JPWO2019088272A1 - 臨床的指標と関連性のある細菌群の情報を利用した口腔内検査方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】歯周病の状態を判定する口腔内検査方法の提供。【解決手段】口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定し、当該シグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、得られた算出値を指標として歯周病の状態を判定する口腔内検査方法であって、細菌群の存在割合は、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係である、前記方法。【選択図】 なし
Description
本発明は、臨床的指標と関連性のある細菌群の情報を利用することにより、歯周病の状態を判定する口腔内検査方法等に関する。
歯周病は複数の細菌が関与する細菌感染症という側面と、原因細菌（細菌因子）、免疫（宿主因子）及び生活習慣が関与して進行する多因子疾患という側面があり、その発症には、歯周病原性細菌が関与している。
歯周病原性細菌としては、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythensis、Treponema denticola、Campylobacter rectus、Fusobacterium nucleatum、Prevotella intermedia、Aggregatibacter actinomycetemcomitans等が報告され（非特許文献１及び２）、その中でもPorphyromonas gingivalis、Tannerella forsythensis及びTreponema denticolaの３菌種は「Ｒｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ」と呼ばれ、慢性歯周炎の原因菌として重要視されている。「Ｒｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ」が存在すると歯周病の悪性度が高くなることが知られており、「Ｒｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ」を構成する細菌は臨床上重要な細菌とされている。
その他、Aggregatibacter actinomycetemcomitansは侵襲性歯周炎の原因菌として、Prevotella intermediaは思春期性あるいは妊娠性歯周炎の原因菌として報告されている（非特許文献１及び２）。
歯周病の従来の細菌検査として、プラークあるいは唾液中の”Ｒｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ”の３種類の細菌を合計した値と歯周病の状態（進行度）の関連が報告されている。具体的には、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythensis及びTreponema denticolaの少なくとも１種の細菌数の合計が、総菌数に対して０．５％未満の場合を「低」、総菌数に対して０．５％以上５％未満の場合を「中」、総菌数に対して０．５％以上の場合を、「高」であると判定する（非特許文献３）。
歯周病原性細菌を検出し細菌数を算出する方法としては、たとえば、培養法、リアルタイムＰＣＲ、次世代シーケンサー、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法が報告されている。より詳細には、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、唾液中におけるPorphyromonas gingivalis及び／又はTannerella forsythensis(旧Bacteroides forsythus)の菌体数を個別に検出する報告もある（特許文献１、３及び４）。
また、細菌叢のゲノムＤＮＡを回収して制限酵素処理し、断片化されたＤＮＡの情報から細菌叢を、パターンの類似度を指標として認識するＴ−ＲＦＬＰ法も報告されている（特許文献５）。この報告によれば、歯科臨床指標と相関のある細菌叢由来のパターンが特定されている。しかしながら、個々の具体的な細菌数の情報は含まれておらず、それ以上の解釈には至っていなかった。Ｔ−ＲＦＬＰ法は、細菌群集の構成をピークパターンとして表すことができ容易に多検体の比較解析が可能であるが、一方で、各ピークが必ずしも１細菌種に由来しないことから、細菌群集構成の把握は困難である（非特許文献４）。
細菌群の構成を把握する方法としては近年、次世代シークエンサーの利用があげられる。例えば、特許文献９では、ヒト被験者から採取した唾液検体中の細菌叢の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を無作為に決定することによって唾液細菌叢の検査方法を提供している。本検査方法では、唾液による炎症性腸疾患の検出方法を提案しており、UniFrac解析の結果、健常者群とCD患者群とを識別できている一方で、個々の細菌ごとにt検定を繰り返して有意差検定をしており、解析の過程は疑問が残る。
また、すべての細菌の量を捕える方法、すなわち総細菌を検出する方法として、各微生物間において保存性の高い領域を選択したユニバーサルプライマーを利用した報告がある（特許文献６〜８）。ＤＮＡマイクロアレイを利用した例では、検体調製のＰＣＲの工程において１組のユニバーサルプライマーを設定して、口腔内細菌２０種類を検出した報告がある（非特許文献５〜８）。
これまで、「Ｒｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ」の少なくとも１種類の細菌数を測定し、歯周病重症度の指標とする例は多数報告されていた。しかし、歯周病は複数の細菌が原因となる疾患であるため、限られた種類の悪性細菌の測定では、歯周ポケット測定で得られる情報と同等の情報しか得られなかった。また、歯周病の治療効果の判断指標という点では、歯科医師の経験に基づいて取得される臨床情報によるものが基本であり、ほとんどの場合において細菌叢の情報までは確認されてこなかった。
さらに、歯周病の初期段階における歯周病悪化の指標はなかった。したがって、多くの患者が歯周病に罹患したと気付づく頃には既に歯周病は進行しており、歯周病の症状に気づいてからその治療を開始したとしても、その治療が効果を奏さないことが多いため、歯周病の悪化に関する効果的な予測方法も求められていた。具体例としては以下のようなことがあげられる。
歯周治療終了後の継続的なプロフェッショナルケアである「サポーティブペリオドンタルセラピー（SPT）」は、“病状安定”を維持し歯周治療の予後を良好に保つための不可欠な治療である。現在、臨床の現場でSPTへ移行する際の判断基準は，プロービングポケットデプスやBOP 等である。一方、今後SPT移行後の進行を予知する指標があれば、治療計画の判断に大変有用となるが、現在明確な判断基準が確立していない（非特許文献9）。
歯周治療終了後の継続的なプロフェッショナルケアである「サポーティブペリオドンタルセラピー（SPT）」は、“病状安定”を維持し歯周治療の予後を良好に保つための不可欠な治療である。現在、臨床の現場でSPTへ移行する際の判断基準は，プロービングポケットデプスやBOP 等である。一方、今後SPT移行後の進行を予知する指標があれば、治療計画の判断に大変有用となるが、現在明確な判断基準が確立していない（非特許文献9）。
このような状況下、判断基準設定の試みとして、唾液中の総菌数に対するP. gingivalis菌数の比率とアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の組み合わせによる方法や、治療再評価時に唾液中P. gingivalis 比率とP. gingivalis に対する血清抗体価を組み合わせた測定する方法が検討されてきた（非特許文献10）。さらには、予知の指標として口腔内細菌検査も期待されており（非特許文献11）、例えば、Haffajee らはA. actinomycetemcomitansとP. gingivalisの菌数と2 mm以上のアタッチメントロスを起こすリスクについての関連性を報告しているが（非特許文献１２）、先に述べたように検査細菌種が限定的であり、未だ予知の指標として実用化に至っていない。
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Haffajee AD, Socransky SS. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol 2000. 1994 Jun;5:78-111. Review.
前述のように、現在、歯周病悪化の予測指標や治療方針を決定するための情報はまだ不足している。そこで、本発明は、簡便な方法で詳細に口腔内細菌を検出,、定量化することにより、歯周病の状態、歯周病の治療効果の判定を行う方法等を提供することを目的とする。
本発明者は、前記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、口腔内試料中に存在する細菌について特定の細菌（群）間の存在割合を求めることにより、歯周病の状態を判定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明者は、プラーク中の主要な口腔細菌群（歯周病関連細菌群と常在細菌群を含む）を一括して測定し、歯周病関連細菌群と常在細菌群との存在割合をもとにした病態悪化の判定モデルを作成することにより、同じ歯周ポケット数値の病態をさらに細分化して分類することができることを見出した。
さらには、口腔内試料中に存在する特定の細菌（群）間との存在割合を求めることにより歯周病の治療効果、歯周病の経過などを判定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
さらには、口腔内試料中に存在する特定の細菌（群）間との存在割合を求めることにより歯周病の治療効果、歯周病の経過などを判定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定し、当該シグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、得られた算出値を指標として歯周病の状態を判定する口腔内検査方法であって、
細菌群の存在割合は、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係である、前記方法。
[２] 得られた算出値を、細菌群の存在割合のカットオフ値と比較することにより歯周病の状態を判定する、[1]に記載の方法。
[３] 前記細菌群の存在割合は、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との比である、[１]又は[２]に記載の方法。
[４] 前記カットオフ値は、基準策定用口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、当該算出値から作成されたROC曲線に基づいて定めたものである、[２]又は[３]に記載の方法。
[５] 前記細菌群の存在割合は、Fusobacterium nucleatum種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係である、[１]〜[４]のいずれか１項に記載の方法。
[６] 前記細菌群の存在割合として以下の(a)及び(b)を用いる、[１]〜[５]のいずれか１項に記載の方法。
(a)歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種（ただしFusobacterium nucleatum種以外の細菌種を１種以上含む。）の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係
(b) Fusobacterium nucleatum種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係
[７] 歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種が、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium periodonticum、Prevotella intermedia、Streptococcus constellatus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Eikenella corrodens、Filifactor alocis、Porphyromonas endodontalis、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Treponema medium及びSelenomonas sputigenaからなる群から選ばれる少なくとも一種である[１]〜[６]のいずれか１項に記載の方法。
[８] 歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種が、Prevotella nigrescens、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mitis bv 2、Actinomyces odontolyticus、Veillonella parvula、Actinomyces naeslundii II、Selenomonas noxia、Prevotella denticola、Prevotella melaninogenica、Gemella sanguinis、Eubacterium sulci、Corynebacterium matruchotii、Rothia mucilaginosa、Porphyromonas catoniae、Solobacterium moorei、Neisseria flavescens、Prevotella loescheii、Megasphaera micronuciformis、Actinomyces graevenitzii、Veillonella atypica、Prevotella pallens、Prevotella shahii、Porphyromonas pasteri、Veillonella rogosae、Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308)、Rothia dentocariosa、Granulicatella adiacens、Streptococcus salivarius、Haemophilus parainfluenzae及びStreptococcus parasanguinisから なる群から選ばれる少なくとも一種である、[１]〜[７]のいずれか１項に記載の方法。
[９] Fusobacterium nucleatum種が、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、及びFusobacterium nucleatum subsp. nucleatumからなる群から選ばれる少なくとも一種である[５]〜[８]のいずれか１項に記載の方法。
[１０] 口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定し、当該シグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、得られた算出値と、歯周病の状態、経過又は治療効果とを関連づけることを特徴とする、口腔内検査方法。
[１１] 細菌群の存在割合と歯周病の状態との関連づけは、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種との比を算出することにより行う、[１０]に記載の方法。
[１２] 細菌群の存在割合と歯周病の経過との関連づけは、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加するFusobacterium属に属する細菌種と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種との比を算出することにより行う、[１０]又は[１１]に記載の方法。
[１３] 細菌群の存在割合と歯周病の治療効果との関連づけは、歯周病治療の前後における、以下の(a)及び/又は(b)の値を比較することにより行う、[１０]〜[１２]のいずれか１項に記載の方法。
(a) 歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種との比
(b) 歯周ポケットの数値の増大に伴い増加するFusobacterium属に属する細菌種と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種との比
[１４] Fusobacterium属に属する細菌種が、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum及びFusobacterium periodonticumからなる群から選ばれる少なくとも一種である[１２]又は[１３]に記載の方法。
[１５] 歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種が、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium periodonticum、Prevotella intermedia、Streptococcus constellatus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans及びEikenella corrodensからなる群から選ばれる少なくとも一種であり、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種が、Prevotella nigrescens、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mitis bv 2、Actinomyces odontolyticus、Veillonella parvula、Actinomyces naeslundii II及びSelenomonas noxiaからなる群から選ばれる少なくとも一種である、[１１]〜[１４]のいずれか１項に記載の方法。
[１６] Fusobacterium属に属する細菌種が、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum及びFusobacterium periodonticumからなる群から選ばれる少なくとも一種であり、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種が、Prevotella nigrescens、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mitis bv 2、Actinomyces odontolyticus、Veillonella parvula、Actinomyces naeslundii II及びSelenomonas noxiaからなる群から選ばれる少なくとも一種である、[１２]〜[１５]のいずれか１項に記載の方法。
[１] 口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定し、当該シグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、得られた算出値を指標として歯周病の状態を判定する口腔内検査方法であって、
細菌群の存在割合は、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係である、前記方法。
[２] 得られた算出値を、細菌群の存在割合のカットオフ値と比較することにより歯周病の状態を判定する、[1]に記載の方法。
[３] 前記細菌群の存在割合は、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との比である、[１]又は[２]に記載の方法。
[４] 前記カットオフ値は、基準策定用口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、当該算出値から作成されたROC曲線に基づいて定めたものである、[２]又は[３]に記載の方法。
[５] 前記細菌群の存在割合は、Fusobacterium nucleatum種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係である、[１]〜[４]のいずれか１項に記載の方法。
[６] 前記細菌群の存在割合として以下の(a)及び(b)を用いる、[１]〜[５]のいずれか１項に記載の方法。
(a)歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種（ただしFusobacterium nucleatum種以外の細菌種を１種以上含む。）の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係
(b) Fusobacterium nucleatum種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係
[７] 歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種が、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium periodonticum、Prevotella intermedia、Streptococcus constellatus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Eikenella corrodens、Filifactor alocis、Porphyromonas endodontalis、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Treponema medium及びSelenomonas sputigenaからなる群から選ばれる少なくとも一種である[１]〜[６]のいずれか１項に記載の方法。
