JP2017085944A - イヌの歯周病の評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、簡便にかつ正確に、イヌの歯周病の罹患又はリスクの評価診断を行う方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、被験犬から採取された唾液検体中の微生物叢を構成する菌種数を測定し、菌種数が少ない場合に被験犬は歯周病に罹患している可能性が高いと評価することを含む、犬の歯周病罹患の評価方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、イヌの歯周病の評価方法に関する。

イヌの歯周病発症の機序は、歯面に付着した歯垢中で歯周病原因細菌が増殖し、それが歯肉に炎症を起こし、重度になると歯周組織を破壊する、というものである。イヌの歯周病（歯肉炎及び歯周炎）の臨床診断は、歯周病発症の機序に沿ってなされ、主に、歯肉や歯面に付着する歯垢歯石、歯周組織に対する肉眼所見や触診による判断方法が用いられている。具体的には、歯肉の炎症程度、歯垢歯石の付着程度、歯の動揺度等が指標として活用されている（非特許文献１を参照）。

しかしながらこのような従来の診断手法は視診触診によるため、早期診断、発症の予測には限界がある。近年、イヌとヒトとの関係性に関する科学的解明が進んでおり（非特許文献２を参照）、イヌが単なるペットではなくヒトの伴侶として認識されつつある現在においては、その健康寿命を伸長すべく予防や早期診断治療への期待も大きい。そのため、発症前あるいは超早期の歯周病を発見することが重要な課題となっている。

近時、宿主である動物（ヒト、伴侶動物、産業動物等）と、その共生者である口腔内及び腸内に棲息する微生物叢との共生関係に注目が集まっている。共生関係のうち特徴的な点は、共生者が宿主の生理的機序を補完する点（特に免疫機序を補完する点）、及び、共生者の種類及び数が宿主の健康状態を反映して変動する点である。いわば、宿主と共生者が一つの生命体であるかのようにふるまっているのである。すなわち、動物の口腔内や腸内には、数百種の微生物からなりかつ多様な組成比を有する微生物叢（マイクロバイオーム）が存在するが、腸管免疫の発達には健常個体が持つ菌種及び組成比の細菌叢が必要であると推測されている。そして、微生物叢の菌種や構成比が宿主の生理的変化（特に免疫系の変化）、ひいては特定症状の発症に対し特徴的な変化をすることがわかってきた。

そこで、口腔内や腸内の微生物叢の動態を、ヒトの様々な疾患の診断指標とする試みが行われている（特許文献１及び２を参照）。従来は、培養可能な菌種を培地の選択や組み合わせにより特定するか、又はデータベースに登録されているその菌種の塩基配列と照合して特定するしかなかった。しかし近年の大規模シークエンス技術とＤＮＡデータベースの拡充により、未分類の菌種も含めた微生物叢について、網羅的に、しかも安価かつ迅速にＤＮＡ解析が可能となり、ひいては微生物叢の網羅的な動態解析が行えるようになった。

微生物叢の動態を様々な疾患の診断指標にする試みは、イヌでも行われつつある（非特許文献３を参照）。口腔内細菌叢を指標にした診断手法の調査研究としては、例えば、イヌの歯垢を指標として歯垢細菌叢と歯周病のステージとの対応関係を調査した報告等がある（非特許文献４及び５を参照）。

特開２０１１−１９３８１０号公報 特開２０１３−１８３６６３号公報

臨床のための小動物歯科；著者：藤田 桂一（フジタ動物病院）、出版：インターズー、１８４頁、発行年月日：２００８年１１月１９日、ＩＳＢＮ：９７８−４８９９９５−４８４−２ Ｏｘｙｔｏｃｉｎ−ｇａｚｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｌｏｏｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ−ｄｏｇ ｂｏｎｄｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ １７ Ａｐｒｉｌ ２０１５：Ｖｏｌ．３４８ｎｏ．６２３２ ｐｐ．３３３−３３６ １６Ｓ ｒＲＮＡ Ｇｅｎｅ Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｕｏｄｅｎｕｍ ｏｆ Ｄｏｇｓ ｗｉｔｈ Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（６）：ｅ３９３３３.ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３９３３３．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｊｕｎ １５． Ａ Ｃｒｏｓｓ−Ｓｅｃｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｐｌａｑｕｅ ｆｒｏｍ Ｃｌｉｅｎｔ Ｏｗｎｅｄ Ｄｏｇｓ ｗｉｔｈ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｇｉｎｇｉｖａ，Ｇｉｎｇｉｖｉｔｉｓ ｏｒ Ｍｉｌｄ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ；ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ｄｅｃ １３；８（１２）：ｅ８３１５８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８３１５８．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１３． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｎｉｎｅ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｄｉｓｅａｓｅ；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖｅｔｍｉｃ．２０１１．０３．００１

