgtacattta cctgtcatgc gtgggccttc tccgaatagc ctacgtagtg atatcgctgg 240
tcgaataggc ggattgctca taaatgcaca ttggctaagg cccacggaac acgaatcacg 300
tgagatcact tactattcga cggaactact atacgcaccg ggacatgcaa gtagcgtccc 360
acaagcataa ggaactctat actcgccatc tacgcagcta caggggatac acgtatgagc 420
ggttacgaag taaagccgag atagagcggt ctttagagaa aaaacaggat tagataccct 480
ggtagtcc 488
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 37
tcctacggga ggcagcagt 19
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 38
cagggtatct aatcctgttt gctacc 26
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 39
gagaagccta cacaaacgta acgtc 25
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 40
ctctaaagac cgctctatct cgg 23
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 41
tcctacggga ggcagcagt 19
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 42
tcctacggga ggcagcag 18
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 43
tcctacggga ggcagca 17
<210> 44
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 44
tcctacggga ggcagc 16
<210> 45
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 45
cctacgggag gcagc 15
<210> 46
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 46
ctacgggagg cagcag 16
<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 47
tacgggaggc agcag 15
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 48
ggactaccag ggtatctaat cctgtt 26
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 49
cagggtatct aatcctgttt gctacc 26
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 50
cagggtatct aatcctgtty g 21
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 51
cagggtatct aatcctgtt 19
<210> 52
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 52
gggtatctaa tccygtt 17
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 53
crgggtatct aatccygtt 19
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 54
cctacgctta cttaaccacc ta 22
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 55
gtgcttaatg aggttaagcc 20
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 56
cccctactac agagttttac ga 22
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 57
tacacacgtt cttcccctac 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 58
acacgtgact cttgttattc 20
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 59
cgtcaaatcc tcgcactatt c 21
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 60
agttaacgtc aatcacctag 20
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 61
ttcccaacta aaagcagttt a 21
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 62
ctggtaagtt accgtcac 18
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 63
gcgcttcata acccggctac 20
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 64
cacgtgcatc aaattattct cg 22
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 65
cctactttca gcgcactcaa 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 66
cacgtgactg actttatccc 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 67
ccaacaattt aaccacttac 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 68
aatagggaca cgtccctaac 20
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 69
gtaccgtcac ccaaactcaa ta 22
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 70
acccactgca aaaccagggt 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 71
tctcttcttc cctgctaaca 20
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 72
accgtcaatt cctctaacta tt 22
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 73
accaccgact tgaaggacca 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 74
agtcagacgt tgggcgccta 20
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 75
tacatgcatc tcagctacac gt 22
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 76
cacactcgtt cttgacttac 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 77
aaaaagcagt gccttgttcc 20
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 78
gtcgattacc gtcatcagat g 21
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 79