[８] 歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種が、Prevotella nigrescens、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mitis bv 2、Actinomyces odontolyticus、Veillonella parvula、Actinomyces naeslundii II、Selenomonas noxia、Prevotella denticola、Prevotella melaninogenica、Gemella sanguinis、Eubacterium sulci、Corynebacterium matruchotii、Rothia mucilaginosa、Porphyromonas catoniae、Solobacterium moorei、Neisseria flavescens、Prevotella loescheii、Megasphaera micronuciformis、Actinomyces graevenitzii、Veillonella atypica、Prevotella pallens、Prevotella shahii、Porphyromonas pasteri、Veillonella rogosae、Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308)、Rothia dentocariosa、Granulicatella adiacens、Streptococcus salivarius、Haemophilus parainfluenzae及びStreptococcus parasanguinisから なる群から選ばれる少なくとも一種である、[１]〜[７]のいずれか１項に記載の方法。
[９] Fusobacterium nucleatum種が、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、及びFusobacterium nucleatum subsp. nucleatumからなる群から選ばれる少なくとも一種である[５]〜[８]のいずれか１項に記載の方法。
[１０] 口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定し、当該シグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、得られた算出値と、歯周病の状態、経過又は治療効果とを関連づけることを特徴とする、口腔内検査方法。
[１１] 細菌群の存在割合と歯周病の状態との関連づけは、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種との比を算出することにより行う、[１０]に記載の方法。
[１２] 細菌群の存在割合と歯周病の経過との関連づけは、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加するFusobacterium属に属する細菌種と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種との比を算出することにより行う、[１０]又は[１１]に記載の方法。
[１３] 細菌群の存在割合と歯周病の治療効果との関連づけは、歯周病治療の前後における、以下の(a)及び/又は(b)の値を比較することにより行う、[１０]〜[１２]のいずれか１項に記載の方法。
(a) 歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種との比
(b) 歯周ポケットの数値の増大に伴い増加するFusobacterium属に属する細菌種と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種との比
[１４] Fusobacterium属に属する細菌種が、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum及びFusobacterium periodonticumからなる群から選ばれる少なくとも一種である[１２]又は[１３]に記載の方法。
[１５] 歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種が、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium periodonticum、Prevotella intermedia、Streptococcus constellatus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans及びEikenella corrodensからなる群から選ばれる少なくとも一種であり、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種が、Prevotella nigrescens、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mitis bv 2、Actinomyces odontolyticus、Veillonella parvula、Actinomyces naeslundii II及びSelenomonas noxiaからなる群から選ばれる少なくとも一種である、[１１]〜[１４]のいずれか１項に記載の方法。
[１６] Fusobacterium属に属する細菌種が、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum及びFusobacterium periodonticumからなる群から選ばれる少なくとも一種であり、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種が、Prevotella nigrescens、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mitis bv 2、Actinomyces odontolyticus、Veillonella parvula、Actinomyces naeslundii II及びSelenomonas noxiaからなる群から選ばれる少なくとも一種である、[１２]〜[１５]のいずれか１項に記載の方法。
本発明によれば、多数の口腔内細菌（歯周病関連細菌、常在菌を含む）を一括して検出、定量化することができ、歯周病の状態を従来手法よりも細分化して判定することができる。また、本発明によれば、歯周病の状態、歯周病の治療効果、歯周病の経過を判定することができ、同じ歯周ポケットの大きさの病態をさらに細分化して分類できる。また歯周ポケットの数値が無くとも治療効果、病状安定の判定を行うことができる。さらには今後、判定に用いる細菌種を入れ替えることにより、判定モデル性能の向上させることも可能である。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
本発明は、口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定し、当該シグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、得られた算出値を指標として歯周病の状態を判定する口腔内検査方法である。本発明において、前記細菌群の存在割合とは、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係である。
当該口腔内検査方法の具体的な態様としては、限定はされないが、本明細書においては、口腔内試料中の細菌の菌数を測定する方法については、ＤＮＡチップを用いた方法を中心に述べる。
ＤＮＡチップを用いる方法以外の方法、例えば、インベーダー法、リアルタイムＰＣＲ法、インベーダーＰＣＲ法、次世代シークエンス法等によって口腔内試料中の細菌の検出、測定、定量化を実施してもよい。
当該口腔内検査方法の具体的な態様としては、限定はされないが、本明細書においては、口腔内試料中の細菌の菌数を測定する方法については、ＤＮＡチップを用いた方法を中心に述べる。
ＤＮＡチップを用いる方法以外の方法、例えば、インベーダー法、リアルタイムＰＣＲ法、インベーダーＰＣＲ法、次世代シークエンス法等によって口腔内試料中の細菌の検出、測定、定量化を実施してもよい。
１．口腔内細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブ
本発明の方法においては、被験者から採取された口腔内試料から口腔内細菌を検出する際に、ＤＮＡチップを使用することができ、当該ＤＮＡチップには、例えば、以下のプローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも一方のプローブとを搭載することができる。
本発明の方法においては、被験者から採取された口腔内試料から口腔内細菌を検出する際に、ＤＮＡチップを使用することができ、当該ＤＮＡチップには、例えば、以下のプローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも一方のプローブとを搭載することができる。
（ａ）検出対象の細菌の遺伝子（または遺伝子由来の増幅産物）それぞれに特異的にハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｂ）すべての細菌の遺伝子（または遺伝子由来の増幅産物）にハイブリダイズする核酸からなる総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標それぞれに特異的にハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｂ）すべての細菌の遺伝子（または遺伝子由来の増幅産物）にハイブリダイズする核酸からなる総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標それぞれに特異的にハイブリダイズする核酸からなるプローブ
なお、一般的に、ＤＮＡチップとは、プローブが配置された基盤の総称である。また、本明細書においては、ＤＮＡチップ及びＤＮＡマイクロアレイ等の名称については、それぞれ区別はせず、同義語であるとする。
（１）測定対象となる口腔内細菌
本発明の検査方法において、測定対象となる口腔内細菌としては、限定はされないが、Porphyromonas属、Tannerella属、Treponema属、Prevotella属、Campylobacter属、Fusobacterium属、Streptococcus属、Aggregatibacter属、Capnocytophaga属、Eikenella属、Actinomyces属、Veillonella属、Selenomonas属、さらには、Pseudomonas属、Haemophilus属、Klebsiella属、Serratia属、Moraxella属、Eubacterium属、Parvimonas属、Filifactor属、Alloprevotella属、Solobacterium属、Rothia属、Peptostreptococcus属、Gemella属、Corynebacterium属、Neisseria属、Granulicatella属、Megasphaera属及びSR1門に属する細菌などを、検出対象菌種とすることができる。
本発明の検査方法において、測定対象となる口腔内細菌としては、限定はされないが、Porphyromonas属、Tannerella属、Treponema属、Prevotella属、Campylobacter属、Fusobacterium属、Streptococcus属、Aggregatibacter属、Capnocytophaga属、Eikenella属、Actinomyces属、Veillonella属、Selenomonas属、さらには、Pseudomonas属、Haemophilus属、Klebsiella属、Serratia属、Moraxella属、Eubacterium属、Parvimonas属、Filifactor属、Alloprevotella属、Solobacterium属、Rothia属、Peptostreptococcus属、Gemella属、Corynebacterium属、Neisseria属、Granulicatella属、Megasphaera属及びSR1門に属する細菌などを、検出対象菌種とすることができる。
より詳細には、例えば、現在歯周病やう蝕に関連していると考えられる、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium periodonticum、Prevotella intermedia、Prevotella nigrescens、Streptococcus constellatus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Eikenella corrodens、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mitis bv 2、Actinomyces odontolyticus、Veillonella parvula、Actinomyces naeslundiiII、Selenomonas noxia、さらには、Streptococcus sanguis、Actinomyces viscosus、Streptococcus pyogenes、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus mutans、Eubacterium nodatum、Parvimonas micra、Filifactor alocis、Streptococcus sobrinus、Porphyromonas pasteri、Veillonella atypica、Haemophilus parainfluenzae、Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308)、Streptococcus parasanguinis、Actinomyces israelii、Prevotella pallens、Prevotella loescheii、Prevotella histicola、Solobacterium moorei、Prevotella melaninogenica、Selenomonas sputigena、Rothia dentocariosa、Rothia mucilaginosa、Veillonella rogosae、Peptostreptococcus stomatis、Prevotella denticola、Porphyromonas endodontalis、Streptococcus salivarius、Actinomyces graevenitzii、Treponema medium、Treponema socranskii、Gemella sanguinis、Porphyromonas catoniae、Corynebacterium matruchotii、Eubacterium saphenum、Neisseria flavescens、Granulicatella adiacens、Eubacterium sulci、Megasphaera micronuciformis、Prevotella shahii、SR1 sp. OT 345、などの細菌を検出対象菌種とすることが好ましく、より好ましくは、病態と関連して増減が明確な細菌種である。
口腔内の状態を検出する目的の場合は、例えば、歯周ポケットの数値とともに増減が明確な細菌種を挙げることができる。
なお、本発明において「歯周ポケットの数値」とは、歯周ポケットの深さ（Ｐｄ）の数値を言う。歯周ポケットの深さ（Ｐｄ）とは、歯周プローブをポケットに挿入した際の，歯肉辺縁からプローブ先端までの距離を示す。１ｍｍ単位で数値化する。なお、ここでいう「歯周プローブ」とは、ポケット測定器具（ヘリオプローブ）を意味する。
なお、本発明において「歯周ポケットの数値」とは、歯周ポケットの深さ（Ｐｄ）の数値を言う。歯周ポケットの深さ（Ｐｄ）とは、歯周プローブをポケットに挿入した際の，歯肉辺縁からプローブ先端までの距離を示す。１ｍｍ単位で数値化する。なお、ここでいう「歯周プローブ」とは、ポケット測定器具（ヘリオプローブ）を意味する。
増減については、歯周ポケットの数値が大きくなった時に増加が認められる細菌群、または歯周ポケットの数値が小さい時に増加し始め、その後増加し、歯周ポケットの数値が大きくなった時に細菌量が維持される細菌群等、増減のパターンについては限定されない。より単純な例としては、「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群と、「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群である。
歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種及び歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種は、細菌量（またはSN比のような細菌量と比例する測定量）を測定できるツールにより確認することができる。ツールは特に限定はされず、例えばＤＮＡチップを用いることができる。
歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種及び歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種は、細菌量（またはSN比のような細菌量と比例する測定量）を測定できるツールにより確認することができる。ツールは特に限定はされず、例えばＤＮＡチップを用いることができる。
ＤＮＡチップを用いて確認する場合、口腔内試料をＤＮＡチップで測定し、その後歯周ポケットの数値と各細菌の細菌量またはＳＮ比のような測定量との相関係数を算出し、相関係数が正の値となる細菌群と負の値となる細菌群として分類、特定することができる。これらの細菌は、測定回数が４０回以上の場合に相関係数の絶対値が０．０２以上であることが好ましく、０．１以上であることがより好ましく、０．２以上であることがさらに好ましく、０．４以上であることが特に好ましく、０．６以上であることが最も好ましい。
歯周病の状態の判定に実験誤差補正後のデータを用いる際は、細菌群の分類にも実験誤差補正後のデータを用いる。
歯周病の状態の判定に実験誤差補正後のデータを用いる際は、細菌群の分類にも実験誤差補正後のデータを用いる。
歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種（以下、「正の相関菌」と記載することがある。）は、すなわち歯周病の悪化に伴い増加する細菌である。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ等が知られており、既存の歯周病細菌検査で使われている。
歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種としては、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium periodonticum、Prevotella intermedia、Streptococcus constellatus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Eikenella corrodens、Filifactor alocis、Porphyromonas endodontalis、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Treponema medium、及びSelenomonas sputigenaからなる群から選ばれる少なくとも一種が挙げられる。
歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種としては、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium periodonticum、Prevotella intermedia、Streptococcus constellatus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Eikenella corrodens、Filifactor alocis、Porphyromonas endodontalis、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Treponema medium、及びSelenomonas sputigenaからなる群から選ばれる少なくとも一種が挙げられる。
中でも、歯周ポケットの数値が小さい時に増加し始め、その後増加し、歯周ポケットの数値が大きくなった時に細菌量が維持される細菌を、以下「経過指標細菌」と記載することがある。「経過指標細菌」は、後述する「悪玉菌」と「善玉菌」をつなぐ役割を果たすと考えられており、歯周病悪化の前段階の指標となる。「経過指標細菌」としては、具体的には、Fusobacterium nucleatum種が挙げられる。
Fusobacterium nucleatum種としては、例えば、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis及びFusobacterium nucleatum subsp. nucleatumからなる群から選ばれる少なくとも1種が挙げられる。
Fusobacterium nucleatum種としては、例えば、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis及びFusobacterium nucleatum subsp. nucleatumからなる群から選ばれる少なくとも1種が挙げられる。
一方、歯周ポケットの数値が大きくなった時に増加が認められる細菌群を、以下「悪玉菌」と記載することがある。「悪玉菌」としては、具体的には、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種のうちの、Fusobacterium nucleatum種以外の細菌種が挙げられる。例えば、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Fusobacterium periodonticum、Prevotella intermedia、Streptococcus constellatus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Eikenella corrodens、Filifactor alocis、Porphyromonas endodontalis、Eubacterium nodatum、Eubacterium saphenum、Treponema medium、及びSelenomonas sputigenaからなる群から選ばれる少なくとも1種が挙げられる。
歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種（以下、「負の相関菌」と記載することがある。）としては、Streptococcus属、Actinomyces属、Veillonella属等に属する細菌の一部の菌種があげられる。
これらは、(i)歯周ポケットの数値の増加（すなわち歯周病の悪化）に伴い減少する細菌、(ii)歯周ポケットの数値の減少（歯周病の改善）に伴い増加する細菌種、又は上記(i)及び(ii)の両者を含む。歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種群を、以下「善玉菌」と記載することがある。
これらは、(i)歯周ポケットの数値の増加（すなわち歯周病の悪化）に伴い減少する細菌、(ii)歯周ポケットの数値の減少（歯周病の改善）に伴い増加する細菌種、又は上記(i)及び(ii)の両者を含む。歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種群を、以下「善玉菌」と記載することがある。
歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種及び/又は歯周ポケットの数値の減少に伴い増加する細菌種としては、Prevotella nigrescens、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mitis bv 2、Actinomyces odontolyticus、Veillonella parvula、Actinomyces naeslundii II、Selenomonas noxia、Prevotella denticola、Prevotella melaninogenica、Gemella sanguinis、Eubacterium sulci、Corynebacterium matruchotii、Rothia mucilaginosa、Porphyromonas catoniae、Solobacterium moorei、Neisseria flavescens、Prevotella loescheii、Megasphaera micronuciformis、Actinomyces graevenitzii、Veillonella atypica、Prevotella pallens、Prevotella shahii、Porphyromonas pasteri、Veillonella rogosae、Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308)、Rothia dentocariosa、Granulicatella adiacens、Streptococcus salivarius、Haemophilus parainfluenzae、及びStreptococcus parasanguinisからなる群から選ばれる少なくとも一種が挙げられる。
（２）プローブ（ａ）について
本発明において、プローブ（ａ）として使用され得るオリゴＤＮＡは、口腔内細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの菌特異的な領域（菌の種類によって塩基配列が変わる領域）の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。ここで、当該核酸は、染色体ＤＮＡやプラスミドＤＮＡ等を含むＤＮＡ及びＲＮＡのいずれでもよく限定はされないが、染色体ＤＮＡであることが好ましい。具体的には、本発明においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、前記口腔内細菌の染色体ＤＮＡ中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。
本発明において、プローブ（ａ）として使用され得るオリゴＤＮＡは、口腔内細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの菌特異的な領域（菌の種類によって塩基配列が変わる領域）の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。ここで、当該核酸は、染色体ＤＮＡやプラスミドＤＮＡ等を含むＤＮＡ及びＲＮＡのいずれでもよく限定はされないが、染色体ＤＮＡであることが好ましい。具体的には、本発明においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、前記口腔内細菌の染色体ＤＮＡ中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。
本発明に用い得るプローブは、検出目的となる各種の前記口腔内細菌に特異的な塩基配列となるような領域を選択してその領域の塩基配列を設計することが好ましい。一般的に、プローブの設計の際には、特異的な領域を選択することに加え、融解温度（Ｔｍ）がそろっていて、二次構造を形成しにくいものである必要がある。
口腔内細菌の各々の種に対応する特異的な塩基配列は、例えば、マルチプルアラインメントをとり、種間で異なる領域にプローブを設計するなどの手段により見出すことができる。アラインメントをとるためのアルゴリズムには、特に限定はないが、より具体的な解析プログラムとしては、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８等のプログラムを利用することができる。アラインメントをとる際のパラメータは、各プログラムのデフォルト状態で実行してもよいが、プログラムの種類などに応じて適宜調整することができる。
一方で、プローブの特異性は、属レベルの特異性を基に同じ属の細菌を一括に検出するものであってもよいし、個々の種レベルで検出可能な特異性であってもよく、細菌検出の目的に応じて適宜判断が可能である。検出の特異性のレベルに応じて、検出できている細菌種を特定の1種類と限定することもでき、または属レベルの和（合計）としてとられることもできる。
（３）プローブ（ｂ）について
総量指標プローブは、特定のプライマー対で増幅できた、検体の中のすべての細菌を捕捉する目的のプローブである。細菌を検出する上では、検出対象細菌が、非検出対象細菌を含む全体の細菌の中でどの程度の割合であるのか、また、そもそも検体中にどれくらいの量の細菌が存在しているのかといった観点から細菌の総量を検出することはきわめて重要となる。非検出対象細菌は、存在や種類は分かっているが検出対象としなくてもよい細菌、及び存在や種類が不明である細菌の和（合計）として理解できる。
総量指標プローブは、特定のプライマー対で増幅できた、検体の中のすべての細菌を捕捉する目的のプローブである。細菌を検出する上では、検出対象細菌が、非検出対象細菌を含む全体の細菌の中でどの程度の割合であるのか、また、そもそも検体中にどれくらいの量の細菌が存在しているのかといった観点から細菌の総量を検出することはきわめて重要となる。非検出対象細菌は、存在や種類は分かっているが検出対象としなくてもよい細菌、及び存在や種類が不明である細菌の和（合計）として理解できる。
細菌の総量を検出するためには、例えば、ＤＮＡチップとは独立に細菌の総量を測定することも可能であるが、ＤＮＡチップ中に細菌の総量の指標となるプローブを搭載しておくことにより操作の簡便性が向上する。プローブについては、プライマー対によって増幅される塩基配列の中から、多種類の菌種に共通な塩基配列を使用してもよい。そのような配列が見つからない場合は、比較的共通な配列を複数設計し、それらを総合的に判断することで総量指標プローブとしてもよい。総量指標プローブは、好ましくは、検体に含まれる細菌に由来する核酸にハイブリダイズするプローブ、詳しくは、前記特定のプライマー対により増幅される塩基配列のうちの、検出対象となる複数種類の細菌が共通に有する塩基配列とハイブリダイズするプローブである。
総量指標は、個々の菌種特異的な増幅産物の合計量を表すため、一般的に量が多くなることから、目的のシグナル強度が、検出可能なシグナル強度の範囲を超えてしまうことがある。そのような状況を防ぐためには、ハイブリダイゼーションに供する検体量を制限することが望ましい。又は、プローブを設計する際には、例えば当該プローブのＴｍ値を低くする。具体的にはＧＣ含量を少なくすることや、プローブの配列長自体を短くする方法が考えられる。
また、ハイブリダイゼーションに際して、増幅された核酸と総量指標プローブとのハイブリダイゼーションに対して競合的に作用するような核酸を添加することで、シグナル強度の低減化を図ることが可能である。このような核酸としては、例えば、総量指標プローブと全て又は部分的に同じ配列を有する核酸、又は総量指標プローブの相補配列を全て又は部分的に有する核酸などが挙げられる。
（４）プローブ（ｃ）について
絶対量指標プローブは、絶対量指標の核酸にのみハイブリダイズするプローブである。本明細書において、絶対量指標とは、増幅反応やハイブリダイゼーション反応の前に、検体中に一定量添加する核酸の量を示す指標である。絶対量指標は、通常の増幅反応を行えば増幅反応が確実に行われる核酸であり、いわゆる陽性コントロールとしての役割を果たす。従って、絶対量指標に特異的なプローブを、ＤＮＡチップに搭載しておけば、その検出結果から、増幅反応やハイブリダイゼーション等が適切に実施されたかを確認することができる。
絶対量指標プローブは、絶対量指標の核酸にのみハイブリダイズするプローブである。本明細書において、絶対量指標とは、増幅反応やハイブリダイゼーション反応の前に、検体中に一定量添加する核酸の量を示す指標である。絶対量指標は、通常の増幅反応を行えば増幅反応が確実に行われる核酸であり、いわゆる陽性コントロールとしての役割を果たす。従って、絶対量指標に特異的なプローブを、ＤＮＡチップに搭載しておけば、その検出結果から、増幅反応やハイブリダイゼーション等が適切に実施されたかを確認することができる。
絶対量指標を増幅反応前に添加するのであれば、絶対量指標に対する特定のプライマー対も反応液に加えておく必要があるが、場合により細菌用のプライマー対で共通して増幅させることも可能である。また、ハイブリダイゼーションで他の検出対象とは独立して検出するためには、検出対象細菌、非検出対象細菌いずれにも類似性が低い塩基配列を選択する必要がある。
絶対量指標を１種類設定した場合、多少増幅効率やハイブリダイゼーション効率が増減した場合に、絶対量指標のシグナル強度を比較することにより補正係数を算出することができる。複数のＤＮＡチップのデータを比較する際には、補正係数で補正した後のシグナル強度で比較してもよい。
絶対量指標を１種類設定した場合、多少増幅効率やハイブリダイゼーション効率が増減した場合に、絶対量指標のシグナル強度を比較することにより補正係数を算出することができる。複数のＤＮＡチップのデータを比較する際には、補正係数で補正した後のシグナル強度で比較してもよい。
ここでプローブ(a）、(b）、(c）の具体例として表１に例示できる。
細菌それぞれに特異的なプローブの例を表１に示す。（配列番号１〜３３）。
総量指標プローブの例を、配列番号３４に示す。
絶対量指標用プローブの例を配列番号３５に示す。
絶対量指標の例を配列番号３６に示す。
細菌それぞれに特異的なプローブの例を表１に示す。（配列番号１〜３３）。
総量指標プローブの例を、配列番号３４に示す。
絶対量指標用プローブの例を配列番号３５に示す。
絶対量指標の例を配列番号３６に示す。
＜プライマーの設計＞
本発明のプライマー設計方法は、まず、解析対象細菌の多様性を示す可変領域を少なくともひとつ選択し、選択した可変領域の前後に、保存性の高いユニバーサルプライマー設計領域を選択し、プライマー配列を設計する。対象となる可変領域は、限定はされないが、ゲノム配列のうち、すべての細菌が有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子などが挙げられる。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のうち、全長又は、可変領域Ｖ１−Ｖ９の一つ以上の領域を対象とすることが望ましい。より好ましくは、可変領域Ｖ１−Ｖ６を対象とすることが望ましい。さらに好ましくは、可変領域Ｖ３−Ｖ６を対象とすることが望ましい。なお、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の可変領域がＶ１−Ｖ９領域からなり、その領域も特定されていることは公知である。
本発明のプライマー設計方法は、まず、解析対象細菌の多様性を示す可変領域を少なくともひとつ選択し、選択した可変領域の前後に、保存性の高いユニバーサルプライマー設計領域を選択し、プライマー配列を設計する。対象となる可変領域は、限定はされないが、ゲノム配列のうち、すべての細菌が有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子などが挙げられる。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のうち、全長又は、可変領域Ｖ１−Ｖ９の一つ以上の領域を対象とすることが望ましい。より好ましくは、可変領域Ｖ１−Ｖ６を対象とすることが望ましい。さらに好ましくは、可変領域Ｖ３−Ｖ６を対象とすることが望ましい。なお、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の可変領域がＶ１−Ｖ９領域からなり、その領域も特定されていることは公知である。
プライマーの網羅性を評価するために、細菌のゲノム配列を広範囲に取得しているデータベースを活用する。具体的には、ＲＤＰ、ＮＣＢＩ、ＫＥＧＧ、ＭＧＤＢなどが挙げられる。一例として、設計したユニバーサルプライマー配列を、ＲＤＰのデータベースのＰｒｏｂｅ Ｍａｔｃｈに入力する。結果の一覧において、Ｔｏｔａｌ ｓｅａｒｃｈ中の完全一致数が得られる。完全一致数がＴｏｔａｌ Ｓｅａｒｃｈに近いほど、その網羅性が高い。このとき、条件として、Ｓｔｒａｉｎは、「Ｔｙｐｅ」を選択しても良い。また、Ｓｏｕｒｓｅは、「Ｉｓｏｌａｔｅｓ」を選択しても良い。
絶対量指標用配列とこれを増幅するプライマー配列を設計する場合には、例えば、ソフトウェア「ＥＸＣＥＬ」（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ社製）のＲＮＤＢ19ＥＴＷＥＥＮ関数を使用し、１から４までの整数をランダムにＸ個（Ｘは任意の数）発生させ、それをつなげて１から４までの数値のみから構成されるＸ桁の数値とし、１〜４の数値にA、G、C及びTのいずれかと置き換えることにより、ランダム配列を得ることができる。例えば、１をＡ、２をＴ、３をＣ、４をＧと置き換えることにより、ＡＴＧＣのＸ塩基によるランダム配列を多数得ることができる。
これらの配列につき、ＧとＴの和がＡとＴの和と同数になる配列のみを抜粋し、抜粋された配列を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに対してＢｌａｓｔ検索し、生物由来の核酸に対し、類似配列の少ないものを選抜する。
増幅反応時における反応効率をなるべく一定にするために、検出対象細菌にて増幅される塩基長と絶対量指標の増幅塩基長は大きな差のないようにすることが望ましい。例えば、検出対象細菌の増幅産物が５００ｂｐ程度となるのであれば、絶対量指標の増幅産物は３００ｂｐから１０００ｂｐ程度とすることが望ましい。
一方で、増幅後に電気泳動等で増幅鎖長を確認する場合においては、検出対象細菌とは異なる長さの増幅産物となるように設計した上で、絶対量指標由来の増幅産物を検出対象細菌のバンドとは異なる位置で検出し、ハイブリダイゼーションの前に増幅反応の成否を確認することも可能である。
最後に、検体中に含まれる絶対量指標があまりにも濃度が高いときは、検出対象の細菌と増幅反応における競合が激しくなり、本来検出できるはずの検出対象細菌が検出できなくなる可能性もあるため、アプリケーションに応じて適宜濃度調整をする必要がある。
細菌由来の核酸と絶対量指標を別々に増幅させる場合においては必要に応じて２対以上のプライマー対を用いるマルチプレックス手法を適用できる。逆に必要に応じて共通の一組にプライマー対で競合させる手法も適用できる。
プライマー配列の例を表２に示す。細菌増幅用プライマー対（配列番号３７、３８）や、絶対量指標用プライマー対（配列番号３９、４０）を利用することが可能である。他にも表３に示すプライマーも利用することが可能である。
＜プローブの設計＞
本発明に用いるプローブを設計する際、プローブの長さは限定されるものではなく、例えば、１０塩基以上が好ましく、より好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは１８〜３５塩基である。プローブの長さが適切であれば（前記範囲内であれば）、非特異的なハイブリダイゼーション（ミスマッチ）を抑制し、特異的な検出に使用することができる。また本発明に用いるプローブの設計の際には、Ｔｍも確認しておくことが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッド形成する温度を意味し、鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡとプローブとが二本鎖を形成してハイブリダイズするためには、ハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こりやすくなるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。
本発明に用いるプローブを設計する際、プローブの長さは限定されるものではなく、例えば、１０塩基以上が好ましく、より好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは１８〜３５塩基である。プローブの長さが適切であれば（前記範囲内であれば）、非特異的なハイブリダイゼーション（ミスマッチ）を抑制し、特異的な検出に使用することができる。また本発明に用いるプローブの設計の際には、Ｔｍも確認しておくことが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッド形成する温度を意味し、鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡとプローブとが二本鎖を形成してハイブリダイズするためには、ハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こりやすくなるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。
従って、設計しようとする核酸断片のＴｍはハイブリダイゼーションを行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプローブ設計用ソフトウェアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウェアとしては、例えばＰｒｏｂｅ Ｑｕｅｓｔ（登録商標；ダイナコム社）などが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウェアを使わずに自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明のプローブにおいては、限定はされないが、平均Ｔｍが約３５〜７０℃又は４５〜６０℃であることが好ましい。なお、プローブとして特異的なハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量等があり、その条件は当業者に周知である。
さらに本発明のプローブには、例えば、タグ配列などの付加配列が含まれていてもよい。タグ配列としては、例えば「AAAAAAA」のようなスペーサー配列が一例として挙げられる。本発明の方法において、検出目的となる前記口腔内細菌が有する核酸の塩基配列は、すべての場合において当該塩基配列そのものである必要はなく、塩基配列の一部が欠失、置換、挿入等により変異が生じたものであってもよい。したがって、検出目的の核酸の塩基配列は、当該塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつそれぞれの塩基配列に由来する機能や活性を有する変異型遺伝子も対象とすることができ、プローブは、このような変異型遺伝子の塩基配列を基礎として設計することもできる。
設計されるプローブとしては、具体的には、前述のプローブ(a)の配列が含まれる。また、これらのＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ口腔内細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列を検出し得る機能を有するＤＮＡを含むものが好ましく挙げられる。このようなＤＮＡの塩基配列としては、プローブ(a)に対して少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上である。
実際にプローブを検出に用いる際にはハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーも考慮する必要がある。ストリンジェンシーをある程度緊密にすることによって、各種の口腔内細菌において各々の核酸中の特定の領域間で類似する塩基配列領域が存在しても、他の異なる領域を区別してハイブリダイズすることができる。また、当該特定の領域間の塩基配列がほとんど異なる場合は、ストリンジェンシーを緩やかに設定することができる。
このようなストリンジェンシーの条件としては、例えば緊密条件の場合は５０〜６０℃の条件下でのハイブリダイゼーションであり、ゆるやかな条件の場合は３０〜４０℃の条件下でのハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーションの条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、４０℃」、「０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、３７℃」、「０．２４ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、３０℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「０．２４ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、５０℃」、「０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、５５℃」、「０．０６Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．０６Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、６０℃」等の条件を挙げることができる。
