WO2018012011A1 - 口腔内検査方法 - Google Patents

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WO2018012011A1
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bacteria
oral
probe
periodontal disease
streptococcus
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あい 原
伸也 村上
剛徳 野崎
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三菱ケミカル株式会社
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an intraoral inspection method for determining periodontal disease and / or caries.
  • Periodontal disease and dental caries which are two major diseases in the mouth, are bacterial infections involving multiple bacteria.
  • Periodontal disease is a multifactorial disease that progresses by involving causative bacteria (bacterial factors), immunity (host factors), and lifestyle habits, but periodontopathic bacteria are always involved in the onset.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Porphyromonas gingivalis Among them, Tannerella forsythensis and Treponema
  • the three bacterial species of denticola are called “Red Complex” and are regarded as important causative bacteria of chronic periodontitis. It is known that the presence of “Red Complex” increases the malignancy of periodontal disease, and bacteria constituting “Red Complex” are regarded as clinically important bacteria.
  • Streptococcus mutans is known to be a causative bacterium, and the causative bacterium metabolizes saccharides to produce lactic acid. As a result, the oral environment becomes acidic and enamel decalcification occurs. It has been. Kits for culturing and examining mutans streptococci and lactobacilli are commercially available for caries bacterial testing and are used as a diagnostic material. From the cultured results, the number of colonies is determined visually.
  • Bacterial testing methods for periodontal disease or caries causing bacteria include microscopic observation methods, culture methods, enzyme activity methods, immunological methods, DNA probe methods, PCR methods, and Realtime PCR methods.
  • Patent Document 1 There have been many reports on methods for calculating the number of bacteria in relation to one item of periodontal disease or caries. For example, there is a method of detecting the number of Porphyromonas gingivalis and / or Bacteroides forsythus in saliva using a real-time PCR method (Patent Document 1). In addition, the ratio of mutans streptococci to the total number of streptococci can be calculated using a real-time PCR method (Patent Document 2).
  • a T-RFLP method has been reported in which genomic DNA of bacterial flora is collected and subjected to restriction enzyme treatment, and the bacterial flora is recognized from the information of the fragmented DNA using pattern similarity as an index (Patent Document 5). ). According to this report, patterns from bacterial flora that correlate with dental clinical indicators were identified. However, no specific information on the number of bacteria was included, and no further interpretation was possible.
  • the T-RFLP method can express the composition of bacterial communities as a peak pattern and can easily perform comparative analysis of multiple specimens. However, since each peak is not necessarily derived from one bacterial species, the bacterial community composition Is difficult to grasp (Non-Patent Document 4).
  • Patent Documents 6 to 8 there is a report using a universal primer that selects a region having high conservation between each microorganism.
  • Non-Patent Documents 5 to 8 there are reports that 20 types of oral bacteria are detected by setting one set of universal primers in the PCR process of sample preparation.
  • periodontal disease is a disease caused by multiple bacteria, so limited bacteria measurement may not provide enough evidence, but it is also assumed that periodontal disease severity or causative bacteria may be overlooked .
  • the judgment index of the treatment effect of periodontal disease is based on clinical information obtained based on the experience of dentists, and in most cases, it has not been confirmed until bacteria are removed .
  • periodontal disease has already progressed by the time that it is noticed that many patients suffered from periodontal disease, and even if the treatment is started after noticing the symptoms of periodontal disease, the treatment is effective. Since there is often no performance, an effective prediction method for the deterioration of periodontal disease is also required.
  • an object of this invention is to provide the method which can determine the state of periodontal disease and / or a caries by a simple method.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of determining the severity of periodontal disease, the therapeutic effect of periodontal disease, or the risk of worsening periodontal disease by detecting oral bacteria in detail.
  • the present inventor obtained periodontal disease and / or caries by obtaining a ratio of a specific number of bacteria to a total number of bacteria present in an oral sample. As a result, the present invention has been completed. In addition, the present inventor can determine the severity of periodontal disease, the therapeutic effect of periodontal disease, the risk of worsening periodontal disease, etc. by determining the number of specific bacteria present in the oral sample. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows. (1) An intraoral inspection method for determining a periodontal disease and / or a caries state by measuring the amount of bacteria present in an intraoral sample from an intraoral sample collected from a subject.
