KR20080024503A - 감염성 질환 원인균에 대한 질환군별 고효율 분석 및동시에 항생제 내성 분석을 위한 신규 프로브,멀티플렉스-ｐｃｒ 키트, ｄｎａ 칩, ｐｎａ 칩, 그리고이를 이용한 감염성 질환 검사방법 - Google Patents

감염성 질환 원인균에 대한 질환군별 고효율 분석 및동시에 항생제 내성 분석을 위한 신규 프로브,멀티플렉스-ｐｃｒ 키트, ｄｎａ 칩, ｐｎａ 칩, 그리고이를 이용한 감염성 질환 검사방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대표적인 감염성 질환의 원인균을 우수한 민감도와 특이도로 검출하는 진단용 칩(chip)에 관한 것이다. 감염성 질환의 68종 균을 질환군별로 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(Multiplex PCR)으로 증폭한 후, 그 산물을 해당 원인균에 특이적으로 결합하도록 설계된 프로브(probe)가 고정화된 칩 기판위에 혼성화(hybridization) 반응을 통해 감염 여부뿐 아니라 감염균 유전자형(genotype)과 항생제 내성 보유 유무까지 판별하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 키트, 프로브, DNA(Deoxyribonucleic acid) 칩, PNA(Peptide nucleic acid) 칩을 제공한다. 본 발명에 의하면 감염 유무외에 감염균 유전자형 그리고 항생제 내성까지 one-stop 분석함으로써 조기진단과 감염 초기에 효과적인 의료 서비스를 가능케할 수 있다.
감염성 질환, 멀티플렉스 PCR, DNA 칩, PNA 칩, 항생제 내성, 성전파성 질환, 요로감염, 인유두종바이러스, 전립선염, 마이코박테리아.

Description

감염성 질환 원인균에 대한 질환군별 고효율 분석 및 동시에 항생제 내성 분석을 위한 신규 프로브, 멀티플렉스-ＰＣＲ 키트, ＤＮＡ 칩, ＰＮＡ 칩, 그리고 이를 이용한 감염성 질환 검사방법{Novel probes, multiplex-PCR kit, DNA chip and PNA chip prerequisite for high-throughput analysis and simultaneous antibiotics resistance analysis to detect infectious diseases-related microorganisms and method thereof}
본 발명의 목적은 감염성 질환 원인균을 질환군별로 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(Multiplex PCR)으로 증폭한 후, 그 산물을 해당 원인균에 특이적으로 결합하도록 설계된 프로브(probe)가 고정화된 칩 기판위에 혼성화(hybridization) 반응을 통해 감염 여부뿐 아니라 감염균 유전자형(genotype) 및 항생제 내성 보유 유무를 판별할 수 있는 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 68종의 감염성 질환 원인균을 1회 칩 반응만으로 판별할 수 있는 검사방법을 제공하는 것이며, 목적을 달성하기 위한 프로브, 멀티플렉스 PCR 키트, DNA 칩, PNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 성전파성질환 12종 원인균의 감염 여부를 분석하기 위해 선택된 고 특이도 신규 프로브와 멀티플렉스 PCR 키트, DNA 칩, PNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 요로감염균 12종 원인균의 감염 여부를 분석하기 위해 선택된 고 특이도 신규 프로브와 멀티플렉스 PCR 키트, DNA 칩, PNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인유두종 바이러스 고위험형 9종, 저위험형 5종 유전자형 감염 여부를 분석하기 위해 선택된 고 특이도 신규 프로브와 멀티플렉스 PCR 키트, DNA 칩, PNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 감염성 질환 원인균의 항생제 내성(Antibiotics resistance) 보유 여부를 분석하기 위해 선택된 고 특이도 신규 프로브와 멀티플렉스 PCR 키트, DNA 칩, PNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 감염여부와 NTM(Non-tuberculous Mycobacteria) 유전형 13종을 분석하기 위해 선택된 고 특이도 신규 프로브와 멀티플렉스 PCR 키트, DNA 칩, PNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 부비동염(Rhinosinusitis)의 4대 주요 감염원인을 속(Genus) 단위에서 분석하기 위해 선택된 고 특이도 신규 프로브와 멀티플렉스 PCR 키트, DNA 칩, PNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 치주염(Periodontitis) 6종 감염원인균의 감염 여부를 분석하기 위해 선택된 고 특이도 신규 프로브와 멀티플렉스 PCR 키트, DNA 칩, PNA 칩을 제공하는 것이다.
전통적인 미생물 검출 시험법의 gold standard인 배양(culture) 검사는 검체에 존재하는 세균들을 균 특성에 적합한 특수배지들을 사용하여 배양함으로써 감염균을 선별 한다는 개념이다. 그러나 일부 병원성 미생물들은 배양이 까다로운(culture-resistant) 것으로 보고되었으며 이로 인해 배양검사 민감도가 현저히 낮으며, 평균 1주일의 배양기간이 소요되어 신속한 검사가 어려운 단점이 있었다. 또한 항생제 감수성 검사를 시행할 수 있으나 세균배양을 통해 분석을 하기에 오염에 의한 결과 오류의 가능성도 존재한다(Thiemo Rudolph et al., Acta Ophthalmol. Scandinavica ., 82, 463-467, 2004, Van Dyck E. et. al., J of Clin . Microbiology, 39, 1751-1756, 2001, Anthony J. Schaeffer et al., The J of Urology, 163, 127-130, 2000, John N. Krieger et al., J of Clin . Microbiology, 36, 1646-1652, 1998, M. A. Pfaller et al., Emerging Infectious Diseases, 7, 312-318, 2001).
배양검사가 용이하지 않거나 불가능할 경우, 박테리아나 바이러스의 핵산을 분석하는 검사(NAT, Nucleic acid test)의 중요성이 부각되었다. 핵산검사(NAT)는 체외진단검사(IVD, In vitro diagnostics) 중 가장 빠른 속도로 성장하는 분야로 IVD Technology 자료(2006년 5월호)에 의하면 2008년 시장점유율은 전체 진단시장의 13%에 해당하며 규모는 49억 달러에 달할 것으로 전망한 바 있다. 핵산검사의 대부분은 증폭(Amplification)방법을 이용하여 핵산을 검출한다. Target 증폭법은 Taq 중합효소와 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(Deoxyribonucleotide triphosphate, dNTPs)를 이용한 효소반응으로 목적하는 표적(target) 핵산의 단편(fragment)을 증폭시키는 방법이다. Roche Molecular Systems사의 PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법이외에도 Gen-Probe사의 TMA(Transcription-mediated amplification), BioMerieux사의 NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification), Becton Dickinson사의 SDA(Strand displacement amplification), Innogenetics Diagnostics사의 LiPA(Line-probe assay)등이 이 방법에 속한다(H.Y. Park et al., J of Clin . Microbiology, 38, 4080-4085, 2000, P. Wattiau et al., Appl. Microbiol . Biotechnol ., 56, 816-819, 2001, K. Rantakokko-Jalava et al., J of Clin . Microbiology, 38, 32-39, 2000, Boddinghaus. B. et al., J of Clin . Microbiology, 28, 1751-1759, 1990, W. E. Hill et al., Bacteriological Analytical Manual 8 th ed ., 1998).
근래에는 민감도와 재현성이 높은 다중분석(Multiplex assay) platform에 대한 요구가 증가하고 있다. 가장 최근의 DNA 칩 검사법은 대량(high-throughput)으로 원인균 탐색이 가능하다는 것이 주요한 장점이다. 검체로부터 목적하는 박테리아나 바이러스의 핵산 단편을 증폭한 후, 이와 결합가능한 핵산 프로브들을 칩 기판위에 미리 고정화시켜두고, 특정 온도에서 증폭된 핵산단편과 이에 특이적인 핵산 프로브간 혼성화(hybridization) 반응을 시킨 후, 적절한 세척과정을 거치고, 표지물질의 signal을 측정함으로써 결과를 판독하는 검사방법이다. 1회 검사로 신속하면서 높은 민감도로 감염 원인균을 정량적으로 분석할 수 있다(S. V. Tillib et al., Curr . Opin . in Biotechnology, 12, 53-58, 2001, J. G. Hacia et al., Nature Genetics supplement, 21, 42-47, 1999, D. G. Wang et al., Science, 280, 1077-1082, 1998).
2007년 현재 미국 FDA로부터 승인받은 분자진단 테스트 중, 멀티플렉스 진단 키트는 Digene사의 HC2 HR and LR 제품이 유일하다.(on-line 검색, http://www.fda.gov/cdrh/oivd/index.html). Digene사의 제품은 target 증폭법이 아닌 검체로부터 분리한 HPV DNA에 RNA 프로브를 반응시키는 Hybrid Capture 방식으로 인유두종바이러스 18종을 분석할 수 있다. RNA 프로브의 안정성 문제와 오염 가능성이 상존한다는 단점이 있다. PCR 방식으로는 Roche Molecular Diagnostics사의 AMPLICOR CT/NG Test 제품이 클라미디아 트라코마티스와 나이세리아 고노레아 2종의 세균만을 동시에 판별할 수 있다.
국내에서는 2008년 현재 4개사(마이진, 바이오메드랩, 굿젠, 바이오코아)가 한국 식품의약품안전청으로부터 인유두종바이러스 단일질환에 대한 감염 여부를 판독할 수 있는 HPV DNA 칩 제조허가를 승인받은 바 있다.
그러나 단일 감염성질환의 감염여부 자체에 대한 분석방법 이외에, 1회 검사만으로 관련있는 다수의 질환그룹별 분석을 수행하면서 진단과 처방 모두에 유용한 정보를 제공할 수 있는 신규 high-throughput 검사방법 및 진단 툴(tool)에 대한 기술개발요구가 증가하고 있다.
근래의 미생물 분석 방법은 배양검사, 항원-항체반응에 근거한 효소면역측정 법(EIA, Enzyme immunoassay) 키트 또는 중합효소 연쇄반응(PCR)-염기서열 시퀀싱(Sequencing) 등을 통한 검체 내 해당 원인균을 선별하는 것이 보편적인 방법이다. 배양검사는 배양이 불가능하거나 까다로운 원인균일 경우에 민감도가 낮으며 검사기간(평균 1주일)이 길다는 단점이 있다. 박테리아나 바이러스의 단백질을 분석하는 대부분의 효소면역측정법은 특이도(specificity)는 우수하나 민감도(sensitivity)가 낮다는 문헌보고가 꾸준히 보고된 바 있고, 무엇보다 생화학적 또는 면역학적 반응을 통해 발생한 형광(Fluorescence) 수준을 측정해서 제한된 수의 미생물을 판별하는 정성분석에 그친다는 것이 단점이다. PCR-염기서열 분석방법은 모든 세균들이 가지고 있는 16S rRNA 유전자를 증폭시킨 뒤 이 유전자의 염기서열을 분석하여 감염균을 규명하기에, 세균배양검사와 비교 시, PCR검사의 민감도는 뛰어나며, 특이도는 비슷한 것으로 공통되게 보고되고 있다. 그러나 감염질환의 매우 다양한 원인균 중, 소수 원인균에 대해서만 검사 진행이 가능한 기술적 제약으로 인해 1회에 수십종의 원인균을 목표로 검사하기 어렵다. 또한 해당 감염균의 항생제 내성 보유 유무에 대한 정보를 제공할 수 없어 항생제 오남용의 가능성이 상존한다.
