CN109790531A

CN109790531A - 口腔内检查方法

Info

Publication number: CN109790531A
Application number: CN201780042661.2A
Authority: CN
Inventors: 原爱; 村上伸也; 野崎刚德
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 2016-07-11
Filing date: 2017-01-26
Publication date: 2019-05-21
Also published as: JP2018196386A; JP7122337B2; EP3483266A1; JPWO2018012011A1; JP6805413B2; WO2018012011A1; JP2020141686A; JP2019004888A; EP3483266A4; US20190153518A1

Abstract

提供能够通过简便的方法判定牙周病和龋齿的状态的方法、能够通过口腔内细菌检测判定牙周病的严重程度、治疗效果、恶化风险的方法等。例如，本发明是通过由从受试者采集的口腔内试样测定口腔内试样中存在的细菌量来判定牙周病和/或龋齿的状态的口腔内检查方法。

Description

口腔内检查方法

技术领域

本发明涉及判定牙周病和/或龋齿的状态的口腔内检查方法等。

背景技术

作为口腔内的两大疾病的牙周病和龋齿(蛀牙)是与多种细菌相关的细菌感染症。

牙周病是与病原细菌(细菌因子)、免疫(宿主因子)和生活习惯相关的进行性多因子疾病，但其发病一定与牙周病原性细菌相关。

作为牙周病原性细菌，报告了牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythensis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)等(非专利文献1和2)，其中，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体这3种菌种被称为“红色复合体(Red Complex)”，作为慢性牙周炎的病原菌受到重视。已知，如果存在“红色复合体”，则牙周病的恶性程度增高，构成“红色复合体”的细菌被认为是临床上重要的细菌。

另外，伴放线放线杆菌被报告为侵袭性牙周炎的病原菌，中间普雷沃菌被报告为青春期或妊娠性牙周炎的病原菌(非专利文献1和2)。

作为牙周病的细菌检查，报告了将菌斑或唾液中的“红色复合体”的3种细菌合计的值与牙周病的状态(进展)相关联。具体地，将牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体中至少一种细菌数的合计相对于总菌数低于0.5％的情况判定为“低”，将相对于总菌数为0.5％以上且低于5％的情况判定为“中”，将相对于总菌数为0.5％以上的情况判定为“高”(非专利文献3)。

众所周知，变形链球菌(Streptococcus mutans)是龋齿的病原细菌，该病原细菌通过代谢糖类而产生乳酸，其结果是，口腔内环境变为酸性，发生牙釉质的脱钙。

作为龋齿的细菌检查，市售有培养变形链球菌群和乳酸杆菌进行检查的试剂盒，作为一种诊断的材料被利用。通过目测由培养的结果判定大概的菌落数。

培养评价中，低于100000CFU/mL分类为“分类0”，100000CFU/mL以上且低于500000CFU/mL分类为“分类1”，500000CFU/mL以上且低于1000000CFU/mL分类为“分类2”，1000000CFU/mL以上分类为“分类3”。

作为牙周病或龋齿的病原菌的细菌检查法，有利用显微镜进行的观察法、培养法、酶活法、免疫学方法、DNA探针法、PCR法、Real time PCR法。

迄今为止，已报告了多种与牙周病或龋齿中任一项目相关的算出细菌数的方法。例如，可列举使用实时PCR法检测唾液中的牙龈卟啉单胞菌和/或福赛类杆菌(Bacteroidesforsythus)菌体数的方法(专利文献1)。此外，还可列举使用实时PCR法算出变形链球菌与总链球菌菌数的比率等(专利文献2)。

而作为算出牙周病原性细菌数的方法，例如，报告了使用培养法、实时PCR、第二代测序仪、DNA微阵列的方法。更详细地，也有使用实时PCR法分别检测唾液中的牙龈卟啉单胞菌和/或福赛类杆菌菌体数的报告(专利文献3和4)。

此外，还报告了回收细菌菌群的基因组DNA，进行限制酶处理，根据片段化的DNA的信息，以图谱的相似度为指标来识别细菌菌群的T-RFLP法(专利文献5)。根据该报告，确定了与牙科临床指标相关的细菌菌群来源的图谱。然而，其并不包括各自具体的细菌数的信息，未获得更近一步的解释。T-RFLP法可以将菌群集的构成以峰型(peak pattern)来表示，能够容易地进行多个待测物的比较分析，但各峰不一定来源于一种细菌，因而难以掌握细菌菌群构成(非专利文献4)。

此外，作为检测总细菌的方法，还有利用选择各微生物间保守性高的区域的通用引物的报告(专利文献6～8)。

DNA微阵列的例子中，有在制备待测物的PCR工序中设定1组通用引物，检测20种口腔内细菌的报告(非专利文献5～8)。

迄今为止，还有测定“红色复合体”中的至少一种细菌数作为牙周病严重程度指标的例子。可是，牙周病是以多种细菌为原因的疾病，因此通过测定有限的细菌，不仅不能作为充分的证据，而且估计也忽视了牙周病的严重程度或病原细菌。

此外，牙周病治疗效果的判断指标基本依据的是基于牙科医生的经验取得的临床信息，几乎在所有情况下，在细菌被除去之前是无法确认的。

进一步，还没有牙周病初始阶段牙周病恶化的指标。因此，大量患者在注意到患上牙周病时，牙周病就已经有了发展，即便注意到牙周病的症状后就开始其治疗，大多情况下该治疗也没有效果，因此还需要对于牙周病的恶化的有效预测方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4252812号

专利文献2：日本特开2008-206516号公报

专利文献3：日本特开2004-229537号公报

专利文献4：国际公开第2002/010444号

专利文献5：日本特开2011-193810号公报

专利文献6：国际公开第03/106676号

专利文献7：日本特表2004-504069号公报

专利文献8：日本特开2007-068431号公报

非专利文献

非专利文献1：Socransky，S.S.等J Clin Microbiol，37，1426-30，1999

非专利文献2：使用细菌检查的牙周治疗的概念(細菌検查を用ぃた歯周治療のコンセプト)医学信息社编著：三边正人、吉野敏明，P.3，平成17年6月出版

非专利文献3：牙周疾病者中抗菌疗法的诊疗指南(歯周疾患者における抗菌療法の診療ガイドライン)日本牙周病学会编辑

非专利文献4：常在细菌菌群操控的人类健康与疾病(常在細菌叢が操るヒ卜の健康と疾患)羊土社编辑：大野博司、服部正平，P.97，2014年3月出版

非专利文献5：Eberhard，J.等Oral Microbiol Immunol 2008，23：21-8.

非专利文献6：Topcuoglu，N.等J Clin Pediatr Dent 2013，38：155-60.

非专利文献7：Topcuoglu，N.等Anaerobe 2015，35：35-40.

非专利文献8：Henne，K.等J Oral Microbiol 2014，6：25874.

发明内容

发明所要解决的课题

因此，本发明的目的在于，提供能够通过简便的方法判定牙周病和/或龋齿的状态的方法。

本发明的目的在于，提供能够通过详细检测口腔内细菌来判定牙周病的严重程度、牙周病的治疗效果或牙周病的恶化风险的方法等。

用于解决课题的方法

为了解决前述课题，本发明人进行了深入研究，结果发现，通过求出特定细菌数相对于口腔内试样中存在的细菌的总菌数的比例，能够判定牙周病和/或龋齿的状态，从而完成了本发明。此外，本发明人还发现，通过求出口腔内试样中存在的特定细菌数，能够判定牙周病的严重程度、牙周病的治疗效果、牙周病的恶化风险等，从而完成了本发明。

即，本发明如下。

(1)一种口腔内检查方法，通过由从受试者采集的口腔内试样测定口腔内试样中存在的细菌量来判定牙周病和/或龋齿的状态。

(2)前述(1)所述的方法，通过求出特定细菌的菌数与口腔内试样中存在的细菌的总菌数的比例来判定牙周病和/或龋齿的状态。

(3)前述(2)所述的方法，在使用唾液作为口腔内试样的情况下，将唾液中存在的细菌中选自由牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体组成的组的至少一种细菌的菌数的合计相对于总菌数低于0.01％的情况判定为牙周病的症状为“轻度”，将相对于总菌数为0.01％以上且低于0.5％的情况判定为牙周病的症状为“中度”，将相对于总菌数为0.5％以上的情况判定为牙周病的症状为“重度”。

(4)前述(2)所述的方法，在使用唾液作为口腔内试样的情况下，将唾液中存在的细菌中变形链球菌的菌数相对于总菌数低于0.05％的情况判定为龋齿的症状为“轻度”，相对于总菌数为0.05％以上且低于2.5％的情况判定为龋齿的症状为“中度”，相对于总菌数为2.5％以上的情况判定为龋齿的症状为“重度”。

(5)前述(2)所述的方法，在使用菌斑作为口腔内试样的情况下，将菌斑中存在的细菌中选自由牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体组成的组的至少一种细菌的菌数的合计相对于总菌数低于0.1％的情况判定为牙周病的症状为“轻度”，将相对于总菌数为0.1％以上且低于5％的情况判定为牙周病的症状为“中度”，将相对于总菌数为5％以上的情况判定为牙周病的症状为“重度”。

(6)前述(1)所述的方法，包括：

由从受试者采集的口腔内试样测定口腔内试样中的特定细菌的细菌量、口腔内试样中存在的总菌量、或特定的细菌量与口腔内试样中存在的总菌量两者的工序；以及

通过对得到的测定结果进行统计分析来判定牙周病的严重程度的工序。

(7)前述(1)所述的方法，包括：

由牙周病治疗前后从受试者采集的口腔内试样测定口腔内试样中的特定细菌的细菌量、口腔内试样中存在的总菌量、或特定的细菌量与口腔内试样中存在的总菌量两者的工序；

基于前述治疗前的细菌量和前述治疗后的细菌量的比较结果来判定牙周病的治疗效果的工序。

(8)前述(1)所述的方法，包括：

基于得到的细菌量的比率来判定牙周病的恶化风险的工序。

(9)前述(6)或(7)中记载的方法，口腔内试样中的特定细菌为选自由属于卟啉菌属(Porphyromonas)、坦纳菌属(Tannerella)、密螺旋体属(Treponema)、普雷沃菌属(Prevotella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)、微单胞菌属(Parvimonas)、链球菌属(Streptococcus)、伴放线放线杆菌属(Aggregatibacter)、二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)、艾肯菌属(Eikenella)、放线菌属(Actinomyces)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、月形单胞菌属(Selenomonas)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷菌属(Serratia)、莫拉氏菌属(Moraxella)和念珠菌属(Candida)的细菌组成的组的至少一种。

(10)前述(6)或(7)所述的方法，口腔内试样中的特定细菌为选自由牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体、中间普雷沃菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌文氏亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii)、具核梭杆菌多形亚种(Fusobacteriumnucleatum subsp.polymorphum)、具核梭杆菌动物亚种(Fusobacterium nucleatumsubsp.animalis)、具核梭杆菌具核亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.nucleatum)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、轻型链球菌(Streptococcus mitis)、粘性放线菌(Actinomyces viscosus)、金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、纤细弯曲菌(Campylobacter gracilis)、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、昭和弯曲菌(Campylobacter showae)、牙周梭杆菌(Fusobacterium periodonticum)、微小微单胞菌(Parvimonas micra)、变黑普雷沃菌(Prevotella nigrescens)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、简明弯曲杆菌(Campylobacter concisus)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga gingivalis)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)、生痰二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagasputigena)、啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、戈登氏链球菌(Streptococcusgordonii)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、轻型链球菌bv 2、溶齿放线菌(Actinomyces odontolyticus)、小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)、内氏放线菌II(Actinomyces naeslundii II)和有害月形单胞菌(Selenomonas noxia)组成的组的至少一种。

(11)前述(6)或(7)所述的方法，口腔内试样中的特定细菌为选自由牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体、具核梭杆菌、直肠弯曲菌、星座链球菌、戈登氏链球菌、轻型链球菌、口腔链球菌、血链球菌和小韦荣氏球菌组成的组的至少一种。

(12)前述(8)所述的方法，口腔内试样中的特定细菌为选自由牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体组成的组的至少一种和具核梭杆菌。

(13)根据权利要求1所述的方法，通过包括以下的工序(1)～(3)的细菌数计算方法来测定口腔内试样中存在的细菌数：

(1)将由待测样品得到的数据与绝对量指标探针信号强度比较、进行校正的工序，

(2)对于预先分离的各检测对象细菌，由用于检测该检测对象细菌的探针信号强度比求出细菌数计算式的工序，

(3)使用上述工序(2)中得到的计算式，由上述工序(1)中校正后的信号强度计算各检测对象菌种的细菌数的工序。

(14)一种引物或引物组，包含由序列编号193～198和201～204所示碱基序列或与该碱基序列互补的碱基序列构成的DNA中的一种或两种以上。

(15)一种寡核苷酸探针，包含：

由序列编号97、100、120、121、122、129、130、152或155所示碱基序列或与该碱基序列互补的碱基序列构成的DNA、或

与由与该DNA互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且具有能够检测口腔内细菌来源的核酸的碱基序列中的至少一部分碱基序列的功能的DNA。