  • the number of Streptococcus mutans bacteria is When the total number of bacteria is less than 0.05%, caries symptoms are "mild” If the total number of bacteria is 0.05% or more and less than 2.5%, the caries symptoms are "medium” When the total number of bacteria is 2.5% or more, the caries symptom is "severe” The method according to (2), wherein it is determined that
  • plaque When using plaque as an intraoral sample, among bacteria present in plaque, The total number of bacteria of at least one kind of bacteria selected from the group consisting of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythesis and Treponema denticola, If the total number of bacteria is less than 0.1%, the symptoms of periodontal disease are "mild” If the total number of bacteria is 0.1% or more and less than 5%, the periodontal disease symptoms are "moderate” When the total number of bacteria is 5% or more, periodontal disease is "severe” The method according to (2), wherein it is determined that
  • Bacterial amount of specific bacteria in the oral sample from the oral sample collected from the subject By measuring the total bacterial amount present in the oral sample, or both the specific bacterial amount and the total bacterial amount present in the oral sample, and performing statistical analysis on the obtained measurement results, periodontal
  • Bacterial amount of specific bacteria in the oral sample from the oral sample collected from the subject before and after treatment of periodontal disease Measuring the total bacterial amount present in the oral sample, or both the specific bacterial amount and the total bacterial amount present in the oral sample, The method according to (1), including a step of determining a therapeutic effect of periodontal disease based on a comparison result between the bacterial amount before the treatment and the bacterial amount after the treatment.
  • Bacterial amount of specific bacteria in the oral sample from the oral sample collected from the subject Based on the step of measuring the total bacterial amount present in the oral sample, or both the specific bacterial amount and the total bacterial amount present in the oral sample, and the ratio of the obtained bacterial amount, The method according to (1) above, comprising a step of determining a deterioration risk.
  • the specific bacteria in the oral cavity sample are Porphyromonas, Tannerella, Treponema, Prevotella, Campylobacter, Fusobacterium, Genus Parvimonac, Streptococcus, Aggregacatagen
  • the genus, Selenomonas genus, Lactobacillus genus, Pseudomonas genus, Haemophilus genus, Klebsiella genus, Serratia genus, Moraxella genus and Candida genus are at least one kind selected from the above (6) or (7) Direction .
  • Specific bacteria in oral samples are Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Prevotella intermedia, Aggregatibacteractinumumetumumetumactimumactemumactumumactemumactumumactimumactemumactimumbumactisumbum.
  • Vincentii Fusobacterium nucleatum subsp. Polymorphum, Fusobacterium nucleatum subsp. Animalis, Fusobacterium nucleatum subsp.
  • a primer or primer set comprising one or more of DNAs comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 193 to 198 and 201 to 204 or nucleotide sequences complementary to the nucleotide sequences.
  • DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 97, 100, 120, 121, 122, 129, 130, 152 or 155 or a base sequence complementary to the base sequence, or It has a function capable of detecting at least a part of a base sequence of a nucleic acid derived from an oral bacterium and hybridizing with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA under stringent conditions.
  • DNA An oligonucleotide probe comprising:
  • periodontal disease and / or caries can be determined by a simple method.
  • the severity of periodontal disease, the therapeutic effect of periodontal disease, and the risk of worsening periodontal disease can be determined by detecting bacteria in the oral cavity by a simple method.
  • the determination can be performed with higher accuracy, and more efficiently and cheaply than real-time PCR and sequencer.
  • the intraoral inspection method of the present invention is a method for determining the periodontal disease and / or caries state by measuring the amount of bacteria present in the intraoral sample.
  • Specific embodiments of the intraoral inspection method are not limited.
  • A) A method for the determination by determining the ratio of the number of specific bacteria to the total number of bacteria present in the oral sample, or B) in the oral sample from the oral sample collected from the subject. Method for measuring the amount of bacteria and making the determination based on the measurement result obtained Etc.
  • Etc the measurement result obtained Etc.
  • the method for measuring the number of bacteria in the oral sample will be described mainly with a method using a DNA chip.
  • a method other than the method using a DNA chip for example, The number of bacteria in the oral sample can also be measured by an invader method, a real-time PCR method, an invader PCR method, or the like.
  • a DNA chip can be used when measuring the oral bacterial amount from an oral sample collected from a subject, for example, the following probe (a) and at least one of the probes (b) and (c) can be mounted on the DNA chip.