이에 본 발명은, 종래의 감염성 질환 원인균 검사방법의 부족한 정확성, 많은 시간과 경비의 소요, 1회에 검출 가능한 미생물 갯수의 제약등 단점들을 극복할 수 있는 새로운 검사법을 제공하고자 한다. 본 발명을 통해 1회 검사만으로 상관성 높은 다수의 질환그룹별 분석을 수행하면서 진단과 처방 모두에 유용한 정보를 제공할 수 있는 신규 high-throughput 검사방법, 키트(kit) 및 칩(chip)을 제공하고 자 한다. 더 나아가 본 발명은 body fluid나 비침습적(non-invasive)으로 채취가 가능한 검체를 대상으로 재현성이 우수하고 높은 민감도를 갖는 검사법을 제공하고자 한다. 또한 본 발명의 기술적 과제를 실현하기 위해서 DNA 프로브외에 PNA 프로브를 사용하는데, 이는 DNA 프로브가 특정 서열에서 DNA 염기 자체의 불안정성(instability)으로 인해 반응성의 저하, 2차구조 변화가 수반되는 단점을 상쇄하기 위함이다.
청구항 1항 내지 13항에 따른 방법으로 해결하고자 한다.
본 발명의 고 특이도 신규 프로브와 멀티플렉스 PCR 키트, DNA 칩, PNA 칩을 이용하여 감염성질환의 대표적 원인균들을 검출하고 이들의 유전자형을 판별하며 나아가 이들의 항생제 내성 유무까지 분석할 수 있다. 더욱 상세하게는, 1회 반응만으로 68종의 박테리아와 바이러스를 고속처리(High-throughput) 방식으로 다양한 감염성 질환의 감염 유무뿐 아니라 임상적으로 중요한 유전형 분석 및 항생제 처방에 있어 주요기준이 되는 내성 보유 유무까지 총체적인 분석을 제공할 수 있을 것이다. 또한 감염성 질환의 조기 진단과 더불어 감염균주에 적합한 항생제만을 처방하기에 항생제 오남용을 줄일 수 있고, 치료기간을 단축하고 비용을 절감함으로써 질병 회복율과 완치율을 향상시킬 수 있을 것이다. 또한 비침습적(Non-invasive) 방법으로 채취가 가능한 검체를 이용함으로써 검사의 용이함을 추구하고 더불어 민 감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 향상시킬 수 있다.
<실시예 1> 진단용 칩(chip) 분석을 위한 멀티플렉스 PCR 반응에 포함되는 프라이머(primer) 디자인 및 합성
대표적인 감염성 질환의 68종 원인균(박테리아 외에 바이러스를 포함)을 질환군별로 검출하는 진단용 칩(chip) 분석을 위해 선행되는 멀티플렉스 PCR 반응에 포함되는 프라이머(primer)는 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 염기서열 데이터베이스인 GenBank, 일본의 DDBJ(The DNA Data Bank of Japan, 그리고 유럽연합의 EMBL(the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) 염기서열 데이터베이스로부터 검색된 68종 원인균의 염기서열을 분석하여 제작하였다. 프라이머 디자인에 사용된 68종 원인균의 타겟(target) 유전자는 5.8S, 16S, 18S, 23S, 28S rRNA(ribosomal RNA), 16S rRNA-ITS(Internal transcribed spacer)-23S rRNA 등 구조 유전자를 또는 종-특이적 증폭이 가능한 개별 유전자를 프라이머 디자인의 대상 부위(region)로 이용하였다. 해당 질환군별로 대상 부위 염기서열을 Clustal method를 이용하여 다중정렬(multiple alignment)을 실시하고 이에 따라 각 원인균별 특이적인(specific) 프라이머 타겟 부위를 선별하였다. 이후, 선별된 프라이머 타겟 부위로부터 프라이머 프리미어(Primer premier version 5, Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA), 디엔에이시스 맥스 (DNASIS MAX Version 2.7, MiraiBio Group, South San Francisco, CA, USA) 프로그램을 응용하여 종-특이적(strain-specific) 프라이머를 디자인하였다. 프라 이머 선발 조건은 다음과 같다 ; 프라이머 길이(18 - 25 base pair), 융해온도[Tm(℃), 58 - 63℃], 3' 말단의 GC 함량이 높지 않아야하며, 프라이머 서열내 염기 4개 이상 연속해서 상보적이지 않도록 해서 이차구조 형성을 방지하였으며, 3'말단에 동일한 염기가 3개 이상 연속해서 위치하지 않도록 해서 프라이머 이합체(dimer)의 형성을 방지하였다. 또한 프라이머 염기서열이 본 발명이 목적하는 칩을 구성하는 타 원인균과 cross-reactive한 특성을 나타내지 않음을 미국 NCBI 염기서열 데이터베이스 등 다양한 염기서열 검색 툴(tool)을 활용하여 검증하였다. 대표적인 감염성 질환의 68종 원인균(박테리아 외에 바이러스를 포함)을 질환군별로 검출하는 진단용 칩(chip)에 이용되는 프라이머(primer)의 세부정보는 표 1에 기술하였다. 본 발명에 사용하는 프라이머(primer) 미국 IDT(Integrated DNA Technologies, Inc., San Jose, CA, USA)를 통해 합성하였고, 멀티플렉스 PCR 반응의 결과로 얻어지는 증폭산물에 형광색소(fluorescent dye)를 표지하기 위해 사용된다. 이를 위해 DNA 염기서열의 5'말단 또는 3'말단에 형광색소가 표지된 프라이머를 사용하거나 또는 형광색소가 표지되지 않은 일반적인 프라이머를 사용하고 멀티플렉스 PCR 반응 중에 형광색소가 표지된 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트가 증폭산물에 삽입되게끔 유도하여 증폭산물을 표지하는 두가지 방법을 모두 확인하였다. 본 발명에 사용하는 형광색소는 6-FAM(6-carboxyfluorescein), Cy5, Cy3, Cy5.5, JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxyfluorescein), Rhodamine Green, TAMRA NHS(N-hydroxysuccinimide) Ester, Texas Red 이다. 프라이머의 농도는 ND-1000 분광광도계(NanoDrop Technologies, Rockland, Maine, USA) 를 통해 확인하였고 몰디-토프(MALDI-TOF, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight)를 통해 불순물 함유 여부를 확인하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, High-performance liquid chromatography)를 통해 순수 정제하였다.
감염성질환 68종 원인균에 대한 질환군별 멀티플렉스-PCR을 수행하기위한 프라이머(primer) 조합
서열목록번호 반응 대상 균주명 프라이머 방향, 염기서열(5'-3') 길이
1 Fungus sp. general 정방향, GCATCGATGAAGAACGCAGC 20
2 역방향, TCCTCCGCTTATTGATATGC 20
3 Rhizopus sp. general 정방향, ATTACCATGAGCAAATCAGA 20
4 역방향, CAATCCAAGAATTTCACCTCTAG 23
5 Aspergillus sp. general 정방향, CGGCCCTTAAATAGCCCG 18
6 역방향, GACCGGGTTTGACCAACTTT 20
7 Candida sp. general 정방향, GCATCGATGAAGAACGCAGC 20
8 역방향, TCCTCCGCTTATTGATATGC 20
9 Mycobacterium tuberculosis 정방향, TTTCGCTGTTGTGGTTCTCA 20
10 역방향, GGGCACTGGACCTGTATGAG 20
11 Mycobacterium sp. general 정방향, DCCKCYTTTCTAAGGWGCACC 21
12 역방향, GATGCTCGCAACCACTATCCA 21
13 Human Papilloma Virus 정방향, TTTBTHACHGTDGTDGAYACHAC 23
14 역방향, GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 25
15 Proteus mirabilis 정방향, GCGGTTTATCACGAAGGG 18
16 역방향, GCTTGGCGAGATTGAGTGC 19
17 Enterobacter sp. 정방향, CCTGGACGAAGACTGACGC 19
18 역방향, CGGACTACGACGCACTTTATG 21
19 Escherichia Coli sp. 정방향, AGCGTCGCAGAACATTACAT 20
20 역방향, GGGCAACAAGCCGAAAGA 18
21 Enterococcus faecalis 정방향, AGTTTCTGCTGCTGATGGT 19
22 역방향, TAACAACGCCTGAACCTAC 19
23 Staphylococcus sp. general 정방향, AGTATCTGCTGCTGACGGTCC 21
24 역방향, GTAGCAACAGTACCACGACCA 21
25 Staphylococcus aureus 정방향, AATGGACGGCGGTATCTT 18
26 역방향, TCAACACGGCCTGTAGCA 18
27 Streptococcus agalactiae 정방향, TGCGGTAACGAACGAAAT 18
28 역방향, TTCACAAGGCGCTCACTCA 19
29 Streptococcus pneumoniae 정방향, TCGTTTCATCAAAGAGGGTAA 21
30 역방향, CCGCAAGAAGAGTGGGATT 19
31 Corynebacterium sp. 정방향, CCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAAT 25
32 역방향, ACCGACCACAAGGGAAAGACT 21
33 Pseudomonas aeruginosa 정방향, TGAAGGGTGACAACGAGGAG 20
34 역방향, GCCCGCACTGAGGAATAAA 19
35 Veillonella sp. 정방향, TGAAAGGTGGCCTCTATTTAT 21
36 역방향, CAATCCTTCTAACTGTTCGCAAG 23
37 Leptotrichia sp. 정방향, CAATTCTGTGTGTGTGAAGAAG 22
38 역방향, ACAGTTTTGTAGGCAAGCCTAT 22
39 Lactobacillus sp. 정방향, TCTGCCTTGAAGATCGGAGTGC 22
40 역방향, ACAGTTGATAGGCATCATCTG 21
41 Enterobacteriaceae sp. 정방향, TTTCCGTGTCGCCCTTAT 18
42 역방향, CGACCGAGTTGCTCTTGC 18
43 Enterobacteriaceae sp. 정방향, CCGCTGGGAAACGGAACT 18
44 역방향, CCCGCAGATAAATCACCACAAT 22
45 Enterobacteriaceae sp. 정방향, TGCCGCACCTCAACAAATC 19
46 역방향, CAATAGCGTCGCCACCAA 18
47 Bacteria general 정방향, TCATAGACACGCCAGGACATA 21
48 역방향, CAGATTCGGTAAAGTTCGTCA 21