发明的效果

根据本发明，能够通过简便的方法来判定牙周病和/或龋齿的状态。

此外，根据本发明，能够通过简便的方法，通过检测口腔内细菌来判定牙周病的严重程度、牙周病的治疗效果、牙周病的恶化风险。尤其是与以往的培养法相比，能够以更高的精度进行该判定，进一步，能够利用实时PCR和测序仪，高工作效率、廉价地进行。

附图说明

图1为显示簇分类的结果的图。

图2为显示簇分类的结果的图。

图3为显示热图的图。

具体实施方式

以下，详细地对本发明进行说明。本发明的范围不限于这些说明，除了以下的例示以外，还可以在不损害本发明宗旨的范围内适当变更而实施。需要说明的是，本说明书包含作为本申请优先权主张的基础的日本特愿2016-136579号说明书(2016年7月11日申请)整体。此外，本说明书中的引用是全部出版物、例如现有技术文献和公开公报、专利公报及其他专利文献作为参照并入本说明书。

如上所述，本发明的口腔内检查方法是通过测定口腔内试样中存在的细菌量来判定牙周病和/或龋齿的状态方法。

作为该口腔内检查方法的具体方式，没有限定，例如可列举：

A)通过求出特定细菌的菌数与口腔内试样中存在的细菌的总菌数的比例进行前述判定的方法、B)由从受试者采集的口腔内试样测定口腔内试样中细菌量，基于得到的测定结果进行前述判定的方法等。

以下，分别对该方法A)和B)进行说明。

I.关于前述方法A)

本说明书中，关于测定口腔内试样中的细菌的菌数的方法，以使用DNA芯片的方法为中心进行了描述，但也可以通过使用DNA芯片的方法以外的方法、例如侵入法、实时PCR法、侵入PCR法等来测定口腔内试样中的细菌的菌数。

1.口腔内细菌量的测定所用的寡核苷酸探针

本发明的方法中，由从受试者采集的口腔内试样测定口腔内细菌量时，可以使用DNA芯片，该DNA芯片中例如可以搭载以下的探针(a)、探针(b)和(c)中的至少一种探针。需要说明的是，一般而言，DNA芯片是配置探针的基底的总称。此外，本说明书中，关于DNA芯片和DNA微阵列等名称未进行彼此区分，设为是同义词。

(a)包含分别与检测对象细菌的基因特异性杂交的核酸的探针

(b)包含与全部细菌的基因杂交的核酸的总量指标探针

(c)包含分别与一种或多种绝对量指标特异性杂交的核酸的探针

(1)作为测定对象的口腔内细菌

本发明的检查方法中，作为成为测定对象的口腔内细菌，没有限定，可以将属于卟啉菌属的细菌、属于坦纳菌属的细菌、属于密螺旋体属的细菌、属于密螺旋体属的细菌、属于弯曲杆菌属的细菌、属于梭杆菌属的细菌、属于微单胞菌属的细菌、属于链球菌属的细菌、属于伴放线放线杆菌属的细菌、属于二氧化碳嗜纤维菌属的细菌、属于艾肯菌属的细菌、属于放线菌属的细菌、属于韦荣氏球菌属的细菌、属于月形单胞菌属的细菌、属于乳酸杆菌属的细菌、属于假单胞菌属的细菌、属于嗜血杆菌属的细菌、属于克雷伯氏菌属的细菌、属于沙雷菌属的细菌、属于莫拉氏菌属的细菌和属于念珠菌属的细菌等作为检测对象菌种。

更详细地，例如，优选将目前认为与牙周病、龋齿相关的牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体、中间普雷沃菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种、血链球菌、轻型链球菌、粘性放线菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、纤细弯曲菌、直肠弯曲菌、昭和弯曲菌、牙周梭杆菌、微小微单胞菌、变黑普雷沃菌、星座链球菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、啮蚀艾肯菌、戈登氏链球菌、中间链球菌、轻型链球菌bv 2、溶齿放线菌、小韦荣氏球菌、内氏放线菌II、有害月形单胞菌和变形链球菌等中的至少一种细菌设为检测对象菌种，更优选为牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体、变形链球菌。

(2)关于探针(a)

本发明中，作为探针(a)可使用的寡聚DNA能够与口腔内细菌来源的核酸的碱基序列中的特定区域中的碱基序列杂交。这里，该核酸为包括染色体DNA、质粒DNA等的DNA和RNA均可，没有限定，优选为染色体DNA。具体地，本发明中作为探针使用的寡核苷酸能够与前述口腔内细菌的染色体DNA中的16S rRNA基因的碱基序列杂交。

关于本发明可使用的探针，选择成为对作为检测目标的各种前述口腔内细菌特异性的碱基序列那样的区域、对该区域的碱基序列进行设计是优选的。一般而言，设计探针时，除了选择特异性区域以外，还需要熔解温度(Tm)一致、难以形成二级结构。

对应于各种口腔内细菌的特异性碱基序列例如可以通过下述方法来找出：进行多序列比对，在种间在不同区域设计探针等。用于进行比对的算法没有特别限定，作为更具体的分析程序，例如可以利用ClustalX1.8等程序。进行比对时的参数可以以各程序的默认状态进行，也可以根据程序的种类等适当调整。

另一方面，探针的特异性可以是基于属水平的特异性一并检测同一属的细菌，也可以是能够在各个种水平上检测的特异性，可以根据细菌检测的目标适当判断。

(3)关于探针(b)

总量指标探针是能够以特定引物对扩增、捕捉待测物中的全部细菌的目标探针。在检测细菌时，从检测对象细菌在包括非检测对象细菌的全体细菌中是何种程度的比例、以及最初待测物中存在多少量的细菌的观点出发，检测细菌的总量也是极为重要的。

非检测对象细菌可以理解为，已知存在、种类但可以不作为检测对象的细菌、以及存在、种类尚不清楚的细菌的和(合计)。

为了检测细菌的总量，例如，可以独立于DNA芯片测定细菌的总量，通过在DNA芯片中搭载作为细菌的总量的指标的探针，从而提高操作的简便性。关于探针，可以从引物对扩增的碱基序列中，使用多种菌种通用的碱基序列。找不到这样的序列的情况下，也可以设计多个比较通用的序列，通过对它们进行综合判断，作为总量指标探针。总量指标探针优选为与待测物所含细菌来源的核酸杂交的探针，详细地，为包含由前述特定引物对扩增的碱基序列中作为检测对象的多种细菌共同具有的碱基序列的探针。将总量指标探针的例子示于表1-1-1(序列编号60)。

总量指标表示各个菌种特异性扩增产物的合计量，因此一般量多，因而有时目标信号强度会超过能够检测的信号强度范围。

为了防止这样的状况，限制用于杂交的待测物量是优选的。或者，在设计探针时，例如降低该探针的Tm值。具体地，可以考虑减少GC含量、缩短探针的序列长度本身的方法。

此外，通过在杂交时添加对于扩增的核酸与总量指标探针的杂交起竞争性作用那样的核酸，能够实现信号强度的降低。作为这样的核酸，可列举例如具有与总量指标探针全部或部分相同的序列的核酸、或具有全部或部分总量指标探针的互补序列的核酸等。

(4)关于探针(c)

绝对量指标探针是仅与绝对量指标核酸杂交的探针。

本说明书中，绝对量指标是在扩增反应、杂交反应之前向待测物中以一定量添加的核酸。绝对量指标是如果进行通常的扩增反应则扩增反应切实地进行的核酸，发挥作为所谓阳性对照的作用。

因此，如果将对绝对量指标特异性的探针搭载于DNA芯片，则能够从其检测结果算出扩增反应、杂交等是否合适地实施。此外，将绝对量指标设定一种的情况下，由多个DNA芯片得到的绝对量指标的信号强度应当是恒定的，在扩增效率、杂交效率有些增减的情况下，通过比较绝对量指标的信号强度，可以算出校正系数。多个DNA芯片中，校正后的信号强度可以进行比较。

将对各细菌特异性的探针的例子示于表1-1-1(序列编号3～59)。此外，将绝对量指标用探针的例子示于表1-1-1(序列编号61～75)，此外将绝对量指标的例子示于表1-1-2(序列编号76～90)。

如果在扩增反应前添加绝对量指标，则必须是以特定引物对扩增到的核酸，即具有与引物对互补的碱基序列，且为了通过杂交进行检测，需要具有检测对象细菌、非检测对象细菌均不具有的碱基序列。

[表1-1-1]

[表1-1-2]

特定引物的意思是，扩增对象序列是限定的，引物对不一定必须为1对。根据需要也可以应用使用2对以上的引物对的复合方法。将引物对的例子示于表1-2。可以利用细菌扩增用引物对(序列编号1、2)、绝对量指标用引物对(序列编号91、92)。

[表1-2]

对于本发明的引物设计方法而言，首先，选择至少一个显示分析对象细菌的多样性的可变区域，在选择的可变区域前后，选择保守性高的通用引物设计区域而设计引物序列。作为对象的可变区域没有限定，可列举基因组序列中，全部细菌都具有的16S rRNA基因等。16S rRNA基因中，以全长或可变区域V1-V9中一个以上的区域为对象是优选的。更优选以可变区域V3-V4为对象是优选的。

为了评价引物的包罗性，利用拥有广泛的细菌基因组序列的数据库。具体地，可列举RDP、NCBI、KEGG、MGDB等。

作为一个例子，将设计的通用引物序列输入RDP数据库的Probe Match(探针匹配)。结果一览中，得到Total search(总搜索)中的完全一致数。完全一致数越接近TotalSearch，其包罗性越高。此时，作为条件，Strain(株)可以选择Type(类型)。此外，Sourse(来源)可以选择Isolates(分离株)。

绝对量指标例如可以利用日本产业技术综合研究所开发的定量分析用核酸标准物质，也可以重新设计。进行设计的情况下，例如，使用软件“EXCEL”(微软公司制)的RNDBETWEEN函数，随机产生X个(X为任意的数字)1至4的整数，使它们连成仅由1至4的数值构成的X位数值，通过将1替换为A、2替换为T、3替换为C、4替换为G，能够获得多个由ATGC的X碱基形成的随机序列。

可以通过下述方法来设计：基于这些序列，仅选取G和T之和与A和T之和为相同数的序列，用选取的序列对NCBI的GenBank等数据库进行Blast检索，筛选与生物来源的核酸相似序列少的序列，在序列的两个末端添加引物序列。此外，还可以使设计的序列适当连接而延长或者部分去除而缩短。

为了使扩增反应时的反应效率尽可能恒定，使得由检测对象细菌扩增到的碱基长度与绝对量指标的扩增碱基长度没有大的差异是优选的。例如，如果检测对象细菌的扩增产物为500bp左右，则绝对量指标的扩增产物设为300bp至1000bp左右是优选的。

另一方面，扩增后通过电泳等确认扩增链长的情况下，在以形成与检测对象细菌不同长度的扩增产物的方式设计的基础上，还能够在与检测对象细菌的条带不同的位置检测绝对量指标来源的扩增产物，确认杂交前扩增反应是否成功。

最后，如果待测物中所含的绝对量指标浓度过高，则存在与检测对象细菌在扩增反应中的竞争变得激烈、本来应当能检测到的检测对象细菌无法检测的可能性，因此必须根据应用适当进行浓度调整。

设计本发明所用的探针时，必须考虑杂交中的严格度。通过使严格度在某种程度上严格，从而即使在各种口腔内细菌中的各核酸中的特定区域间存在相似的碱基序列区域，也能够对其他不同区域进行区别而杂交。此外，该特定区域间的碱基序列几乎不同的情况下，可以宽松地设定严格度。

作为这样的严格度的条件，例如严格条件的情况是50～60℃条件下的杂交，温和条件的情况是30～40℃条件下的杂交。杂交的条件中，作为严格的条件，可以列举例如“0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、40℃”、“0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、37℃”、“0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、30℃”，作为更严格的条件，可以列举例如“0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、50℃”、“0.24MTris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、55℃”、“0.06M Tris-HCl/0.06M NaCl/0.05％Tween-20、60℃”等条件。更详细地，有下述方法：添加探针，在50℃保持1小时以上形成杂交，其后，进行4次在0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20中50℃、20分钟的洗涤，最后进行1次0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl、50℃、10分钟的洗涤。通过提高杂交或洗涤时的温度，能够设定更严格的条件。除了这样的缓冲液的盐浓度、温度等条件以外，本领域技术人员还可以增加其他探针浓度、探针的长度、反应时间等各项条件来设定条件。关于杂交方法的详细步骤，可以参照“Molecular Cloning，A Laboratory Manual 4th ed.”(ColdSpring Harbor Press(2012)，“Current Protocols in Molecular Biology”(JohnWiley&Sons(1987-1997))等。