より詳細には、プローブを添加して１時間以上５０℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０中、５０℃で２０分の洗浄を４回、最後に、０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４ＭＮａＣｌ、５０℃で１０分の洗浄を１回行う方法もある。ハイブリダイゼーション、又は洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件を設定することができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning， A Laboratory Manual 4th ed.」（Cold Spring Harbor Press (2012)、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons (1987-1997))等を参照することができる。
また、本発明に用いるプローブを構成するヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡ、又はＰＮＡのいずれであってもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡの２種以上のハイブリッドであってもよい。例えば、通常のオリゴヌクレオチド合成法を使用して化学合成する（精製はＨＰＬＣ等により行う）ことにより作製することができる。また上記ヌクレオチドの末端、中間を化学修飾したものを使用することもできる。
２．口腔内細菌量の測定に用いる口腔内細菌遺伝子検出用ＤＮＡチップ
前記したように、本発明の方法においては、ＤＮＡチップを用いることができ、当該ＤＮＡチップは、前記１.項で説明した各種オリゴヌクレオチドプローブが支持体となる基盤に複数配置されたものである。支持体となる基盤の形態としては、平板（ガラス板、樹脂板、シリコン板等）、棒状、ビーズ等のいずれの形態のものも使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔もって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０， ４６７−４７０ （１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１， ７６７−７７３ （１９９１）等参照）。
前記したように、本発明の方法においては、ＤＮＡチップを用いることができ、当該ＤＮＡチップは、前記１.項で説明した各種オリゴヌクレオチドプローブが支持体となる基盤に複数配置されたものである。支持体となる基盤の形態としては、平板（ガラス板、樹脂板、シリコン板等）、棒状、ビーズ等のいずれの形態のものも使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔もって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０， ４６７−４７０ （１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１， ７６７−７７３ （１９９１）等参照）。
他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、所定のプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるＤＮＡチップ（以下「繊維型ＤＮＡチップ」と言う）が好ましく例示できる。このマイクロアレイは、貫通孔基板に核酸を固定化したタイプのものと説明することもでき、いわゆる「貫通孔型ＤＮＡチップ」とも言われる（特許第３５１０８８２号公報等参照）。
プローブの支持体への固定方法は限定されず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定することもできる。以下、ＤＮＡチップの一形態である繊維型ＤＮＡチップに関して詳細に説明する。このＤＮＡチップは、例えば、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を経て作製することができる。
（ｉ） 複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列して配列体を製造する工程
（ｉｉ） 前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程
（ｉｉｉ） オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程
（ｉｖ） 中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程
中空繊維に使用される材料としては、限定はされないが、例えば、特開２００４−１６３２１１号公報等に記載の材料が好ましく挙げられる。
（ｉｉ） 前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程
（ｉｉｉ） オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程
（ｉｖ） 中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程
中空繊維に使用される材料としては、限定はされないが、例えば、特開２００４−１６３２１１号公報等に記載の材料が好ましく挙げられる。
中空繊維は、その長手方向の長さが同一となるように３次元に配列される（工程（ｉ））。
配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１−１０８９２８号公報参照）や、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ね合わせ、それらの孔部に中空繊維を通過させ、その後２枚の多孔板の間隔を開いて仮固定し、２枚の多孔板間における中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させて硬化させる方法（特開２００１−１３３４５３号公報参照）などが挙げられる。製造された配列体はその配列が乱れないように包埋される（工程（ｉｉ））。
配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１−１０８９２８号公報参照）や、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ね合わせ、それらの孔部に中空繊維を通過させ、その後２枚の多孔板の間隔を開いて仮固定し、２枚の多孔板間における中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させて硬化させる方法（特開２００１−１３３４５３号公報参照）などが挙げられる。製造された配列体はその配列が乱れないように包埋される（工程（ｉｉ））。
包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂及びエポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法のほか、繊維どうしを熱融着により接着する方法等が好ましく挙げられる。
包埋された配列体には、各中空繊維の中空部に、オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液（ゲル形成溶液）を充填し、中空部内で重合反応を行う（工程（ｉｉｉ））。これにより、各中空繊維の中空部に、プローブが固定されたゲル状物を保持させることができる。ゲル前駆体重合性溶液とは、ゲル形成重合性モノマー等の反応性物質を含有する溶液であって、該モノマー等を重合、架橋させることにより該溶液がゲル状物となることが可能な溶液をいう。そのようなモノマーとしては、例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドン、メチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。この場合、溶液には重合開始剤等が含まれていてもよい。中空繊維内にプローブを固定した後、中空繊維の長手方向と交差する方向（好ましくは直交する方向）で、ブロック体を切断して薄片化する（工程（ｉｖ））。このようにして得られた薄片は、ＤＮＡチップとして使用できる。当該ＤＮＡチップの厚みは、０．０１ｍｍ〜１ｍｍ程度であることが好ましい。ブロック体の切断は、例えば、ミクロトーム及びレーザー等により行うことができる。前記した繊維型ＤＮＡチップとしては、例えば、三菱ケミカル社製ＤＮＡチップ（Ｇｅｎｏｐａｌ ＴＭ）等が好ましく挙げられる。
繊維型ＤＮＡチップでは、前記のように、プローブはゲル内で３次元的に配列され、３次元構造を維持することが可能となる。そのため、表面をコートしたスライドガラスにプローブを結合させた平面ＤＮＡチップに比べて、検出効率が上昇し、高感度で高再現性の検査をすることが可能となる。また、ＤＮＡチップに配置されるプローブの種類の数は、１つのＤＮＡチップに５００種類以下、好ましくは２５０種類以下、さらに好ましくは１００種類以下が好ましい。このように配置されたプローブ数（種類）をある程度制限することにより、目的の口腔内細菌をより高感度で検出することが可能となる。なお、プローブの種類は塩基配列によって区別される。従って、通常、同じ遺伝子に由来のプローブであっても塩基配列が１個でも異なれば別の種類として特定する。
３．口腔内細菌遺伝子の検出
本発明の方法において、口腔内細菌を検出するために当該細菌の遺伝子を検出する方法は、例えば、下記の工程を含む方法である。
（ｉ）被験者から採取した口腔内試料を検体とし、検体中の核酸を抽出する工程
（ｉｉ）抽出した核酸を、前記した本発明のオリゴヌクレオチドプローブ又は本発明のＤＮＡチップに接触させる工程
（ｉｉｉ）ＤＮＡチップから得られたシグナル強度からSN比を算出する工程、または細菌量を算出する工程
本発明の方法において、口腔内細菌を検出するために当該細菌の遺伝子を検出する方法は、例えば、下記の工程を含む方法である。
（ｉ）被験者から採取した口腔内試料を検体とし、検体中の核酸を抽出する工程
（ｉｉ）抽出した核酸を、前記した本発明のオリゴヌクレオチドプローブ又は本発明のＤＮＡチップに接触させる工程
（ｉｉｉ）ＤＮＡチップから得られたシグナル強度からSN比を算出する工程、または細菌量を算出する工程
以下に、当該検出方法の詳細を工程ごとに説明する。
（１）工程（ｉ）について
本工程では、被験者又は被生物から採取した口腔内試料を検体とし、検体中に含まれる細菌の核酸を抽出する。採取する口腔内試料の種類は、特には限定されない。例えば、唾液、プラーク（歯肉縁下プラーク、歯肉縁上プラーク）、舌苔、口腔洗浄液等を使用することができ、これらの中でもプラークが好ましく、その中でも、歯周病細菌が最も多く棲息している場所から採取する歯肉縁下プラークがより好ましい。
（１）工程（ｉ）について
本工程では、被験者又は被生物から採取した口腔内試料を検体とし、検体中に含まれる細菌の核酸を抽出する。採取する口腔内試料の種類は、特には限定されない。例えば、唾液、プラーク（歯肉縁下プラーク、歯肉縁上プラーク）、舌苔、口腔洗浄液等を使用することができ、これらの中でもプラークが好ましく、その中でも、歯周病細菌が最も多く棲息している場所から採取する歯肉縁下プラークがより好ましい。
口腔内試料を採取する方法は特には限定されず、試料の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、口腔内試料として唾液を使用する場合は、市販の唾液採取キットを利用する方法、綿棒を口に含み唾液を採取する方法、唾液を容器に直接採取する方法等が挙げられる。
口腔内試料としてプラークを使用する場合、歯ブラシによる歯面や歯間のブラッシング、綿棒による歯面擦過、歯間ブラシによる歯間擦過、ペーパーポイント法等が挙げられる。プラークの採取に使用した歯ブラシ、綿棒、歯間ブラシ又はペーパーポイントを滅菌水中に浸して必要に応じて撹拌等することにより、プラークを溶解又は懸濁させ、得られた溶液又は懸濁液を検体とすることもできる。採取するプラークの量は特には限定されず、例えば、ペーパーポイント１本分あれば良い。口腔内試料として舌苔を使用する場合、綿棒による舌面擦過する方法等が挙げられる。プラークの採取に使用した綿棒を溶解又は懸濁させ、得られた溶液又は懸濁液を検体とすることもできる。採取する舌苔の量は特には限定されず、例えば、綿棒１本分あれば良い。
口腔内試料として口腔洗浄液を使用する場合、口腔洗浄液又は水を口に含み、口腔洗浄液又は水とともに唾液を容器に採取し、得られた溶液を検体とする方法が挙げられる。口腔洗浄液としては、例えば滅菌された生理食塩水等が挙げられる。次いで、得られた口腔内試料中に存在する細菌の核酸抽出を行う。抽出の方法は限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、機器による自動抽出法、市販の核酸抽出キットを利用する方法、ビーズで破砕する方法、プロテイナーゼＫ処理後にフェノール抽出する方法、クロロホルムを利用する方法又は簡易抽出方法として、試料を加熱、溶解する方法等が挙げられる。これらを組み合せて処理してもよい。また、特に検体中から核酸を抽出せず、次の工程に進んでも良い。
検体から得られた核酸は、そのままＤＮＡチップ等に接触させてもよいし、ＰＣＲ等により所望の塩基配列領域を増幅し、その増幅断片をＤＮＡチップ等に接触させてもよく、限定はされない。得られた核酸をテンプレートとして増幅する領域は、本発明に用いるプローブ、又はＤＮＡチップに配置したオリゴヌクレオチドの塩基配列を含む核酸領域をコードする部位である。増幅する所望の領域は、限定はされず、前記口腔内細菌の種を問わず保存性の高い領域の塩基配列を利用し、多種類の混合物を一度に増幅して得ることができる。このような増幅のための配列は、実験的に単離、精製し、単離されたポリヌクレオチドの塩基配列を解析し、その配列に基づいて決定してもよいし、また、塩基配列等の各種データベースで既知の塩基配列を検索し、アラインメントを取ることなどによって、Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏで決定してもよい。核酸又はアミノ酸などのデータベースは、特に限定されるものではないが、例えば、DDBJ (DNA Data Bank of Japan)、EMBL (European Molecular BiologyLaboratry，EMBL nucleic acid sequence data library)、GenBank (Geneticsequence data bank)、NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)のＴａｘｏｎｏｍｙデータベース等を利用できる。
具体的に、増幅する所望の部位としては、前記口腔内細菌の染色体ＤＮＡ中のリボソームＲＮＡ （１６Ｓ ｒＲＮＡ）遺伝子であることが好ましい。当該領域の増幅に用い得るＰＣＲプライマーとしては、例えば、表２（配列番号３７、３８）、表３（配列番号４１〜５３）が好ましく挙げられる。なお、ＰＣＲ法による核酸の増幅は、定法に従って行うことができる。
本工程において抽出した核酸及びその増幅断片は、適宜標識化し、ハイブリダイズさせた後の検出過程において利用することも可能である。具体的には、ＰＣＲプライマーの末端を各種レポーター色素で標識しておく方法、反応性のヌクレオチドアナログを逆転写反応時に取り込ませる方法、ビオチン標識したヌクレオチドを取り込ませる方法などが考えられる。さらに、調製後に蛍光標識試薬と反応させて標識することも可能である。蛍光試薬としては、例えば、各種レポーター色素（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＶＩＣ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ等）を用いることができる。
（２）工程（ｉｉ）について
本工程では、工程（ｉ）で得た核酸又はその増幅断片を、本発明に用いるプローブ又はＤＮＡチップに接触させるが、具体的には、当該核酸等を含むハイブリダイゼーション溶液を調製し、当該溶液中の核酸等を、ＤＮＡチップに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブに結合（ハイブリダイズ）させる。ハイブリダイゼーション溶液は、ＳＤＳやＳＳＣ等の緩衝液を用いて、定法に従い、適宜調製することができる。ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション溶液中の核酸等が、ＤＮＡチップに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう、反応条件（緩衝液の種類、ｐＨ、温度等）を適宜設定して行うことができる。なお、ここで言う「ストリンジェントな条件」とは、類似配列によるクロスハイブリダイゼーションを生じにくい、又は類似配列によってクロスハイブリダイゼーションした核酸を解離させる条件のことをいい、具体的には、ハイブリダイゼーション反応時又はハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの洗浄条件を意味する。
本工程では、工程（ｉ）で得た核酸又はその増幅断片を、本発明に用いるプローブ又はＤＮＡチップに接触させるが、具体的には、当該核酸等を含むハイブリダイゼーション溶液を調製し、当該溶液中の核酸等を、ＤＮＡチップに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブに結合（ハイブリダイズ）させる。ハイブリダイゼーション溶液は、ＳＤＳやＳＳＣ等の緩衝液を用いて、定法に従い、適宜調製することができる。ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション溶液中の核酸等が、ＤＮＡチップに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう、反応条件（緩衝液の種類、ｐＨ、温度等）を適宜設定して行うことができる。なお、ここで言う「ストリンジェントな条件」とは、類似配列によるクロスハイブリダイゼーションを生じにくい、又は類似配列によってクロスハイブリダイゼーションした核酸を解離させる条件のことをいい、具体的には、ハイブリダイゼーション反応時又はハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの洗浄条件を意味する。
例えば、ハイブリダイゼーション反応時の条件としては、反応温度は、３５〜７０℃が好ましく、より好ましくは４０〜６５℃であり、ハイブリダイズさせる際の時間は、約１分〜１６時間が好ましい。また、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの洗浄条件としては、洗浄液組成は、０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０であることが好ましく、洗浄時の温度は、３５〜８０℃又は４０〜６５℃が好ましく、より好ましくは４５〜６０℃である。より具体的には、塩（ナトリウム）濃度が４８〜７８０ｍＭであり、温度が３７〜８０℃である条件が好ましく、より好ましくは塩濃度が９７．５〜３９０ｍＭであり、温度が４５〜６０℃である条件である。
洗浄後は、プローブに結合した核酸等の標識を検出できる装置により、スポットごとに検出強度を測定する。例えば、前記核酸等を蛍光標識化していた場合は、各種蛍光検出装置、例えば、ＣＲＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）、ａｒｒａｙＷｏＲｘ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４２８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，社製）、ＧｅｎｅＰｉｘ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＳｃａｎＡｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）、ジェノパールリーダー（三菱ケミカル社製）などを用いて、蛍光強度を測定することができる。これらの装置については、蛍光スキャナーの場合は、例えば、レーザーの出力、検出部の感度を適宜調整してスキャンを行うことができ、ＣＣＤカメラ型のスキャナーの場合は、露光時間を適宜調節してスキャンを行うことができる。スキャンの結果に基づく定量方法は、定量ソフトウェアにより行う。定量ソフトウェアに特に限定はなく、スポットの蛍光強度の平均値、中央値等を用いて定量することができる。また、定量にあたっては、ＤＮＡフラグメントのスポット範囲の寸法精度などを考慮し、プローブを搭載していないスポットの蛍光強度をバックグラウンドとして用いるなど、調整を行うことが好ましい。
（３）工程（ｉｉｉ）について
本工程では、前記の手順で得られたシグナル強度より、検出対象菌種の細菌の細菌量を算出する。たとえば、検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度とバックグラウンドのシグナル強度の比からＳＮ比として示す方法がある。シグナル強度は細菌の存在量と比例するため、コピー数を算出する必要がない場合においては、SN比を解析にそのまま用いることもできる。
本工程では、前記の手順で得られたシグナル強度より、検出対象菌種の細菌の細菌量を算出する。たとえば、検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度とバックグラウンドのシグナル強度の比からＳＮ比として示す方法がある。シグナル強度は細菌の存在量と比例するため、コピー数を算出する必要がない場合においては、SN比を解析にそのまま用いることもできる。
あるいは、あらかじめ細菌ごとに細菌の染色体ＤＮＡの濃度を変えて複数条件にて検出し、各濃度条件で得られるシグナル強度を元に、細菌ごとに染色体ＤＮＡ濃度を算出する換算係数（検量線）を取得しておき、それぞれの条件で得られたシグナル強度から染色体ＤＮＡの濃度を算出する方法を用いることもできる。この場合は、結果を細菌のコピー数として算出することもできる。
さらに、いずれの場合でも、各ＤＮＡチップの検出対象細菌のシグナル強度に補正係数を考慮することでシグナル強度やコピー数を補正してもよい。補正とシグナル強度・コピー数換算の順序は特に問わない。
４．歯周病の状態の判定