49 Bacteria general 정방향, TGCTGTCCAGGCAGGTAGAT 20
50 역방향, GGCATAAATCGCCGTGAAG 19
51 Bacteria general 정방향, GAAAAGGTACTCAACCAA 18
52 역방향, ATAAGTAACGGTACTTAAATTG 22
53 Herpes Simplex Virus general 정방향, CCGAGTACGGCGGCTCCTTC 20
54 역방향, TGCAGCTCGCACCACGCG 18
55 Herpes Simplex Virus, type 2 정방향, CGACAAGATTAACGCCAAGGG 21
56 역방향, CGTCGCCAGCACAAACTCA 19
57 Haemophilus ducreyi 정방향, AGCGTGGGTGCCAGTAAAT 19
58 역방향, GAAAGGTAGGCGTGAGAGAATC 22
59 Treponema pallidum 정방향, GGTATGAAGTTTGTCCCAGTTGC 23
60 역방향, GCGTCATCACCGTAGTAGTCGT 22
61 Mycoplasma hominis 정방향, AATGGCTAATGCCGGATACGC 21
62 역방향, AGGTACCGTCAGTCTGCAATCAT 23
63 Gardnerella vaginalis 정방향, GGGCGTATTGGTTGGATGC 19
64 역방향, CCCCGAATACGCAACACCT 19
65 Candida albicans 정방향, CGACCAATAGAGGCGTTACAA 21
66 역방향, ACGGATTTAGGTGGCAAGG 19
67 Trichomonas vaginalis 정방향, CTCAGTTCGCAAAGGCAGTC 20
68 역방향, ATGCGATTGGCTGCTTGA 18
69 Ureaplasma urealyticum 정방향, CAGCATTAAAAATACTGGTGACCG 24
70 역방향, ATTCCCTAACTTGTCGTCTAACTTC 25
71 Mycoplasma genitalium 정방향, AGTTGATGAAACCTTAACCCCTT 23
72 역방향, TGAGGGGTTTTCCATTTTTGC 21
73 Chlamydiae trachomatis 정방향, TGGAGTGCTGGCTCGTATAAA 21
74 역방향, GACCGCTGTCTCGCAAATC 19
75 Neisseria gonorrhoeae 정방향, CGGTTTCCGTGCGTTACG 18
76 역방향, ACTGGTTTCATCTGATTACTTTCCA 25
77 Actinobacillus actinomycetemcomitans 정방향, GGGGCTTTCTACTACGGGAC 20
78 역방향, AGCATCTGCGATCCCTGTAT 20
79 Porphyromonas gingivalis 정방향, GAATAACGGGCGATACGAG 19
80 정방향, GCTGACTTACCGAACAACCT 20
81 Treponema denticola 역방향, AGAATAAGAAGAAGAGGGAATGCT 24
82 정방향, GCTTACCTAACCGCCTACATACC 23
83 Tannerella forsythensis 역방향, CGGGCTGCAATGGAACTA 18
84 정방향, GCTTCTCAGGTCCCAGCAA 19
85 Prevotella intermedia 역방향, CCAACCTTCCCTCCACTCG 19
86 정방향, CGTCAATCCTGCACGCTACTT 21
87 Fusobacterium nucleatum 정방향, CATTTATTGTGATGGAGGGACG 22
88 역방향, CCTCTTCACTGCGACCCTC 19
89 Bacteria general 정방향, TCCTACGGGAGGCAGCAGT 19
90 역방향, GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT 26
<실시예 2> 검체 채취 및 이로부터 DNA 분리
본 발명이 실현하고자 하는 비침습적(Non-invasive) 진단을 위해서, 종래의 조직(tissue), 스왑(swab), 뇨(urine) 검체시료이외에도 거의 모든 종류의 체액(body fluid)으로부터 동일한 민감도와 특이도를 나타내는 검사방법이 요구되며, 이를 위해서는 검체로부터 효율적인 DNA 분리가 주요 선행조건 중의 하나였다. 본 발명에 사용되는 검체종류는 VB1(first-voided urine), VB3(third-voided urine), 전립선 분비액(EPS, expressed prostatic secretion), 정액(semen), 요도 스왑(urethral swab), 궤양 스왑(ulcer swab), 요도 분비물(urethral discharge), 자궁경부 스왑(vaginal swab), 혈액(blood), 조직(tissue), 객담(sputum), 구강 스왑(buccal swab), 비강 스왑(nasal swab)이다. 채취된 검체는 가급적 24시간 이내에 신선한 상태에서 분석하였으며, 스왑 검체는 3 - 5mL의 1X PBS(Phosphate-buffered solution)용액이 충진된 용기를 사용하여 시료를 채취하였다. 1X PBS 용액은 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4를 3차 멸균 증류수 1L에 최종 pH 7.4가 되도록 조성하였다. 뇨(urine) 검체는 운송과정 중의 0.5 - 2%(w/v)의 소디움 아자이드(Sodium azide), 1 - 3%(v/v)의 톨루엔(toluene) 또는 1 - 2%(w/v)의 붕산(boric acid)을 포함하는 검사용기를 통해 채취하였고 분석실로 실온조건에서 운송하였다.
상기 검체로부터 게노믹 DNA(genomic DNA)를 분리하기 위해 상용화된 DNA 추출 키트(LaboPass™ Tissue kit, 코스모진텍, 서울, 한국)를 사용하였다. 뇨 검체의 경우, 채취용기로부터 1.5 mL의 뇨 시료를 채취하여 덴빌 260D 고속 원심분리기(High-speed centrifuge, Denville Scientific Inc., Metuchen, NJ, USA)를 이용해서 12,000 rpm(revolutions per minute, 분당회전수), 1분 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 침전물(Pellet)을 500 uL의 PBS 용액에 풀어준 뒤 다시 동일 조건에서 원심분리하여 세척과정을 거쳤다. 기타 볼륨(volume)이 적은 검체는 시료를 1.5 mL 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)로로 옮긴 뒤 고속원심분리기에서 12,000 rpm, 2분 원심분리하였고 500 uL의 PBS 용액으로 침전물을 풀어준 뒤 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 침전물에 시료를 분해하는 TL 완충용액(buffer) 200 uL를 첨가하여 풀어주고 단백분해효소 K(Proteinase K, 100 mg/mL) 20 uL를 첨가하고 약하게 교반(vortex)한 후 56℃, 10분간 반응시켰다. 이후 반응물에 TB 완충용액 400 uL를 첨가하고 교반하여 반응물을 혼합하였다. 이어서 반응물을 스핀 칼럼(spin column)의 상층부에 로딩(loading)하고 8,000 rpm, 1분 원심분리하였다. 컬렉션 튜브(collection tube)를 새로 교체하고 검체로 부터 추출된 DNA를 칼럼의 멤브레인(membrane)에 결합시키는 작용을 하는 BW 완충용액 700 uL를 첨가하고 상기 동일 조건으로 원심분리하였다. 컬렉션 튜브(collection tube)를 새로 교체하고 멤브레인으로부터 불순물을 제거하는 NW 완충용액 500 uL를 첨가하고 13,000 rpm, 2분 원심분리하였다. 이후 스핀 칼럼 상층부를 새로운 에펜도르프 튜브로 옮긴뒤 DNA를 용출시키기 위해 탈이온(de-ionized) 멸균 3차 증류수 100 uL를 로딩하고 실온에서 5분 처리하고 8,000 rpm, 2분 원심분리하여 순수한 DNA를 분리하였다.
<실시예 3> 멀티플렉스 PCR을 통한 진단용 칩(chip)의 타겟(target) DNA 제조
본 발명은 질환군별로 멀티플렉스 PCR를 수행하고 항생제 내성 판별을 위한 멀티플렉스 PCR을 수행하여 그 반응산물을 칩위에 미리 고정화시켜둔 선택적 프로브와 혼성화 반응을 실시함으로써 총 68종 감염 원인균(바이러스를 포함)의 감염 여부뿐 아니라 감염균 유전자형(genotype) 및 항생제 내성 보유 유무를 판별할 수 있는 분석방법을 제공한다. 본 실시예에서는 상기 분석방법에 포함되는 치주염(periodontitis) 원인균 판별을 위한 멀티플렉스 PCR 수행 과정을 대표 예로써 설명하고자 한다. 다양한 검체종류로부터 분리된 DNA를 주형(template)으로 삼고, 치주염 원인균 6종 및 내부대조군 2종을 선택적으로 증폭할 수 있는 프라이머 프리믹스(pre-mix)를 동일한 PCR 튜브(single tube)에서 1회 반응만으로 증폭하는 치주염 8종 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 상기 반응에 포함되는 내부 대조군(internal control)은 인간베타클로빈 유전자 및 박테리아 16S 리보소말 리보핵산(ribosomal RNA)를 증폭하는 프라이머 세트(정방향 및 역방향 프라이머)이다. 멀티플렉스 PCR의 반응 조성 및 반응조건을 표 2에 나타내었다.
치주염 멀티플렉스-PCR 반응 조성 및 반응조건
PCR 반응액 조성 부피(uL) PCR 반응 조건
탈이온 3차 멸균 증류수 7 초기변성 (Initial denaturation) 95℃, 15분 1회
치주염 8종 프라이머 프리믹스 3 변성 (Denaturation) 95℃, 50초 37회
2X PCR 프리믹스 15 결합 (Annealing) 58℃, 60초
주형 DNA(40 ng 이상) 5 연장 (Extension) 72℃, 60초
최종 부피 30 최종연장 (Extension) 72℃, 10분 1회
멀티플렉스 PCR 반응액 혼합물에 포함되는 PCR 완충용액의 최종농도는 50 mM KCl, 3.5 mM MgCl2, 10mM Tris-HCl, pH 8.2이며, 2.5 unit의 Taq 중합효소, 300 uM dNTPs(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), 10 mg/mL 소혈청알부민(Bovine serum albumin)을 포함한다. 치주염 8종 프라이머 프리믹스에 포함되는 치주염 종-특이 프라이머들의 정방향(sense) 프라이머들은 이들의 5'말단에 Cy3 형광색소를 표지시켜 합성하였고(Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA), 8종 정방향/역방향 프라이머들의 조성비율(단위는 pmole/uL each)은 다음과 같다. A. 액티노미세템코미탄스 5 pmole each, P. 진지발리스 5 pmole each, T. 덴티콜라 16 pmole each, T. 포시덴시스 8 pmole each, P. 인터미디아 5 pmole each, F. 뉴클리아텀 7 pmole each, 박테리아 16S rRNA 11 pmole each, 인간베타글로빈 7 pmole each 로 조제하였다.