  • a DNA chip is a general term for a substrate on which probes are arranged.
  • the names of DNA chips, DNA microarrays, and the like are not distinguished from each other but are synonymous.
  • Probes comprising nucleic acids that specifically hybridize to each bacterial gene to be detected
  • B Total amount index probe comprising nucleic acids that hybridize to all bacterial genes
  • C a probe comprising a nucleic acid that specifically hybridizes to one or more kinds of absolute quantity indicators
  • the oral bacteria to be measured are not limited, Bacteria belonging to the genus Porphyromonas, bacteria belonging to the genus Tannerella, bacteria belonging to the genus Treponema, bacteria belonging to the genus Prevotella, bacteria belonging to the genus Campylobacter, bacteria belonging to the genus Fusobacterium, bacteria belonging to the genus Parvimonacus, bacteria belonging to the genus Streptococcus Bacteria belonging to the genus Capnocytophaga, bacteria belonging to the genus Eikenella, bacteria belonging to the genus Actinomyces, bacteria belonging to the genus Velillella, bacteria belonging to the genus Selenomonas, bacteria belonging to the genus Lactobacillus, bacteria belonging to the genus Pseudomonas, Bacteria, Bacteria belonging to lebsiella genus, bacteria belonging to the genus Serratia, bacteria
  • Porphyromonas gingivalis Tannerella forsythia, Treponema denticola, Prevotella intermediate, Aggregatibacteractiminobacteria, which is considered to be related to periodontal disease and caries.
  • Vincentii Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Fusobacterium nucleatum subsp. animalis, Fusobacterium nucleatum subsp.
  • the oligo DNA that can be used as the probe (a) is capable of hybridizing with a base sequence in a specific region of a base sequence of a nucleic acid derived from oral bacteria.
  • the nucleic acid may be any of DNA and RNA including chromosomal DNA and plasmid DNA, but is not limited, but is preferably chromosomal DNA.
  • the oligonucleotide used as a probe in the present invention is capable of hybridizing with the base sequence of the 16S rRNA gene in the chromosomal DNA of the oral bacteria.
  • the probe that can be used in the present invention, it is preferable to select a region that has a base sequence specific to various oral bacteria to be detected and design the base sequence of the region.
  • Tm melting temperature
  • Specific base sequences corresponding to each species of oral bacteria can be found by means of, for example, taking multiple alignments and designing probes in different regions between species.
  • the algorithm for taking the alignment is not particularly limited, but as a more specific analysis program, for example, a program such as ClustalX1.8 can be used.
  • the parameters for the alignment may be executed in the default state of each program, but can be adjusted as appropriate according to the type of program.
  • the specificity of the probe may be one that collectively detects bacteria of the same genus based on the specificity at the genus level, or may be the specificity that can be detected at the individual species level, Appropriate judgment can be made according to the purpose of bacteria detection.
  • the total amount index probe is a probe intended to capture all bacteria in the specimen that can be amplified with a specific primer pair. In detecting bacteria, what percentage of the total number of bacteria, including non-detected bacteria, is, and how much bacteria are present in the sample in the first place It is also extremely important to detect the total amount of bacteria from the viewpoint.
  • Non-detection target bacteria can be understood as the sum (total) of bacteria whose existence and type are known but not required to be detected, and bacteria whose presence and type are unknown.
  • the total amount of bacteria for example, it is possible to measure the total amount of bacteria independently of the DNA chip, but by mounting a probe that is an indicator of the total amount of bacteria in the DNA chip. The ease of operation is improved.
  • a base sequence common to many types of bacteria may be used from among the base sequences amplified by the primer pair. When such a sequence is not found, a plurality of relatively common sequences may be designed, and the total amount index probe may be determined by comprehensively judging them.
  • the total amount index probe is preferably a probe that hybridizes to a nucleic acid derived from a bacterium contained in a specimen, and more specifically, a plurality of types of bacteria to be detected among the base sequences amplified by the specific primer pair.
  • This probe contains a common base sequence. Examples of total amount index probes are shown in Table 1-1-1 (SEQ ID NO: 60). Since the total amount index represents the total amount of amplification products specific to individual bacterial species, the amount is generally large, and the target signal intensity may exceed the detectable signal intensity range. .
  • the amount of sample to be subjected to hybridization is desirable to limit the amount of sample to be subjected to hybridization.