本発明においては、口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定し、当該シグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、得られた算出値を指標として歯周病の状態を判定する。
口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度の測定には、いかなるツールを用いてもよく、前記３．項で説明したようにＤＮＡチップを用いる方法や、その他、リアルタイムPCRを用いる方法やFISH法を用いる方法が挙げられる。
シグナル強度の測定値としては、ＤＮＡチップから得られるＳＮ比やリアルタイムＰＣＲで得られるＣｔ値、ＦＩＳＨ法から得られる蛍光強度等が挙げられる。
本発明においては、口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定し、当該シグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、得られた算出値を指標として歯周病の状態を判定する。
口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度の測定には、いかなるツールを用いてもよく、前記３．項で説明したようにＤＮＡチップを用いる方法や、その他、リアルタイムPCRを用いる方法やFISH法を用いる方法が挙げられる。
シグナル強度の測定値としては、ＤＮＡチップから得られるＳＮ比やリアルタイムＰＣＲで得られるＣｔ値、ＦＩＳＨ法から得られる蛍光強度等が挙げられる。
細菌群の存在割合とは、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種（正の相関菌）の細菌量と歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種（負の相関菌）の細菌量との相関関係を言う。
相関関係の例としては、正の相関菌の細菌量の総和と負の相関菌の細菌量の総和との比（Σ正の相関菌の細菌量／Σ負の相関菌の細菌量）、負の相関菌の細菌量の総和から正の相関菌の細菌量の総和を引いた値（Σ負の相関菌の細菌量−Σ正の相関菌の細菌量）、正の相関菌の細菌量の総和に所定係数を乗じた値と負の相関菌の細菌量の総和に所定係数を乗じた値との比（Σ係数×正の相関菌の細菌量／Σ係数×負の相関菌の細菌量）、正の相関菌の細菌量の総和に所定の正の係数を乗じた値と負の相関菌の細菌量の総和に所定の負の係数を乗じた値との和（Σ正の係数×正の相関菌の細菌量＋Σ負の係数×負の相関菌の細菌量）の値などが挙げられる。
相関関係の例としては、正の相関菌の細菌量の総和と負の相関菌の細菌量の総和との比（Σ正の相関菌の細菌量／Σ負の相関菌の細菌量）、負の相関菌の細菌量の総和から正の相関菌の細菌量の総和を引いた値（Σ負の相関菌の細菌量−Σ正の相関菌の細菌量）、正の相関菌の細菌量の総和に所定係数を乗じた値と負の相関菌の細菌量の総和に所定係数を乗じた値との比（Σ係数×正の相関菌の細菌量／Σ係数×負の相関菌の細菌量）、正の相関菌の細菌量の総和に所定の正の係数を乗じた値と負の相関菌の細菌量の総和に所定の負の係数を乗じた値との和（Σ正の係数×正の相関菌の細菌量＋Σ負の係数×負の相関菌の細菌量）の値などが挙げられる。
なお、正の相関菌の種の数と、負の相関菌の種の数が異なる場合は、両者が同じ細菌種数から計算された結果となるように補正することが好ましい。
例えば、「正の相関菌」群のSN比の総和を算出した後、その「正の相関菌」群の種類数で除算することにより、「正の相関菌」群の平均SN比を算出する。同様に、「負の相関菌」群のSN比の総和を算出した後、その「負の相関菌」群の種類数で除算することにより、「負の相関菌」群の平均SN比を算出する。
最後に「正の相関菌」群の平均SN比と「負の相関菌」群の平均SN比の比率を取ることにより、バランス指標とすることができる。
細菌群の存在割合としては、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との「比」を用いることが好ましい。
例えば、「正の相関菌」群のSN比の総和を算出した後、その「正の相関菌」群の種類数で除算することにより、「正の相関菌」群の平均SN比を算出する。同様に、「負の相関菌」群のSN比の総和を算出した後、その「負の相関菌」群の種類数で除算することにより、「負の相関菌」群の平均SN比を算出する。
最後に「正の相関菌」群の平均SN比と「負の相関菌」群の平均SN比の比率を取ることにより、バランス指標とすることができる。
細菌群の存在割合としては、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との「比」を用いることが好ましい。
このようにして得られた存在割合の算出値をバランス指標と呼ぶ。
バランス指標を算出するための分子及び分母は任意であり、どちらを分母又は分子にしてもよい。例えば、分母を歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種群のＳＮ比、分子を歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種群のＳＮ比とすることも、分母を歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種群のＳＮ比、分子を歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種群のＳＮ比とすることもできる。
バランス指標を算出するための分子及び分母は任意であり、どちらを分母又は分子にしてもよい。例えば、分母を歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種群のＳＮ比、分子を歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種群のＳＮ比とすることも、分母を歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種群のＳＮ比、分子を歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種群のＳＮ比とすることもできる。
これまでの細菌検査においては、「悪玉菌」に相当する細菌を検出することによって歯周病の状態を判定していた。これらは歯周ポケットがある程度大きくなった後に増加する細菌種であるため、悪化した後の情報しか得ることが出来なかった。本発明においては、「善玉菌」に相当する細菌群を使用してバランス指標を算出し、歯周病の状態を判定するため、健康な状態も判定することができる。
より詳しく説明すると以下のように考えられる。
「悪玉菌」の細菌量は歯周ポケットの数値に対して単調増加関数となり、一方、「善玉菌」の細菌量は歯周ポケットの数値に対して単調減少関数となる。
「悪玉菌」の細菌量を縦軸にとり、歯周ポケットの数値を横軸にとる場合は、歯周ポケットの数値が０−３ｍｍの間で判定できる数値が無い、ということが生じうる。
一方、「悪玉菌」の細菌量／「善玉菌」の細菌量の指標を縦軸にとり、歯周ポケットの数値を横軸にとると、この関数は変曲点が明確に現れ、その付近で判定できるという点で優れている。また、歯周ポケットの数値が０−３ｍｍの間で判定できる数値が存在し、この数値をもって健康な状態も判定することができる。
「悪玉菌」の細菌量は歯周ポケットの数値に対して単調増加関数となり、一方、「善玉菌」の細菌量は歯周ポケットの数値に対して単調減少関数となる。
「悪玉菌」の細菌量を縦軸にとり、歯周ポケットの数値を横軸にとる場合は、歯周ポケットの数値が０−３ｍｍの間で判定できる数値が無い、ということが生じうる。
一方、「悪玉菌」の細菌量／「善玉菌」の細菌量の指標を縦軸にとり、歯周ポケットの数値を横軸にとると、この関数は変曲点が明確に現れ、その付近で判定できるという点で優れている。また、歯周ポケットの数値が０−３ｍｍの間で判定できる数値が存在し、この数値をもって健康な状態も判定することができる。
また、本発明においては、バランス指標をカットオフ値と比較することにより歯周病の状態を判定することが好ましい。
カットオフ値は、細菌群の存在割合（バランス指標）の閾値又は基準値としての機能を有する値である。
あらかじめ基準策定用口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定しておいて、そのシグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、得られた算出値（バランス指標）からROC曲線を作成し、そしてこのROC曲線から定めることができる。カットオフ値は、ROC曲線の図の左上からの距離が小さくなるように選択することが好ましい。しかし目的（必要な感度や特異度の大きさ）によって適宜変更することが可能である。
カットオフ値は、細菌群の存在割合（バランス指標）の閾値又は基準値としての機能を有する値である。
あらかじめ基準策定用口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定しておいて、そのシグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、得られた算出値（バランス指標）からROC曲線を作成し、そしてこのROC曲線から定めることができる。カットオフ値は、ROC曲線の図の左上からの距離が小さくなるように選択することが好ましい。しかし目的（必要な感度や特異度の大きさ）によって適宜変更することが可能である。
また、カットオフ値は、上記ROC曲線のほか、クラスター分析により定めることもできる。より具体的には、k-means法でクラスター分析する際に、エルボー法により最適なクラスター数を検討、決定する、またはx-means法にて自動でクラスター数を出力させる等行った後、そのクラスター間の境界に対応する指標をカットオフ値にすることが考えられる。
判定モデル作成の第一の態様としては、「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」と「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」との存在割合（バランス指標）に基づく判定モデルが考えられる。
各種細菌の例は、項目１．で記載した通りである。
各種細菌の例は、項目１．で記載した通りである。
歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種としては、特に限定されないが、Fusobacterium nucleatum種（「経過指標細菌」）以外の細菌種を１種以上含むことが好ましい。具体的には、Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Campylobacter gracilis,Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Fusobacterium periodonticum, Prevotella intermedia, Streptococcus constellatus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Eikenella corrodens, Selenomonas sputigena, Treponema medium, Eubacterium saphenum, Eubacterium nodatum, Porphyromonas endodontalis, Filifactor alocis, Peptostreptococcus stomatis, 及びTreponema socranskiiからなる群から選ばれる１種以上が好ましく、Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Fusobacterium periodonticum, Prevotella intermedia, Streptococcus constellatus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Eikenella corrodens, Selenomonas sputigena, Treponema medium, Eubacterium saphenum, Eubacterium nodatum, Porphyromonas endodontalis,及びFilifactor alocisからなる群から選ばれる１種以上がより好ましい。
用いる細菌種は、４種以上であることが好ましく、８種以上であることがより好ましく１２種以上であることがさらに好ましく、１４種以上であることが特に好ましい。用いる細菌種は、１００種以下であることが好ましく、７５種以下であることがより好ましく５０種以下であることがさらに好ましく、２５種以下であることが特に好ましい。
歯周ポケットの数値の増加に伴い減少する細菌種としては、特に限定されないが、具体的には、Streptococcus parasanguinis, Haemophilus parainfluenzae, Streptococcus salivarius, Granulicatella adiacens, Rothia dentocariosa, Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308), Veillonella rogosae, Porphyromonas pasteri, Prevotella shahii, Prevotella pallens, Veillonella atypica, Actinomyces graevenitzii, Megasphaera micronuciformis, Prevotella loescheii, Neisseria flavescens, Solobacterium moorei, Porphyromonas catoniae, Rothia mucilaginosa, Corynebacterium matruchotii, Eubacterium sulci, Gemella sanguinis, Prevotella melaninogenica, Prevotella denticola, Prevotella nigrescens, Campylobacter concisus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mitis bv 2, Actinomyces odontolyticus, Veillonella parvula, Actinomyces naeslundii II, Selenomonas noxia, SR1 sp. OT 345, Parvimonas micra, Streptococcus sobrinus, Actinomyces israelii,及びPrevotella histicolaからなる群から選ばれる１種以上が好ましく、Streptococcus parasanguinis, Haemophilus parainfluenzae, Streptococcus salivarius, Granulicatella adiacens, Rothia dentocariosa, Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308), Veillonella rogosae, Porphyromonas pasteri, Prevotella shahii, Prevotella pallens, Veillonella atypica, Actinomyces graevenitzii, Megasphaera micronuciformis, Prevotella loescheii, Neisseria flavescens, Solobacterium moorei, Porphyromonas catoniae, Rothia mucilaginosa, Corynebacterium matruchotii, Eubacterium sulci, Gemella sanguinis, Prevotella melaninogenica, Prevotella denticola, Prevotella nigrescens, Campylobacter concisus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mitis bv 2, Actinomyces odontolyticus, Veillonella parvula, Actinomyces naeslundii II,及びSelenomonas noxiaからなる群から選ばれる１種以上がより好ましい。
歯周ポケットの数値の増加に伴い減少する細菌種としては、特に限定されないが、具体的には、Streptococcus parasanguinis, Haemophilus parainfluenzae, Streptococcus salivarius, Granulicatella adiacens, Rothia dentocariosa, Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308), Veillonella rogosae, Porphyromonas pasteri, Prevotella shahii, Prevotella pallens, Veillonella atypica, Actinomyces graevenitzii, Megasphaera micronuciformis, Prevotella loescheii, Neisseria flavescens, Solobacterium moorei, Porphyromonas catoniae, Rothia mucilaginosa, Corynebacterium matruchotii, Eubacterium sulci, Gemella sanguinis, Prevotella melaninogenica, Prevotella denticola, Prevotella nigrescens, Campylobacter concisus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mitis bv 2, Actinomyces odontolyticus, Veillonella parvula, Actinomyces naeslundii II, Selenomonas noxia, SR1 sp. OT 345, Parvimonas micra, Streptococcus sobrinus, Actinomyces israelii,及びPrevotella histicolaからなる群から選ばれる１種以上が好ましく、Streptococcus parasanguinis, Haemophilus parainfluenzae, Streptococcus salivarius, Granulicatella adiacens, Rothia dentocariosa, Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308), Veillonella rogosae, Porphyromonas pasteri, Prevotella shahii, Prevotella pallens, Veillonella atypica, Actinomyces graevenitzii, Megasphaera micronuciformis, Prevotella loescheii, Neisseria flavescens, Solobacterium moorei, Porphyromonas catoniae, Rothia mucilaginosa, Corynebacterium matruchotii, Eubacterium sulci, Gemella sanguinis, Prevotella melaninogenica, Prevotella denticola, Prevotella nigrescens, Campylobacter concisus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mitis bv 2, Actinomyces odontolyticus, Veillonella parvula, Actinomyces naeslundii II,及びSelenomonas noxiaからなる群から選ばれる１種以上がより好ましい。
用いる細菌種は、２種以上であることが好ましく、１０種以上であることがより好ましく２０種以上であることがさらに好ましい。用いる細菌種は、１００種以下であることが好ましく、７５種以下であることがより好ましく５０種以下であることがさらに好ましく、２５種以下であることが特に好ましい。
歯周病の状態が既知の基準策定用口腔内試料中に存在する上記細菌群由来の核酸のシグナル強度の測定値から上記細菌群の存在割合を算出し、当該算出値（バランス指標）からカットオフ値を求める。
その後、歯周病の状態が不明の試料の判定において、上記の細菌群を一括して検出した後、同様にバランス指標を算出し、上記のカットオフ値と比較することにより、状態を判定する。
第一の態様の判定モデルによれば、歯周病の状態が未知のサンプルを、カットオフ値により、２つのグループに判定することができる。
その後、歯周病の状態が不明の試料の判定において、上記の細菌群を一括して検出した後、同様にバランス指標を算出し、上記のカットオフ値と比較することにより、状態を判定する。
第一の態様の判定モデルによれば、歯周病の状態が未知のサンプルを、カットオフ値により、２つのグループに判定することができる。
一例として、非疾患状態と疾患状態とを判定するモデルを説明する。
非疾患状態と疾患状態は適宜定義できるが、本願では、非疾患状態を歯周ポケット深さ1〜3ｍｍ、疾患状態を歯周ポケット深さ5ｍｍ以上と定義する。つまり、歯周ポケット深さ4ｍｍは、疾患状態か非疾患状態か不明の状態である。
歯周ポケット深さ1〜3ｍｍの試料と、歯周ポケット深さ5ｍｍ以上の試料について、各種細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定し、測定値から各種細菌群の存在割合を算出し、当該算出値（バランス指標）からカットオフ値を求める。その後、歯周ポケット深さ4ｍｍの試料について、同様にバランス指標を算出し、これを先ほどのカットオフ値と比較することで、疾患状態が不明であった歯周ポケット深さ4ｍｍ群を、非疾患状態（歯周ポケット深さ1〜3ｍｍ群と同程度）と疾患状態（歯周ポケット深さ5ｍｍ群と同程度）とに判定することができる。従来判定が困難とされてきた歯周ポケット深さ4ｍｍ群の判定が可能になるという点で、本発明の方法は非常に有益である。