또한 본 발명이 구성하는 멀티플렉스 PCR 키트는 PCR 과정중에 Cy3 형광색소가 표지된 디옥시사이토신 트리포스페이트(Cy3-dCTP)가 증폭산물을 구성하는 뉴클레오티드로 첨가되도록 하여 반응의 민감도와 특이도를 향상시킬 수 있었다. Cy3-dCTP를 사용하는 치주염 8종 멀티플렉스 PCR 반응에는 형광색소가 표지되지 않은 프라이머 프리믹스를 사용하고 PCR 완충용액을 구성하는 반응물들의 최종농도는 50 mM KCl, 3.5 mM MgCl2, 10mM Tris-HCl, pH 8.2이며, 2.5 unit의 Taq 중합효소, 300 uM dATP, 300 uM dGTP, 300 uM dTTP, 25 uM dCTP, 275 uM Cy3-dCTP(FluoroLink Cy3-dCTP, Amersham Pharmacia Biotech AB, Piscataway, NJ, USA), 10 mg/mL 소혈청알부민(Bovine serum albumin)을 포함한다.
<실시예 4> 진단용 칩(chip)을 구성하는 프로브(probe) 디자인 및 합성
대표적인 감염성 질환의 68종 원인균(박테리아 외에 바이러스를 포함)을 질환군별로 검출하는 진단용 칩(chip)에 이용되는 고 특이도의 프로브(probe)는 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 염기서열 데이터베이스인 GenBank, 일본의 DDBJ(The DNA Data Bank of Japan, 그리고 유럽연합의 EMBL(the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) 염기서열 데이터베이스로부터 검색된 68종 원인균의 염기서열을 분석하여 제작하였다. 프로브 디자인에 사용된 68종 원인균의 타겟(target) 유전자는 5.8S, 16S, 18S, 23S, 28S rRNA(ribosomal RNA), 16S rRNA-ITS(Internal transcribed spacer)-23S rRNA 등 구조 유전자를 또는 플라스미드(plasmid), pseudogene, repeated elements 등 개별 유전자를 프로브 디자인의 대상 부위(region)로 이용하였다. 해당 질환군별로 대상 부위 염기서열을 Clustal method를 이용하여 다중정렬(multiple alignment)을 실시하고 이에 따라 각 원인균별 특이적인(specific) 프로브 타겟 부위를 선별하였다. 이후, 선별된 프로브 타겟 부위로부터 프라이머 프리미어(Primer premier version 5, Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA), 디엔에이시스 맥스 (DNASIS MAX Version 2.7, MiraiBio Group, South San Francisco, CA, USA), 또는 올리고어레이(OligoArray 2.0, http://cbr-rbc.nrc-cnrc.gc.ca) 프로그램을 응용하여 종-특이적(strain-specific) 고 특이도의 프로브를 디자인하였다. 프로브 디자인의 선택 조건은 다음과 같다 ; 프로브 길이(20-30 base pair), 융해온도[Tm(℃), 60-70℃], GC 함량(40-65%), 그리고 이차구조 형성 여부, 자가 혼성화 또는 교차 혼성화 형성 여부를 검토하였다. 또한 디자인된 프로브가 칩을 구성하는 타 원인균과 cross-reactive한 특성을 나타내지 않음을 미국 NCBI 염기서열 데이터베이스 등 다양한 염기서열 검색 툴(tool)을 활용하여 검증하였다. 대표적인 감염성 질환의 68종 원인균(박테리아 외에 바이러스를 포함)을 질환군별로 검출하는 진단용 칩(chip)에 이용되는 프로브(probe)의 세부정보는 표 3에 기술하였다. 목적하는 DNA 또는 PNA 프로브 염기서열의 5'말단 또는 3'말단에 아미노 모디파이어(Amino modifiers)를 표지하여 종-특이적 프로브를 합성하였다(MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany). 프로브의 5'말단에 아미노 모디파이어를 수식할 경우 탄소 6개에서 12개의 스페이서를 첨가하여 반응 효율을 촉진하였다. 프로브의 3'말단에 아미노 모디파이어를 수식할 경우에는 스페이서를 사용하지 않았다. 프로브의 아민기는 1차 아민기의 성질을 지니며, 알데히드-활성화된 또는 카르복실(carboxyl)-활성화된 칩(chip) 표면에 부착하였다. 프로브의 농도는 260nm에서 흡광도 수치를 통해 환산하였고 몰디-토프(MALDI-TOF, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight)를 통해 불순물 함유 여부를 확인하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, High-performance liquid chromatography)를 통해 순수 정제한 후 멸균 3차 증류수에 최종농도가 100-300 pM 되도록 제조하였다.
감염성질환 68종 원인균의 질환군별 또는 전체(whole) 검사에 사용하는 프로브(probe) 조합
서열 목록 번호 반응 대상 균주명 프로브 방향, 염기서열(5'-3') 길이
91 Fungus sp. general 역방향, GCATCGATGAAGAACGCAGC 20
92 Fungus sp. general 정방향, TTGACCTCRRATCAGGTAGGRATACCCGCTGAACTTAA 38
93 Rhizopus sp. general 역방향, CTAGCGGCCAAATACAAATGC 21
94 Rhizopus sp. general 역방향, TTCACCTCTAGCGGCCAAAT 20
95 Aspergillus sp. general 역방향, GGCTTGAGCCGATAGTCCCC 20
96 Aspergillus sp. general 정방향, TCAAGCCGATGGAAGTGCG 19
97 Candida sp. general 역방향, GAAGGCAACACCAAACCCG 19
98 Candida sp. general 역방향, TCCTACCTGATTTGAGGGCGA 21
99 Mycobacterium avium 정방향, GACCGAGTGTTGTCTCAGGGC 21
100 Mycobacterium chelonae 정방향, ATTTCCCAGCCGAATGAGC 19
101 Mycobacterium flavescens 정방향, GGTCTGGTGTCGCCCTGTCTT 21
102 Mycobacterium gordonae 정방향, CTCGGGTGCTGTCCCTCCA 19
103 Mycobacterium kansasii 정방향, GAGGCAACACTCGGGCTCTG 20
104 Mycobacterium simiae 정방향, TTCGGTTGAAGTGGTGTCCCTC 22
105 Mycobacterium szulgai 정방향, CGGCAACGAACAAGCCAGACA 21
106 Mycobacterium vaccae 정방향, CGGCGAGGGAAATCATCAGACA 22
107 Mycobacterium fortuitum 정방향, GTCTTACCCGAGCCGTGAGGA 21
108 Mycobacterium intracellulare 정방향, CCCTGAGACAACACTCGGTCG 21
109 Mycobacterium tuberculosis 정방향, TTGGGTCCTGAGGCAACACTCG 22
110 Mycobacterium abscessus 정방향, TTGGGTCCTGAGGCAACACG 20
111 Mycobacterium bovis 정방향, TTGGGTCCTGAGGCAACACTCG 22
112 Human Papilloma Virus type 16 정방향, ACCTCCAGCACCTAAAGAAGAT 22
113 Human Papilloma Virus type 18 역방향, GGACCCGTGTATACAGGCACAT 23
114 Human Papilloma Virus type 31 역방향, ATGGATCTTCCTTGGGCTTTT 21
115 Human Papilloma Virus type 33 정방향, CAGGCTATTACGTGTCAAAAAAC 23
116 Human Papilloma Virus type 35 역방향, CCAGAAGGCGGTGGTGTAAG 20
117 Human Papilloma Virus type 39 역방향, CAAACTGGCAGATGGTGGAG 20
118 Human Papilloma Virus type 52 정방향, CCCCACCACCGTCTGCATC 19
119 Human Papilloma Virus type 56 정방향, GGGTTATCCCCGCCAGTG 18
120 Human Papilloma Virus type 58 역방향, GTCCTGTAAACTGGCAGACGG 21
121 Human Papilloma Virus type 6 정방향, CCCCAAATGGTACATTAGAAGATA 24
122 Human Papilloma Virus type 11 역방향, CCATTTGGTGGAGGCGATA 19
123 Human Papilloma Virus type 30 정방향, AACTCCACTTTACTTGAGGGCTG 23
124 Human Papilloma Virus type 54 역방향, TGCAGGGGCATTATTCTTTTG 21
125 Human Papilloma Virus type 62 정방향, TCACTATTTGCAGTCTCGGGCTA 23
126 Proteus mirabilis 정방향, CGCACTCAATCTCGCCAAG 19
127 Proteus mirabilis 역방향, ATGGCATTTAGAGGATGTAGCA 22
128 Proteus mirabilis 정방향, GCGGTTTATCACGAAGGGGT 20
129 Enterobacter sp. general 역방향, GACATCGTTTACGGCGTGGACT 22
130 Enterobacter sp. general 역방향, CCTCAAGGGCACAACCTCCAAG 22
131 Enterobacter sp. general 역방향, TCAGGTGCGAAAGCGTGGG 19
132 Escherichia Coli sp. general 역방향, CGTCCGATCACCTGCGTCAA 20
133 Escherichia Coli sp. general 역방향, GCGAAGAGGCAGTCAACGGG 20
134 Escherichia Coli sp. general 역방향, GGGCAACAAGCCGAAAGAACTG 22
135 Enterococcus faecalis 역방향, GGAACATCATCGCCTGGGAA 20
136 Enterococcus faecalis 역방향, GATAACTGGAACATCATCGCC 21
137 Enterococcus faecalis 역방향, ATGATGTTCCAGTTATCGCAGG 22
138 Staphylococcus sp. general 역방향, CGTATTGAGCATCGCCTTCTA 21
139 Staphylococcus sp. general 역방향, CGTATTGAGCATCGCCTTC 19
140 Staphylococcus sp. general 역방향, TTAGAAGGCGATGCTCAATAC 21
141 Staphylococcus aureus 역방향, TCGTATTGAGCATCGCCTT 19
142 Staphylococcus aureus 역방향, CTTCGTATTGAGCATCGCC 19
143 Staphylococcus aureus 정방향, AAGGCGATGCTCAATACGA 19
144 Streptococcus agalactiae 정방향, GAGTATCAAGCAGCCCACG 19
145 Streptococcus agalactiae 정방향, ATCAAGCAGCCCACGATTC 19
146 Streptococcus agalactiae 역방향, AAGGAATACATGCTGTTGCG 20
147 Streptococcus pneumoniae 정방향, GCTACCCGATGAGTTTGTTGTT 22
148 Streptococcus pneumoniae 정방향, AGCTACCCGATGAGTTTGTTGTT 23
149 Streptococcus pneumoniae 역방향, CGATAACAACAAACTCATCGGGT 23
150 Corynebacterium sp. general 정방향, GCACAAGCGGCGGAGCAT 18