非特許文献４及び５に記載の報告は、いずれも歯周病の原因菌を想定し、あるいは発症機序に着目するために、歯垢や歯肉縁から採取したサンプルの細菌叢と歯周病の病態との相関関係に関するものである。しかし、歯垢は細菌の凝集塊であり、嫌気性が高いなど、唾液とは環境が異なり、棲息する菌種や菌叢構造が歯垢と唾液で異なる可能性が高い。歯肉縁から採取するスワブについても同様の傾向と推測される。またイヌの歯垢を指標として歯周病を診断する方法では、被験者（イヌ）を麻酔したうえで歯垢を採取する必要があり、被験者に負担を与えるため、簡便な方法が求められていた。

ヒトにおいて唾液や歯垢の細菌叢と歯周病との相関が認められるとしても、イヌの口腔内は弱アルカリ性であり齲歯が発生しにくいと言われているなど、イヌとヒトとでは口腔内の環境（菌種や菌叢構造）が大きく異なる。

本発明は、簡便にかつ正確に、イヌの歯周病の罹患又はリスクの評価を行う方法を提供することを目的とする。

本発明者らは下記の〔１〕〜〔１３〕を提供する。
〔１〕被験犬から採取された唾液検体中のＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属及びＦｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物からなる群より選ばれる少なくとも一種を定量すること、
得られた量と、健常犬から採取された唾液検体中の前記群より選ばれる少なくとも一種の量とを比較すること、及び、
Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びＴｉｓｓｉｅｒｅｌｌａ属微生物のうち少なくとも一種の量が健常犬より少ない場合および／またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属及びＦｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物から選ばれる少なくとも一種の量が健常犬より多い場合には被験犬が歯周病に罹患していると評価すること
を含むイヌの歯周病の評価方法。
〔２〕被験犬から採取された唾液検体中のＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する微生物および／またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する微生物のいずれかの微生物又はその一部を定量すること、
得られた量と、健常犬から採取された唾液検体中の前記群より選ばれる少なくとも一種の量とを比較すること、及び、
Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する微生物の量が健常犬より多い場合および／またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する微生物の量が健常犬より少ない場合には被験犬が歯周病に罹患している可能性が高いと評価すること、
を含むイヌの歯周病の評価方法。
〔３〕定量は、各微生物の遺伝子量の定量により行う、〔１〕又は〔２〕に記載の評価方法。
〔４〕遺伝子量は、リボソームＲＮＡ遺伝子量である、〔３〕に記載の評価方法。
〔５〕被験犬から採取された唾液検体中の微生物叢を構成する菌種数を測定し、菌種数が少ない場合に被験犬は歯周病に罹患している可能性が高いと評価することを含む、犬の歯周病罹患の評価方法。
〔６〕菌種数の測定は、各微生物の遺伝子解析により行う、〔５〕に記載の評価方法。
〔７〕菌種数はｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔにより決定する、〔５〕又は〔６〕に記載の評価方法。
〔８〕健常群に属するサンプル同士の菌叢構造と、健常群と被験犬のサンプルの菌叢構造との間に差が認められる場合に、被験犬は歯周病に罹患している可能性が高いと評価することを含む、犬の歯周病罹患の評価方法。
〔９〕菌叢構造の解析は、ＵｎｉＦｒａｃ分析により行う〔８〕に記載の評価方法。
〔１０〕菌叢の構成は、各微生物の遺伝子解析により行う、〔８〕又は〔９〕に記載の評価方法。
〔１１〕Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属およびＦｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子配列を増幅するプライマー、又は該遺伝子配列の少なくとも一部と結合するプローブを含む、犬の歯周病罹患評価用キット。
〔１２〕Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する微生物および／またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する微生物の遺伝子配列の一部を含むプライマー、又は、該遺伝子配列の少なくとも一部と結合するプローブを含む、犬の歯周病罹患評価用キット。
〔１３〕遺伝子配列は、ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である、〔１１〕又は〔１２〕に記載のキット。