非疾患状態と疾患状態は適宜定義できるが、本願では、非疾患状態を歯周ポケット深さ1〜3ｍｍ、疾患状態を歯周ポケット深さ5ｍｍ以上と定義する。つまり、歯周ポケット深さ4ｍｍは、疾患状態か非疾患状態か不明の状態である。
歯周ポケット深さ1〜3ｍｍの試料と、歯周ポケット深さ5ｍｍ以上の試料について、各種細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定し、測定値から各種細菌群の存在割合を算出し、当該算出値（バランス指標）からカットオフ値を求める。その後、歯周ポケット深さ4ｍｍの試料について、同様にバランス指標を算出し、これを先ほどのカットオフ値と比較することで、疾患状態が不明であった歯周ポケット深さ4ｍｍ群を、非疾患状態（歯周ポケット深さ1〜3ｍｍ群と同程度）と疾患状態（歯周ポケット深さ5ｍｍ群と同程度）とに判定することができる。従来判定が困難とされてきた歯周ポケット深さ4ｍｍ群の判定が可能になるという点で、本発明の方法は非常に有益である。
判定モデル作成の第二の態様としては、「経過指標細菌（Fusobacterium nucleatum種）」と「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」の存在割合に基づく判定モデルが考えられる。第一の態様における「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群を、「経過指標細菌」であるFusobacterium nucleatum種と置き換える。
各種細菌の例は、項目１．で記載した通りである。
Fusobacterium nucleatum種としては、特に限定されないが、具体的には、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、及びFusobacterium nucleatum subsp. Polymorphumからなる群から選ばれる１種以上が好ましく、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、及びFusobacterium nucleatum subsp. Nucleatumからなる群から選ばれる１種、または２種がより好ましい。
Fusobacterium nucleatum種としては、特に限定されないが、具体的には、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、及びFusobacterium nucleatum subsp. Polymorphumからなる群から選ばれる１種以上が好ましく、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、及びFusobacterium nucleatum subsp. Nucleatumからなる群から選ばれる１種、または２種がより好ましい。
歯周ポケットの数値の増加に伴い減少する細菌種としては、第一の態様と同じものが好ましく用いられる。
第一の態様の判定モデルと同様に、カットオフ値を算出し、これにより２つのグループに判定することができる。
第二の態様の判定モデルによれば、歯周ポケットの数値が小さい時の状態を第一の態様より良好に捉えることができる。
第一の態様の判定モデルと同様に、カットオフ値を算出し、これにより２つのグループに判定することができる。
第二の態様の判定モデルによれば、歯周ポケットの数値が小さい時の状態を第一の態様より良好に捉えることができる。
本発明と類似の指標として、「悪玉菌」であるPorphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticolaの細菌量の合計と、「経過指標細菌」であるFusobacterium nucleatumの細菌量との比率を指標としている例がある。本発明では、「善玉菌」群との比率を指標としている点が異なる。本発明の指標によれば、悪化の経過をより明確に判定することが出来る。
より詳しく説明すると以下のように考えられる。
「悪玉菌」の細菌量は歯周ポケットの数値に対して単調増加関数となり、一方、「善玉菌」の細菌量は歯周ポケットの数値に対して単調減少関数となる。
「悪玉菌」の細菌量／「経過指標細菌」の細菌量の指標を縦軸にとり、歯周ポケットの数値を横軸にとる場合では、健康な状態のサンプルでは「悪玉菌」細菌量が少なく、全く検出されない結果も生じうる。すなわち、歯周ポケットの数値が０−３ｍｍの間で判定できる数値が無い、ということが生じうる。
「悪玉菌」の細菌量は歯周ポケットの数値に対して単調増加関数となり、一方、「善玉菌」の細菌量は歯周ポケットの数値に対して単調減少関数となる。
「悪玉菌」の細菌量／「経過指標細菌」の細菌量の指標を縦軸にとり、歯周ポケットの数値を横軸にとる場合では、健康な状態のサンプルでは「悪玉菌」細菌量が少なく、全く検出されない結果も生じうる。すなわち、歯周ポケットの数値が０−３ｍｍの間で判定できる数値が無い、ということが生じうる。
一方、「悪玉菌」や「経過指標細菌」の細菌量／「善玉菌」の細菌量の指標を縦軸にとり、歯周ポケットの数値を横軸にとると、この関数は変曲点が明確に現れ、その付近で判定できるという点で優れている。また、歯周ポケットの数値が０−３ｍｍの間で判定できる数値が存在し、この数値をもって健康な状態も判定することができる。
また本発明においては、前記細菌群の存在割合として以下の(a)及び (b)を組合せて用いることができる。
(a)歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種（ただしFusobacterium nucleatum種以外の細菌種を１種以上含む。）の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係
(b) Fusobacterium nucleatum種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種との相関関係 ＤＮＡチップを用いる場合においては一括して複数の細菌群を検出できるため、複数のバランス指標を同時に算出することができる。よって、２つのバランス指標に軸として同時に判定することもでき、２×２＝４グループに分類できる。
(a)歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種（ただしFusobacterium nucleatum種以外の細菌種を１種以上含む。）の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係
(b) Fusobacterium nucleatum種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種との相関関係 ＤＮＡチップを用いる場合においては一括して複数の細菌群を検出できるため、複数のバランス指標を同時に算出することができる。よって、２つのバランス指標に軸として同時に判定することもでき、２×２＝４グループに分類できる。
本発明により得られた歯周病の状態判定は、あくまで細菌数、または細菌量に比例するSN比から推定する状態の判定であり、正確な病態を表すものではない。すなわち、正確な病態の診断は歯科医による診断が必要である。しかし、本発明によれば、歯周ポケットの数値とは別に独立して判定することができるため、新たな視点からの歯周病の早期発見・早期治療が可能になると共に、これらの予防にも貢献できる。
５．歯周病の治療効果の判定
治療とは、歯科の現場で歯科医師や歯科衛生士が一般的に実施している治療を示し、例えば、歯周基本治療としては、プラークコントロール（歯みがき指導）及び歯石の除去（スケーリング・ルートプレーニング）及びかみ合わせの調整等が挙げられる。さらに、歯周基本治療の後の再評価検査の結果、歯石がポケットの深いところに入り込んでいて除去できず、治っていない場合に実施する外科的治療があげられる。具体的な外科的治療は、例えばフラップ手術及び歯周組織再生療法及びプラスチックサージェリー（歯周形成外科手術）等である。また、歯周治療終了後の継続的なプロフェッショナルケアである「サポーティブペリオドンタルセラピー（SPT）」も、“病状安定”を維持し歯周治療の予後を良好に保つための不可欠な治療として重要である。
歯周病の治療効果の判定は、歯周病治療前及び治療後に検体を採取し、データを比較検討することにより行う。
治療とは、歯科の現場で歯科医師や歯科衛生士が一般的に実施している治療を示し、例えば、歯周基本治療としては、プラークコントロール（歯みがき指導）及び歯石の除去（スケーリング・ルートプレーニング）及びかみ合わせの調整等が挙げられる。さらに、歯周基本治療の後の再評価検査の結果、歯石がポケットの深いところに入り込んでいて除去できず、治っていない場合に実施する外科的治療があげられる。具体的な外科的治療は、例えばフラップ手術及び歯周組織再生療法及びプラスチックサージェリー（歯周形成外科手術）等である。また、歯周治療終了後の継続的なプロフェッショナルケアである「サポーティブペリオドンタルセラピー（SPT）」も、“病状安定”を維持し歯周治療の予後を良好に保つための不可欠な治療として重要である。
歯周病の治療効果の判定は、歯周病治療前及び治療後に検体を採取し、データを比較検討することにより行う。
もっとも基本的な考え方としては検体の臨床情報を活用するとともに、治療前後に増減した細菌を明らかにすることにより、その治療効果を客観的に判定することができる。また、治療後の細菌データにより、治療により減少しにくかった細菌を明らかにすることができ、特異的に治療することにも可能になる。
本発明の方法によれば、前述の「４．歯周病の状態の判定」に記載した判定を治療の前後で行うことにより、複数の細菌のバランス指標から歯周病の治療効果を判定することができる。特に同じ歯周ポケットの数値を示す歯周病の状態をさらに４つの区分に分類できる。
歯周ポケットの数値情報も加味して判定する場合においては病状安定の判定を行うこともできる。例えば、歯周ポケットの数値が４ｍｍ以上であっても、前述の「４．歯周病の状態の判定」に記載したバランス指標で「軽度」と判定されれば、病状安定と考えることができる。逆に歯周ポケットの数値が３ｍｍ以下であっても、バランス指標で「重度」と判定されれば、治療を検討する可能性があると判断できる。
これまでの説明において、細菌量を示す測定値として、ＤＮＡチップのＳＮ比を用いて説明を行ったが、ＤＮＡチップのＳＮ比と同義の数値として使用できるものであれば本発明の範囲内に含まれる。例えばＤＮＡチップのＳＮ比から換算した細菌のコピー数、リアルタイムＰＣＲで定量した細菌のコピー数、量の程度を示すCt値、次世代シークエンサーの結果得られるリード数、リード数から換算される相対量パーセンテージ等が考えられる。
６．オリゴヌクレオチドプローブセット
本発明は、以下の(a)又は(b)のDNAを含む、口腔細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。
(a) 配列番号１〜３３に示される塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号１〜３３に示される塩基配列に対して90％以上の同一性を有し、かつ、口腔細菌の染色体DNA中の16SrRNA遺伝子またはその相補鎖の一部の塩基配列にハイブリダイズするDNA
本発明は、以下の(a)又は(b)のDNAを含む、口腔細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。
(a) 配列番号１〜３３に示される塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号１〜３３に示される塩基配列に対して90％以上の同一性を有し、かつ、口腔細菌の染色体DNA中の16SrRNA遺伝子またはその相補鎖の一部の塩基配列にハイブリダイズするDNA
本発明において使用されるプローブは、配列番号１〜３３に示される33種類の塩基配列からなるDNAのうち、任意の組合せのDNAを用いることができる。例えば、配列番号１〜３３に示される塩基配列からなるDNAのうち、いずれか1種類のDNAでもよく、2種類のDNAの組合せでもよく、32種類のDNAの組合せでもよく、33種類のDNAの組合せでもよい。
「ハイブリダイズ」のストリンジェンシー条件などは、前記した内容と同様である。
「ハイブリダイズ」のストリンジェンシー条件などは、前記した内容と同様である。
また、検出の対象となる口腔細菌としては、前記と同様、Porphyromonas属、Tannerella属、Treponema属、Prevotella属、Campylobacter属、Fusobacterium属、Streptococcus属、Aggregatibacter属、Capnocytophaga属、Eikenella属、Actinomyces属、Veillonella属及びSelenomonas属のいずれかの属に属する少なくとも一種の細菌が挙げられる。
さらに、本発明は、上記オリゴヌクレオチドプローブセットが配置された、口腔細菌検出用マイクロアレイを提供する。本発明においては、マイクロアレイとして、「２．口腔内細菌量の測定に用いる口腔内細菌遺伝子検出用ＤＮＡチップ」の項に記載したものを使用することができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
さらに、本発明は、上記オリゴヌクレオチドプローブセットが配置された、口腔細菌検出用マイクロアレイを提供する。本発明においては、マイクロアレイとして、「２．口腔内細菌量の測定に用いる口腔内細菌遺伝子検出用ＤＮＡチップ」の項に記載したものを使用することができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１−１］
歯周病の状態の判定方法
歯周病の状態の判定方法
歯肉縁下プラーク検体中の口腔内細菌の検出
＜歯肉縁下プラーク検体の調製＞
大阪大学歯学部附属病院にて、歯周病治療前の状態の２０歳代から７０歳代の男女２２０名の被験者から、歯肉縁下プラークを採取した。Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ ｐａｐｅｒ ｐｏｉｎｔｓ（ＩＳＯ Ｃｏｌｏｒ−Ｃｏｄｅｄ）＃４０（ＤＥＮＴＳＰＬＹ ＭＡＩＬＬＥＦＥＲ社製）を２本、歯周ポケットに挿入して３０秒間置いた。その後、０．１５ｍＬの滅菌蒸留水を入れたマイクロチューブにペーパーポイントを投入し、２０秒間ボルテックスした。ペーパーポイントを滅菌したピンセットで取り出して、検出まで−２０℃で凍結して保管した。
＜歯肉縁下プラーク検体の調製＞
大阪大学歯学部附属病院にて、歯周病治療前の状態の２０歳代から７０歳代の男女２２０名の被験者から、歯肉縁下プラークを採取した。Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ ｐａｐｅｒ ｐｏｉｎｔｓ（ＩＳＯ Ｃｏｌｏｒ−Ｃｏｄｅｄ）＃４０（ＤＥＮＴＳＰＬＹ ＭＡＩＬＬＥＦＥＲ社製）を２本、歯周ポケットに挿入して３０秒間置いた。その後、０．１５ｍＬの滅菌蒸留水を入れたマイクロチューブにペーパーポイントを投入し、２０秒間ボルテックスした。ペーパーポイントを滅菌したピンセットで取り出して、検出まで−２０℃で凍結して保管した。
＜臨床情報の取得＞
すべての検体について臨床情報を下記の基準に従って数値化した。下記４項目は歯科において広く活用されている指標である。
（ｉ）歯周ポケットの深さ（Ｐｄ）：歯周プローブをポケットに挿入した際の，歯肉辺縁からプローブ先端までの距離を示す。１ｍｍ単位で数値化した。なお、ここでいう「歯周プローブ」とは、ポケット測定器具（ヘリオプローブ）を意味する。
（ｉｉ）プロービング時の出血（ＢＯＰ）：歯周プローブをポケットに挿入した際に出血の有無を示す。出血がない場合を０、出血がある場合を１とした。
（ｉｉｉ）Ｇｉｎｇｉｖａｌ Ｉｎｄｅｘ（ＧＩ）：歯肉の炎症の程度を示す。炎症が認められない場合を０、軽度の炎症の場合を１、中等度の炎症の場合を２、高度の炎症の場合を３とした。
（ｉｖ）Ｐｌａｑｕｅ Ｉｎｄｅｘ（ＰｌＩ）：歯肉に隣接した歯面のプラーク沈着量を示す。プラークは認められない場合を０、プラークが肉眼的には認められないがプローブで擦過して認められる場合を１、プラークが視認できる場合を２、プラークが多量に認められる場合を３とした。
すべての検体について臨床情報を下記の基準に従って数値化した。下記４項目は歯科において広く活用されている指標である。
（ｉ）歯周ポケットの深さ（Ｐｄ）：歯周プローブをポケットに挿入した際の，歯肉辺縁からプローブ先端までの距離を示す。１ｍｍ単位で数値化した。なお、ここでいう「歯周プローブ」とは、ポケット測定器具（ヘリオプローブ）を意味する。
（ｉｉ）プロービング時の出血（ＢＯＰ）：歯周プローブをポケットに挿入した際に出血の有無を示す。出血がない場合を０、出血がある場合を１とした。
（ｉｉｉ）Ｇｉｎｇｉｖａｌ Ｉｎｄｅｘ（ＧＩ）：歯肉の炎症の程度を示す。炎症が認められない場合を０、軽度の炎症の場合を１、中等度の炎症の場合を２、高度の炎症の場合を３とした。
（ｉｖ）Ｐｌａｑｕｅ Ｉｎｄｅｘ（ＰｌＩ）：歯肉に隣接した歯面のプラーク沈着量を示す。プラークは認められない場合を０、プラークが肉眼的には認められないがプローブで擦過して認められる場合を１、プラークが視認できる場合を２、プラークが多量に認められる場合を３とした。
＜ＰＣＲ＞
前記の凍結保管していたすべての検体を融解し、ＰＣＲテンプレートとした。検体中の口腔内細菌の１６ＳｒＲＮＡの検出対象領域の配列を増幅するために、以下の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ用キットは、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑTM Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により行った。プライマーは下記の配列を有するプライマーを用いた。なお、フォワードプライマーは５’末端がＣｙ５で標識化されているものを用いた。
前記の凍結保管していたすべての検体を融解し、ＰＣＲテンプレートとした。検体中の口腔内細菌の１６ＳｒＲＮＡの検出対象領域の配列を増幅するために、以下の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ用キットは、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑTM Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により行った。プライマーは下記の配列を有するプライマーを用いた。なお、フォワードプライマーは５’末端がＣｙ５で標識化されているものを用いた。
フォワードプライマー（細菌増幅用）：
５’−Ｃｙ５−ＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ−３’（配列番号３７）
リバースプライマー（細菌増幅用）：
５’−ＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＡＣＣ−３’（配列番号３８）
５’−Ｃｙ５−ＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ−３’（配列番号３７）
リバースプライマー（細菌増幅用）：
５’−ＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＡＣＣ−３’（配列番号３８）
フォワードプライマー（絶対量指標増幅用）:
５’−Ｃｙ５−ＧＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＧＴＡＡＣＧＴＣ−３’（配列番号３９）
リバースプライマー（絶対量指標増幅用）:
５’−ＣＴＣＴＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号４０）
５’−Ｃｙ５−ＧＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＧＴＡＡＣＧＴＣ−３’（配列番号３９）
リバースプライマー（絶対量指標増幅用）:
５’−ＣＴＣＴＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号４０）
＜反応液組成＞
２×Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）
Hot Start Version １０μＬ
４μＭフォワードプライマー（細菌増幅用） １μＬ
４μＭリバースプライマー（細菌増幅用） １μＬ
４μＭフォワードプライマー（絶対量指標増幅用） １μＬ
４μＭリバースプライマー（絶対量指標増幅用） １μＬ
テンプレートＤＮＡ ５μＬ
絶対量指標１μＬ
合計２０μＬ
２×Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）
Hot Start Version １０μＬ
４μＭフォワードプライマー（細菌増幅用） １μＬ
４μＭリバースプライマー（細菌増幅用） １μＬ
４μＭフォワードプライマー（絶対量指標増幅用） １μＬ
４μＭリバースプライマー（絶対量指標増幅用） １μＬ
テンプレートＤＮＡ ５μＬ
絶対量指標１μＬ
合計２０μＬ
＜反応条件＞
９５℃で１分間加熱後、「解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（３０ｓｅｃ）→合成：７２℃（２０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計４０サイクル行い、４℃で冷却し、増幅産物を得た。
９５℃で１分間加熱後、「解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（３０ｓｅｃ）→合成：７２℃（２０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計４０サイクル行い、４℃で冷却し、増幅産物を得た。
＜ＤＮＡチップ：口腔内細菌検出用ＤＮＡチップの製造＞
貫通孔型のＤＮＡチップを、特開２００７−７４９５０号公報（メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡの検出方法）の実施例２−１に記載の方法と同様の方法で製造を行った。
ただし、搭載させたオリゴヌクレオチドプローブは、非特許文献1：Ｓｏｃｒａｎｓｋｙ，Ｓ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３７，１４２６−３０，１９９９の菌種の情報を参考にし、表４に示す配列情報をもつプローブを用いた。
貫通孔型のＤＮＡチップを、特開２００７−７４９５０号公報（メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡの検出方法）の実施例２−１に記載の方法と同様の方法で製造を行った。