151 Corynebacterium sp. general 역방향, ATGCTCCGCCGCTTGTGC 18
152 Corynebacterium sp. general 정방향, TGCAACGCGAAGAACCTTACCT 22
153 Pseudomonas aeruginosa 역방향, CCGTACACGCCGGTAGCA 18
154 Pseudomonas aeruginosa 역방향, GCCGGGTCCAGGATGCCC 18
155 Veillonella sp. general 역방향, CCACATTGGGACTGAGACACGG 22
156 Veillonella sp. general 정방향, TCCTACGGGAGGCAGCAGTG 20
157 Veillonella sp. general 정방향, CTACGGGAGGCAGCAGTGGG 20
158 Leptotrichia sp. general 역방향, CGGATAACGCTCGCAACATA 20
159 Leptotrichia sp. general 정방향, TATGTTGCGAGCGTTATCCG 20
160 Leptotrichia sp. general 정방향, AGGCGGTAAGACAAGTTGAAGG 22
161 Lactobacillus sp. general 역방향, CGTGTTACTCACCCGTCCGC 20
162 Lactobacillus sp. general 정방향, CGGCGGACGGGTGAGTAA 18
163 Lactobacillus sp. general 정방향, AGCGGCGGACGGGTGAGT 18
164 Enterobacteriaceae sp. 역방향, GAATAAGGGCGACACGGAAA 20
165 Enterobacteriaceae sp. 정방향, TTTCCGTGTCGCCCTTATTC 20
166 Enterobacteriaceae sp. 역방향, CAGCACGGAGCGGATCAACG 20
167 Enterobacteriaceae sp. 정방향, CGCCCTGCTTGGCCCGAATA 20
168 Enterobacteriaceae sp. 역방향, CGTTGATTTGTTGAGGTGCGG 21
169 Enterobacteriaceae sp. 역방향, TACCGCCACCGCCATACC 18
170 Bacteria general 역방향, CGAGTTTGTGCTTGTACGCCAT 22
171 Bacteria general 정방향, AAAGATGGCGTACAAGCACAAAC 23
172 Bacteria general 정방향, TGATCTTCACGGCGATTTATGC 22
173 Bacteria general 정방향, CATTGGACCGCTGATCTTCACG 22
174 Bacteria general 역방향, TTGGCGTGTTTCATTGCTTG 20
175 Bacteria general 역방향, ATCAAGCAATGAAACACGCCAA 22
176 Herpes Simplex Virus general 정방향, CACATCAAGGTGGGCCAGCCGC 22
177 Herpes Simplex Virus general 역방향, TGCGGCTGGCCCACCTTGATG 21
178 Herpes Simplex Virus general 역방향, CCAGGTAGTACTGCGGCTGGCC 22
179 Herpes Simplex Virus type 2 역방향, CCGTGGAGCGGCAGACCCC 19
180 Herpes Simplex Virus type 2 역방향, GCCGTGGAGCGGCAGACC 18
181 Herpes Simplex Virus type 2 역방향, TGGCCGTGGAGCGGCAGACC 20
182 Haemophilus ducreyi 정방향, GCGCCGTATCGGTTGGGT 18
183 Haemophilus ducreyi 역방향, AAGGTAGGCGTGAGAGAATCAAAAA 25
184 Haemophilus ducreyi 역방향, CGTAGGCATCAAGAAGGTAAAGCG 24
185 Treponema pallidum 역방향, AGGAACCGCAACTGGGACAAA 21
186 Treponema pallidum 역방향, GAGGAACCGCAACTGGGACA 20
187 Treponema pallidum 정방향, TGAAGTTTGTCCCAGTTGCGGT 22
188 Mycoplasma hominis 역방향, ACTAATGTTCCGCACCCTCATCT 23
189 Mycoplasma hominis 정방향, AGATGAGGGTGCGGAACATTAGT 23
190 Gardnerella vaginalis 정방향, GCTGCCGAGTGGGCTTTG 18
191 Gardnerella vaginalis 정방향, GTCAGGTGTTGCGTATTCGGG 21
192 Candida albicans 역방향, GCATCTCCAATCATTCGCCTA 21
193 Candida albicans 정방향, AGATGCCTTGCCACCTAAATCC 22
194 Trichomonas vaginalis 역방향, GGACTGCCTTTGCGAACTGA 20
195 Trichomonas vaginalis 역방향, GGCTGCTTGACCATCCGAAA 20
196 Ureaplasma urealyticum 정방향, GGGGATGAACTCTACTATGAAGTTA 25
197 Ureaplasma urealyticum 역방향, GTTAACTAAGCCGTTTACACCTCAA 25
198 Mycoplasma genitalium 역방향, ATATTTAAGTTGTCATTTTGGCTTC 25
199 Mycoplasma genitalium 정방향, AAGAAGCCAAAATGACAACTTAAAT 25
200 Chlamydiae trachomatis 역방향, GAGATAGGAAACCAACTCTACGCTG 25
201 Chlamydiae trachomatis 정방향, CAGCGTAGAGTTGGTTTCCTATCTC 25
202 Neisseria gonorrhoeae 역방향, GCAGGCGTATAGGCGGACTTG 21
203 Neisseria gonorrhoeae 역방향, GGGAATCGTAACGCACGGAAA 21
204 Actinobacillus actinomycetemcomitans 정방향, GGGGCTTTCTACTACGGGACCT 22
205 Actinobacillus actinomycetemcomitans 역방향, CAGCATCTGCGATCCCTGTAT 21
206 Porphyromonas gingivalis 역방향, TACCGAACAACCTACGCACCCT 22
207 Porphyromonas gingivalis 정방향, GCGGTAATACGGAGGATGCG 20
208 Treponema denticola 역방향, GCCTACATACCCTTTACGCCCA 22
209 Treponema denticola 역방향, GGGCTTATTCGCATGACTACCG 22
210 Tannerella forsythensis 역방향, CGGGCGTGGGATTGGTGATG 20
211 Tannerella forsythensis 역방향, TGTATCGGGCGTGGGATTGGT 21
212 Prevotella intermedia 정방향, ATGGCATCTGACGTGGACCAAA 22
213 Prevotella intermedia 역방향, CGTAGCCTTGGTGGGCCGTTA 21
214 Fusobacterium nucleatum 역방향, TTCTGCGTCCCTCCATCACA 20
215 Fusobacterium nucleatum 역방향, ACTTCCGTTCGTCCGTGC 18
216 Bacteria general 역방향, CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC 23
<실시예 5> 진단용 칩(chip) 제작
본 발명을 구성하는 68종의 감염성 질환 원인균 프로브를 6대 질환군과 항생제 내성군을 포함한 7개 그룹으로 그리드(grid)를 작성하였다(도1 참조). 하나의 칩 기판위에 8개의 그리드를 작성하고 8 웰 혼성화 반응 챔버(8 well hybridization reaction chamber)를 통해 서로 다른 8개의 검체에 대한 분석을 진행할 수 있도록 고안하였다. 영하 70℃ 보관중인 프로브 스탁(stock)을 실온에서 해동한 후, 탈이온 멸균 3차 증류수에 최종농도 10 nM이 되도록 희석하여 워킹 스탁(working stock)으로 사용하였다. 워킹 스탁을 50배 희석한 프로브를 3X SSC 스포팅 용액(500 mM NaCl, 3 mM sodium citrate, 1.5 M N,N,N-trimethylglycine, pH 6.8)과 1 : 5 - 10 비율(v/v)로 혼합하여 최종 96 웰 플레이트(well plate)에 분주되는 프로브의 농도범위가 20 - 40 pmole/uL 가 되도록 하였다. 상기 플레이트를 Microssys 5100 microarrayer(Cartesian Technologies, Ann Arbor, MI, USA)에 장착하고 이로부터 알데하이드-, 티오이소시아네이트-, 아민-활성화된 글라스 슬라이드(CEL associates Inc., Houston, TX, USA) 혹은 에폭시-활성화된 플라스틱 칩 표면에 프로브들을 순서에 따라 2개씩 스포팅하였다. 스팟(spot)의 평균 크기(diameter)는 80 - 150 마이크로미터(micrometer)이며 스팟간 크로스-토크(cross-talk)효과를 최소화하기 위해 스팟간의 거리는 400 - 500 마이크로미터를 유지하였다. 칩 제작은 74% 습도( humidity)를 유지하는 클래스 10,000 룸에서 실시하였다. 프로브가 스팟팅된 칩을 120℃, 1시간 베이킹(baking)한 후, 0.25% SDS(Sodium dodecyl sulfate)용액에서 3분간 세척하고 멸균 3차 증류수로 다시 세척하였다. 이후 칩을 0.2% 소디움 보로하이드라이드(NaBH4)를 포함하는 용액에 반응시켜 프로브를 블럭킹(blocking)하였다. 이후 3차 증류수로 2회 세척하고 물기를 제거한 후 사용시점까지 데시케이터(dessicator)에 보관하였다.
<실시예 6> 진단용 칩(chip) 혼성화(hybridization) 반응 및 결과 분석
본 발명을 구성하는 68종의 감염성 질환 원인균에 대한 멀티플렉스 PCR 반응을 수행한 후 각 PCR 반응산물 5 uL씩 총 40 uL에 탈이온 3차 멸균 증류수 40 uL를 첨가하여 95℃, 5분간 열변성시킨 후 얼음위에 5분간 보존하고 원심분리기로 스핀다운(spin down)하였다. 칩(chip) 표면에는 8 웰 혼성화 반응 챔버(8 well hybridization chamber)를 위치시키고 웰 커버(cover)로 웰 상층부를 덮어두었다. 이후 반응시키고자하는 웰(well)에 상기 반응 혼합용액에 혼성화 반응 온도인 50℃로 미리 가열해둔 60 uL의 혼성화 반응 용액(3X SSC, 0.1% SDS, 0.2 mg/mL 소혈청알부민, pH 7)을 첨가하여 혼합한 후 웰 커버의 구멍(hole)을 통해 반응액 혼합물을 주입하고 버블(bubble)이 발생하지 않도록 주의하였다. 챔버 리드(lid)를 고정시킨 후 50℃, 30분간 혼성화 반응을 통해 칩 표면의 프로브와 멀티플렉스 PCR 반응산물간 특이적인 뉴클레오티드 상보적(complementary) 결합을 유도하였다. 혼성화 반응이 종료된 칩 표면의 웰 커버를 제거하고 칩을 세척버퍼 1(0.1X SSC, 0.05% SDS)용액에 담그고 2분간 2,000 rpm에서 교반하면서 세척(washing)하고 이를 반복하였다. 이후 세척용액 2(2X SSC, 0.1% SDS)용액에 2분간 2,000 rpm에서 교반하면서 세척(washing)하고 이를 반복하였다. 이후 탈이온 3차 멸균 증류수에 담가 2회 세척하고 1,000 rpm에서 원심분리하여 칩을 건조하였다. 상기 칩을 스캔어래이 라잇(ScanArray Lite, Packard Instrument Co., Meriden, CT, USA) 스캐너를 이용하여 판독하였고, 분석 소프트웨어(QuantArray 2.0)를 이용하여 양성 대조군 스팟들의 평균 형광강도(fluorescence intensity) 및 표준오차를 스파 주변의 값들과 비교하여 signal-to-noise(S/R) 비율을 구한 뒤 이 값이 5 이상일 경우 양성 값으로 스코어링(scoring) 처리하였다.