本発明によれば、イヌから唾液を採取することにより簡便に歯周病を判定することができ、被験犬の歯周病の罹患可能性を判断するのに好適である。すなわち、獣医臨床においては、ヒトと異なり、動物の口を簡単に開閉させることはできない。一般的に、歯石除去等の場合には、全身麻酔を行い、その上でスケーリング等の処置を行う。全身麻酔は、近時安全度が高くなってはいるものの副作用のリスクがゼロではないため、飼主が希望しない場合、あるいは健常と判断する被験動物については全身麻酔を行うことはできず、また動物の開口は必ずしも容易ではないため、１歯ずつ正確に歯周病の有無を確認することは困難であるのが現状である。それゆえ、唾液により、いずれかの歯に歯周病の存在が確認できれば、飼主へ処置の必要性を訴求しやすく、また、保定を行った上での全歯の確認、あるいは全身麻酔を用いた全歯確認を行いやすくなる。この点は、唾液を採取するだけで歯周病の有無を判定しうる手法の利点である。これに対して、歯垢を用いて歯周病を判断する場合、基本的に１歯ずつ判断しなければならない。成犬であれば、合計４２本の歯がある。また、本発明によれば、被験犬の歯周病に罹患可能性を評価できるので、予防医学的な利用も可能である。さらに、治療処置または投薬を進めると共に本発明の判定方法を実施することにより、治療処置又は医薬の評価判定を行うこともできる。

図１は、各検体のＯＴＵ数を示すグラフである。 図２は、健常群及び罹患群のＯＴＵ数を示すグラフである。 図３は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する菌数の群間比較を示すグラフである。 図４は、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する菌数の群間比較を示すグラフである。 図５は、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図６は、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図７は、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図８は、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図９は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図１０は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図１１は、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図１２は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図１３は、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図１４は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図１５は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図１６は、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図１７は、Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａ属微生物数の群間比較を示すグラフである。 図１８は、Ｕｎｉｆｒａｃ解析（Ｗｅｉｇｈｔｅｄ）における主座標分析図である。図１８中のパーセントバリエーション１４．７％、２５．１％は、それぞれの固有値における寄与率を表す。 図１９は、Ｕｎｉｆｒａｃ解析（Ｗｅｉｇｈｔｅｄ）におけるＵｎｉｆｒａｃ ｄｉｓｔａｎｃｅの群間比較を示すグラフである。 図２０は、Ｕｎｉｆｒａｃ解析（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ）における主座標分析図である。図２０中のパーセントバリエーション１４．７％、２５．１％は、それぞれの固有値における寄与率を表す。 図２１は、Ｕｎｉｆｒａｃ解析（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ）におけるＵｎｉｆｒａｃ ｄｉｓｔａｎｃｅの群間比較を示すグラフである。

本発明の判定方法においては、被験犬から採取された唾液検体に含まれる微生物の量、種類、及び微生物叢の組成から選ばれる少なくとも１つから、歯周病罹患の可能性を判定する。

被験犬は、イヌであればよく、年齢、健康状態、性別等の身体条件は特に限定されない。犬種も限定されないが、トイプードル、スタンダードプードル、パグであることが好ましく、トイプードルであることがより好ましい。

唾液検体は、非刺激唾液と刺激唾液とがあり、どちらでもよい。刺激唾液は、パラフィンガムを咀嚼することにより容易に採取することができる。唾液を用いることにより、定期的な歯の健康状態を把握することが容易となり、歯周病の罹患率低下、早期発見、健康維持につなげることができるので好ましい。なお、歯垢及びスワブが含まれていてもよいが、歯垢は細菌等の微生物の凝集塊であり、スワブ（歯肉縁から採取されることが多い）も唾液とは環境が異なる可能性が高いことから、判定前に唾液検体から除かれることが好ましい。

唾液検体の採取方法としては、例えば、綿棒を犬の口に挿入して唾液を吸収させることが挙げられる。

採取後すぐに利用しない場合には、低温（例えば、約４℃）で冷蔵保存することができる。なお、上述のように唾液の採取に綿棒を用いる場合、綿棒をそのまま適宜滅菌チューブ等の容器に入れて保存してもよい。

被験犬から採取された唾液検体に含まれる微生物としては、門レベルの例としては、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する微生物および／またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する微生物が挙げられる。また、属レベルの例としては、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａ属微生物が挙げられる。

唾液検体中の微生物の定量は、各微生物の遺伝子により行うことができる。遺伝子としては、通常は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子を用いる。ｒＲＮＡとしては、１６ＳｒＲＮＡ、５ＳｒＲＮＡ、２６ＳｒＲＮＡなどが挙げられる。ｒＲＮＡはリボソームの小サブユニットであるが、このリボソームはタンパク質合成という生命維持に不可欠な器官であるため、進化による変異が生じにくい。そのため、ｒＲＮＡをコードする遺伝子によって、生物を種という分類レベルで正確に比較することが可能であると考えられている。本発明で行い得るような微生物の系統樹解析においては、通常は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が用いられる。