本发明所用的探针的长度没有限定，例如，优选为10个碱基以上，进一步优选为16～50个碱基，进一步优选为18～35个碱基。只要探针的长度合适(只要在前述范围内)，就能够抑制非特异性杂交(错配)，用于特异性检测。

设计本发明所用的探针时，提前确认Tm是优选的。Tm的意思是任意核酸链的50％与其互补链形成杂交的温度，为了使模板DNA或RNA与探针形成双链而杂交，必须对杂交的温度进行优化。另一方面，如果使该温度过于降低，则容易发生非特异性反应，因此温度尽可能高是优选的。因此，想要设计的核酸片段的Tm在进行杂交上是重要的因子。Tm的确认可以利用公知的探针设计用软件，作为本发明中可利用的软件，可列举例如Probe Quest(注册商标，达康公司)等。此外，Tm的确认也可以不使用软件而是通过自己计算来进行。这种情况下，可以利用基于最接近碱基对法(Nearest Neighbor Method)、Wallance法、GC％法等的计算式。本发明的探针没有限定，平均Tm优选约为35～70℃或45～60℃。需要说明的是，除此以外，作为能够作为探针特异性杂交的条件，还有GC含量等，其条件对于本领域技术人员而言是公知的。

此外，构成本发明所用的探针的核苷酸为DNA和RNA、或PNA均可，也可以是DNA、RNA和PNA中两种以上的杂合体。

作为本发明所用的探针，具体地，优选列举例如包含以下的(d)或(e)的DNA碱基序列的探针。例如，使用表1-2所示引物(序列编号1、2)扩增的情况下，可以以上述表1-1-1(序列编号3～59)所示序列为探针，使用选自序列编号3～59所示碱基序列的至少2个序列是优选的。此外，也可以是选自序列编号3～59所示碱基序列的至少2个序列的互补序列，还可以是与选自序列编号3～59所示碱基序列的至少2个序列实质上相同的序列或与选自序列编号3～59所示碱基序列的至少2个序列的互补序列实质上相同的序列。

这里，实质上相同是，在严格的条件下与序列编号3～59中记载的序列或互补序列特异性杂交。

(d)由序列编号3～59所示碱基序列构成的DNA

(e)在严格的条件下与由与前述(d)的DNA互补的碱基序列构成的DNA杂交，且具有能够检测口腔内细菌来源的核酸的碱基序列中的至少一部分碱基序列的功能的DNA

关于前述(d)的各种DNA，关于其具体的碱基序列、探针名称、作为检测对象的口腔内细菌，可以参照上述表1-1-1的记载。

此外，前述(e)的DNA可以如下获得：使用前述(d)的各种DNA或由与之互补的碱基序列构成的DNA、或将它们片段化而得的片段作为探针，实施菌落杂交、菌落杂交和Southern印迹杂交(Southern blot)等公知的杂交方法，由cDNA文库、基因组文库获得。文库可以利用通过公知的方法制作的文库，也可以利用市售的cDNA文库、基因组文库，没有限定。关于杂交方法的详细步骤，可以参照与前述同样的方法。作为杂交的DNA，优选为与前述(d)的DNA的碱基序列具有至少60％以上的同源性的碱基序列，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为98％以上，最优选为99％以上。

本发明所用的探针例如可以通过使用通常的寡核苷酸合成法进行化学合成(纯化利用HPLC等进行)来制作。这样的探针例如可以利用Probe Quest(注册商标，达康公司制)来设计。此外，本发明的探针可以含有例如标签序列等附加序列。

本发明的方法中，作为检测目标的前述口腔内细菌所具有的核酸的碱基序列不必须为该碱基序列本身，也可以是碱基序列的一部分由于缺失、替换、插入等而发生了突变。因此，检测目标核酸的碱基序列也可以以在严格的条件下与该碱基序列互补的序列杂交、且具有各自碱基序列来源的功能、活性的突变型基因为对象，探针也可以以这样的突变型基因的碱基序列为基础来设计。这里，“严格的条件”可以适用与前述同样的条件。

2.口腔内细菌量的测定所用的口腔内细菌基因检测用DNA芯片

如上所述，本发明的方法中可以使用DNA芯片，该DNA芯片是在成为支撑体的基底上配置多个前述1.项中说明的各种寡核苷酸探针而成。

作为成为支撑体的基底的形态，平板(玻璃板、树脂板、硅板等)、棒状、珠子等任何形态的物体均可使用。使用平板作为支撑体的情况下，可在该平板上将每种规定的探针按规定的间隔固定(点样法等，参照Science 270，467-470(1995)等)。此外，也可以在平板上的特定位置逐次合成每种规定的探针(光刻法等，参照Science 251，767-773(1991)等)。作为其他优选的支撑体的形态，可列举使用中空纤维的支撑体。使用中空纤维作为支撑体的情况下，可以优选例示通过下述方法得到的DNA芯片(以下称为“纤维型DNA芯片”)：将每种规定的探针固定于各中空纤维，将全部中空纤维集束固定后，在纤维的长度方向上反复切割。该微阵列也可以被描述为将核酸固定在通孔基板上类型的微阵列，也被称为所谓“通孔型DNA芯片”(参照日本专利第3510882号公报等)。

将探针固定于支撑体的方法没有限定，什么样的结合方式均可。此外，不限定直接固定于支撑体，例如，也可以预先将支撑体用聚赖氨酸等聚合物进行包被处理，将探针固定于处理后的支撑体。进一步，使用中空纤维等管状体作为支撑体的情况下，也可以将凝胶状物保持在管状体中，将探针固定于该凝胶状物。

以下，详细地对作为DNA芯片的一个方式的纤维型DNA芯片进行说明。该DNA芯片例如可以经过下述工序(i)～(iv)来制作。

(i)使多根中空纤维以中空纤维的长度方向为相同方向的方式三维排列，制造排列体的工序；

(ii)包埋前述排列体，制造块体的工序；

(iii)将含有寡核苷酸探针的凝胶前体聚合性溶液导入前述块体各中空纤维的中空部，进行聚合反应，将含有探针的凝胶状物保持在中空部的工序；

(iv)沿与中空纤维的长度方向交叉的方向切割，将块体薄片化的工序。

作为中空纤维中使用的材料没有限定，优选列举例如日本特开2004-163211号公报等中记载的材料。

中空纤维以其长度方向的长度相同的方式三维排列(工序(i))。作为排列方法，例如可列举下述方法：在粘合片等片状物上将多根中空纤维按规定的间隔平行配置制成片状后，将该片卷成螺旋状(参照日本特开平11-108928号公报)；使多个孔按规定的间隔设置的两块多孔板以孔部一致的方式重合，使中空纤维通过其孔部，其后拉开两块多孔板的间隔，临时固定，使固化性树脂原料充满两块多孔板间中空纤维的周围并固化(参照日本特开2001-133453号公报)等。

制造的排列体以其排列不会被弄乱的方式包埋(工序(ii))。作为包埋的方法，除了使聚氨酯树脂和环氧树脂等流入纤维间的间隙的方法以外，还优选列举使纤维彼此通过热熔合而粘接的方法等。

包埋的排列体中，在各中空纤维的中空部填充含有寡核苷酸探针的凝胶前体聚合性溶液(凝胶形成溶液)，在中空部内进行聚合反应(工序(iii))。由此，能够在各中空纤维的中空部保持固定有探针的凝胶状物。

凝胶前体聚合性溶液是指含有凝胶形成聚合性单体等反应性物质的溶液，该溶液能够通过使该单体等聚合、交联而形成凝胶状物。作为这样的单体，可列举例如丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、乙烯基吡咯烷酮、亚甲基双丙烯酰胺等。这种情况下，溶液可以含有聚合引发剂等。

将探针固定在中空纤维内后，沿与中空纤维的长度方向交叉的方向(优选正交的方向)将块体切割而薄片化(工序(iv))。以这种方式操作得到的薄片可以用作DNA芯片。该DNA芯片的厚度优选为0.01mm～1mm左右。块体的切割例如可以利用切片机和激光等进行。

作为前述纤维型DNA芯片，例如优选列举三菱丽阳公司制DNA芯片(Genopal TM)等。

纤维型DNA芯片中，能够如上述那样，探针在凝胶内三维排列，维持三维结构。因此，与使探针结合于表面进行了涂敷的载玻片的平面DNA芯片相比，检测效率提高，能够进行高灵敏度、高再现性的检查。

此外，配置于DNA芯片的探针的种数是，1个DNA芯片上500种以下、优选250种以下、进一步优选100种以下是优选的。通过以这种方式对配置的探针数(种类)进行某种程度的限制，能够以更高灵敏度检测目标口腔内细菌。另外，探针的种类根据碱基序列来区别。因此，通常，即使是同一基因来源的探针，如果碱基序列有1个不同，也会确定为另一种类。

3.口腔内细菌基因的检测

本发明的方法中，为了测定口腔内细菌量而检测该细菌的基因的方法例如是包括下述工序的方法。

(i)以从受试者采集的口腔内试样为待测物，提取待测物中的核酸的工序；

(ii)使提取的核酸与前述本发明的寡核苷酸探针或本发明的DNA芯片接触的工序；

(iii)由从DNA芯片得到的信号强度算出细菌量的工序。

以下，按工序对该检测方法的详细信息进行说明。

(1)关于工序(i)

本工序中，以从受试者或被生物采集的口腔内试样为待测物，提取待测物中所含细菌的核酸。采集的口腔内试样的种类没有特别限定。例如可以使用唾液、菌斑(龈下菌斑、龈上菌斑)、舌苔、口腔清洗液等，其中优选为菌斑，其中，更优选从牙周病细菌存在最多的位置采集的龈下菌斑。

采集口腔内试样的方法没有特别限定，可以根据试样的种类适当选择。例如，使用唾液作为口腔内试样的情况下，可列举利用市售的唾液采集试剂盒的方法、将棉签含在口中采集唾液的方法、直接将唾液采集在容器中的方法等。

使用菌斑作为口腔内试样的情况下，可列举用牙刷刷牙面、牙缝、用棉签摩擦牙面、用牙缝刷摩擦牙缝、纸尖法等。也可以通过将菌斑的采集中使用的牙刷、棉签、牙缝刷或纸尖浸在灭菌水中并根据需要进行搅拌等，使菌斑溶解或悬浮，以得到的溶液或悬浮液作为待测物。采集的菌斑的量没有特别限定，例如，可以为1根纸尖的量。

使用舌苔作为口腔内试样的情况下，可列举用棉签摩擦舌面的方法等。也可以使菌斑的采集中使用的棉签溶解或悬浮，将得到的溶液或悬浮液作为待测物。采集的舌苔的量没有特别限定，例如，可以为1根棉签的量。

使用口腔清洗液作为口腔内试样的情况下，可列举将口腔清洗液或水含在口中，将口腔清洗液或水与唾液一起采集至容器，将得到的溶液作为待测物的方法。作为口腔清洗液，可列举例如经灭菌的生理盐水等。

接下来，进行得到的口腔内试样中存在的细菌的核酸提取。提取的方法没有限定，可以使用公知的方法。例如，可列举利用器械的自动提取法、利用市售的核酸提取试剂盒的方法、蛋白酶K处理后进行苯酚提取的方法、利用氯仿的方法或作为简易提取方法的将试样加热、溶解的方法等。此外，也可以不特地从待测物中提取核酸，而是进行下一工序。

从待测物得到的核酸可以直接与DNA芯片等接触，也可以通过PCR等对期望的碱基序列区域进行扩增，使该扩增片段与DNA芯片等接触，没有限定。以得到的核酸为模板扩增的区域是编码包含本发明所用的探针或配置于DNA芯片的寡核苷酸的碱基序列的核酸区域的部位。扩增的期望的区域没有限定，可以利用不管前述口腔内细菌的种类保守性均高的区域的碱基序列，一次性扩增多种混合物。这样的用于扩增的序列可以实验性地分离、纯化，对分离的多聚核苷酸的碱基序列进行分析，基于该序列来确定，此外，也可以检索碱基序列等的各种数据库中已知的碱基序列，通过进行比对等，利用In Silico来确定。核酸或氨基酸等的数据库没有特别限定，例如可以利用DDBJ(DNA Data Bank of Japan)、EMBL(European Molecular Biology Laboratry，EMBL nucleic acid sequence datalibrary)、GenBank(Genetic sequence data bank)、NCBI(National Center forBiotechnology Information)的Taxonomy数据库等。