ttcctccaaa acttattcct 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 80
ccgtctctac tgtatatagt 20
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 81
ggtacattca ctatggtaca cg 22
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 82
tcttaacaaa ggtaccgtca cc 22
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 83
ccctaggaca gaggcttaca 20
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 84
agctgtcgat attagcaaca g 21
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 85
gtcaaggcgc taacagttac 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 86
aaaccctgcg cttaaggtgc 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 87
taaccacaag attattcgtc 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 88
acgtgggctc ttttatcccc 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 89
cgtcattcgt cttctgccaa 20
<210> 90
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 90
tacgggaggc agcag 15
<210> 91
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 91
crgggtatct aatccygtt 19
Claims (8)
1.口腔内细菌检测用寡核苷酸探针在判定牙周病的状态的DNA芯片的制造中的用途，其中，
使所述口腔内细菌检测用寡核苷酸探针与口腔内试样中存在的口腔内细菌群来源的核酸进行杂交，测定信号强度，根据该信号强度的测定值计算出所述细菌群的存在比例，将得到的计算值作为指标来判定牙周病的状态，
细菌群的存在比例是随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类的细菌量与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的细菌量的相关关系，
细菌种类满足以下(a)～(c)中的任意条件：
(a)随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类包含牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、纤细弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种、牙周梭杆菌、中间普雷沃氏菌、星群链球菌、伴放线菌团聚杆菌、以及啮蚀艾肯氏菌，随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类包含变黑普雷沃氏菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、缓症链球菌bv 2、龋齿放线菌、小韦荣氏球菌、内氏放线菌II、以及有害月形单胞菌；
(b)随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类包含具核梭杆菌动物亚种及具核梭杆菌具核亚种，随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类包含变黑普雷沃氏菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、缓症链球菌bv 2、龋齿放线菌、小韦荣氏球菌、内氏放线菌II、以及有害月形单胞菌；或者
(c)随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类包含牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、直肠弯曲杆菌、具核梭杆菌具核亚种、以及中间普雷沃氏菌，随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类包含牙龈二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、以及小韦荣氏球菌。
2.口腔内细菌检测用寡核苷酸探针在判定牙周病的状态的DNA芯片的制造中的用途，其中，
使所述口腔内细菌检测用寡核苷酸探针与口腔内试样中存在的口腔内细菌群来源的核酸进行杂交，测定信号强度，根据该信号强度的测定值计算出所述细菌群的存在比例，将得到的计算值作为指标来判定牙周病的状态，
细菌群的存在比例是随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类的细菌量与随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的细菌量的相关关系，
随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类包含龈沟产线菌、牙髓卟啉单胞菌、缠结真杆菌、隐藏真杆菌、中间密螺旋体及生痰月形单胞菌，
随牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类包含栖牙普雷沃氏菌、产黑色素普雷沃氏菌、溶血孪生球菌、沟迹真杆菌、马氏棒杆菌、胶胨罗斯氏菌、卡托氏卟啉单胞菌、莫氏细小杆菌、变黄奈瑟氏球菌、洛氏普雷沃氏菌、小核桃形巨球形菌、葛氏放线菌、非典型韦荣氏球菌、苍白普雷沃氏菌、夏氏普雷沃氏菌、巴斯德卟啉单胞菌、罗氏韦荣氏球菌、拟普雷沃氏菌属(A.rava,OT 308)、龋齿罗斯氏菌、邻接短链小球菌、唾液链球菌、副流感嗜血杆菌及副血链球菌。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，通过对得到的计算值与细菌群的存在比例的截止值进行比较来判定牙周病的状态。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述细菌群的存在比例是随牙周袋的数值的增大而增加的细菌种类的细菌量与伴牙周袋的数值的增大而减少的细菌种类的细菌量之比。
5.根据权利要求3所述的用途，其中，所述截止值是基于ROC曲线而确定的，所述ROC曲线是根据基准制定用口腔内试样中存在的口腔内细菌群来源的核酸的信号强度的测定值计算出所述细菌群的存在比例、并由该计算值绘制的。
6.根据权利要求1所述的用途，其中，随牙周袋的数值的增大而增加的菌种进一步包含选自牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、纤细弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、牙周梭杆菌、中间普雷沃氏菌、星群链球菌、伴放线菌团聚杆菌、啮蚀艾肯氏菌、龈沟产线菌、牙髓卟啉单胞菌、缠结真杆菌、隐藏真杆菌、中间密螺旋体及生痰月形单胞菌中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的用途，其中，随牙周袋的数值的增大而减少的菌种包含选自变黑普雷沃氏菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、缓症链球菌bv 2、龋齿放线菌、小韦荣氏球菌、内氏放线菌II、有害月形单胞菌、栖牙普雷沃氏菌、产黑色素普雷沃氏菌、溶血孪生球菌、沟迹真杆菌、马氏棒杆菌、胶胨罗斯氏菌、牙龈卟啉单胞菌、莫氏细小杆菌、变黄奈瑟氏球菌、洛氏普雷沃氏菌、小核桃形巨球形菌、葛氏放线菌、非典型韦荣氏球菌、苍白普雷沃氏菌、夏氏普雷沃氏菌、巴斯德卟啉单胞菌、罗氏韦荣氏球菌、拟普雷沃氏菌属(A.rava,OT 308)、龋齿罗斯氏菌、邻接短链小球菌、唾液链球菌、副流感嗜血杆菌及副血链球菌中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的用途，其中，具核梭杆菌菌种包含选自具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种及具核梭杆菌具核亚种中的至少一种。
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