唾液検体中の微生物の定量を１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を利用して行う場合、例えば、まず、唾液検体中の微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を抽出（ＤＮＡペレット）しＰＣＲにより増幅した後、ＤＮＡシークエンシングにより１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のマーカー部分の塩基配列を決定する。微生物ゲノムＤＮＡの抽出方法は特に限定されず、例えば、化学的な溶菌による方法、あるいは物理的に細胞壁を破砕する方法のいずれでもよい。化学的な溶菌を例にとると、溶媒（フェノール、クロロホルム等）、酵素（ＲＮａｓｅ、プロテイナーゼ）等を適宜組み合わせて行えばよい（後段の実施例にある溶菌酵素法）。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のマーカー部分の増幅は、例えば、ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等）、ＬＡＭＰ法、マイクロアレイ法などによることができるが、ＰＣＲ法に依ることが好ましく、ユニバーサルプライマー等を用いたＰＣＲによることがより好ましい。増幅後の断片（リード）は、必要に応じて、クオリティチェックを行い、高精度の選抜を行ってもよい。あるいは、健常個体と罹患個体の区別に利用しうる特定の属及び門に帰属する菌種について、リアルタイムＰＣＲを利用して微生物量の多い少ないを判定してもよい。

１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を利用した唾液検体中の微生物の定量は、１つの微生物に相当する１リードを出発点とし、そのリードの塩基配列の類似度に基づいてグルーピングされるＯＴＵ（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔ）により行うことができる。ＯＴＵは、微生物の分類上は“種”のレベルに相当し、ＯＴＵの代表配列とＤａｔａｂａｓｅ（Ｔｈｅ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）等）との照合によりいずれの菌種に帰属するのか判断できる。菌種帰属が判定できると、その上の分類である属や門への帰属も判定できる。なお、菌種によって、その保有する１６ＳｒＲＮＡのコピー数が異なるため、菌種同士の１６ＳｒＲＮＡ数の比が菌種の実際の組成比を反映するものとは限らない。よって、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を利用した唾液検体中の微生物の定量は、菌種の存在量の相対的な比を表現するものであり、例えば、その比が健常群と罹患群で異なるあるいは同等である等の評価に活用するものである。微生物の定量を行う際の検体中のリード数は、１０００個以上であることが好ましく、１５００個以上であることが好ましく、１８００個以上であることがより好ましい。

ＯＴＵの数は、微生物の種の数を表す。被験犬の唾液検体に由来する試料のＯＴＵ数が健常犬より少ない場合には、被験犬は歯周病に罹患している可能性が高い。また、被験犬に由来する検体のＯＴＵ数が好ましくは１３３以下であれば、被験犬は歯周病に罹患している可能性が高い。一方、被験犬に由来する検体のＯＴＵ数が好ましくは１４９以上であれば、被験犬は歯周病に罹患している可能性が低い。

本発明においては、被験犬由来の試料中のＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属及びＦｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物から選ばれる少なくとも一種の微生物の量を得て、これを、健常犬から採取された唾液検体中の前記属に属する微生物又はその一部の量と比較する。その結果、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びＴｉｓｓｉｅｒｅｌｌａ属微生物のうち少なくとも一種の量が健常犬より少ない場合には、被験犬が歯周病に罹患していると評価する。また、これらの微生物のうち少なくとも一種の量が健常犬と同等以上である場合には、被験犬が歯周病に罹患していると評価する。

一方、被験犬由来の試料中のＰｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属及びＦｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物から選ばれる少なくとも一種の量が健常犬より多い場合には被験犬が歯周病に罹患していると評価する。また、これらの微生物の量が健常犬と同等以下である場合には、被験犬が歯周病に罹患していると評価する。

Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属微生物としては例えば、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．ｃａｎｉｎｅ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ２９５、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．ｃａｎｉｎｅ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３２９が挙げられる。

Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属微生物としては例えば、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ ｓｔｅｅｄａｅが挙げられる。

Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属微生物としては例えば、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ ｔｒｅｈａｌｏｓｉが挙げられる。

Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属微生物としては例えば、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍが挙げられ、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍが好ましい。

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属微生物としては例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗｅａｖｅｒ、Ｎ
ｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｈａｙｅｇａｎｉｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃａｎｉｓが挙げられる。

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属微生物としては例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓが挙げられる。

Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属微生物としては例えば、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｃａｎｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｄａｇｍａｔｉｓが挙げられる。

Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属微生物としては、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖｉｃａｎｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｃａｎｉｎｅ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３４１、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃａｎｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃａｎｏｒｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＵＱＤ ４０６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＵＱＤ ４０２、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＵＱＤ ３４８、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＵＱＤ ４３４、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが挙げられる。

Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物としては例えば、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ｖｉｌｌｏｓｕｓｎ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓが挙げられる。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属微生物としては例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＥＯ２００１−０１が挙げられる。

Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属微生物としては例えば、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ ｃｒａｓｓａが挙げられる。

本発明においては、被験犬由来の試料中のＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する微生物および／またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する微生物のいずれかの微生物を定量する。その結果、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する微生物の量が健常犬より多い場合には被験犬が歯周病に罹患していると評価する。また、該微生物の量が健常犬と同等以下である場合には、被験犬が歯周病に罹患していると評価する。一方、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する微生物の量が健常犬より少ない場合には被験犬が歯周病に罹患していると評価する。また、これらの微生物の量が健常犬と同等以上である場合には、被験犬が歯周病に罹患していると評価する。

Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する微生物としては、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物（例は上述のとおり）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属微生物（例は上述のとおり）、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属微生物（例えば、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｎｉｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｐ４Ｐ＿３１ Ｐ３、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｃａｎｉｎｅ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ０４４）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属微生物（例えば、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｏｎｆｕｓａ）、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属微生物（例えば、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｓｐ．ｃａｎｉｎｅ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ０３５、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、Ｃａｔｏｎｅｌｌａ属微生物（例えば、Ｃａｔｏｎｅｌｌａ ｓｐ．ｃａｎｉｎｅ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １５８）、Ｇｅｍｅｌｌａ属微生物（例えば、Ｇｅｍｅｌｌａ ｐａｌａｔｉｃａｎｉｓ）、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属微生物（例えば、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物（例えば、［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ｙｕｒｉｉ）、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ属微生物（例えば、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ ｄｅｆｅｃｔｉｖａ）、Ｆｕｓｉｂａｃｔｅｒ属微生物（例えば、Ｆｕｓｉｂａｃｔｅｒ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属微生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．７＿３＿５４ＦＡＡ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｉｍｅｔａｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＢＮＬ１１００、［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ］ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ、［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ］ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ）、Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍｅｌｌａ属微生物（例えば、Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍｅｌｌａ ｂｏｖｉｓ）、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属微生物（例えば、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｓｐ．３＿２＿５６ＦＡＡ）、Ｐｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ属微生物（例えば、Ｐｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ ｓｐｈｅｎｉｓｃｉ）、Ｃａｔｏｎｅｌｌａ属微生物（例えば、Ｃａｔｏｎｅｌｌａ ｍｏｒｂｉ）、Ｐａｒａｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物（例えば、Ｐａｒａｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、Ｆｕｓｉｂａｃｔｅｒ属微生物（例えば、Ｆｕｓｉｂａｃｔｅｒ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、Ｐａｒａｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物（例えば、Ｐａｒａｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物（例えば、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｆ１）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ属微生物（例えば、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属微生物（例えば、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ属微生物（例えば、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｔｒａｎｓｖａａｌｅｎｓｉｓ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ属微生物（例えば、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｉｎｄｏｌｉｃｕｓ）が挙げられる。

Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する微生物としては、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属微生物（例は上述のとおり）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属微生物Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属微生物（例）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属微生物（例は上述のとおり）、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属微生物（例は上述のとおり）、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属微生物（例は上述のとおり）Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物（例えば、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｏｒａｌｅ）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属微生物（例えば、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐ．ｃａｎｉｎｅ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ０１８）、Ｏｔｔｏｗｉａ属微生物（例えば、Ｏｔｔｏｗｉａ ｔｈｉｏｏｘｙｄａｎｓ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属微生物（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｃｔｕｓ）、Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ属微生物（例えば、Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ ｂｕｔｚｌｅｒｉ）、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ属微生物（例えば、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｏｎｇｉｉｃｏｌａ）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属微生物（例えば、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ）、Ｌａｕｔｒｏｐｉａ属微生物（例えば、Ｌａｕｔｒｏｐｉａ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属微生物（例えば、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．ＳＦＣＤ１）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属微生物（例えば、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｎｏｎｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｉｎｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｗｏｆｆｉｉ）、Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓ属微生物（例えば、Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、Ｓｕｔｔｏｎｅｌｌａ属微生物（例えば、Ｓｕｔｔｏｎｅｌｌａ ｏｒｎｉｔｈｏｃｏｌａ）、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物（例えば、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｏｍｉｎｉｓ）が挙げられる。