具体地，作为扩增的期望的部位，优选为前述口腔内细菌的染色体DNA中的核糖体RNA(16S rRNA)基因。作为该区域的扩增可使用的PCR引物，例如优选列举表1-2的序列编号1、2。另外，利用PCR法进行的核酸的扩增可以按照常规方法进行。

本工序中提取的核酸和其扩增片段还可以适当标记，用于杂交后的检测过程。具体地，可以考虑将PCR引物的末端用各种报告色素标记的方法、在逆转录反应时掺入反应性核苷酸同源物的方法、掺入经生物素标记的核苷酸的方法等。进一步，也可以在制备后与荧光标记试剂反应而进行标记。作为荧光试剂，例如可以使用各种报告色素(例如Cy5、Cy3、VIC、FAM、HEX、TET、荧光素、FITC、TAMRA、Texas red、Yakima Yellow等)。

(2)关于工序(ii)

本工序中，使工序(i)中得到的核酸或其扩增片段与本发明所用的探针或DNA芯片接触，具体地，制备含有该核酸等的杂交溶液，使该溶液中的核酸等结合(杂交)于DNA芯片中搭载的寡核苷酸探针。杂交溶液使用SDS、SSC等缓冲液，可以按照常规方法适当制备。

杂交反应是，以杂交溶液中的核酸等能够与DNA芯片中搭载的寡核苷酸探针在严格的条件下杂交的方式适当设定反应条件(缓冲液的种类、pH、温度等)来进行。需要说明的是，这里所说的“严格的条件”是指，难以发生相似序列导致的交叉杂交、或使相似序列导致交叉杂交的核酸解离的条件，具体地，是指杂交反应时或杂交后的DNA芯片的洗涤条件。

例如，作为杂交反应时的条件，反应温度优选为35～70℃，更优选为40～65℃，杂交时的时间优选为约1分钟～16小时。

此外，作为杂交后的DNA芯片的洗涤条件，洗涤液组成优选为0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20，洗涤时的温度优选为35～80℃或40～65℃，更优选为45～60℃。更具体地，优选为盐(钠)浓度为48～780mM、温度为37～80℃的条件，更优选为盐浓度为97.5～390mM、温度为45～60℃的条件。

洗涤后，利用能够检测结合于探针的核酸等的标记的装置，按斑点测定检测强度。例如，对前述核酸等进行了荧光标记的情况下，可以使用各种荧光检测装置、例如CRBIO(日立软件工程公司制)、arrayWoRx(GE Healthcare公司制)、Affymetrix 428 Array Scanner(昂飞(Affymetrix)公司制)、GenePix(Axon Instruments公司制)、ScanArray(珀金埃尔默(PerkinElmer)公司制)、Geno Pearl Reader(三菱丽阳公司制)等测定荧光强度。关于这些装置，在为荧光扫描仪的情况下，例如，可以适当调整激光的输出、检测部的灵敏度而进行扫描；在为CCD相机型扫描仪的情况下，可以适当调节曝光时间而进行扫描。基于扫描结果的定量方法利用定量软件来进行。定量软件没有特别限定，可以使用斑点的荧光强度平均值、中央值等进行定量。此外，定量时，考虑DNA片段斑点范围的尺寸精度等、使用未搭载探针的斑点的荧光强度作为背景等进行调整是优选的。

(3)关于工序(iii)

本工序中，由前述步骤中得到的信号强度算出检测对象菌种细菌的细菌量。例如，有如下方法：由用于检测检测对象细菌的探针信号强度与背景信号强度，作为SN比表示的方法。或者，预先按各细菌改变细菌的染色体DNA的浓度，以多个条件进行检测，以各浓度条件下得到的信号强度为基础，按各细菌取得算出染色体DNA浓度的换算系数(校正曲线)，由各条件下得到的信号强度算出染色体DNA的浓度的方法等是优选的。

任一情况下，可以以由多个DNA芯片的检测得到的绝对量指标探针信号强度为恒定的方式按各DNA芯片算出校正系数，通过在各DNA芯片的检测对象细菌的信号强度中考虑校正系数，进行DNA芯片间的比较。

4.牙周病和/或龋齿的状态的判定

(1)牙周病的状态判定判定基准1

将作为口腔内试样的唾液中所含的细菌中牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体中的至少一种细菌的菌数的合计相对于总菌数低于0.01％的情况判定为“轻度”，将相对于总菌数为0.01％以上且低于0.5％的情况判定为“中度”，将相对于总菌数为0.5％以上的情况判定为“重度”。

使用菌斑作为口腔内试样的情况下，将牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体中的至少一种细菌的菌数的合计相对于总菌数低于0.1％的情况判定为“轻度”，将相对于总菌数为0.1％以上且低于5％的情况判定为“中度”，将相对于总菌数为5％以上的情况判定为“重度”。

这是以如下报告为基础：作为牙周病的细菌检查，使用将菌斑或唾液中的“红色复合体”3种细菌合计的值，将牙周病的状态分类为4个阶段的报告。其是以3种细菌数为基准，按照由多个临床研究报告和综述汇总的参考值，作为日本牙周病学会的指南，被认为是具有充分依据的值。假设为唾液的情况，将基准值设为菌斑的情况的十分之一。将4个阶段的分类中中间的2阶段作为一个，以接受检查的人容易理解的方式分为3个阶段(非专利文献3)。

(2)龋齿的状态判定判定基准2

此外，将作为口腔内试样的唾液中所含的细菌中变形链球菌的菌数相对于总菌数低于0.05％的情况判定为龋齿的状态为“轻度”，将相对于总菌数为0.05％以上且低于2.5％的情况判定为龋齿的状态为“中度”，将相对于总菌数为2.5％以上的情况判定为龋齿的状态为“重度”。

其判定基准例如基于使用Ivoclar vivadent公司制Caries risk test(龋病风险测试)等试剂盒的变形链球菌培养评价的龋齿风险4阶段判定(J Health Care Dent.2000，2，4-17)来确定。

该培养评价是，对变形链球菌进行培养，通过目测判定产生的菌落，结果

低于100000CFU/mL则分类为“分类0”，

为100000CFU/mL以上且低于500000CFU/mL则分类为“分类1”，

为500000CFU/mL以上且低于1000000CFU/mL则分类为“分类2”，

为1000000CFU/mL以上则分类为“分类3”。

CFU是培养时形成菌落的单位，已知大约1CFU为100基因组拷贝。此外，1mL人唾液中含有约1000000000基因组拷贝的细菌。

因此，基于该数值，设定下述基准：将“分类0”的情况在本说明书中设为“低”，将“分类1”的情况在本说明书中设为“中”，将“分类2和3”的情况在本说明书中设为“高”。

(3)其他

通过本发明得到的牙周病和龋齿的状态判定仅是由细菌数推测状态的判定，并不表示确切的病状。即，确切的病状诊断必须是由牙科医生进行的诊断。

不过，根据本发明，能够简便地判定牙周病和龋齿的状态，因此能够进行牙周病、龋齿的早期发现、早期治疗，同时能够预防这些疾病。

II.关于前述B)的方法

作为前述B)的方法没有限定，具体地，例如，

作为第一方式，可列举包括下述工序的方法：

由从受试者采集的口腔内试样测定口腔内试样中的i)特定细菌的细菌量、ii)口腔内试样中存在的总菌量、或iii)特定的细菌量与口腔内试样中存在的总菌量两者的工序；以及

作为第二方式，可列举包括下述工序的方法：

由牙周病治疗前后从受试者采集的口腔内试样测定口腔内试样中的i)特定细菌的细菌量、ii)口腔内试样中存在的总菌量、或iii)特定的细菌量与口腔内试样中存在的总菌量两者的工序；以及基于前述治疗前的细菌量和前述治疗后的细菌量的比较结果来判定牙周病的治疗效果的工序。

作为第三方式，可列举包括下述工序的方法：

由从受试者采集的口腔内试样测定口腔内试样中的i)特定细菌的细菌量、ii)口腔内试样中存在的总菌量、或iii)特定的细菌量与口腔内试样中存在的总菌量两者的工序；以及基于得到的细菌量的比率来判定牙周病的恶化风险的工序。

1.口腔内细菌量的测定所用的寡核苷酸探针

(a)包含分别与检测对象细菌的基因特异性杂交的核酸的探针

(b)包含与全部细菌的基因杂交的核酸的总量指标探针

(1)作为测定对象的口腔内细菌

本发明的检查方法中，作为成为测定对象的口腔内细菌没有限定，可以将属于卟啉菌属的细菌、属于坦纳菌属的细菌、属于密螺旋体属的细菌、属于密螺旋体属的细菌、属于弯曲杆菌属的细菌、属于梭杆菌属的细菌、属于微单胞菌属的细菌、属于链球菌属的细菌、属于伴放线放线杆菌属的细菌、属于二氧化碳嗜纤维菌属的细菌、属于艾肯菌属的细菌、属于放线菌属的细菌、属于韦荣氏球菌属的细菌、属于月形单胞菌属的细菌、属于乳酸杆菌属的细菌、属于假单胞菌属的细菌、属于嗜血杆菌属的细菌、属于克雷伯氏菌属的细菌、属于沙雷菌属的细菌、属于莫拉氏菌属的细菌和属于念珠菌属的细菌等设为检测对象菌种。

更详细地，例如，优选将目前被认为与牙周病相关的牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体、中间普雷沃菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种、血链球菌、轻型链球菌、粘性放线菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、纤细弯曲菌、直肠弯曲菌、昭和弯曲菌、牙周梭杆菌、微小微单胞菌、变黑普雷沃菌、星座链球菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、啮蚀艾肯菌、戈登氏链球菌、中间链球菌、轻型链球菌bv 2、溶齿放线菌、小韦荣氏球菌、内氏放线菌II、和有害月形单胞菌等中至少一种细菌设为检测对象菌种。

本发明中，更优选将牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体、具核梭杆菌、直肠弯曲菌、星座链球菌、戈登氏链球菌、轻型链球菌、口腔链球菌、血链球菌和小韦荣氏球菌等设为检测对象，进一步优选将其中的至少一种、优选将两种以上设为检测对象。通过在牙周病的治疗前后测定、比较它们的细菌量，能够客观判定牙周病的治疗效果。如果细菌数充分减少则有治疗效果，如果未减少则没有治疗效果，需要实施别的治疗方法。

此外，它们的细菌量是与临床信息相关或逆相关性高的信息，成为表示牙周病严重程度的指标。得到表示总细菌中恶性程度高的细菌多或恶性程度低的细菌多的牙周病严重程度相关详细信息。

其中，作为判定牙周病恶化风险情况下的测定对象口腔内细菌，优选为选自由牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体组成的组的至少一种和具核梭杆菌。在作为临床信息的牙周袋的深度PD变深、牙周病恶化、或在作为其前一阶段的“红色复合体”增殖之前，具核梭杆菌细菌增殖，因此具核梭杆菌的检测成为牙周病的初期指标。即，具核梭杆菌相对于作为“红色复合体”的牙龈卟啉单胞菌的细菌量、福赛斯坦纳菌的细菌量、齿垢密螺旋体的细菌量这3种的合计的细菌量成为恶化风险的判定指标。

(2)关于探针(a)

本发明中，可用作探针(a)的寡聚DNA是能够与口腔内细菌来源的核酸碱基序列中的特定区域的碱基序列杂交的DNA。这里，该核酸为包括染色体DNA、质粒DNA等的DNA和RNA均可，没有限定，但优选为染色体DNA。具体地，本发明中作为探针使用的寡核苷酸是能够与前述口腔内细菌的染色体DNA中16S rRNA基因的碱基序列杂交的寡核苷酸。

关于本发明可使用的探针，选择成为对作为检测目标的各种前述口腔内细菌特异性的碱基序列区域、对该区域的碱基序列进行设计是优选的。一般而言，设计探针时，除了选择特异性区域以外，还需要熔解温度(Tm)一致、难以形成二级结构。

对应于口腔内各种细菌的特异性碱基序列例如可以通过下述方法来找出：进行多序列比对，在种间在不同区域设计探针等。用于进行比对的算法没有特别限定，作为更具体的分析程序，例如可以利用ClustalX1.8等程序。进行比对时的参数可以以各程序的默认状态进行，也可以根据程序的种类等适当调整。

(3)关于探针(b)

总量指标探针是能够以特定引物对扩增的、捕捉待测物中的全部细菌的目标探针。在检测细菌时，从检测对象细菌在包括非检测对象细菌的全体细菌中是何种程度的比例、此外最初待测物中存在多少量的细菌的观点出发，检测细菌的总量也是极为重要的。