<실시예 7> 진단용 칩(chip)과 종래기술과의 비교시험을 통한 성능확인
본 발명은 68종의 감염성 질환 원인균을 질환군별로 대량 고속처리(high-throughput) 분석하는 검사방법을 제공하는데, 본 발명을 구성하는 6대 주요 질환군 중 요로감염 원인균 그룹에 대한 칩 분석결과와 종래의 요로감염 검사법 중 최신 멀티플렉스-PCR 방법을 비교하여 본 발명의 성능을 확인하였다. 임상검체를 통한 비교시험 이전에 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC, 대전, 한국) 또는 미국 ATCC(American Tissue Type Collection, Manassas, VA, USA)로부터 분양받은 표준균주를 이용하여 두 방법간의 검사 민감도와 특이도를 비교하였다. 비교에 사용한 표준균주는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa, KCTC1637), 쉬겔라 플렉스너리(Shigella flexneri, KCTC2008), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium, KCTC2057), 대장균 K12(Escherichia Coli, ATCC29425), 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni, ATCC43431), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis, ATCC10741), 엔테로박터 클로애이시(Enterobacter cloacae, ATCC10699), 스태필로코커스 오리우스(Staphylococcus aureus, ATCC10390), 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae, ATCC14364), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca, ATCC13182), 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae, ATCC10211), 락토바실러스(Lactobacillus sp., ATCC10746), 아시네토박터(Acinetobacter sp., ATCC11171) 총 13종이다. 비교방법은 음성으로 판별된 체액(body fluid) 시료 3 mL에 계대배양한 상기 균주를 최종 1 X 10 - 105 CFU(colony forming unit)/mL2이 되도록 첨가하고 균주별 단일감염, 중복감염 및 다중감염을 모의(simulation)하여 총 130여 검체를 비교하였다. 비교결과는 표 4에 요약되어 있다.
요로감염 원인균 그룹에 대한 칩(chip)과 종래기술(PCR)과의 비교
비교 대상 그룹 또는 조건 진단용 칩(chip) (백분율,%) 멀티플렉스-PCR (백분율,%)
13종 개별 단일감염 모의군 (N=130) 126 (96.9) 122 (93.8)
13종 중복감염 모의군 (N=65) 64 (96.9) 53 (81.5)
13종 다중 단일감염 모의군 (N=45) 42 (93.3) 34 (75.6)
양성 대조군 (N=10) 10 (100) 9 (90)
음성 대조군 (N=10) 10 (100) 10 (100)
검체로부터 DNA 분리방법 동일 동일
검사 소요시간 3.5시간 2.5시간
1회 분석 가능 검체 수 수백개 92개
판독가능한 대상균주 수십개까지 10개미만
진단용 칩(chip) 분석의 경우, 실시예 2와 동일한 방법으로 체액(body fluid) 유래 검체로부터 DNA를 분리한 후 실시예 3에 기술한 방법으로 멀티플렉스 PCR 반응을 수행하였다. 단 요로감염 10종 프라이머 프리믹스 4 uL를 사용하고 PCR 반응조건의 변화는 표 5와 같다. 이후 실시예 5에 기술한 방법으로 칩(chip)을 제작하고 실시예 6과 동일한 방법으로 혼성화 반응, 세척, 칩 스캐닝(scanning)을 진행하였다.
요로감염 멀티플렉스-PCR 반응 조성 및 반응조건
PCR 반응액 조성 부피(uL) PCR 반응 조건
탈이온 3차 멸균 증류수 6 초기변성 (Initial denaturation) 95℃, 15분 1회
요로감염 10종 프라이머 프리믹스 4 변성 (Denaturation) 95℃, 60초 38회
2X PCR 프리믹스 15 결합 (Annealing) 59℃, 60초
주형 DNA(40 ng 이상) 5 연장 (Extension) 72℃, 60초
최종 부피 30 최종연장 (Extension) 72℃, 10분 1회
멀티플렉스-PCR(중합효소 연쇄반응) 분석의 경우, 상기 기술한 요로감염 10종 멀티플렉스-PCR 반응단계까지 실시하고 그 반응산물을 아가로즈 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)를 통해 반응산물의 크기를 확인함으로써 결과를 판독하거나 필요한 경우 당해업자에게 매우 보편적인 DNA 자동염기서열 분석기(ABI3130xL genetic analyzer, Applied Biosystems Inc., Foster city, CA, USA)를 통해 그 염기서열을 확인하였다. 상기 비교시험은 서로 다른 검사자가 동일검체를 개별적으로 2차례 중복 시험하고 그 결과를 판독하는 이중검맹(duplicate blind)방식으로 진행하였고 결과가 일치하지 않을 경우 검사 오류(failure)로 분류하였다.
도 1은 본 발명에 따라 제작된 감염성 질환 68종 원인균 및 항생제 내성 유무 분석용 유전자들이 그룹별로 배열된 칩(chip)을 나타낸 것이고, 형광물질이 표지된 타겟 DNA와 칩 위에 배열된 프로브간 혼성화(hybridization)반응이 이루어지는 8웰 혼성화 반응 챔버를 나타냈으며, 칩위에 스팟팅(spotting)된 프로브들의 질환 그룹별(부비동염, 인유두종바이러스, 성전파성질환, 치주염, 요로감염, 마이코박테리아, 항생제 내성 분석) 그리드(grid) 배열을 나타냈다.
도 2는 본 발명이 포함하는 특이도가 높으며 원인균을 제외한 기타 세균들과 교차반응(cross-talk)이 발생하지 않는 프로브를 설계하는 과정을 나타낸 흐름도이다.
도 3은 본 발명에 따라 다양한 검체로부터 DNA를 분리하여 멀티플렉스-PCR 반응을 통해 타겟 DNA를 증폭한 뒤, 감염성 질환 68종 원인균에 대한 감염여부 및 이들의 항생제 내성 보유 유무를 분석하는 칩(chip) 분석과정의 주요 단계를 나타낸 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에 따라 다양한 검체로부터 DNA를 분리한 후, 아가로스 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 통해 검체종류별 DNA 농도를 상대비교하는 그림이다. 웰(well) 번호 1 - 19는 자궁경부 스왑, 번호 20 - 39는 혈액, 번호 39-49는 VB1 뇨, 번호 50 - 69는 구강 스왑, 번호 70 - 79는 전립선 분비액, 번호 80 - 96는 조직으로부터 분리한 DNA를 확인할 수 있다.
도 5는 본 발명에 따라 구강 스왑 검체로부터 DNA를 분리하고 치주염 8종 멀 티플렉스-PCR 반응을 통해 증폭한 임상검체 3례의 타겟 DNA 분포양상을 확인할 수 있다. 검체 S1은 3개, S2는 2개의 치주염 원인균 감염을 확인할 수 있고 검체 S3은 음성의 결과를 확인할 수 있다.
도 6은 본 발명에 따라 감염성 질환 68종 원인균 및 항생제 내성 유무 분석용 유전자들을 분석한 결과를 나타내는 칩 스캔 이미지와 칩 그리드를 나타낸다. 해당검체는 인유두종 바이러스 type 35, 성전파성질환 그룹에서 허피스 심플렉스 바이러스 type 2, 마이코플라즈마 호미니스, 유레아플라즈마 유레아라이티쿰, 클라미디아 트라코마티스, 나이세리아 고노레아, 요로감염 그룹에서 대장균, 스트렙토코커스 아갈락티애, 슈도모나스 애루지노사등이 감염되었고 이들 균들은 세팔로스포린/페니실린계, 테트라사이클린계, 마크로리드계 항생제에 대한 내성을 보유하고 있음을 확인할 수 있다.
도 7은 본 발명에 따라 감염성 질환 68종 원인균 및 항생제 내성 유무 분석용 유전자들을 분석한 결과를 나타내는 또 다른 칩 스캔 이미지와 칩 그리드를 나타낸다. 해당검체는 요로감염 그룹에서 스태필로코커스 오리우스, 엔테로코커스 패칼리스, 마이코박테리아 그룹에서 마이코박테리움 포튜이텀, 마이코박테리움 인트라셀룰리, 치주염 그룹에서 트레포니마 덴티콜라, 퓨소박테리움 뉴클리아텀, 부비동염 그룹에서 곰팡이 및 캔디다 균 등이 감염되었고 이들 균들은 세팔로스포린/페니실린계, 테트라사이클린계, 마크로리드계 항생제에 대한 내성을 보유하고 있음을 확인할 수 있다.