一方、被験犬から採取された唾液検体中の微生物叢を構成する微生物の菌種間類似度を解析してもよい。被験犬の結果と健常犬のデータとの間の距離が大きければ類似性が低く、小さければ類似性が大きいと判断することができる。菌種間類似度は、ＵｎｉＦｒａｃ解析により数値化できるので、該方法を用いることが好ましい。Ｕｎｉｆｒａｃ解析は、例えば以下のように行う。総当たりでサンプル同士の系統樹解析を行い、サンプル同士で共有する枝の長さと各々のサンプルに固有の枝の長さの比をとる。この比は、サンプル同士の類似度が大きければ小さくなり（０に近づく）、類似度が小さければ大きくなる（１に近づく）。すなわち、仮に健常群に属するサンプル同士の距離が小さく、また罹患群に属するサンプル同士の距離が小さく、加えて健常と罹患のサンプル同士の距離が大きい場合、これら距離の平均値の差が統計学的に有意に大きいものであれば、これは健常群と罹患群の間の菌叢構造の違いを示すものとなる。よって、この比を算出することにより、サンプルの微生物叢同士の類似度を評価することができる。この比は、Ｕｎｉｆｒａｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ（群間類似距離）として表現され得る。ＵｎｉＦｒａｃ解析条件については、Ｌｏｚｕｐｏｎｅ Ｃ ａｎｄ Ｋｎｉｇｈｔ Ｒ：ＵｎｉＦｒａｃ：ａ ｎｅｗ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７１：８２２８−８２３５（２００５）に例示されている。

ＵｎｉＦｒａｃ解析は、菌種の数とその他の要因（組成比など）を考慮するＷｅｉｇｈｔｅｄ解析又は菌種の数のみで評価するＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄ解析によることができる。
ＵｎｉＦｒａｃ解析によって得られた群間類似距離に基づき、主座標分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＰＣｏＡ）を行うことができる。主座標分析によれば、各サンプルの菌叢構造の類似性を視覚化することができる。主座標分析で２次元散布図を作成すると、例えば、健常なイヌのデータ群は、そのＸ軸の負領域に布置し、他方、歯周病に罹患したイヌのデータ群は、Ｘ軸上の正領域に分布するといったように、歯周病に罹患したイヌのデータ群（以下、「患者群」ともいう）と健常なイヌのデータ群（以下、「健常群」ともいう）とを区別して識別することが可能となる。

本発明の犬の歯周病罹患評価用キットは、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属およびＦｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子配列の一部を増幅するプライマー、または、該遺伝子配列の少なくとも一部と結合するプローブを含む。あるいは、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する微生物および／またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する微生物の遺伝子配列の一部を増幅するプライマー、または該遺伝子配列の少なくとも一部と結合するプローブを含む。本発明のキットを用いることにより、被験犬から採取された唾液検体中の前記微生物の定量をより簡便、迅速、かつ正確に行うことができる。

各微生物の遺伝子配列は、各微生物に特有の遺伝子であることが好ましく、ｒＲＮＡ遺伝子であることがより好ましく、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子であることがさらに好ましい。各微生物に特有の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、遺伝子データベースなどから入手可能である。

１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の一例としては、配列番号１〜９２に記載の塩基配列が挙げられる。これらの塩基配列は、上記各微生物の遺伝子（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子）、該遺伝子と推定される遺伝子、又はこれらの一部であると推測される。

プライマーは、各微生物に特有の遺伝子の少なくとも一部を増幅するものであればよく、増幅方法等に応じて適宜設計すればよい。通常は、各微生物に特有の遺伝子の少なくとも一部の一端に結合できるプライマーと、他端に結合できるプライマーのプライマーペアである。プライマーの長さは、１０塩基以上であることが好ましく、１１塩基以上、１２塩基以上であることがより好ましい。上限は、５０塩基以下であることが好ましく、３５塩基以下、３０塩基以下であることがより好ましい。プライマーは、ある微生物のみを検出できるものであってもよいし、２種以上の微生物を検出できるものであってもよい。

プローブは、各微生物に特有の遺伝子の少なくとも一部に結合すればよく、特異的にハイブリダイズすることが好ましい。プローブを構成する塩基配列は、適宜決定することができる。プローブの長さは、２０塩基以上であることが好ましく、２２塩基以上、２４塩基以上であることがより好ましい。上限は、５０塩基以下であることが好ましく、３５塩基以下、３０塩基以下であることがより好ましい。プローブは、ある微生物のみを検出できるものであってもよいし、２種以上の微生物を検出できるものであってもよい。

本発明のキットは、２以上のプライマーペアを含んでいてもよい。また、２以上のプローブを含んでいてもよい。また、プライマーやプローブの他に、遺伝子増幅に用いる試薬、用具を含んでいてもよい。例えば、緩衝液、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、容器などが挙げられる。