为了检测细菌的总量，例如，可以独立于DNA芯片测定细菌的总量，通过在DNA芯片中搭载作为细菌的总量的指标的探针，从而提高操作的简便性。关于探针，可以从以引物对扩增到的碱基序列中，使用多种菌种通用的碱基序列。找不到这样的序列的情况下，也可以设计多个比较通用的序列，通过对它们进行综合性判断，作为总量指标探针。总量指标探针优选为与待测物所含细菌来源的核酸杂交的探针，详细地，为包含由前述特定引物对扩增到的碱基序列中作为检测对象的多种细菌共同具有的碱基序列的探针。将总量指标探针的例子示于表2-1(序列编号159)。

此外，通过在杂交时添加对于扩增的核酸与总量指标探针的杂交发挥竞争性作用那样的核酸，能够实现信号强度的降低。作为这样的核酸，可列举例如具有与总量指标探针全部或部分相同的序列的核酸、或具有全部或部分总量指标探针的互补序列的核酸等。

(4)关于探针(c)

绝对量指标探针是仅与绝对量指标核酸杂交的探针。

本说明书中，绝对量指标是在扩增反应、杂交反应之前向待测物中以一定量添加的核酸。绝对量指标是如果进行通常的扩增反应则扩增反应切实地进行的核酸，发挥作为所谓阳性对照的功能。

因此，如果将对绝对量指标特异性的探针搭载于DNA芯片，则能够由其检测结果算出扩增反应、杂交等是否合适地实施。此外，将绝对量指标设为一种的情况下，由多个DNA芯片得到的绝对量指标信号强度是应当是恒定的，在扩增效率、杂交效率有些增减的情况下，通过比较绝对量指标的信号强度，可以算出校正系数。多个DNA芯片中，校正后的信号强度可以进行比较。

将对各细菌特异性的探针的例子示于表2-1(序列编号93～158)。此外，将绝对量指标用探针的例子示于表2-1(序列编号160～174)，此外将绝对量指标的例子示于表2-2(序列编号175～189)。

[表2-1]

[表2-2]

特定引物的意思是，扩增对象序列是限定的，引物对不一定必须为1对。根据需要也可以应用使用2对以上的引物对的复合方法。将引物对的例子示于表2-3。可以利用细菌扩增用引物对(序列编号192～204)、绝对量指标用引物对(序列编号190、191)。

作为特定引物，优选为由序列编号193～198和序列编号201～204所示碱基序列(或与该碱基序列互补的碱基序列)构成的DNA。这些引物对于牙周病菌群的序列同源性比现有的引物高，因而是优选的。

作为特定引物，更优选由序列编号193～198和203～204、进一步优选由序列编号197～198和203～204、特别优选由序列编号198和204所示碱基序列(或与该碱基序列互补的碱基序列)构成的DNA。

通过上述评价，确认到由序列编号193～198和203～204所示碱基序列(或与该碱基序列互补的碱基序列)构成的DNA对于牙周病菌群的序列同源性为100％。

尤其是，由序列编号198和204所示碱基序列(或与该碱基序列互补的碱基序列)构成的DNA引物对，在引物的序列与牙周病菌群基因组DNA序列的同源性为100％这一点、以及引物对的熔解温度(Tm)与GC含量的条件一致这一点上是优选的。一般，设计引物对时，必须熔解温度(Tm)接近、难以形成二级结构。

[表2-3]

绝对量指标例如可以利用日本产业技术综合研究所开发的定量分析用核酸标准物质，也可重新设计。进行设计的情况下，例如，使用软件“EXCEL”(微软公司制)的RNDBETWEEN函数，随机产生X个(X为任意的数字)1至4的整数，使它们连成仅由1至4的数值构成的X位数值，通过将1替换为A、将2替换为T、将3替换为C、将4替换为G，能够获得多个由ATGC的X碱基形成的随机序列。

作为这样的严格的条件，例如严格条件的情况是50～60℃条件下的杂交，温和条件的情况是30～40℃条件下的杂交。杂交的条件中，作为严格的条件，可以列举例如“0.24MTris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、40℃”、“0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、37℃”、“0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、30℃”，作为更严格的条件，可以列举例如“0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、50℃”、“0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、55℃”、“0.06M Tris-HCl/0.06M NaCl/0.05％Tween-20、60℃”等条件。更详细地，有下述方法：添加探针，在50℃保持1小时以上形成杂交，其后，进行4次在0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20中50℃、20分钟的洗涤，最后进行1次0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl、50℃、10分钟的洗涤。通过提高杂交或洗涤时的温度，能够设定更严格的条件。除了这样的缓冲液的盐浓度、温度等条件以外，本领域技术人员还可以增加其他探针浓度、探针的长度、反应时间等各项条件来设定条件。关于杂交方法的详细步骤，可以参照“Molecular Cloning，A Laboratory Manual 4th ed.”(Cold SpringHarbor Press(2012)，“Current Protocols in Molecular Biology”(John Wiley&Sons(1987-1997))等。

设计本发明所用的探针时，确认过Tm是优选的。Tm的意思是任意核酸链的50％与其互补链形成杂交的温度，为了使模板DNA或RNA与探针形成双链而杂交，必须对杂交的温度进行优化。另一方面，如果使该温度过于降低，则容易发生非特异性反应，因此温度尽可能高是优选的。因此，想要设计的核酸片段的Tm在进行杂交上是重要的因子。Tm的确认可以利用公知的探针设计用软件，作为本发明中可利用的软件，可列举例如Probe Quest(注册商标，达康公司)等。此外，Tm的确认也可以不使用软件而是通过自己计算来进行。这种情况下，可以利用基于最接近碱基对法(Nearest Neighbor Method)、Wallance法、GC％法等的计算式。本发明的探针没有限定，平均Tm优选约为35～70℃或45～60℃。需要说明的是，除此以外，作为能够作为探针特异性杂交的条件，还有GC含量等，其条件对于本领域技术人员而言是公知的。

作为本发明所用的探针，具体地，优选列举例如包含以下的(d)或(e)的DNA碱基序列的探针。例如，使用表2-3所示引物(序列编号190～204)扩增的情况下，可以以上述表2-1(序列编号93～174)所示序列为探针，使用选自序列编号1～82所示碱基序列的至少2个序列是优选的。此外，也可以是选自序列编号93～174所示碱基序列的至少2个序列的互补序列，还可以是与选自序列编号93～174所示碱基序列的至少2个序列实质上相同的序列或与选自序列编号93～174所示碱基序列的至少2个序列的互补序列实质上相同的序列。

这里，实质上相同是，在严格的条件下与序列编号93～174中记载的序列或互补序列特异性杂交。

(d)由序列编号93～174所示碱基序列构成的DNA

(e)在严格的条件下与由与前述(d)的DNA互补的碱基序列构成的DNA杂交、且具有能够检测口腔内细菌来源的核酸的碱基序列中的至少一部分碱基序列的功能的DNA

作为探针，优选为序列编号97、100、120、121、122、129、130、152、155的探针。序列编号97、100、121、122、125、130在使探针序列的碱基长度增长、通过提高熔解温度(Tm)来促进与待测物来源DNA的氢键这一点上是优选的。

进一步，其中的序列编号121、122、129、130在参照多株检测对象细菌的基因组DNA序列、为了对应一个碱基多态而设定多个碱基序列这一点上是优选的。

此外，序列编号120、152、155在参照检测对象细菌的基因组DNA序列、选择特异性更高的区域进行修正这一点上是优选的。这些引物牙周病菌群的序列同源性比现有的引物高，因而是优选的。

关于前述(d)的各种DNA，关于它们的具体的碱基序列、探针名称、作为检测对象的口腔内细菌，可以参照上述表2-1的记载。这里，链球菌(Streptococcus spp.)用探针表示将星座链球菌、戈登氏链球菌、轻型链球菌、口腔链球菌、血链球菌等合并而得的细菌量。

此外，二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga spp.)用探针1表示将牙龈二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌等合并而得的细菌量，二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagaspp.)用探针2表示将牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌等合并而得的细菌量。此外，具核梭杆菌用探针表示将具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种等合并而得的细菌量。此外，弯曲菌(Campylobacterspp.)用探针2、3表示将直肠弯曲菌、昭和弯曲菌等合并而得的细菌量。

此外，前述(e)的DNA可以如下获得：使用前述(d)的各种DNA或由与之互补的碱基序列构成的DNA、或将它们片段化而得的片段作为探针，实施菌落杂交、菌落杂交和Southern印迹杂交(Southern blot)等公知的杂交方法，由cDNA文库、基因组文库获得。文库可以利用通过公知的方法制作的文库，也可以利用市售的cDNA文库、基因组文库，没有限定。关于杂交方法的详细步骤，可以参照与前述同样的方法。作为杂交的DNA，优选为对于前述(d)的DNA的碱基序列具有至少60％以上的同源性的碱基序列，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为98％以上，最优选为99％以上。

本发明所用的探针例如可以通过使用通常的寡核苷酸合成法进行化学合成(纯化利用HPLC等来进行)来制作。这样的探针例如可以利用Probe Quest(注册商标，达康公司制)来设计。此外，本发明的探针例如可以含有标签序列等附加序列。

本发明的方法中，作为检测目标的前述口腔内细菌所具有的核酸的碱基序列不必须为该碱基序列本身，也可以是碱基序列的一部分由于缺失、替换、插入等产生突变的序列。因此，检测目标核酸的碱基序列也可以以在严格的条件下与该碱基序列互补的序列杂交、且具有各自碱基序列来源的功能、活性的突变型基因为对象，探针也可以以这样的突变型基因的碱基序列为基础进行设计。这里“严格的条件”能够适用与前述同样的条件。

2.口腔内细菌量的测定所用的口腔内细菌基因检测用DNA芯片

如上所述，本发明的方法中可以使用DNA芯片，该DNA芯片是在成为支撑体的基底配置多个前述1.项中说明的各种寡核苷酸探针而成。

作为成为支撑体的基底的形态，平板(玻璃板、树脂板、硅板等)、棒状、珠子等任意形态均可使用。使用平板作为支撑体的情况下，可在该平板上将每种规定的探针按规定的间隔固定(点样法等，参照Science 270，467-470(1995)等)。此外，也可以在平板上的特定位置逐次合成每种规定的探针(光刻法等，参照Science 251，767-773(1991)等)。作为其他优选的支撑体的形态，可列举使用中空纤维的支撑体。使用中空纤维作为支撑体的情况下，可以优选例示通过下述方法得到的DNA芯片(以下称为“纤维型DNA芯片”)：将每种规定的探针固定于各中空纤维，将全部中空纤维集束固定后，在纤维的长度方向上反复切割。该微阵列也可以被描述为将核酸固定在通孔基板上类型的微阵列，也被称为所谓“通孔型DNA芯片”(参照日本专利第3510882号公报等)。

(ii)包埋前述排列体，制造块体的工序；

作为中空纤维中使用的材料没有限定，例如，优选列举日本特开2004-163211号公报等中记载的材料。

3.口腔内细菌基因的检测

(iii)由从DNA芯片得到的信号强度算出细菌量的工序。

以下，按工序对该检测方法的详细信息进行说明。

(1)关于工序(i)

具体地，作为扩增的期望的部位，优选为前述口腔内细菌的染色体DNA中的核糖体RNA(16S rRNA)基因。作为该区域的扩增可使用的PCR引物，例如优选列举表2-3的序列编号190～204。另外，利用PCR法进行的核酸的扩增可以按照常规方法进行。

(2)关于工序(ii)

例如，作为杂交反应时的条件，反应温度优选为35～70℃、更优选为40～65℃，杂交时的时间优选为约1分钟～16小时。

洗涤后，利用能够检测结合于探针的核酸等的标记的装置，按斑点测定检测强度。例如，将前述核酸等用荧光标记的情况下，可以使用各种荧光检测装置、例如CRBIO(日立软件工程公司制)、arrayWoRx(GE Healthcare公司制)、Affymetrix 428 Array Scanner(昂飞(Affymetrix)公司制)、GenePix(Axon Instruments公司制)、ScanArray(珀金埃尔默(PerkinElmer)公司制)、Geno Pearl Reader(三菱丽阳公司制)等来测定荧光强度。关于这些装置，在为荧光扫描仪的情况下，例如，可以适当调整激光的输出、检测部的灵敏度而进行扫描；在为CCD相机型扫描仪的情况下，可以适当调节曝光时间而进行扫描。基于扫描结果的定量方法利用定量软件来进行。定量软件没有特别限定，可以使用斑点的荧光强度平均值、中央值等进行定量。此外，定量中，考虑DNA片段的斑点范围的尺寸精度等、使用未搭载探针的斑点的荧光强度作为背景等进行调整是优选的。