<110> PARK, MinKoo <120> Novel probes, multiplex-PCR kit, DNA chip, PNA chip required for multiplex-PCR and antibiotics resistance analysis to detect infectious diseases-related microorganisms and method thereof <160> 216 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Fungus spp. <400> 1 gcatcgatga agaacgcagc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Fungus spp. <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Rhizopus spp. <400> 3 attaccatga gcaaatcaga 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Rhizopus spp. <400> 4 caatccaaga atttcacctc tag 23 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Aspergillus spp. <400> 5 cggcccttaa atagcccg 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Aspergillus spp. <400> 6 gaccgggttt gaccaacttt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Candida spp. <400> 7 gcatcgatga agaacgcagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Candida spp. <400> 8 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 9 tttcgctgtt gtggttctca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 10 gggcactgga cctgtatgag 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Mycobacterium spp. <400> 11 dcckcytttc taaggwgcac c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Mycobacterium spp. <400> 12 gatgctcgca accactatcc a 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Human Papilloma Virus L1 region <400> 13 tttbthachg tdgtdgayac hac 23 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Human Papilloma Virus L1 region <400> 14 gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Proteus mirabilis <400> 15 gcggtttatc acgaaggg 18 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Proteus mirabilis <400> 16 gcttggcgag attgagtgc 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Enterobacter sp. <400> 17 cctggacgaa gactgacgc 19 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Enterobacter sp. <400> 18 cggactacga cgcactttat g 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli sp. <400> 19 agcgtcgcag aacattacat 20 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Escherichia coli sp. <400> 20 gggcaacaag ccgaaaga 18 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 21 agtttctgct gctgatggt 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 22 taacaacgcc tgaacctac 19 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus sp. <400> 23 agtatctgct gctgacggtc c 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus sp. <400> 24 gtagcaacag taccacgacc a 21 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 25 aatggacggc ggtatctt 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 26 tcaacacggc ctgtagca 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae <400> 27 tgcggtaacg aacgaaat 18 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae <400> 28 ttcacaaggc gctcactca 19 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 29 tcgtttcatc aaagagggta a 21 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 30 ccgcaagaag agtgggatt 19 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Corynebacterium sp. <400> 31 ccgcaaggct aaaactcaaa ggaat 25 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Corynebacterium sp. <400> 32 accgaccaca agggaaagac t 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 33 tgaagggtga caacgaggag 20 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 34 gcccgcactg aggaataaa 19 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Veillonella sp. <400> 35 tgaaaggtgg cctctattta t 21 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Veillonella sp. <400> 36 caatccttct aactgttcgc aag 23 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Leptotrichia sp. <400> 37 caattctgtg tgtgtgaaga ag 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Leptotrichia sp. <400> 38 acagttttgt aggcaagcct at 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Lactobacillus sp. <400> 39 tctgccttga agatcggagt gc 22 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Lactobacillus sp. <400> 40 acagttgata ggcatcatct g 21 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Enterobacteriaceae sp. <400> 41 tttccgtgtc gcccttat 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Enterobacteriaceae sp. <400> 42 cgaccgagtt gctcttgc 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Enterobacteriaceae sp. <400> 43 ccgctgggaa acggaact 18 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Enterobacteriaceae sp. <400> 44 cccgcagata aatcaccaca at 22 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Enterobacteriaceae sp. <400> 45 tgccgcacct caacaaatc 19 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Enterobacteriaceae sp. <400> 46 caatagcgtc gccaccaa 18 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Bacteria general <400> 47 tcatagacac gccaggacat a 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Bacteria general <400> 48 cagattcggt aaagttcgtc a 21 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Bacteria general <400> 49 tgctgtccag gcaggtagat 20 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Bacteria general <400> 50 ggcataaatc gccgtgaag 19 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Bacteria general <400> 51 gaaaaggtac tcaaccaa 18 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Bacteria general <400> 52 ataagtaacg gtacttaaat tg 22 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Herpes Simples Virus <400> 53 ccgagtacgg cggctccttc 20 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Herpes Simplex Virus <400> 54 tgcagctcgc accacgcg 18 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Herpes Simplex Virus type 2 <400> 55 cgacaagatt aacgccaagg g 21 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Herpes Simplex Virus type 2 <400> 56 cgtcgccagc acaaactca 19 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Haemophilus ducreyi <400> 57 agcgtgggtg ccagtaaat 19 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Haemophilus ducreyi <400> 58 gaaaggtagg cgtgagagaa tc 22 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Treponema pallidum <400> 59 ggtatgaagt ttgtcccagt tgc 23 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Treponema pallidum <400> 60 gcgtcatcac cgtagtagtc gt 22 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Mycoplasma hominis <400> 61 aatggctaat gccggatacg c 21 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Mycoplasma hominis <400> 62 aggtaccgtc agtctgcaat cat 23 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Gardnerella vaginalis <400> 63 gggcgtattg gttggatgc 19 <210> 64 <211> 19 <212> DNA <213> Gardnerella vaginalis <400> 64 ccccgaatac gcaacacct 19 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 65 cgaccaatag aggcgttaca a 21 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 66 acggatttag gtggcaagg 19 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Trichomonas vaginalis <400> 67 ctcagttcgc aaaggcagtc 20 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Trichomonas vaginalis <400> 68 atgcgattgg ctgcttga 18 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Ureaplasma urealyticum <400> 69 cagcattaaa aatactggtg accg 24 <210> 70 <211> 25 <212> DNA <213> Ureaplasma urealyticum <400> 70 attccctaac ttgtcgtcta acttc 25 <210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> Mycoplasma genitalium <400> 71 agttgatgaa accttaaccc ctt 23 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Mycoplasma genitalium <400> 72 tgaggggttt tccatttttg c 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Chlamydiae trachomatis <400> 73 tgaggggttt tccatttttg c 21 <210> 74 <211> 19 <212> DNA <213> Chlamydiae trachomatis <400> 74 gaccgctgtc tcgcaaatc 19 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 75 cggtttccgt gcgttacg 18 <210> 76 <211> 25 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 76 actggtttca tctgattact ttcca 25 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Actonobacillus actinomycetemcomitans <400> 77 ggggctttct actacgggac 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Actinobacillus actinomycetemcomitans <400> 78 agcatctgcg atccctgtat 20 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 79 gaataacggg cgatacgag 19 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 80 gctgacttac cgaacaacct 20 <210> 81 <211> 24 <212> DNA <213> Treponema denticola <400> 81 agaataagaa gaagagggaa tgct 24 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Treponema denticola <400> 82 gcttacctaa ccgcctacat acc 23 <210> 83 <211> 18 <212> DNA <213> Tannerella forsythensis <400> 83 cgggctgcaa tggaacta 18 <210> 84 <211> 19 <212> DNA <213> Tannerella forsythensis <400> 84 gcttctcagg tcccagcaa 19 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213> Prevotella intermedia <400> 85 ccaaccttcc ctccactcg 19 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Prevotella intermedia <400> 86 cgtcaatcct gcacgctact t 21 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum <400> 87 catttattgt gatggaggga cg 22 <210> 88 <211> 19 <212> DNA <213> Fusobacterium nucleatum <400> 88 cctcttcact gcgaccctc 19 <210> 89 <211> 19 <212> DNA <213> Bacteria general <400> 89 tcctacggga ggcagcagt 19 <210> 90 <211> 26 <212> DNA <213> Bacteria general <400> 90 ggactaccag ggtatctaat cctgtt 26 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Fungus spp. <400> 91 gcatcgatga agaacgcagc 20 <210> 92 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Fungus spp. <400> 92 ttgacctcrr atcaggtagg ratacccgct gaacttaa 38 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Rhizopus spp. <400> 93 ctagcggcca aatacaaatg c 21 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Rhizopus spp. <400> 94 ttcacctcta gcggccaaat 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Aspergillus spp. <400> 95 ggcttgagcc gatagtcccc 20 <210> 96 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Aspergillus spp. <400> 96 tcaagccgat ggaagtgcg 19 <210> 97 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Candida spp. <400> 97 gaaggcaaca ccaaacccg 19 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Candida spp. <400> 98 tcctacctga tttgagggcg a 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycobacterium avium <400> 99 gaccgagtgt tgtctcaggg c 21 <210> 100 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycobacterium chelonae <400> 100 atttcccagc cgaatgagc 19 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycobacterium flavescens <400> 101 ggtctggtgt cgccctgtct t 21 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycobacterium gordonae <400> 102 ctcgggtgct gtccctcca 19 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycobacterium kansasii <400> 103 gaggcaacac tcgggctctg 20 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycobacterium simiae <400> 104 ttcggttgaa gtggtgtccc tc 22 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycobacterium szulgai <400> 105 cggcaacgaa caagccagac a 21 <210> 106 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycobacterium vaccae <400> 106 cggcgaggga aatcatcaga ca 22 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycobacterium fortuitum <400> 107 gtcttacccg agccgtgagg a 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycobacterium intracellulare <400> 108 ccctgagaca acactcggtc g 21 <210> 109 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Mycobacterium tuberculosis <400> 109 ttgggtcctg aggcaacact cg 22 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycobacterium abscessus <400> 110 ttgggtcctg aggcaacacg 20 <210> 111 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycobacterium bovis <400> 111 ttgggtcctg aggcaacact cg 22 <210> 112 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for HPV type 16 <400> 112 acctccagca cctaaagaag at 22 <210> 113 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for HPV type 18 <400> 113 ggacccgtgt atacaggcac at 22 <210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for HPV type 31 <400> 114 atggatcttc cttgggcttt t 21 <210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for HPV type 33 <400> 115 caggctatta cgtgtcaaaa aac 23 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for HPV type 35 <400> 116 ccagaaggcg gtggtgtaag 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for HPV type 39 <400> 117 caaactggca gatggtggag 20 <210> 118 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for HPV type 52 <400> 118 ccccaccacc gtctgcatc 19 <210> 119 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for HPV type 56 <400> 119 gggttatccc cgccagtg 18 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for HPV type 58 <400> 120 gtcctgtaaa ctggcagacg g 21 <210> 121 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for HPV type 6 <400> 121 ccccaaatgg tacattagaa gata 24 <210> 122 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for HPV type 11 <400> 122 ccatttggtg gaggcgata 19 <210> 123 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for HPV type 30 <400> 123 aactccactt tacttgaggg ctg 23 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for HPV type 54 <400> 124 tgcaggggca ttattctttt g 21 <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for HPV type 62 <400> 125 tcactatttg cagtctcggg cta 23 <210> 126 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Proteus