本発明の判定方法及びキットは、被験犬の歯周病の罹患可能性を判断するのに好適である。本発明の判定方法及びキットは、被験犬の歯周病の罹患可能性を評価できるので、予防医学的な利用も可能である。さらに、歯周病の被験犬に治療処置又は投薬を行った場合、治癒に向かっていれば、各微生物の量、割合等は健常犬のそれに近づく。従って、治療処置または投薬を進めると共に本発明の判定方法を実施することにより、治療処置又は投薬の評価判定を行うこともできる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１〜２０
（検体）
表１に示す、薬剤（特に抗生物質）が投与されていない２〜７歳のイヌを検体として用いた。表１中のＧＩ（Ｇｉｎｇｉｖａｌ Ｉｎｄｅｘ）は歯肉炎指数であり、その評価基準を表２に示す。

ＧＩ＝０の検体（健常群）は、身体検査、血液検査、尿検査、糞便検査、Ｘ線検査、超音波検査を行った結果、いずれも標準値の範囲内にあり健常であった。

（サンプルの調製）
被験対象であるイヌの口中に綿棒を入れ、下唇と歯茎との間に溜まった唾液を吸収させた。唾液を吸収した綿棒を滅菌チューブに入れ、冷蔵庫内で約４℃にて保管した。

唾液検体より、溶菌酵素法（Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，Ｖｏｌ．２２（２００７），Ｎｏ．３，Ｐ２１４−２２２）に準じて細菌ゲノムＤＮＡを抽出した。バーコード化したプライマーを用いて、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のマーカーＶ１−Ｖ２を含む領域（２７Ｆ〜３３８Ｒ）をＰＣＲ増幅した。各ＰＣＲ産物を精製、定量、混合した。ＰＣＲ産物の配列を、Ｒｏｃｈｅ−４５４ ＧＳシリーズのシークエンサー（ロシュ社製）を用いて決定し、バーコード配列を利用して混合した複数検体を元通り検体ごとに分類した。１検体あたり約３００ｂｐ塩基長を５０００リードずつシークエンスした。各リードからプライマー対を含むリードを除去し、さらにシーケンサに付属のクオリティプログラムを用いてクオリティチェックを行い、クオリティチェックを通過したリード（高精度に選抜されたリード）につき後述の遺伝子解析のサンプルとした（表３）。

（ＯＴＵの作成）
各サンプル中の微生物叢に含まれる菌種数（ｓｐｅｃｉｅｓ）の解析を行った。すなわち、リード約１８００個以上を選択し、それらの塩基配列の類似度（９６％閾値）を基にＯＴＵ（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔ）を作成した。ＯＴＵ数は、健常群の方が罹患群よりも多かった（表４及び５並びに図１及び２）。

（菌分類（門レベル）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析）
各群におけるサンプルに含まれる菌分類（門レベル）を、ＯＴＵに基づき１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列のデータベース（ＲＤＰ及びＧｅｎｏｍｅＤＢ（ＮＣＢＩコンプリート、ＨＭＰドラフト及び発明者所有のデータ）を用いて行った。その上で、Ｐｈｙｌｕｍ（門）レベルの群間比較の結果、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する微生物の数は罹患群において健常群より多く認められた（図３）。また、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する微生物数は、健常群において罹患群より多く認められ、両者の間に有意差があった（有意水準５％、図４）。

（菌分類（属レベル）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析）
各群におけるサンプルに含まれる菌分類（属レベル）を、ＯＴＵに基づき１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列のデータベース（ＲＤＰ及びＧｅｎｏｍｅＤＢ（ＮＣＢＩコンプリート、ＨＭＰドラフト及び発明者所有のデータ）を用いて行った。その結果、検出量が上位から３２位までであった属において、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属微生物の各々の微生物数は健常群において罹患群より多く認められ、両者の間に有意差があった（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属は有意水準５〜２０％、それ以外は有意水準５％、図５〜１４）。また、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物の各々の微生物数は罹患群において健常群より多く認められ、両者の間に有意差があった（有意水準５〜２０％、図１５〜１６）。

菌種レベルでは、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．ｃａｎｉｎｅ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ２９５（配列番号４）、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ ｓｔｅｅｄａｅ（配列番号１８）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ（配列番号１９）、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ（配列番号３０）、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ（配列番号３３）、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ ｔｒｅｈａｌｏｓｉ（配列番号３６）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（配列番号４７）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃａｎｏｒｉｓ（配列番号３８）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｉｎｕｓ（配列番号５４）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｗｏｆｆｉｉ（配列番号６１）の各々の微生物群は健常群において罹患群より多く認められ、両者の間に有意差があった。