  • the Tm value of the probe is lowered.
  • a method of reducing the GC content or shortening the probe sequence length itself can be considered.
  • nucleic acid that acts competitively on the hybridization between the amplified nucleic acid and the total amount index probe.
  • a nucleic acid include a nucleic acid having the same or all the same sequence as the total amount indicator probe, or a nucleic acid having all or a part of the complementary sequence of the total amount indicator probe.
  • the absolute quantity index probe is a probe that hybridizes only to the nucleic acid of the absolute quantity index.
  • the absolute quantity index is a nucleic acid added to a sample in a certain amount before an amplification reaction or a hybridization reaction.
  • the absolute quantity index is a nucleic acid that can be reliably amplified when a normal amplification reaction is performed, and serves as a so-called positive control. Therefore, if a probe specific to the absolute quantity index is mounted on the DNA chip, it can be confirmed from the detection result whether the amplification reaction, hybridization, or the like has been appropriately performed.
  • the signal intensity of the absolute quantity index obtained from a plurality of DNA chips should be constant, and when the amplification efficiency or hybridization efficiency slightly increases or decreases, A correction factor can be calculated by comparing the signal intensities. In a plurality of DNA chips, the corrected signal intensity can be compared.
  • probes specific to each bacterium are shown in Table 1-1-1 (SEQ ID NOs: 3 to 59).
  • Examples of absolute quantity index probes are shown in Table 1-1-1 (SEQ ID NOs: 61 to 75), and examples of absolute quantity indices are shown in Table 1-1-2 (SEQ ID NOs: 76 to 90). If an absolute quantity index is added before the amplification reaction, it is detected by hybridization that it is a nucleic acid amplified by a specific primer pair, that is, possesses a base sequence complementary to the primer pair. For this purpose, it is necessary to possess a base sequence that is not possessed by either the detection target bacteria or the non-detection target bacteria.
  • the specific primer means that the sequence to be amplified is limited, and the primer pair is not necessarily one pair.
  • a multiplex method using two or more primer pairs can be applied as necessary. Examples of primer pairs are shown in Table 1-2.
  • Bacterial amplification primer pairs (SEQ ID NOs: 1 and 2) and absolute quantity index primer pairs (SEQ ID NOs: 91 and 92) can be used.
  • variable region showing the diversity of bacteria to be analyzed is selected, a highly conserved universal primer design region is selected before and after the selected variable region, and a primer sequence is designed.
  • the variable region used as object is not limited, 16S rRNA gene which all the bacteria have among genome sequences is mentioned. Of the 16S rRNA gene, it is desirable to target the full length or one or more regions of the variable region V1-V9. More preferably, the variable region V3-V4 is targeted.
  • a database that acquires a wide range of bacterial genome sequences is used. Specific examples include RDP, NCBI, KEGG, and MGDB.
  • the designed universal primer sequence is input to the Probe Match of the RDP database.
  • the number of exact matches in Total search is obtained. The closer the number of perfect matches is to Total Search, the higher the coverage.
  • “Strain” may select Type.
  • Source may select Isolates.
  • the absolute quantity index may be, for example, a nucleic acid standard for quantitative analysis developed by AIST or may be newly designed.
  • EXCEL software “manufactured by MICROSOFT”
  • an integer from 1 to 4 is randomly generated (X is an arbitrary number) and connected to generate 1
  • X is an arbitrary number
  • sequences only those sequences in which the sum of G and T is the same as the sum of A and T are extracted, and the extracted sequences are subjected to a Blast search against a database such as NCBI's GenBank to obtain nucleic acids derived from organisms.
  • a database such as NCBI's GenBank
  • sequence can be lengthened by connecting suitably, and it can also be partially removed and shortened.
  • the base length amplified in the detection target bacterium and the amplified base length of the absolute quantity index do not have a large difference.
  • the amplification product of the detection target bacteria is about 500 bp
  • the amplification product of the absolute quantity index is desirably about 300 bp to about 1000 bp.
  • the amplification product derived from the absolute quantity index is used as the detection target bacteria after designing the amplification product to have a length different from that of the detection target bacteria. It is also possible to detect at a position different from that of the band and confirm the success or failure of the amplification reaction before hybridization.