ただし、搭載させたオリゴヌクレオチドプローブは、非特許文献1：Ｓｏｃｒａｎｓｋｙ，Ｓ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３７，１４２６−３０，１９９９の菌種の情報を参考にし、表４に示す配列情報をもつプローブを用いた。
＜ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション＞
以下のように各溶液を混合し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
以下のように各溶液を混合し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
ＰＣＲ後に得たＤＮＡ増幅産物２０μＬ
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ４８μＬ
１Ｍ ＮａＣｌ ４８μＬ
０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ２０μＬ
水６４μＬ
合計２００μＬ
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ４８μＬ
１Ｍ ＮａＣｌ ４８μＬ
０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ２０μＬ
水６４μＬ
合計２００μＬ
２００μＬのハイブリダイゼーション溶液を前記ＤＮＡチップに接触させ、５０℃で２時間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後、下記の条件でＤＮＡチップを洗浄した。
０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０溶液１０００μＬで２２０秒の洗浄を１２回繰り返し、続いて、０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ１０００μＬで２２０秒の洗浄を４回繰り返した。洗浄終了後に、各チップを室温の０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ混合溶液に移した。
０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０溶液１０００μＬで２２０秒の洗浄を１２回繰り返し、続いて、０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ１０００μＬで２２０秒の洗浄を４回繰り返した。洗浄終了後に、各チップを室温の０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ混合溶液に移した。
＜検出＞
前記洗浄後、ジェノパールリーダー（三菱ケミカル社製）を用い、下記条件でＤＮＡチップの各スポットの蛍光強度を測定した。
＜検出条件＞
中心励起波長：６３３ｎｍ
露光時間：０．１、１、４、４０秒
前記洗浄後、ジェノパールリーダー（三菱ケミカル社製）を用い、下記条件でＤＮＡチップの各スポットの蛍光強度を測定した。
＜検出条件＞
中心励起波長：６３３ｎｍ
露光時間：０．１、１、４、４０秒
＜結果＞
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度を、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）で除算し、ハイブリダイゼーションに由来するＳＮ比を算出した。２２０検体すべてについて検出対象細菌ごとにＳＮ比のデータを得た。
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度を、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）で除算し、ハイブリダイゼーションに由来するＳＮ比を算出した。２２０検体すべてについて検出対象細菌ごとにＳＮ比のデータを得た。
＜臨床情報と細菌量（SN比）の相関＞
細菌２８種類について歯周ポケットの数値（Ｐｄ）と各細菌量を示すＳＮ比のデータの散布図を作成し、これを図１に示す（図１−１〜図１−７）。図１の縦軸は各細菌のＳＮ比、横軸はポケットの数値（Ｐｄ）を示す。また２８種類すべてについて相関係数を算出した（表５）。
細菌２８種類について歯周ポケットの数値（Ｐｄ）と各細菌量を示すＳＮ比のデータの散布図を作成し、これを図１に示す（図１−１〜図１−７）。図１の縦軸は各細菌のＳＮ比、横軸はポケットの数値（Ｐｄ）を示す。また２８種類すべてについて相関係数を算出した（表５）。
続いて、相関係数の正、負の値にもとづいて28種類の菌を歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種と歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種に大別した。「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群は、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium periodonticum、Prevotella intermedia、Streptococcus constellatus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Eikenella corrodensの15菌種とした。
「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群は、Prevotella nigrescens、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mitis bv 2、Actinomyces odontolyticus、Veillonella parvula、Actinomyces naeslundii II、Selenomonas noxiaの13菌種とした。
続いて図１に示したグラフのSN比の値を使用して、「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群のSN比の総和を算出した後、その「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群の種類数で除算することにより、「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群の平均SN比を算出した。同様に、「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群のSN比の総和を算出した後、その「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群の種類数で除算することにより、「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群の平均SN比を算出した。
最後に「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群の平均SN比と「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群の平均SN比の比率を取ることにより、細菌群のバランス指標を算出した。縦軸にバランス指標（「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群15種/「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群13種）、横軸に歯周ポケット数値（Ｐｄ）の散布図を図２に示した。
本発明では、非疾患状態を歯周ポケット深さ1〜3ｍｍ、疾患状態を歯周ポケット深さ5ｍｍ以上と定義する。図２に示したデータのうち、歯周ポケット深さ1〜3ｍｍと歯周ポケット深さ5ｍｍ以上のデータで判別モデルを作成し、歯周ポケット深さ４ｍｍのデータをテストデータとして非疾患状態／疾患状態を判定することにした。図２に示したデータのうち、歯周ポケット深さ1〜3ｍｍと歯周ポケット深さ5ｍｍ以上のデータについてヒストグラムを作成した（図３）。図3の縦軸は図２のバランス指標をＬＯＧ１０で変換した数値である。横軸は頻度である。
図3のデータを元にＲＯＣ解析を行い（図４右）、左上に近い点（バランス指標（ＬＯＧ１０）＝0.566）をカットオフ値とした。この場合、同解析より、感度0.890、特異度0.913で判定する検査となることが分かった（図４左）。
図3のデータを元にＲＯＣ解析を行い（図４右）、左上に近い点（バランス指標（ＬＯＧ１０）＝0.566）をカットオフ値とした。この場合、同解析より、感度0.890、特異度0.913で判定する検査となることが分かった（図４左）。
つづいてこの検査を用いて、歯周ポケット深さ（Ｐｄ）が4ｍｍのデータの判定を行った。4ｍｍのデータは図２のポケットの深さ４ｍｍのデータであり、44名分のデータが存在した。
これらをカットオフ値0.566で判定すると、18名はカットオフ値より大きなバランス指標（ＬＯＧ１０）値であった（表６：下から１８名）。これらの方は、歯周ポケット5ｍｍ以上の疾患状態と同程度歯周病の状態が進行していると判断できた。
これらをカットオフ値0.566で判定すると、18名はカットオフ値より大きなバランス指標（ＬＯＧ１０）値であった（表６：下から１８名）。これらの方は、歯周ポケット5ｍｍ以上の疾患状態と同程度歯周病の状態が進行していると判断できた。
歯周ポケット5ｍｍ以上の疾患状態と同程度と判定された一例として、バランス指標（ＬＯＧ１０）値 1.516648のサンプルの各細菌のＳＮ比を図５に示した。図５から「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群の細菌種のSN比が大きく、「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群のSN比が小さいパターンとなっていることが確かめられた。
［実施例１−２］
歯周病の経過状態の判定方法
［実施例１−２］
歯周病の経過状態の判定方法
実施例１のデータと同一のデータを用い、歯周病の経過状態の判定モデルを作成した。
「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群、「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群は、は、実施例１と同様とした。
「経過指標細菌」として、「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群のうち、Fusobacterium nucleatum subsp. animalisとFusobacterium nucleatum subsp. nucleatumを選択した。
「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群、「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群は、は、実施例１と同様とした。
「経過指標細菌」として、「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群のうち、Fusobacterium nucleatum subsp. animalisとFusobacterium nucleatum subsp. nucleatumを選択した。
続いて実施例の図１に示したグラフのSN比の数値を使用して、「経過指標細菌」（Fusobacterium nucleatum subsp. animalisとFusobacterium nucleatum subsp. nucleatum）のSN比の総和を算出した後、その種類数「２」で除算することにより、「経過指標細菌」群の平均SN比を算出した。同様に、「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群の平均SN比を算出した。
最後に「経過指標細菌」群の平均SN比と「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群の平均SN比の比率を取ることにより、細菌群のバランス指標を算出した。縦軸にバランス指標（「経過指標細菌」2種/「善玉菌」群13種）、横軸に歯周ポケット数値（Ｐｄ）の散布図を図６に示した。
図６に示したデータのうち、歯周ポケット深さ1〜3ｍｍ、歯周ポケット深さ5ｍｍ以上のデータで判別モデルを作成し、歯周ポケット深さ４ｍｍのデータをテストデータとして非疾患状態／疾患状態を判定することにした。
図６に示したデータのうち、歯周ポケット深さ1〜3ｍｍと歯周ポケット深さ5ｍｍ以上のデータについてヒストグラムを作成した（図７）。図７の縦軸は図６のバランス指標をＬＯＧ１０で変換した数値である。横軸は頻度である。
図７のデータを元にＲＯＣ解析を行い（図８右）、左上に近い点（バランス指標（ＬＯＧ１０）＝0.826）をカットオフ値とした。この場合、同解析より、感度0.932、特異度0.777で判定する検査となることが分かった。
図６に示したデータのうち、歯周ポケット深さ1〜3ｍｍと歯周ポケット深さ5ｍｍ以上のデータについてヒストグラムを作成した（図７）。図７の縦軸は図６のバランス指標をＬＯＧ１０で変換した数値である。横軸は頻度である。
図７のデータを元にＲＯＣ解析を行い（図８右）、左上に近い点（バランス指標（ＬＯＧ１０）＝0.826）をカットオフ値とした。この場合、同解析より、感度0.932、特異度0.777で判定する検査となることが分かった。
つづいてこの検査を用いて、歯周ポケット深さ（Ｐｄ）が4ｍｍのデータの判定を行った。4ｍｍのデータは図６のポケットの深さ４ｍｍのデータであり、44名分のデータが存在した。
これらをカットオフ値0.826で判定すると、27名はカットオフ値より大きなバランス指標（ＬＯＧ１０）値であった（表７：黄色の２７名(表7の下から１〜２７名分））。これらの方は、歯周病の経過として歯周ポケット5ｍｍ以上の疾患状態と同程度の状態であると判断できた。
これらをカットオフ値0.826で判定すると、27名はカットオフ値より大きなバランス指標（ＬＯＧ１０）値であった（表７：黄色の２７名(表7の下から１〜２７名分））。これらの方は、歯周病の経過として歯周ポケット5ｍｍ以上の疾患状態と同程度の状態であると判断できた。
バランス指標（ＬＯＧ１０）値 0.883のサンプルの各細菌のＳＮ比を図９（図５と同じサンプルである。）に示した。図９から「経過指標細菌」群のFusobacterium属のSN比が大きく、「善玉菌」群のSN比が小さいパターンとなっていることが確かめられた。
［実施例１−３］
歯周病の状態の細分化
［実施例１−３］
歯周病の状態の細分化
実施例１−１、実施例１−２のデータを用い、実施例１−１のバランス指標（LOG１０）を縦軸とし、実施例１−２のバランス指標（ＬＯＧ１０）を横軸とし、その他は実施例１−１及び１−２と同様の手法で判定モデルを作成した。これまで「ポケット４ｍｍ」でひとまとめにされていた部位データを判定したところ、４つのグループに分類できた。
結果を図１０にまとめた。
(a)、(b)、(d)の状態のサンプルについて、各細菌のSN比を図１１に示した。上から状態(a)（要再治療レベル：n=18）、状態(b)（今軽度だが経過注意：n=19）、状態(d)（軽度：n=17）
［実施例１−４］
選択する細菌による判定能の違い
(a)、(b)、(d)の状態のサンプルについて、各細菌のSN比を図１１に示した。上から状態(a)（要再治療レベル：n=18）、状態(b)（今軽度だが経過注意：n=19）、状態(d)（軽度：n=17）
［実施例１−４］
選択する細菌による判定能の違い
実施例１−１と同一のデータを用い、実施例１−１と同様に相関係数の正、負の値にもとづいて28種類の菌を歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種と歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種に大別した。
このうち歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種群は、歯周病関連細菌として知られている5菌種とFusobacterium nucleatum種の1菌種とした。すなわち、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter rectus、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Prevotella intermediaの６菌種とした。
このうち歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種群は、歯周病関連細菌として知られている5菌種とFusobacterium nucleatum種の1菌種とした。すなわち、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter rectus、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Prevotella intermediaの６菌種とした。
また、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種群はSN比が比較的大きいCapnocytophaga gingivalis、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Veillonella parvulaの４菌種とした。すなわち判定モデル作成には、計１０菌種のデータを用いた。
実施例１−１と同様にバランス指標（ＬＯＧ１０）を算出後ＲＯＣ解析を行い実施例１−１の場合と比較した。この結果を図１２に示した。
その結果、細菌種を10種類用いて得たカットオフ値（0.566）では、感度0.877、特異度0.932で判定する検査となることがわかった。（細菌種28種類の場合は、前述の通り、感度0.890、特異度0.913。）
また実施例１−２と同様にバランス指標（ＬＯＧ１０）を算出、ＲＯＣ解析を行い実施例１−２の場合と比較した。この結果を図１３に示した。
その結果、細菌種を10種類用いて得たカットオフ値（0.566）では、感度0.877、特異度0.932で判定する検査となることがわかった。（細菌種28種類の場合は、前述の通り、感度0.890、特異度0.913。）
また実施例１−２と同様にバランス指標（ＬＯＧ１０）を算出、ＲＯＣ解析を行い実施例１−２の場合と比較した。この結果を図１３に示した。
その結果、細菌種を10種類用いて得たカットオフ値（0.826）では、感度0.904、特異度0.806で判定する検査となることがわかった。（細菌種28種類の場合は、前述の通り、感度0.932、特異度0.777。）
この結果より、28種類のほうが滑らかな曲線となり判別の正確性は向上していると考えられた。しかしながら10種類とした場合でも細菌種を適当に選択することで感度、特異度が大きく下がることはなかった。
［実施例２−１］
治療前及び治療後のプラーク検体の細菌検出と歯周病の治療効果の判定
［実施例２−１］
治療前及び治療後のプラーク検体の細菌検出と歯周病の治療効果の判定
＜プラーク検体の調製＞
治療前及び治療後のプラーク検体の細菌量を比較する為に、大阪大学歯学部附属病院にて、歯周病治療前及び治療後の歯肉縁下プラークを２０歳代から７０歳代の男女６1症例から採取した。治療は、歯周基本治療である、歯石の除去（スケーリング・ルートプレーニング）を実施した。
治療前及び治療後のプラーク検体の細菌量を比較する為に、大阪大学歯学部附属病院にて、歯周病治療前及び治療後の歯肉縁下プラークを２０歳代から７０歳代の男女６1症例から採取した。治療は、歯周基本治療である、歯石の除去（スケーリング・ルートプレーニング）を実施した。
Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ ｐａｐｅｒ ｐｏｉｎｔｓ（ＩＳＯ Ｃｏｌｏｒ−Ｃｏｄｅｄ）＃４０（ＤＥＮＴＳＰＬＹ ＭＡＩＬＬＥＦＥＲ社製）を２本、歯周ポケットに挿入して３０秒間置いた。その後、０．１５ｍＬの滅菌蒸留水を入れたマイクロチューブにペーパーポイントを投入し、２０秒間ボルテックスした。ペーパーポイントを滅菌したピンセットで取り出して、検出まで−２０℃で凍結して保管した。
＜ＤＮＡチップ：口腔内細菌検出用ＤＮＡチップの製造＞
貫通孔型のＤＮＡチップを、特開２００７−７４９５０号公報（メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡの検出方法）の実施例１−１に記載の方法と同様の方法で製造を行った。搭載させたオリゴヌクレオチドプローブは、表８に示す配列情報をもつプローブを用いた。ＰＣＲ，ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション、検出までは実施例１−１と同様に実施した。
貫通孔型のＤＮＡチップを、特開２００７−７４９５０号公報（メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡの検出方法）の実施例１−１に記載の方法と同様の方法で製造を行った。搭載させたオリゴヌクレオチドプローブは、表８に示す配列情報をもつプローブを用いた。ＰＣＲ，ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション、検出までは実施例１−１と同様に実施した。
＜結果＞
＜SN比データの算出＞
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度をバックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度）で除算し、ハイブリダイゼーションに由来するSN比を算出した。その後、実施例１−４と同一の10種類、つまり、「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群は、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter rectus、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Prevotella intermediaの６菌種、「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群はCapnocytophaga gingivalis、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Veillonella parvulaの４菌種とし、実施例１−３と同様に2軸での判定を行った。その結果を図１４の上半分の２つのグラフに示した。