（Ｕｎｉｆｒａｃ解析）
実施例１〜１８の各サンプルに含まれる微生物叢同士の類似度を評価するため、Ｕｎｉｆｒａｃ解析を行った。実施例１〜１８の各サンプルについて、２種類のＵｎｉＦｒａｃ解析を行い、主座標分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＰＣｏＡ）及びＵｎｉｆｒａｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ（サンプル同士の類似度を表現する距離）の検討を行った。主座標分析を行ったところ、Ｗｅｉｇｈｔｅｄ解析においては、健常群が横軸近辺に集中するのに対し、罹患群は健常群から離れてばらつく傾向にあった（図１７、１９）。また、Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ解析においては、罹患群の方が左上に位置していたのに対し、健常群は右下に集中する傾向にあった（図１８、２０）。実施例１〜１８の各サンプルについては、Ｗｅｉｇｈｔｅｄ解析及びＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄ解析のいずれにおいても、健常群に属するサンプル同士の距離は小さく、この距離の平均値と罹患群に属するサンプル同士の距離の平均値との間に有意差が認められた。このことから、Ｕｎｉｆｒａｃ ｄｉｓｔａｎｃｅにより、健常群と罹患群を区別することができることが明らかとなった。

実施例で得られたリードのうち、健常群と罹患群とで有意差があったリードの配列、既知微生物の１６ＳｒＲＮＡとの相同性は、表６〜８に示すとおりであった。なお、リードの相同性９０％以上であれば、そのリードはその微生物に由来する、又は由来する可能性が高いと判断した。

Claims (13)

1. 被験犬から採取された唾液検体中のＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属及びＦｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物からなる群より選ばれる少なくとも一種を定量すること、
   得られた量と、健常犬から採取された唾液検体中の前記群より選ばれる少なくとも一種の量とを比較すること、及び、
   Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びＴｉｓｓｉｅｒｅｌｌａ属微生物のうち少なくとも一種の量が健常犬より少ない場合および／またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属及びＦｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物から選ばれる少なくとも一種の量が健常犬より多い場合には被験犬が歯周病に罹患していると評価すること
   を含むイヌの歯周病の評価方法。
2. 被験犬から採取された唾液検体中のＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する微生物および／またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する微生物のいずれかの微生物又はその一部を定量すること、
   得られた量と、健常犬から採取された唾液検体中の前記群より選ばれる少なくとも一種の量とを比較すること、及び、
   Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する微生物の量が健常犬より多い場合および／またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する微生物の量が健常犬より少ない場合には被験犬が歯周病に罹患している可能性が高いと評価すること、
   を含むイヌの歯周病の評価方法。
3. 定量は、各微生物の遺伝子量の定量により行う、請求項１又は２に記載の評価方法。
4. 遺伝子量は、リボソームＲＮＡ遺伝子量である、請求項３に記載の評価方法。
5. 被験犬から採取された唾液検体中の微生物叢を構成する菌種数を測定し、菌種数が少ない場合に被験犬は歯周病に罹患している可能性が高いと評価することを含む、犬の歯周病罹患の評価方法。
6. 菌種数の測定は、各微生物の遺伝子解析により行う、請求項５に記載の評価方法。
7. 菌種数はｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔにより決定する、請求項５又は６に記載の評価方法。
8. 健常群に属するサンプル同士の菌叢構造と、健常群と被験犬のサンプルの菌叢構造との間に差が認められる場合に、被験犬は歯周病に罹患している可能性が高いと評価することを含む、犬の歯周病罹患の評価方法。
9. 菌叢構造の解析は、ＵｎｉＦｒａｃ分析により行う請求項８に記載の評価方法。
10. 菌叢の構成は、各微生物の遺伝子解析により行う、請求項８又は９に記載の評価方法。
11. Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｃｏｎｃｈｉｆｏｒｍｉｂｉｕｓ属、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉａ属、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｙｓｉｅｌｌａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍａｎａｓ属およびＦｉｌｉｆａｃｔｏｒ属微生物からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子配列を増幅するプライマー、又は該遺伝子配列の少なくとも一部と結合するプローブを含む、犬の歯周病罹患評価用キット。
12. Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する微生物および／またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する微生物の遺伝子配列の一部を含むプライマー、又は、該遺伝子配列の少なくとも一部と結合するプローブを含む、犬の歯周病罹患評価用キット。
13. 遺伝子配列は、ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である、請求項１１又は１２に記載のキット。