(3)关于工序(iii)

任一情况下，可以以由多个DNA芯片的检测得到的绝对量指标探针信号强度为恒定的方式按DNA芯片算出校正系数，通过在各DNA芯片的检测对象细菌的信号强度中考虑校正系数，进行DNA芯片间的比较。

4.牙周病的严重程度判定

除了牙周病的患者以外，对于自己没注意到牙周病的人员或心脏疾病等提示与牙周病相关的全身疾病患者、孕妇，也能够以口腔内细菌的各细菌量为基础来判定牙周病的严重程度。

判定中，具体地，认为检测中使用的DNA芯片上标记物质的检测图谱表示受试者口腔内细菌的特征。此外，作为其他判定的方式，可列举对于多个待测物，对检测中使用的DNA芯片上标记物质的检测图谱进行统计学分析的方式。

作为统计分析的方法，例如有相关分析、分层聚类和非分层聚类等。更具体地，作为相关分析时所用的距离函数，可列举皮尔逊相关(Pearson correlation)、余弦系数(Cosine coefficient)等方法。此外，作为分层聚类，可列举UPGMA(非加权配对算术平均法，unweighted-pair group methodusing arithmetic averages)等方法。使用这样的分析方法，能够通过进行簇分析实现受试者的小组化，进一步能够判定受试者的类比等。

本发明中，通过将待测物中的口腔内细菌的检测的结果与迄今为止积累的待测物的检测结果一起进行统计分析，可以由其相似度，根据牙周病待测物、牙周病初始待测物或健康待测物中任意的严重程度分成小组。由该分类的结果、即待测物的细菌量，能够提示潜在的疾病活动性。此外，通过以这些结果为基础，将特定的多种细菌的细菌量视为独立的变量进行回归分析，还能够算出该小组牙周病严重程度预测、牙周袋的深度预测中的预测精度。

根据本发明方法的第一方式，能够由多个细菌的信息高精度地判定牙周病的严重程度，因此成为显示牙周病的严重程度的客观指标。

5.牙周病的治疗效果的判定

本发明方法的前述第二方式中判定牙周病治疗效果的方法是以使用前述3.项中说明的口腔内细菌基因的检测方法得到的细菌的检测结果为指标来判定牙周病的治疗效果的方法。

牙周病治疗前和治疗后采集待测物进行比较研究的情况下，通过明确治疗前后增减的细菌，能够客观判定其治疗效果。此外，根据治疗后的细菌数据，能够明确难以因治疗而减少的细菌，也能够特异性地进行治疗。

治疗表示在牙科现场牙科医生、牙科护士一般实施的治疗，例如作为牙周基本治疗，可列举菌斑控制(刷牙指导)和牙垢的去除(洁治术、根面平整术)和啮合调整等。进一步，作为牙周基本治疗后再评价检查的结果是牙垢进入龈袋深的部位而无法除去、未治愈的情况下实施的外科治疗，也可列举翻瓣术、牙周组织再生疗法和整形手术(牙周形成外科手术)等。

判定中，具体地，认为检测中使用的DNA芯片上标记物质的检测图谱表示受试者口腔内细菌的特征。此外，作为其他判定方式，可列举对于多个待测物，对检测中使用的DNA芯片上的标记物质的检测图谱进行统计学分析的方式。

作为统计分析的方法，例如有t检验、非参数方法相关分析等。更具体地，可列举学生(Student)氏的t检验、异方差情况下的韦尔奇t检验等方法。使用这样的分析方法，能够进行待测物的临床信息、细菌量的显著差异检验，能够判定治疗效果。

对前述治疗前的细菌量与前述治疗后的细菌量进行比较，比较结果是总菌量、或牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体、直肠弯曲菌、具核梭杆菌、中间普雷沃菌、变黑普雷沃菌、伴放线放线杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌中至少一种的细菌量减少时，可以判定为确认到牙周病的治疗效果。

此外，相对于总菌量，链球菌的比例与治疗前的比例相比增加的情况也可以判定为确认到治疗效果。

另一方面，治疗前后的比较结果是总菌量和牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体、直肠弯曲菌、具核梭杆菌、中间普雷沃菌、变黑普雷沃菌、伴放线放线杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌中的任一种的细菌量均未减少时，可以判定为未确认到牙周病的治疗效果。

根据本发明方法的第二方式，能够由多个细菌的信息判定牙周病的治疗效果，因此成为牙周病治疗效果的客观指标。

6.牙周病的恶化风险的判定

本发明方法的前述第三方式中判定牙周病的恶化风险的方法是以使用前述3.项中说明的口腔内细菌基因的检测方法得到的细菌的检测结果为指标来判定牙周病的恶化风险的方法。

例如，通过对一名受试者定期进行判定，能够监控其恶化风险。除了牙周病的患者以外，对于自己没注意到牙周病的人员或提示有心脏疾病等牙周病相关的全身疾病患者、孕妇，也能够基于口腔内细菌的各细菌量来判定牙周病的严重程度。

在虽然根本或几乎检测不到恶性程度高的牙周病细菌的细菌、但某些特定细菌的细菌量显著高的待测物的情况下，判定为存在恶化的风险。恶化表示今后会牙周袋的深度变深、或恶性程度高的牙周病细菌的细菌量增加。

判定中，具体地，认为检测中使用的DNA芯片上的标记物质的检测图谱表示受试者口腔内细菌的特征。此外，作为其他判定方式，可列举对多个待测物，对检测中使用的DNA芯片上标记物质的检测图谱进行统计学分析的方式。

本发明中，口腔内细菌的检测中，在牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体中的任何一种均根本或几乎检测不到、进一步显著检测到具核梭杆菌的细菌量的情况下，例如，具核梭杆菌的细菌量与牙龈卟啉单胞菌的细菌量、福赛斯坦纳菌的细菌量和齿垢密螺旋体的细菌量的合计的比率大那样的情况下，可以判定为牙周病恶化风险高。

另一方面，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体中的任一种均检测不到、进一步具核梭杆菌的细菌量也未显著检测到的情况下，或具核梭杆菌的细菌量与牙龈卟啉单胞菌的细菌量、福赛斯坦纳菌的细菌量和齿垢密螺旋体的细菌量的合计的比率小的情况下，可以判定为牙周病恶化风险低。

根据本发明方法的第三方式，能够由多个细菌的信息高精度地判定牙周病的恶化风险，因此能够在预防中进行利用。

以下，列举实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明不限于此。

[实施例1-1]

使用唾液待测物的牙周病/龋齿的状态的判定

<DNA的制备>

在5名(20岁年龄段至50岁年龄段的男女)健康成年人的协助下实施唾液评价试验。将该5人作为受试者A、B、C、D、E，对唾液进行评价。

唾液采集设为将γ收集拭子RI(荣研化学)在口内含1分钟，采集唾液的方法。将γ收集拭子RI在管中的水中浸渍，室温静置5分钟，将细菌成分洗脱。其后，取出γ收集拭子RI，将管用离心分离机离心。对于得到的沉淀，使用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)提取DNA。

<DNA的评价>

将DNA稀释至10pg左右，用GeneAmp9700(AppliedBiosystems)进行PCR，扩增、标记。引物使用序列编号1、2、91、92。PCR液组成(20μL体系)如表1-3所示。

[表1-3]

	终浓度
		水	-
对照DNA	0.5pg
		引物对照DNA用F	0.25μM
引物对照DNA用R	0.25μM
		引物细菌用F	0.25μM
引物细菌用R	0.25μM
		唾液来源DNA	10pg
Extaq	-

PCR条件如表1-4所示。

[表1-4]

Ramp max，液量20μl

PCR结束后，分别添加180μL杂交反应液(1M Tris-HCl 48μL、1M NaCl48μL、0.5％Tween20 20μL、水65μL)。作为杂交预处理，在GeneAmp9700中94℃反应1分钟，在4℃待机。

在自动杂交洗涤装置(三菱丽阳)中50℃杂交2小时。然后洗涤。

测定中使用的DNA芯片中搭载的探针如表1-5所示。

[表1-5]

检测使用Geno Pearl Reader(三菱丽阳)，曝光时间0.1、1、4、40秒，进行评价。

<结果>

作为1mL唾液中的细菌数，得到表1-6所示结果。

[表1-6]

每1ml唾液的细菌数

<判定>

(1)牙周病的状态的判定

受试者A是，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体这3种菌的合计细菌数为0，相对于总菌量的比例为0％。

将口腔内试样中所含的细菌中牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体中的至少一种细菌数的合计相对于总菌数低于0.05％的情况判定为“轻度”，将相对于总菌数0.05％以上且低于0.5％的情况判定为“中度”，将相对于总菌数为0.5％以上的情况判定为“重度”，基于该基准(本说明书中的判定基准2)，对于受试者A的牙周病的判定为“轻度”。

受试者B是，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体这3种菌的合计细菌数为0，相对于总菌量的比例为0％。

基于与受试者A同样的基准，判定为“轻度”。

受试者C是，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体这3种菌的合计细菌数为3577812，相对于总菌量的比例为1.7％。

基于与受试者A同样的基准，判定为“重度”。

受试者D是，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体这3种菌的合计细菌数为0，相对于总菌量的比例为0％。

如果按照与受试者A同样的基准，则分类为“轻度”。

受试者E是，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体这3种菌的合计细菌数为339241，相对于总菌量的比例为0.4％。

基于与受试者A同样的基准，判定为“中度”。

(2)龋齿的状态的判定

受试者A是，变形链球菌的细菌数为0，相对于总菌量的比例为0％。

将口腔内试样中存在的细菌中变形链球菌的细菌数相对于总菌数低于0.05％的情况判定为轻度，将相对于总菌数为0.05％以上且低于2.5％的情况判定为“中度”，将相对于总菌数为2.5％以上的情况判定为“重度”，基于该基准(本说明书中的判定基准5)，判定为“轻度”。

受试者B是，变形链球菌的细菌数为18862，相对于总菌量的比例为0.01％。基于与受试者A同样的基准，判定为“轻度”。

受试者C是，变形链球菌的细菌数为0，相对于总菌量的比例为0％。基于与受试者A同样的基准，判定为“轻度”。

受试者D是，变形链球菌的细菌数为17736，相对于总菌量的比例为0.05％。基于与受试者A同样的基准，判定为“中度”。

受试者E是，变形链球菌的细菌数为18808，相对于总菌量的比例为0.02％。基于与受试者A同样的基准，判定为“轻度”。

通过一次取样，能够全面取得牙周病和龋齿相关细菌的信息，能够由牙周病和龋齿的细菌数同时进行状态的判定(表1-7)。

可知受试者A和B是，牙周病的状态和龋齿的状态均为轻度。可知受试者C是，牙周病的状态为重度，龋齿的状态为轻度。可知受试者D是，牙周病的状态为轻度，龋齿的状态为中度。可知受试者E是，牙周病的状态为中度，龋齿的状态为轻度。

[表1-7]

[实施例1-2]

使用菌斑待测物的牙周病/龋齿的状态的判定

<龈下菌斑待测物的制备>

在大阪大学牙科部附属医院，在5名受试者协助下实施龈下菌斑评价试验。将该5人设为受试者F、G、H、I、J，对龈下菌斑进行评价。

龈下菌斑是，将两根吸潮纸尖(Absorbent paper points)(ISO Color-Coded(ISO颜色编码))#40(登士柏迈斐(DENTSPLY MAILLEFER)公司制)插入牙周袋，放置30秒。之后，将纸尖投入加入有0.15mL灭菌蒸馏水的微型管，涡旋20秒。用经灭菌的镊子将纸尖取出，在检测前在-20℃冷冻保存。

使冷冻保存的待测物融化，作为PCR模板。用GeneAmp9700(AppliedBiosystems)进行PCR，扩增、标记。引物使用序列编号1、2、91、92。PCR液组成(20μL体系)如表1-8所示。

[表1-8]

	组成
		水	-
对照DNA	0.5pg
		引物对照DNA用F	0.25μM
引物对照DNA用R	0.25μM
		引物细菌用F	0.25μM
引物细菌用R	0.25μM
		菌斑溶解液	1μL
Extaq	-

PCR条件如表1-9所示。

[表1-9]

Ramp max，液量20μl

PCR结束后，分别添加180μL杂交反应液(1M Tris-HCl 48μL、1M NaCl48μL、0.5％Tween2020μL、水65μL)。作为杂交预处理，在GeneAmp9700中94℃反应1分钟，在4℃待机。

测定中使用的DNA芯片中搭载的探针如表1-10所示。

[表1-10]

<结果>

作为纸尖1根中的细菌数，得到表1-11所示结果。

[表1-11]