  • Such stringency conditions include, for example, hybridization under conditions of 50 to 60 ° C. under tight conditions, and hybridization under conditions of 30 to 40 ° C. under mild conditions.
  • Examples of stringent conditions in hybridization conditions include, for example, “0.24M Tris ⁇ HCl / 0.24M NaCl / 0.05% Tween-20, 40 ° C.”, “0.24M Tris ⁇ HCl / 0.
  • More stringent conditions such as “24M NaCl / 0.05% Tween-20, 37 ° C.”, “0.24M Tris ⁇ HCl / 0.24M NaCl / 0.05% Tween-20, 30 ° C.” “0.24M Tris ⁇ HCl / 0.24M NaCl / 0.05% Tween-20, 50 ° C.”, “0.24M Tris ⁇ HCl / 0.24M NaCl / 0.05% Tween-20, 55 ° C.”, “ 0.06M Tris.HCl / 0.06M NaCl / 0.05% Tween Mention may be made of 20,60 °C "conditions such as. More specifically, the probe was added and kept at 50 ° C.
  • the length of the probe used in the present invention is not limited, but is preferably 10 bases or more, more preferably 16 to 50 bases, and further preferably 18 to 35 bases. If the probe length is appropriate (within the above range), nonspecific hybridization (mismatch) can be suppressed and used for specific detection.
  • Tm means a temperature at which 50% of an arbitrary nucleic acid strand hybridizes with its complementary strand, and in order to hybridize a template DNA or RNA and a probe to form a double strand, the hybridization temperature Need to be optimized. On the other hand, if this temperature is lowered too much, non-specific reactions are likely to occur, so the temperature is preferably as high as possible.
  • the Tm of the nucleic acid fragment to be designed is an important factor for hybridization.
  • probe design software can be used for confirmation of Tm.
  • software that can be used in the present invention include Probe Quest (registered trademark; Dynacom).
  • Tm can be confirmed by calculating it by itself without using software. In that case, a calculation formula based on the nearest neighbor method, the Wallance method, the GC% method, or the like can be used.
  • the average Tm is preferably about 35 to 70 ° C. or 45 to 60 ° C.
  • Other conditions that allow specific hybridization as a probe include the GC content and the like, which are well known to those skilled in the art.
  • the nucleotide constituting the probe used in the present invention may be any of DNA and RNA or PNA, and may be a hybrid of two or more of DNA, RNA and PNA.
  • Specific examples of the probe used in the present invention preferably include those containing the following DNA base sequences (d) or (e).
  • the sequences shown in Table 1-1-1 SEQ ID NOs: 3 to 59 can be used as probes. It is preferable to use at least two sequences selected from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 59.
  • it may be a complementary sequence of at least two sequences selected from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 59, and is substantially the same as at least two sequences selected from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 59 Or a sequence substantially identical to the complementary sequence of at least two sequences selected from the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 59, or
  • substantially identical means that it specifically hybridizes under stringent conditions to the sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 59 or complementary sequences.
  • Table 1-1-1 can be referred to for their specific base sequences, probe names, and oral bacteria to be detected.
  • the DNA of (e) is a DNA comprising the various DNAs of (d) or a complementary base sequence thereof, or a fragment thereof, which is used as a probe, colony hybridization, plaque hybridization, and Southern. It can be obtained from a cDNA library or a genomic library by performing a known hybridization method such as blotting. A library prepared by a known method may be used, or a commercially available cDNA library or genomic library may be used, and is not limited. For the detailed procedure of the hybridization method, the same one as described above can be referred to.
  • the hybridizing DNA is preferably a base sequence having at least 60% homology with the DNA base sequence of (d) above, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, More preferably, it is 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the probe used in the present invention can be prepared by, for example, chemical synthesis using a normal oligonucleotide synthesis method (purification is performed by HPLC or the like). Such a probe can be designed by, for example, Probe Quest (registered trademark: manufactured by Dynacom). Moreover, the probe of the present invention may contain an additional sequence such as a tag sequence, for example. In the method of the present invention, the base sequence of the nucleic acid possessed by the oral bacteria to be detected does not have to be the base sequence itself, and a part of the base sequence has been mutated due to deletion, substitution, insertion, etc. It may be a thing.
  • the base sequence of the nucleic acid to be detected is a mutant gene that hybridizes with a sequence complementary to the base sequence under stringent conditions and has functions and activities derived from the respective base sequences.