mirabilis <400> 126 cgcactcaat ctcgccaag 19 <210> 127 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Proteus mirabilis <400> 127 atggcattta gaggatgtag ca 22 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Proteus mirabilis <400> 128 gcggtttatc acgaaggggt 20 <210> 129 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Enterobacteriaceae spp. <400> 129 gacatcgttt acggcgtgga ct 22 <210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Enterobacteriaceae spp. <400> 130 cctcaagggc acaacctcca ag 22 <210> 131 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Enterobacteriaceae spp. <400> 131 tcaggtgcga aagcgtggg 19 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Enterobacteriaceae spp. <400> 132 cgtccgatca cctgcgtcaa 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Escherichia coli sp. <400> 133 gcgaagaggc agtcaacggg 20 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Escherichia coli sp. <400> 134 gggcaacaag ccgaaagaac tg 22 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Enterococcus faecalis <400> 135 ggaacatcat cgcctgggaa 20 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Enterococcus faecalis <400> 136 gataactgga acatcatcgc c 21 <210> 137 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Enterococcus faecalis <400> 137 atgatgttcc agttatcgca gg 22 <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Staphylococcus spp. <400> 138 cgtattgagc atcgccttct a 21 <210> 139 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe seqeunce for Staphylococcus spp. <400> 139 cgtattgagc atcgccttc 19 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Staphylococcus spp. <400> 140 ttagaaggcg atgctcaata c 21 <210> 141 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Staphylococcus aureus <400> 141 tcgtattgag catcgcctt 19 <210> 142 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Staphylococcus aureus <400> 142 cttcgtattg agcatcgcc 19 <210> 143 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Staphylococcus aureus <400> 143 aaggcgatgc tcaatacga 19 <210> 144 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Streptococcus agalactiae <400> 144 gagtatcaag cagcccacg 19 <210> 145 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Streptococcus agalactiae <400> 145 atcaagcagc ccacgattc 19 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Streptococcus agalactiae <400> 146 aaggaataca tgctgttgcg 20 <210> 147 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Streptococcus pneumoniae <400> 147 gctacccgat gagtttgttg tt 22 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Streptococcus pneumoniae <400> 148 agctacccga tgagtttgtt gtt 23 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Streptococcus pneumoniae <400> 149 cgataacaac aaactcatcg ggt 23 <210> 150 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Corynebacterium sp. <400> 150 gcacaagcgg cggagcat 18 <210> 151 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Corynebacterium sp. <400> 151 atgctccgcc gcttgtgc 18 <210> 152 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Corynebacterium sp. <400> 152 tgcaacgcga agaaccttac ct 22 <210> 153 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Pseudomonas aeruginosa <400> 153 ccgtacacgc cggtagca 18 <210> 154 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Pseudomonas aeruginosa <400> 154 gccgggtcca ggatgccc 18 <210> 155 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Veillonella sp. <400> 155 ccacattggg actgagacac gg 22 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Veillonella sp. <400> 156 tcctacggga ggcagcagtg 20 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Veillonella sp. <400> 157 ctacgggagg cagcagtggg 20 <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Leptotrichia sp. <400> 158 cggataacgc tcgcaacata 20 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Leptotrichia sp. <400> 159 tatgttgcga gcgttatccg 20 <210> 160 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Leptotrichia sp. <400> 160 aggcggtaag acaagttgaa gg 22 <210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Lactobacillus sp. <400> 161 cgtgttactc acccgtccgc 20 <210> 162 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Lactobacillus sp. <400> 162 cggcggacgg gtgagtaa 18 <210> 163 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Lactobacillus sp. <400> 163 agcggcggac gggtgagt 18 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for plasmid-borne beta-lactamase TEM gene <400> 164 gaataagggc gacacggaaa 20 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for plasmid-borne beta-lactamase TEM gene <400> 165 tttccgtgtc gcccttattc 20 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for plasmid-borne beta-lactamase SHV gene <400> 166 cagcacggag cggatcaacg 20 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for plasmid-borne beta-lactamase SHV gene <400> 167 cgccctgctt ggcccgaata 20 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for chromosomal beta-lactamase AmpC gene <400> 168 cgttgatttg ttgaggtgcg g 21 <210> 169 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for chromosomal beta-lactamase AmpC gene <400> 169 taccgccacc gccatacc 18 <210> 170 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for TetM gene <400> 170 cgagtttgtg cttgtacgcc at 22 <210> 171 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for TetM gene <400> 171 aaagatggcg tacaagcaca aac 23 <210> 172 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for TetC gene <400> 172 tgatcttcac ggcgatttat gc 22 <210> 173 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for TetC gene <400> 173 cattggaccg ctgatcttca cg 22 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for ermB gene <400> 174 ttggcgtgtt tcattgcttg 20 <210> 175 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for emrB gene <400> 175 atcaagcaat gaaacacgcc aa 22 <210> 176 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for HSV <400> 176 cacatcaagg tgggccagcc gc 22 <210> 177 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for HSV <400> 177 tgcggctggc ccaccttgat g 21 <210> 178 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for HSV <400> 178 ccaggtagta ctgcggctgg cc 22 <210> 179 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for HSV type 2 <400> 179 ccgtggagcg gcagacccc 19 <210> 180 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for HSV type 2 <400> 180 gccgtggagc ggcagacc 18 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for HSV type 2 <400> 181 tggccgtgga gcggcagacc 20 <210> 182 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Haemophilus ducreyi <400> 182 gcgccgtatc ggttgggt 18 <210> 183 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Haemophilus ducreyi <400> 183 aaggtaggcg tgagagaatc aaaaa 25 <210> 184 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Haemophilus ducreyi <400> 184 cgtaggcatc aagaaggtaa agcg 24 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Treponema pallidum <400> 185 aggaaccgca actgggacaa a 21 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Treponema pallidum <400> 186 gaggaaccgc aactgggaca 20 <210> 187 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Treponema pallidum <400> 187 tgaagtttgt cccagttgcg gt 22 <210> 188 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycoplasma hominis <400> 188 actaatgttc cgcaccctca tct 23 <210> 189 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycoplasma hominis <400> 189 agatgagggt gcggaacatt agt 23 <210> 190 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Gardnerella vaginalis <400> 190 gctgccgagt gggctttg 18 <210> 191 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Gardnerella vaginalis <400> 191 gtcaggtgtt gcgtattcgg g 21 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Candida albicans <400> 192 gcatctccaa tcattcgcct a 21 <210> 193 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Candida albicans <400> 193 agatgccttg ccacctaaat cc 22 <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trichomonas vaginalis <400> 194 ggactgcctt tgcgaactga 20 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Trichomonas vaginalis <400> 195 ggctgcttga ccatccgaaa 20 <210> 196 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Ureaplasma urealyticum <400> 196 ggggatgaac tctactatga agtta 25 <210> 197 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Ureaplasma urealyticum <400> 197 gttaactaag ccgtttacac ctcaa 25 <210> 198 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycoplasma genitalium <400> 198 atatttaagt tgtcattttg gcttc 25 <210> 199 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Mycoplasma genitalium <400> 199 aagaagccaa aatgacaact taaat 25 <210> 200 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Chlamydiae trachomatis <400> 200 gagataggaa accaactcta cgctg 25 <210> 201 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Chlamydiae trachomatis <400> 201 cagcgtagag ttggtttcct atctc 25 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Neisseria gonorrhoeae <400> 202 gcaggcgtat aggcggactt g 21 <210> 203 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Neisseria gonorrhoeae <400> 203 gggaatcgta acgcacggaa a 21 <210> 204 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Actinobacillus actinomycetemcomitans <400> 204 ggggctttct actacgggac ct 22 <210> 205 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Actinobacillus actinomycetemcomitans <400> 205 cagcatctgc gatccctgta t 21 <210> 206 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Porphyromonas gingivalis <400> 206 taccgaacaa cctacgcacc ct 22 <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Porphyromonas gingivalis <400> 207 gcggtaatac ggaggatgcg 20 <210> 208 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Treponema denticola <400> 208 gcctacatac cctttacgcc ca 22 <210> 209 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Treponema denticola <400> 209 gggcttattc gcatgactac cg 22 <210> 210 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Tannerella forsythensis <400> 210 cgggcgtggg attggtgatg 20 <210> 211 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Tannerella forsythensis <400> 211 tgtatcgggc gtgggattgg t 21 <210> 212 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Prevotella intermedia <400> 212 atggcatctg acgtggacca aa 22 <210> 213 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Prevotella intermedia <400> 213 cgtagccttg gtgggccgtt a 21 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Fusobacterium nucleatum <400> 214 ttctgcgtcc ctccatcaca 20 <210> 215 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for Fusobacterium nucleatum <400> 215 acttccgttc gtccgtgc 18 <210> 216 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence for bacterial 16S ribosomal RNA <400> 216 cgtattaccg cggctgctgg cac 23

Claims (13)

  1. 감염성 질환 원인균을 질환 그룹별로 멀티플렉스-중합효소 연쇄반응(multiplex-PCR)으로 증폭한 후, 그 산물(product)을 해당 원인균에 특이적으로 결합하도록 설계된 프로브(probe)가 고정화된 칩(chip) 표면에서 혼성화(hybridization) 반응을 통해 질환 그룹별 감염여부뿐 아니라 감염균 유전자형(genotype) 및 항생제 내성 유무까지 동시에 판별할 수 있는 분석방법.
  2. 제 1항에 있어서, 감염성 질환 원인균을 질환 그룹별로 감염여부뿐 아니라 감염균 유전자형 및 항생제 내성 유무까지 판별할 수 있는 분석방법을 이용한 멀티플렉스-PCR 키트(kit).
  3. 제 1항에 있어서, 감염성 질환 원인균을 질환 그룹별로 감염여부뿐 아니라 감염균 유전자형 및 항생제 내성 유무까지 판별할 수 있는 분석방법을 이용한 DNA (Deoxyribonucleic acid)칩.
  4. 제 1항에 있어서, 감염성 질환 원인균을 질환 그룹별로 감염여부뿐 아니라 감염균 유전자형 및 항생제 내성 유무까지 판별할 수 있는 분석방법을 이용한 PNA(Peptide nucleic acid) 칩.
  5. 제 1항에 있어서, 감염성 질환 원인균 분석을 위해 본 발명이 포함하는 질환 그룹은 요로감염(Urinary tract infection), 비부비동염(Rhinosinusitis), 성전파성질환(sexually transmitted disease), 인유두종바이러스(Human papilloma virus), 치주염(Periodontitis), 마이코박테리아 감염인것을 특징으로하는 분석방법.
  6. 제 1항 내지 5항에 있어서, 서열목록번호 1 내지 90의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머(primer)를 포함하는 멀티플렉스-PCR 키트.
  7. 제 1항, 3항 및 5항에 있어서, 서열목록번호 91 내지 216의 염기서열을 갖는 DNA 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 DNA 프로브(probe)를 포함하는 감염성 질환 68종 판별용 칩.
  8. 제 1항, 4항 및 5항에 있어서, 서열목록번호 91 내지 216의 염기서열을 갖는 PNA 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 PNA 프로브(probe)를 포함하는 감염성 질환 68종 판별용 칩.
  9. 제 1항 및 5항에 있어서,
    1) 감염성 질환 원인균 및 항생제 내성 분석용 총 68종 원인균 또는 바이러 스의 타겟 유전자를 검출할 수 있는 서열목록번호 91 내지 216의 염기서열을 갖는 DNA 또는 PNA 프로브를 스팟팅(spotting)하여 칩을 제작하는 단계;
    2) 다양한 체액(body fluid) 유래 검체로부터 DNA를 추출하는 단계;
    3) 감염성 질환 원인균을 질환 그룹별로 멀티플렉스-중합효소 연쇄반응(multiplex-PCR)으로 증폭하고 그 과정중에 증폭산물에 형광물질을 표지하는 단계;
    4) 타겟 DNA 증폭산물과 혼성화반응용액을 칩 기판위의 반응 챔버 커버로 주입하여 혼성화 반응을 유도하고 세척하는 단계;
    5) 레이저 스캐너(scanner)를 이용하여 혼성화 반응 결과에 따른 형광강도를 측정하고 결과를 판독하는 단계로 이루어진 분석방법.
  10. 제 1항 내지 9항에 있어서, 질환 그룹별로 멀티플렉스-PCR 반응을 수행하는 과정중에 반응산물에 형광색소를 포함시키는 멀티플렉-PCR 키트.
  11. 상기 청구항에서 정방향(sense) 또는 역방향(anti-sense) 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 형광색소(Fluorescent dye)가 표지된 프라이머(primer)를 포함하는 멀티플렉스-PCR 키트.
  12. 상기 청구항에서 PCR 증폭 과정중에 형광색소가 표지된 디옥시시티딘 트리포스페이트(Deoxycytidine triphosphate, dCTP) 또는 디옥시유리딘 트리포스페이 트(Deoxyuridine triphosphate, dUTP)을 사용하여 증폭산물의 염기서열내 무작위적으로(randomly) 형광색소가 표지되는 반응원리를 갖는 멀티플렉스-PCR 키트.
  13. 상기 청구항에서 형광색소는 비오틴(Biotin), 로다민(Rhodamine), Cy3, Cy5, Cy5.5, 6-FAM(6-carboxyfluorescein), JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxyfluorescein), Rhodamine Green, TAMRA NHS(N-hydroxysuccinimide) Ester, Texas Red이다.
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