＜SN比データの算出＞
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度をバックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度）で除算し、ハイブリダイゼーションに由来するSN比を算出した。その後、実施例１−４と同一の10種類、つまり、「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群は、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter rectus、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Prevotella intermediaの６菌種、「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群はCapnocytophaga gingivalis、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Veillonella parvulaの４菌種とし、実施例１−３と同様に2軸での判定を行った。その結果を図１４の上半分の２つのグラフに示した。
左側は治療前の結果、右側は治療後の結果である。治療前後でのプロットの位置を見ると、全体的に右上（(a)要再治療レベル）から左下（(d)軽度）に移動しており、治療の効果を判断することができた。また、図１４の下半分の２つのグラフは歯周ポケット（縦軸）とバランス指標（横軸）のグラフである。左側が治療前、右側が治療後である。この結果を見ると、治療後に歯周ポケットが４ｍｍ程度であってもバランス指標が判定値を超えていないプロットは、病状が安定していると判定できた。逆に、歯周ポケットが３ｍｍであってもバランス指標が判定値を超えているプロットは治療を検討したほうがよいと判断できた。
［実施例２−２］
［実施例２−２］
＜コピー数データの算出＞
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度から、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値及び標準偏差の３倍）を減算し、ハイブリダイゼーションに由来するシグナル強度を算出した。続いて、複数枚のＤＮＡチップに対し、絶対量指標プローブのシグナル強度を比較し、各ＤＮＡチップの補正係数を求め、検出対象細菌のシグナル強度を補正し比較できるようにした。その後、事前に決定していた各細菌量算出係数を乗算し、各検出対象の細菌量をゲノムコピー数で算出した。各細菌量算出係数は、各細菌由来ゲノムＤＮＡを検出したときのシグナル強度を測定し検量線を作成しておき、各細菌のシグナル強度から各細菌量を逆算する係数を求めておいた。最後に、ＰＣＲテンプレートに利用した検出80検体の希釈率を乗算し、ペーパーポイント１本あたりの細菌数を算出した。前記の計算により、のべ１２２検体すべてについて、検出対象細菌ごとに細菌数のデータを得た。なお初期にシグナル強度が０以下となった検出下限のものは一律コピー数１０００とした。この結果を治療前（表９（表９−１〜表９−２））と治療後（表１０（表１０−１〜表１０−２））に示した。
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度から、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値及び標準偏差の３倍）を減算し、ハイブリダイゼーションに由来するシグナル強度を算出した。続いて、複数枚のＤＮＡチップに対し、絶対量指標プローブのシグナル強度を比較し、各ＤＮＡチップの補正係数を求め、検出対象細菌のシグナル強度を補正し比較できるようにした。その後、事前に決定していた各細菌量算出係数を乗算し、各検出対象の細菌量をゲノムコピー数で算出した。各細菌量算出係数は、各細菌由来ゲノムＤＮＡを検出したときのシグナル強度を測定し検量線を作成しておき、各細菌のシグナル強度から各細菌量を逆算する係数を求めておいた。最後に、ＰＣＲテンプレートに利用した検出80検体の希釈率を乗算し、ペーパーポイント１本あたりの細菌数を算出した。前記の計算により、のべ１２２検体すべてについて、検出対象細菌ごとに細菌数のデータを得た。なお初期にシグナル強度が０以下となった検出下限のものは一律コピー数１０００とした。この結果を治療前（表９（表９−１〜表９−２））と治療後（表１０（表１０−１〜表１０−２））に示した。
続いて、治療前後のコピー数のデータを用いて、実施例２−１と同じ解析を行った。結果を図１５に示した。ただし、カットオフ値はSN比とコピー数のデータで比例関係が認められるためSN比での解析数値と同じ値を使用した。
実施例２−１と同様に2軸での判定を行った。その結果を図１５の上半分の２つのグラフに示した。左側は治療前の結果、右側は治療後の結果である。治療前後でのプロットの位置を見ると、全体的に右上（(a)要再治療レベル）から左下（(d)軽度）に移動しており、治療の効果を判断することができた。また、図１５の下半分の２つのグラフは歯周ポケット（縦軸）とバランス指標（横軸）のグラフである。左側が治療前、右側が治療後である。この結果を見ると、治療後に歯周ポケットが４ｍｍ程度であってもバランス指標が判定値を超えていないプロットは、病状が安定していると判定できた。逆に、歯周ポケットが３ｍｍであってもバランス指標が判定値を超えているプロットは治療を検討したほうがよいと判断できた。
［実施例３］
次世代シークエンサーデータでの判定
［実施例３］
次世代シークエンサーデータでの判定
実施例１−１のサンプルのうちの１つをJ-Bio21センター(日鉄住金環境株式会社：茨城県つくば市梅園2-1-13 筑波コウケンビル2F）に送付し、１６SrRNA次世代シークエンサー解析を行った。得られた結果から全体の菌数に対する各細菌の相対比を算出した。その結果を図１６に示した。
続いて、実施例１−４に示した「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」と「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」との相対量を調べたところ、表１１に示す通りであった。さらに、実施例１−４、実施例２−２と同様にバランス指標を算出すると3.739（17.2%/4.6%)、LOG10で換算すると約0.5728となり、判定数値を算出することができ、図１５のX軸の値で判定することにより、バランス指標としては「軽度」と判定することができた。
［実施例４］
近年新たに議論されている細菌種について検討するため実施例１−１と同様に新たに表１２に記載の細菌プローブを搭載したDNAチップを作成した。
近年新たに議論されている細菌種について検討するため実施例１−１と同様に新たに表１２に記載の細菌プローブを搭載したDNAチップを作成した。
実施例１−１と同様に収集した３２１サンプルについて表１２に記載のDNAチップで新たに蛍光強度データを収集した。実験条件は実施例１−１と同様に実施したが、以下の2点のみ変更した。
PCRに使用したプライマーを以下のように変更して実施した。
R、Yは混合塩基を示しており、RはAとG、YはCとTを示す。
PCRに使用したプライマーを以下のように変更して実施した。
R、Yは混合塩基を示しており、RはAとG、YはCとTを示す。
フォワードプライマー（細菌増幅用）：
５’−Ｃｙ５−ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号９０）
リバースプライマー（細菌増幅用）：
５’−ＣＲＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＹＧＴＴ−３’（配列番号９１）
フォワードプライマー（絶対量指標増幅用）:
５’−Ｃｙ５−ＧＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＧＴＡＡＣＧＴＣ−３’（配列番号
３９）
リバースプライマー（絶対量指標増幅用）:
５’−ＣＴＣＴＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号４０）
５’−Ｃｙ５−ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号９０）
リバースプライマー（細菌増幅用）：
５’−ＣＲＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＹＧＴＴ−３’（配列番号９１）
フォワードプライマー（絶対量指標増幅用）:
５’−Ｃｙ５−ＧＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＧＴＡＡＣＧＴＣ−３’（配列番号
３９）
リバースプライマー（絶対量指標増幅用）:
５’−ＣＴＣＴＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号４０）
また、ハイブリダイゼーション温度、時間を50℃で16時間とした。
ひきつづき得られた蛍光強度を以下のように処理した。
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度を、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）で減算し、ハイブリダイゼーションに由来するシグナル強度を算出した。このとき、シグナル強度がある閾値を下回るものについては、ノイズと判断し「0」とする。ここでは閾値として、プローブを搭載していないスポット30個の傾向強度のうち上下位5つを除いた20個の値の標準偏差の3倍の値を用いた。
ひきつづき得られた蛍光強度を以下のように処理した。
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度を、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）で減算し、ハイブリダイゼーションに由来するシグナル強度を算出した。このとき、シグナル強度がある閾値を下回るものについては、ノイズと判断し「0」とする。ここでは閾値として、プローブを搭載していないスポット30個の傾向強度のうち上下位5つを除いた20個の値の標準偏差の3倍の値を用いた。
さらに、全体の細菌に対する各細菌の相対比を、検出対象細菌のプローブのシグナル強度を総菌量指標用プローブのシグナル強度で除算して算出した。この後の解析には、これら総量に対する相対比をlog10で変換したものを用いた。ただし、値が「0」のものについては計算できないため、log10変換後の数値を―4に置き換えた。こうして、321検体すべてについてデータを得た。この結果とポケットの深さについて検体ごとにまとめたものを表１３に示した（表１３−１〜表１３−１６）。
歯周ポケットの数値（Ｐｄ）と各細菌のlog10(総量に対する相対比)の値の相関係数を３６種類すべてについて算出し、さらにそれら相関の有意性について、p値、q値を算出した（表１４）。
これらの値は、統計ソフトウェア「Ｒ」（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ）を用いてそれぞれ、相関係数はcor関数、p値はcor.test関数、q値はp.adjust関数(methodsオプションで「BH」を指定)を用いて算出した。
表１４に示す相関係数の有意性について、有意水準をq値<0.05としたとき、有意な相関を示す細菌とした。続いてこれら有意な相関をもつ細菌について、相関係数の正負に基づいて「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」と「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」に大別した。「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群は、Filifactor alocis、Porphyromonas endodontalis、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Treponema medium、Selenomonas sputigenaの6菌種とした。
表１４に示す相関係数の有意性について、有意水準をq値<0.05としたとき、有意な相関を示す細菌とした。続いてこれら有意な相関をもつ細菌について、相関係数の正負に基づいて「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」と「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」に大別した。「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群は、Filifactor alocis、Porphyromonas endodontalis、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Treponema medium、Selenomonas sputigenaの6菌種とした。
「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群は、Prevotella denticola、Prevotella melaninogenica、Gemella sanguinis、Eubacterium sulci、Corynebacterium matruchotii、Rothia mucilaginosa、Porphyromonas catoniae、Solobacterium moorei、Neisseria flavescens、Prevotella loescheii、Megasphaera micronuciformis、Actinomyces graevenitzii、Veillonella atypica、Prevotella pallens、Prevotella shahii、Porphyromonas pasteri、Veillonella rogosae、Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308)、Rothia dentocariosa、Granulicatella adiacens、Streptococcus salivarius、Haemophilus parainfluenzae、Streptococcus parasanguinisの２３菌種とした。
続いてlog10(総量に対する相対比)の値を使用して、「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群と「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群の平均値を算出した。最後にこの平均値について、「歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種」群の値から「歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種」群の値を引くことにより、細菌群のバランス指標を算出した。これを表１５に示した（表１５−１〜表１５−７）。
縦軸にバランス指標、横軸に歯周ポケット深さ（Ｐｄ）の散布図を図１７に示した。図１７に示したデータのうち、歯周ポケット深さ1〜3ｍｍと歯周ポケット深さ5ｍｍ以上のデータで判別モデルを作成し、歯周ポケット深さ４ｍｍのデータをテストデータとして非疾患状態／疾患状態を判定することにした。
図１７に示したデータのうち、歯周ポケット深さ1〜3ｍｍと歯周ポケット深さ5ｍｍ以上のデータについてヒストグラムを作成した（図１８）。図１８の縦軸は図１７のバランス指標をＬＯＧ１０で変換した数値である。横軸は頻度である。
図１８のデータを元にＲＯＣ解析を行い（図１９）、左上に近い点（バランス指標（ＬＯＧ１０）＝0.3182）をカットオフ値とした。この場合、同解析より、感度0.877、特異度0.884で判定する検査となることが分かった。
図１７に示したデータのうち、歯周ポケット深さ1〜3ｍｍと歯周ポケット深さ5ｍｍ以上のデータについてヒストグラムを作成した（図１８）。図１８の縦軸は図１７のバランス指標をＬＯＧ１０で変換した数値である。横軸は頻度である。
図１８のデータを元にＲＯＣ解析を行い（図１９）、左上に近い点（バランス指標（ＬＯＧ１０）＝0.3182）をカットオフ値とした。この場合、同解析より、感度0.877、特異度0.884で判定する検査となることが分かった。
つづいてこの検査を用いて、歯周ポケット深さ（Ｐｄ）が4ｍｍのデータの判定を行った。4ｍｍのデータは図１７のポケットの深さ４ｍｍのデータであり、60名分のデータが存在した。これらをカットオフ値を0.3182で判定すると、３１名はカットオフ値より大きなバランス指標値であった。これらの方は、歯周ポケット5ｍｍ以上の疾患状態と同程度歯周病の状態が進行していると判断できた。
配列番号１〜９１：合成DNA
Claims (9)
- 口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度を測定し、当該シグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、得られた算出値を指標として歯周病の状態を判定する口腔内検査方法であって、
細菌群の存在割合は、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係である、前記方法。 - 得られた算出値を、細菌群の存在割合のカットオフ値と比較することにより歯周病の状態を判定する、請求項１に記載の方法。
- 前記細菌群の存在割合は、歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との比である、請求項１に記載の方法。
- 前記カットオフ値は、基準策定用口腔内試料中に存在する口腔内細菌群由来の核酸のシグナル強度の測定値から前記細菌群の存在割合を算出し、当該算出値から作成されたROC曲線に基づいて定めたものである、請求項２に記載の方法。
- 前記細菌群の存在割合は、Fusobacterium nucleatum種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係である、請求項１に記載の方法。
- 前記細菌群の存在割合として以下の(a)及び(b)を用いる、請求項１に記載の方法。
(a)歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種（ただしFusobacterium nucleatum種以外の細菌種を１種以上含む。）の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係
(b) Fusobacterium nucleatum種の細菌量と、歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種の細菌量との相関関係 - 歯周ポケットの数値の増大に伴い増加する細菌種が、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Campylobacter gracilis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Fusobacterium periodonticum、Prevotella intermedia、Streptococcus constellatus、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Eikenella corrodens、Filifactor alocis、Porphyromonas endodontalis、Eubacterium nodatum 、Eubacterium saphenum、Treponema medium及びSelenomonas sputigenaからなる 群から選ばれる少なくとも一種である請求項１に記載の方法。
- 歯周ポケットの数値の増大に伴い減少する細菌種が、Prevotella nigrescens、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Streptococcus gordonii、Streptococcus intermedius、Streptococcus mitis、Streptococcus mitis bv 2、Actinomyces odontolyticus、Veillonella parvula、Actinomyces naeslundii II、Selenomonas noxia、Prevotella denticola、Prevotella melaninogenica、Gemella sanguinis、Eubacterium sulci、Corynebacterium matruchotii、Rothia mucilaginosa、Porphyromonas catoniae、Solobacterium moorei、Neisseria flavescens、Prevotella loescheii、Megasphaera micronuciformis、Actinomyces graevenitzii、Veillonella atypica、Prevotella pallens、Prevotella shahii、Porphyromonas pasteri、Veillonella rogosae、Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308)、Rothia dentocariosa、Granulicatella adiacens、Streptococcus salivarius、Haemophilus parainfluenzae及びStreptococcus parasanguinisから なる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１に記載の方法。
- Fusobacterium nucleatum種が、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、及びFusobacterium nucleatum subsp. nucleatumからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項５に記載の方法。
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