  • the probe can also be designed based on the base sequence of such a mutant gene.
  • the “stringent conditions” may be the same conditions as described above.
  • DNA chip for detecting bacterial genes in the oral cavity used for measuring the amount of oral bacteria can be used in the method of the present invention.
  • a plurality of nucleotide probes are arranged on a base serving as a support.
  • any form such as a flat plate (glass plate, resin plate, silicon plate, etc.), rod shape, or bead can be used.
  • a predetermined probe can be fixed for each type on the flat plate with a predetermined interval (see, for example, spotting method; Science 270, 467-470 (1995)). .
  • a DNA chip obtained by fixing a predetermined probe to each hollow fiber for each type, converging and fixing all the hollow fibers, and then repeatedly cutting in the longitudinal direction of the fiber (Hereinafter referred to as “fiber type DNA chip”) can be preferably exemplified.
  • This microarray can be described as a type in which a nucleic acid is immobilized on a through-hole substrate, and is also referred to as a so-called “through-hole type DNA chip” (see Japanese Patent No. 3510882).
  • the method for fixing the probe to the support is not limited, and any binding mode may be used. Moreover, it is not limited to fix
  • a support body can be previously coated with polymers, such as a polylysine, and a probe can also be fixed to the support body after a process.
  • a tubular body such as a hollow fiber
  • the tubular body can hold a gel-like material, and the probe can be fixed to the gel-like material.
  • the fiber type DNA chip which is one form of the DNA chip will be described in detail. This DNA chip can be produced, for example, through the following steps (i) to (iv).
  • a step of embedding the array and manufacturing a block body A step of introducing a gel precursor polymerizable solution containing an oligonucleotide probe into the hollow part of each hollow fiber of the block body to carry out a polymerization reaction and holding the gel-like substance containing the probe in the hollow part
  • the material used for the hollow fiber is not limited, but for example, materials described in JP-A No. 2004-163211 are preferable.
  • the hollow fibers are arranged three-dimensionally so that the lengths in the longitudinal direction are the same (step (i)).
  • a plurality of hollow fibers are arranged in parallel at a predetermined interval on a sheet-like material such as a pressure-sensitive adhesive sheet to form a sheet, and then the sheet is spirally wound (Japanese Patent Laid-Open No. 11-1999). No.
  • the embedded array is filled with a gel precursor polymerizable solution (gel forming solution) containing an oligonucleotide probe in the hollow part of each hollow fiber, and a polymerization reaction is performed in the hollow part (step (iii)). .
  • the gel precursor polymerizable solution is a solution containing a reactive substance such as a gel-forming polymerizable monomer, and the solution can be converted into a gel by polymerizing and crosslinking the monomer.
  • a reactive substance such as a gel-forming polymerizable monomer
  • the solution may contain a polymerization initiator and the like.
  • the block body is cut in a direction intersecting with the longitudinal direction of the hollow fiber (preferably in a direction perpendicular to the hollow fiber) to make a thin piece (step (iv)).
  • the flakes thus obtained can be used as a DNA chip.
  • the thickness of the DNA chip is preferably about 0.01 mm to 1 mm.
  • the block body can be cut by, for example, a microtome and a laser.
  • Preferred examples of the fiber-type DNA chip include a DNA chip (Genopal TM) manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
  • the probes are three-dimensionally arranged in the gel, and the three-dimensional structure can be maintained. Therefore, the detection efficiency is increased compared to a planar DNA chip in which a probe is bound to a slide glass whose surface is coated, and it becomes possible to perform a highly sensitive and highly reproducible test.
  • the number of types of probes arranged on the DNA chip is preferably 500 or less, preferably 250 or less, more preferably 100 or less, per DNA chip. By limiting the number (type) of probes arranged in this way to some extent, it becomes possible to detect target oral bacteria with higher sensitivity.
  • the type of probe is distinguished by the base sequence. Therefore, even if the probes are derived from the same gene, even if one base sequence is different, it is specified as a different type.
  • the method for detecting the bacterial gene in order to measure the amount of oral bacteria is, for example, a method comprising the following steps.
  • (I) A step of extracting a nucleic acid in a sample using an intraoral sample collected from a subject as a sample (Ii) contacting the extracted nucleic acid with the oligonucleotide probe of the present invention or the DNA chip of the present invention (iii) calculating the amount of bacteria from the signal intensity obtained from the DNA chip
  • step (i) an oral sample collected from a subject or a living organism is used as a specimen, and bacterial nucleic acids contained in the specimen are extracted.