每根纸尖的细菌数

<判定>

(1)牙周病的状态的判定

受试者F是，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体这3种菌的合计细菌数为2458，相对于总菌量的比例为6.5％。

将口腔内试样中所含的细菌中牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体中的至少一种细菌数的合计相对于总菌数低于0.05％的情况判定为“轻度”，将相对于总菌数0.05％以上且低于0.5％的情况判定为“中度”，将相对于总菌数为0.5％以上的情况判定为“重度”，基于该基准(本说明书中的判定基准1)，对受试者F的牙周病的判定为“重度”。

受试者G是，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体这3种菌的合计细菌数为0，相对于总菌量的比例为0％。

基于与受试者F同样的基准，判定为“轻度”。

受试者H是，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体这3种菌的合计细菌数为0，相对于总菌量的比例为0％。

基于与受试者F同样的基准，判定为“轻度”。

受试者I是，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体这3种菌的合计细菌数为84，相对于总菌量的比例为0.23％。

如果采取与受试者F同样的基准，则分类为“中度”。

受试者J是，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体这3种菌的合计细菌数为0，相对于总菌量的比例为0％。

基于与受试者F同样的基准，判定为“轻度”。

(2)龋齿的状态的判定

受试者F是，变形链球菌的细菌数为0，相对于总菌量的比例为0％。

将口腔内试样中存在的细菌中变形链球菌的细菌数相对于总菌数低于0.05％的情况判定为“轻度”，将相对于总菌数为0.05％以上且低于2.5％的情况判定为“中度”，将相对于总菌数为2.5％以上的情况判定为“重度”，基于该基准(本说明书中的判定基准2)，判定为“轻度”。

受试者G是，变形链球菌的细菌数为3，相对于总菌量的比例为0.06％。基于与受试者F同样的基准，判定为“中度”。

受试者H是，变形链球菌的细菌数为6，相对于总菌量的比例为0％。基于与受试者F同样的基准，判定为“轻度”。

受试者I是，变形链球菌的细菌数为0，相对于总菌量的比例为0％。基于与受试者F同样的基准，判定为“轻度”。

受试者J是，变形链球菌的细菌数为0，相对于总菌量的比例为0％。基于与受试者F同样的基准，判定为“轻度”。

通过一次取样，能够全面取得牙周病和龋齿相关细菌的信息，能够由牙周病和龋齿的细菌数同时进行状态的判定(表1-12)。可知受试者H和J是，牙周病的状态和龋齿的状态均为轻度。可知受试者F是，牙周病的状态为重度，龋齿的状态为轻度。可知受试者G是，牙周病的状态为轻度，龋齿的状态为中度。可知受试者I是，牙周病的状态为中度，龋齿的状态为轻度。

[表1-12]

[实施例2-1]

牙周病的严重程度、恶化风险的判定

龈下菌斑待测物中的口腔内细菌的检测

<龈下菌斑待测物的制备>

在大阪大学牙科部附属医院，从牙周病治疗前状态的20岁年龄段至70岁年龄段的220名男女受试者采集龈下菌斑。龈下菌斑是，将两根吸潮纸尖(Absorbent paper points)(ISO Color-Coded(ISO颜色编码))#40(登士柏迈斐(DENTSPLY MAILLEFER)公司制)插入牙周袋，放置30秒。之后，将纸尖投入加入有0.15mL灭菌蒸馏水的微型管，涡旋20秒。用镊子将纸尖取出，检测前-20℃冷冻保存。

<临床信息的取得>

对于全部待测物，按照下述基准将临床信息数值化。下述4个项目是牙科广泛利用的指标。

(i)牙周袋的深度(Pd)：表示将牙周探针插入龈袋时，从牙龈边缘至探针前端的距离。以1mm单位数值化。

(ii)探测时的出血(BOP)：表示将牙周探针插入龈袋时出血的有无。将没有出血的情况作为0，将有出血的情况作为1。

(iii)牙龈指数(Gingival Index，GI)：表示牙龈炎症的程度。将未确认到炎症的情况作为0，将轻度炎症的情况作为1，将中度炎症的情况作为2，将高度炎症的情况作为3。

(iv)菌斑指数(Plaque Index，PlI)：表示与牙龈相邻的牙面的菌斑沉积量。将未确认到菌斑的情况作为0，将虽然肉眼确认不到菌斑、但用探针摩擦时能够确认到的情况作为1，将能够观察到菌斑的情况作为2，将确认到大量菌斑的情况作为3。

<PCR>

使前述冷冻保存的全部待测物融化，作为PCR模板。为了扩增待测物中的口腔内细菌的16SrRNA的检测对象区域的序列，用以下的反应液组成和反应条件实施PCR。PCR用试剂盒使用Premix Ex Taq^TM Hot Start Version(Takara公司制)，利用GeneAmp9700(AppliedBiosystems公司制)来进行。引物使用具有下述序列的引物。另外，正向引物使用5’末端用Cy5标记的引物。

正向引物(细菌扩增用)：

5’-Cy5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’(序列编号192)

反向引物(细菌扩增用)：

5’-CAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACC-3’(序列编号200)

正向引物(绝对量指标扩增用)：

5’-Cy5-GAGAAGCCTACACAAACGTAACGTC-3’(序列编号190)

反向引物(绝对量指标扩增用)：

5’-CTCTAAAGACCGCTCTATCTCGG-3’(序列编号191)

<反应液组成>

2×Premix Ex Taq(注册商标)

<反应条件>

95℃加热1分钟后，将“解离：98℃(10秒)→退火：60℃(30秒)→合成：72℃(20秒)”作为1个循环，进行合计40个循环，4℃冷却，得到扩增产物。

<DNA芯片：口腔内细菌检测用DNA芯片的制造>

通过与日本特开2007-74950号公报(甲基化DNA和/或非甲基化DNA的检测方法)实施例2-1中记载的方法同样的方法进行通孔型的DNA芯片的制造。

其中，搭载的寡核苷酸探针使用具有表2-4所示序列信息的探针。

[表2-4]

<与DNA芯片的杂交>

以下述方式将各溶液混合，制备杂交溶液。

使200μL杂交溶液与前述DNA芯片接触，在50℃杂交2小时。

杂交后，在下述条件下洗涤DNA芯片。重复进行12次在1000μL 0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20溶液中220秒的洗涤，然后，重复4次在1000μL 0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl中220秒的洗涤。

洗涤结束后，将各芯片移入室温的0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl混合溶液。

<检测>

前述洗涤后，使用Geno Pearl Reader(三菱丽阳公司制)，以下述条件测定DNA芯片的各斑点的荧光强度。

<检测条件>

中心激发波长：633nm

曝光时间：0.1、1、4、40秒

<结果>

用搭载有检测对象细菌用探针的斑点的荧光强度除以背景值(未搭载探针的斑点的荧光强度中央值)，算出杂交来源的荧光强度(以下称为信号强度)的SN比。SN比用对数函数Log2表示。对于所有220个待测物，按检测对象细菌，得到0至最大值10的SN比数据。根据对数函数的性质，1以上时判断为检测到，低于1时判断为检测极限以下。

<临床信息与细菌量的相关分析：牙周病的严重程度>

首先，按待测物，对应表示各临床信息和各细菌量的SN比数据。其后，为了将待测物的临床信息和细菌量通过相似度分类，进行簇分析。对由临床信息的4个项目(Pd、BOP、GI、PlI)和表2-4的探针得到的28种细菌量数值进行簇分析，制成各簇的热图。簇分析使用统计软件“R”(R Development Core Team)。分析条件是生物学统计分析中一般使用的条件，距离函数使用皮尔逊相关(Pearson correlation)，簇的结合方法使用沃德(Ward)法。

<结果>

如图1所示，待测物分类为3个大的簇。为了揭示3个簇的临床信息特征，将各簇表示为小组1、2、3，算出各小组的Pd、BOP、GI、PlI和各细菌量的平均值和标准偏差(表2-5)。

[表2-5]

根据《牙周病的检查、诊断、治疗计划指南2008》(歯周病の検查·診断·治療計画の指針 2008)牙周病学会编P.16，以Pd为6mm以上、或4～5mm、或该值以下的条件改变牙周病的治疗计划，因而认为小组1相当于重度牙周病待测物，小组2相当于牙周病初期待测物，小组3相当于健康待测物。

另一方面，临床信息和细菌的检测项目如图2所示分类为3个大的簇。

此外，根据图3的结果，如下所述找出显示牙周病的严重程度的指标。图3的热图中，各项目的数值从最低开始，表示为绿→红(淡→浓)。

小组A由临床信息和作为“红色复合体”的牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体、属于恶性程度高、仅次于“红色复合体”的小组的直肠弯曲菌、纤细弯曲菌、昭和弯曲菌、具核梭杆菌等构成。小组A的项目是，小组1的待测物中检测到最高，小组2紧随其后，进一步小组3紧随其后，检测量变少。前述7种菌的细菌量是与临床信息相关或逆相关高的信息，被认为是表示牙周病严重程度的指标。

这里，小组2的待测物中，检测到具核梭杆菌的检测量高，与小组1同样，但发现了临床信息PD、“红色复合体”的数值低的亚组2-1。该亚组是，在“红色复合体”增殖前具核梭杆菌已经增加的状态下，被认为以后“红色复合体”增殖、Pd增加等牙周病恶化的可能性高。即，认为相对于牙龈卟啉单胞菌的细菌量、福赛斯坦纳菌的细菌量、齿垢密螺旋体的细菌量的合计的具核梭杆菌的细菌量成为恶化风险的判定指标。

然后，小组B由恶性程度较低的细菌构成。尤其是小组1的待测物中检测到低的链球菌3、中间链球菌、小韦荣氏球菌这3种菌，小组2和小组3中检测量高。即，随着临床信息的数值的下降，链球菌、中间链球菌、小韦荣氏球菌这3种菌的细菌量增加，可以说它们是表示牙周病严重程度的指标。

然后，将各细菌量的信息视为独立的变量，以严重程度分组作为目标变量，进行回归分析。其结果是，与1个菌种的信息相比，3个菌种、6个菌种、进一步8个菌种的情况下，其决定系数接近1。此外，同样地将各细菌量的信息视为独立的变量，以牙周袋的数值作为目标变量，进行回归分析，结果有同样的倾向。以这种方式，通过增加测定细菌的种类，严重程度小组的预测和牙周袋等临床信息的预测精度提高。

[表2-6]

[实施例2-2]

牙周病的治疗效果的判定

治疗前和治疗后菌斑待测物的细菌检测

<菌斑待测物的制备>

为了对治疗前和治疗后的菌斑待测物的细菌量进行比较，在大阪大学牙科部附属医院，从20岁年龄段至70岁年龄段的65个男女病例采集牙周病治疗前和治疗后的龈下菌斑。治疗是实施作为牙周基本治疗的牙垢的去除(洁治术、根面平整术)。

龈下菌斑是将两根吸潮纸尖(Absorbent paper points)(ISO Color-Coded(ISO颜色编码))#40(登士柏迈斐(DENTSPLY MAILLEFER)公司制)插入牙周袋，放置30秒。其后，将纸尖投入加入有0.15mL灭菌蒸馏水的微型管，涡旋20秒。用镊子将纸尖取出，检测前-20℃冷冻保存。

<DNA芯片：口腔内细菌检测用DNA芯片的制造>

通过与日本特开2007-74950号公报(甲基化DNA和/或非甲基化DNA的检测方法)实施例2-1中记载的方法同样的方法，进行通孔型的DNA芯片的制造。

搭载的寡核苷酸探针使用具有表2-7所示序列信息的探针。

PCR、与DNA芯片的杂交至检测与实施例2-1同样实施。

[表2-7]

<结果>

从搭载有检测对象细菌用探针的斑点的荧光强度减去背景值(未搭载探针的斑点的荧光强度中央值和标准偏差的3倍)，算出杂交来源的信号强度。然后，对于多张DNA芯片，比较绝对量指标探针信号强度，求出各DNA芯片的校正系数，对检测对象细菌的信号强度进行校正，以能够进行比较。其后，乘以事先确定的各细菌量计算系数，按基因组拷贝数算出各检测对象的细菌量。各细菌量计算系数是，测定检测各细菌来源基因组DNA时的信号强度，制作校正曲线，由各细菌的信号强度求出反向计算各细菌量的系数。最后，乘以PCR模板所用检测待测物的稀释率，算出每根纸尖的细菌数。

通过前述计算，关于全部的130个待测物，各个检测对象细菌得到0至10的7次方的细菌数数据。然后，算出治疗前和治疗后各项目的平均值和标准偏差(表2-8)。

[表2-8]

<治疗前和治疗后细菌数据的比较>

从治疗前的细菌量减去治疗后的细菌量得到的结果是，牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体、具核梭杆菌、直肠弯曲菌和总菌数的细菌量减少。如果在学生(Student)氏的t检验中以显著差异基准5％为基准，则这些均确认到显著差异。此外，算出各细菌量相对于总菌数的比例，在治疗前后进行比较的情况下，链球菌的比例显著增加。

由以上的结果可见，通过对治疗前后的细菌量、尤其是牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体、具核梭杆菌、直肠弯曲菌、链球菌的细菌量进行比较，能够判断牙周病的治疗效果。

此外，65个病例中，治疗后“红色复合体”的细菌量未减少的病例为7个病例。这些牙齿均为臼齿，与解剖学上臼齿的牙垢除去困难的事实一致。此外，7个病例中，包括Pd的数值增加、作为临床信息也恶化的唯一病例，没有遗漏未获得治疗效果的病例。进一步，其他6个病例是，Pd为改善倾向或同等程度，“红色复合体”的细菌量为同等程度或增加倾向。由这些结果认为，细菌量能够被提出作为与作为临床信息观察到的信息相关、且能够示出疾病活动性的指标。

这里，根据J Health Care Dent.2003，5：42-61.，报告了即使是专科医生，臼齿中的牙垢除去率Pd为1～3mm的情况下是91％、Pd为4～6mm的情况下是61％、Pd为7mm以上的情况下是37％。本研究中，约90％的病例中“红色复合体”的细菌量减少，在与报告例相比也没有矛盾的范围内，是良好的试验。

[实施例2-3]

通用引物的设计

本发明的通用引物包含以下的序列。

通过前述1.项的步骤，作为16SrRNA的可变区域，选择V3和V4。在V3和V4区域前后选择保守性高的通用引物设计区域，设计序列编号192～204所示序列。利用核糖体数据库计划(Ribosomal Database Project，RDP)数据库的Probe Match h(探针匹配)功能，作为条件，Strain(株)选择Type(类型)，Sourse(来源)选择Isolates(分离株)，对于设计的通用引物序列，提取各得分“Hits”。由相对于总数的得分“Hits”的值评价其包罗性。

其中，样品No.1～5的组合中，牙周病细菌的基因组DNA与引物序列的同源性为100％，样品No.6～8的组合中，上述同源性不为100％。

[表2-9]

[实施例2-4]

通用引物的包罗性评价

<测定对象>

以从ATCC购买的各种细菌来源基因组DNA作为测定对象。

<PCR>

为了扩增细菌来源基因组DNA的16SrRNA的检测对象区域的序列，用以下的反应液组成和反应条件实施PCR。PCR用试剂盒使用Premix Ex Taq^TM Hot Start Version(Takara公司制)，利用GeneAmp9700(Applied Biosystems公司制)实施扩增反应。引物设为表2-10所示引物条件。其中，正向引物使用5’末端用Cy5标记的引物，对扩增产物的末端进行标记。

[表2-10]

<反应液组成>

2×Premix Ex Taq(注册商标)

<反应条件>

95℃加热1分钟后，以“解离：98℃(10秒)→退火：60℃(30秒)→合成：72℃(20秒)”作为1个循环，进行合计40个循环，4℃冷却，得到扩增产物。

<DNA芯片：口腔内细菌检测用DNA芯片的制造>

其中，搭载的寡核苷酸探针使用具有表2-11所示序列信息的探针。

[表2-11]

<与DNA芯片的杂交>

以下述方式将各溶液混合，制备杂交溶液。

使用自动杂交洗涤装置(三菱丽阳公司制)，使200μL杂交溶液与前述DNA芯片接触，在50℃杂交2小时。

杂交后，在下述条件下洗涤DNA芯片。重复12次在1000μL 0.24M Tris-HCl/0.24MNaCl/0.05％Tween-20溶液中220秒的洗涤，然后，重复4次在1000μL 0.24M Tris-HCl/0.24M NaCl中220秒的洗涤。

<检测>

<检测条件>

中心激发波长：633nm

曝光时间：0.1、1、4、40秒

<结果>

从搭载有检测对象细菌用探针的斑点的荧光强度减去背景值(未搭载探针的斑点的荧光强度中央值)，算出杂交来源的荧光强度(以下称为信号强度)。其结果如表2-12所示，样品No.6、7、8中未充分获得信号强度、为3000以下的基因组DNA，而样品No.2、3，4中，在目标探针斑点中得到30000以上的充分量的信号强度。此外，所有引物对中序列同源性均为100％，设定为阳性对照，样品No.1、5中均获得充分量的信号强度。

实施例2-3中，Cy5-通用(Universal)16S-FWD6和通用RVS42016相对于总数的得分“Hits”的值比Cy5-通用16S-FWD和通用RVS22014高，这是与本实施例(实施例2-4)中，Cy5-通用16S-FWD6和通用RVS42016的细菌来源基因组DNA的检测能力提高的结果具有一致性的结果。

[表2-12]

[实施例2-5]

细菌检测用DNA探针的设计

本发明的细菌检测用DNA探针的对象是序列编号97、100、120、121、122、129、130、152、155的序列。

作为16SrRNA的可变区域，选择V3和V4。在V3和V4区域中，筛选各细菌特异性地具有的序列，特异性已经充分的情况，选择Tm更高的序列。此外，根据细菌株的不同而有多态序列的情况下，考虑这一点而设定多个序列。

[比较例1]

细菌检测用DNA探针的评价

<测定对象>

以从ATCC购买的各种细菌来源基因组DNA作为测定对象。

<PCR>

为了扩增细菌来源基因组DNA的16SrRNA的检测对象区域的序列，用以下的反应液组成和反应条件实施PCR。PCR用试剂盒使用Premix Ex Taq^TMHot Start Version(Takara公司制)，利用GeneAmp9700(Applied Biosystems公司制)实施扩增反应。引物设为以下所示引物条件。另外，正向引物使用5’末端用Cy5标记的引物，对扩增产物的末端进行标记。

<引物序列>

正向引物：

5’Cy5-TACGGGAGGCAGCAG-3’(序列编号205)

反向引物：

5’-CRGGGTATCTAATCCYGTT-3’(序列编号206，R为A或G，Y为C或T)

<反应液组成>

2×Premix Ex Taq(注册商标)

<反应条件>

<DNA芯片：口腔内细菌检测用DNA芯片的制造>

通过与日本特开2007-74950号公报(甲基化DNA和/或非甲基化DNA的检测方法)实施例2-1中记载的方法同样的方法进行通孔型DNA芯片的制造。

其中，制作包含序列编号95、97、99、100、120、122、123、124、127、129、130、151、152、154、155、159的序列作为细菌检测用DNA探针的DNA微阵列。

<与DNA芯片的杂交>

以下述方式将各溶液混合，制备杂交溶液。

使用自动杂交洗涤装置(三菱丽阳公司制)，使200μL杂交溶液与前述DNA芯片接触，在50℃杂交16小时。

<检测>

<检测条件>

中心激发波长：633nm

曝光时间：0.1、1、4、40秒

<结果>

从搭载有检测对象细菌用探针的斑点的荧光强度减去背景值(未搭载探针的斑点的荧光强度中央值)，算出杂交来源的荧光强度(以下称为信号强度)。其结果如表2-13所示，与现有探针序列编号95、99、119、127、151、154的信号强度相比，作为本发明的探针的序列编号97、100、120、121、122、129、130、152、155在目标探针斑点中得到约2至5倍程度高的信号强度。

由以上结果表明，本发明的探针均为检测灵敏度高的改良探针。

[表2-13]

序列表自由内容

序列编号1～206：合成核酸

Claims

1.一种口腔内检查方法，通过由从受试者采集的口腔内试样测定口腔内试样中存在的细菌量来判定牙周病和/或龋齿的状态。

2.根据权利要求1所述的方法，通过求出特定细菌的菌数与口腔内试样中存在的细菌的总菌数的比例来判定牙周病和/或龋齿的状态。

3.根据权利要求2所述的方法，在使用唾液作为口腔内试样的情况下，将唾液中存在的细菌中选自由牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福赛斯坦纳菌(Tannerellaforsythensis)和齿垢密螺旋体(Treponema denticola)组成的组的至少一种细菌的菌数的合计相对于总菌数低于0.01％的情况判定为牙周病的症状为“轻度”，将相对于总菌数为0.01％以上且低于0.5％的情况判定为牙周病的症状为“中度”，将相对于总菌数为0.5％以上的情况判定为牙周病的症状为“重度”。

4.根据权利要求2所述的方法，在使用唾液作为口腔内试样的情况下，将唾液中存在的细菌中变形链球菌(Streptococcus mutans)的菌数相对于总菌数低于0.05％的情况判定为龋齿的症状为“轻度”，将相对于总菌数为0.05％以上且低于2.5％的情况判定为龋齿的症状为“中度”，将相对于总菌数为2.5％以上的情况判定为龋齿的症状为“重度”。

5.根据权利要求2所述的方法，在使用菌斑作为口腔内试样的情况下，将菌斑中存在的细菌中选自由牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福赛斯坦纳菌(Tannerellaforsythensis)和齿垢密螺旋体(Treponema denticola)组成的组的至少一种细菌的菌数的合计相对于总菌数低于0.1％的情况判定为牙周病的症状为“轻度”，将相对于总菌数为0.1％以上且低于5％的情况判定为牙周病的症状为“中度”，将相对于总菌数为5％以上的情况判定为牙周病的症状为“重度”。

6.根据权利要求1所述的方法，包括：

7.根据权利要求1所述的方法，包括：

基于前述治疗前的细菌量与前述治疗后的细菌量的比较结果来判定牙周病的治疗效果的工序。

8.根据权利要求1所述的方法，包括：

基于得到的细菌量的比率判定牙周病的恶化风险的工序。

9.根据权利要求6或7所述的方法，口腔内试样中的特定细菌为选自由属于卟啉菌属(Porphyromonas)、坦纳菌属(Tannerella)、密螺旋体属(Treponema)、普雷沃菌属(Prevotella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)、微单胞菌属(Parvimonas)、链球菌属(Streptococcus)、伴放线放线杆菌属(Aggregatibacter)、二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)、艾肯菌属(Eikenella)、放线菌属(Actinomyces)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、月形单胞菌属(Selenomonas)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas属)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷菌属(Serratia)、莫拉氏菌属(Moraxella)和念珠菌属(Candida)的细菌组成的组的至少一种。

10.根据权利要求6或7所述的方法，口腔内试样中的特定细菌为选自由牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)、伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、具核梭杆菌文氏亚种(Fusobacteriumnucleatum subsp.vincentii)、具核梭杆菌多形亚种(Fusobacterium nucleatumsubsp.polymorphum)、具核梭杆菌动物亚种(Fusobacterium nucleatumsubsp.animalis)、具核梭杆菌具核亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.nucleatum)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、轻型链球菌(Streptococcus mitis)、粘性放线菌(Actinomyces viscosus)、金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、纤细弯曲菌(Campylobacter gracilis)、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、昭和弯曲菌(Campylobacter showae)、牙周梭杆菌(Fusobacterium periodonticum)、微小微单胞菌(Parvimonas micra)、变黑普雷沃菌(Prevotella nigrescens)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、简明弯曲杆菌(Campylobacter concisus)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga gingivalis)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)、生痰二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagasputigena)、啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、戈登氏链球菌(Streptococcusgordonii)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、轻型链球菌(Streptococcusmitis)bv 2、溶齿放线菌(Actinomyces odontolyticus)、小韦荣氏球菌(Veillonellaparvula)、内氏放线菌II(Actinomyces naeslundii II)和有害月形单胞菌(Selenomonasnoxia)组成的组的至少一种。

11.根据权利要求6或7所述的方法，口腔内试样中的特定细菌为选自由牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、戈登氏链球菌(Streptococcus gordonii)、轻型链球菌(Streptococcus mitis)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)和小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)组成的组的至少一种。

12.根据权利要求8所述的方法，口腔内试样中的特定细菌为选自由牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)和齿垢密螺旋体(Treponema denticola)组成的组的至少一种和具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)。

13.根据权利要求1所述的方法，通过包括以下的工序(1)～(3)的细菌数计算方法来测定口腔内试样中存在的细菌数：

(1)将由待测样品得到的数据与绝对量指标探针信号强度比较、进行校正的工序；

(2)对于预先分离的各检测对象细菌，由用于检测该检测对象细菌的探针信号强度比求出细菌数计算式的工序；

14.一种引物或引物组，包含由序列编号193～198和201～204所示碱基序列或与该碱基序列互补的碱基序列构成的DNA中的一种或两种以上。

15.一种寡核苷酸探针，包含：

由序列编号97、100、120、121、122、129、130、152或155所示碱基序列或与该碱基序列互补的碱基序列构成的DNA；或者