  • the type of intraoral sample to be collected is not particularly limited.
  • saliva, plaque (subgingival plaque, epigingival plaque), tongue coating, oral washing liquid, etc. can be used.
  • Subgingival plaque collected from a location is more preferred.
  • a method for collecting the intraoral sample is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the type of the sample.
  • a method using a commercially available saliva collection kit a method of collecting saliva by using a cotton swab in the mouth, a method of collecting saliva directly in a container, and the like can be mentioned.
  • plaque When plaque is used as an intraoral sample, brushing of tooth surfaces and teeth with a toothbrush, tooth surface abrasion with a cotton swab, interdental abrasion with an interdental brush, paper point method, and the like can be mentioned. Dissolve or suspend the plaque by immersing the toothbrush, swab, interdental brush, or paper point used for collecting the plaque in sterile water and stirring as necessary, and use the resulting solution or suspension as the sample. It can also be. The amount of plaque to be collected is not particularly limited, and may be, for example, one paper point. When tongue coating is used as an intraoral sample, a method of rubbing the tongue surface with a cotton swab can be used. The solution or suspension obtained by dissolving or suspending the cotton swab used for collecting plaques can also be used as a specimen. The amount of tongue coating collected is not particularly limited, and may be, for example, one cotton swab.
  • an oral cleaning liquid as an intraoral sample
  • saliva is collected in a container together with the oral cleaning liquid or water, and the obtained solution is used as a specimen.
  • the mouth washing liquid include sterilized physiological saline.
  • the nucleic acid extraction of the bacteria which exist in the obtained intraoral sample is performed.
  • the extraction method is not limited, and a known method can be used.
  • an automatic extraction method using an instrument, a method using a commercially available nucleic acid extraction kit, a method of extracting phenol after proteinase K treatment, a method of using chloroform or a simple extraction method include a method of heating and dissolving a sample. In particular, it is possible to proceed to the next step without extracting the nucleic acid from the specimen.
  • the nucleic acid obtained from the specimen may be brought into contact with a DNA chip or the like as it is, or a desired base sequence region may be amplified by PCR or the like, and the amplified fragment may be brought into contact with a DNA chip or the like.
  • the region to be amplified using the obtained nucleic acid as a template is a site encoding a nucleic acid region containing the base sequence of the oligonucleotide used in the probe or DNA chip used in the present invention.
  • the desired region to be amplified is not limited, and can be obtained by amplifying many kinds of mixtures at once using the base sequence of the highly conserved region regardless of the species of oral bacteria.
  • the sequence for such amplification may be experimentally isolated, purified, analyzed based on the base sequence of the isolated polynucleotide, and determined based on the sequence, It may be determined by In Silico by searching a known base sequence in various databases and taking an alignment.
  • the database of nucleic acids or amino acids is not particularly limited. For example, DDBJ (DNA Data Bank of Japan), EMBL (European Molecular Biology Laboratories, EMBL nucleic acid gene), NCBI (National Center for Biotechnology Information) Taxonomic database and the like can be used.
  • the desired site to be amplified is preferably a ribosomal RNA (16S rRNA) gene in the chromosomal DNA of the oral bacteria.
  • Preferred examples of PCR primers that can be used for amplification of the region include SEQ ID NOs: 1 and 2 in Table 1-2. Amplification of nucleic acid by the PCR method can be performed according to a conventional method.
  • the nucleic acid extracted in this step and the amplified fragment thereof can be appropriately labeled and used in the detection process after hybridization.
  • a method of labeling the end of a PCR primer with various reporter dyes a method of incorporating a reactive nucleotide analog during a reverse transcription reaction, a method of incorporating a biotin-labeled nucleotide, and the like can be considered.
  • it can be labeled with a fluorescent labeling reagent after preparation.
  • the fluorescent reagent for example, various reporter dyes (for example, Cy5, Cy3, VIC, FAM, HEX, TET, fluorescein, FITC, TAMRA, Texas red, Yakima Yellow, etc.) can be used.
  • step (ii) the nucleic acid or its amplified fragment obtained in step (i) is brought into contact with the probe or DNA chip used in the present invention.
  • a hybridization solution containing the nucleic acid or the like is prepared, and the solution The nucleic acid or the like therein is bound (hybridized) to the oligonucleotide probe mounted on the DNA chip.
  • the hybridization solution can be appropriately prepared according to a conventional method using a buffer solution such as SDS or SSC.
  • the reaction conditions type of buffer, pH, temperature, etc.
  • the nucleic acid in the hybridization solution can hybridize with the oligonucleotide probe mounted on the DNA chip under stringent conditions.
  • stringent conditions refers to conditions under which cross-hybridization due to a similar sequence is unlikely to occur or nucleic acid cross-hybridized with a similar sequence is dissociated. It means the washing condition of the DNA chip after or after hybridization.
  • the reaction temperature is preferably 35 to 70 ° C., more preferably 40 to 65 ° C., and the time for hybridization is preferably about 1 minute to 16 hours.
  • the composition of the washing solution is preferably 0.24 M Tris ⁇ HCl / 0.24 M NaCl / 0.05% Tween-20, and the temperature during washing is 35 It is preferably -80 ° C or 40-65 ° C, more preferably 45-60 ° C. More specifically, the condition that the salt (sodium) concentration is 48 to 780 mM and the temperature is 37 to 80 ° C. is preferable, and the salt concentration is preferably 97.5 to 390 mM and the temperature is 45 to 60 ° C. Is a condition.
  • the detection intensity is measured for each spot using an apparatus capable of detecting a label such as a nucleic acid bound to the probe.
  • an apparatus capable of detecting a label such as a nucleic acid bound to the probe.
  • various fluorescence detection devices such as CRBIO (manufactured by Hitachi Software Engineering), arrayWoRx (manufactured by GE Healthcare), Affymetrix 428 Array Scanner (manufactured by Affymetrix, Inc.), GenePix
  • the fluorescence intensity can be measured using (Axon Instruments), ScanArray (PerkinElmer), Geno Pearl Reader (Mitsubishi Rayon), or the like.
  • scanning can be performed by appropriately adjusting the laser output and the sensitivity of the detection unit, and in the case of a CCD camera type scanner, the exposure time can be adjusted appropriately.
  • a scan can be performed.
  • the quantification method based on the scan result is performed by quantification software.
  • the quantification software can be performed using the average value, median value, etc. of the fluorescence intensity of the spots. Further, in quantification, it is preferable to make adjustments such as using the fluorescence intensity of a spot not equipped with a probe as the background in consideration of the dimensional accuracy of the spot range of the DNA fragment.
  • step (iii) the amount of bacteria of the detection target species is calculated from the signal intensity obtained by the above procedure.
  • the signal intensity obtained by the above procedure For example, there is a method of showing the signal-to-noise ratio from the signal intensity of the probe and the background signal intensity for detecting the detection target bacteria.
  • a method of obtaining the concentration of the chromosomal DNA from the signal intensities obtained under the respective conditions is preferable.
  • a correction coefficient is calculated for each DNA chip so that the signal intensity of the absolute quantity index probe obtained from the detection of a plurality of DNA chips is constant, and the correction coefficient is calculated for the signal intensity of the bacteria to be detected on each DNA chip. Considering the above, comparison between DNA chips may be performed.
  • Periodontal disease status determination Criteria 1 Among the bacteria contained in saliva as a sample in the oral cavity, the total number of bacteria of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythesis and Treponema denticola is less than 0.01% with respect to the total number of bacteria. The case of 0.01% or more and less than 0.5% with respect to the total number of bacteria is determined as “medium”, and the case with 0.5% or more with respect to the total number of bacteria is determined as “severe”.
  • the case where the total number of bacteria of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythesis, and Treponema denticola is less than 0.1% of the total number of bacteria is “mild”.
  • the case of 0.1% or more and less than 5% with respect to the number of bacteria is determined as “medium”, and the case of 5% or more with respect to the total number of bacteria is determined as “severe”.
  • This criterion is determined based on, for example, a 4-stage caries risk determination (J Health Care Dent. 2000, 2, 4-17) of culture evaluation of Streptococcus mutans using a kit such as a caries risk test manufactured by Ivoclar Vivadent. It was. This culture evaluation is based on the result of visual determination of colonies formed by culturing Streptococcus mutans.
  • Class 0 at less than 100,000 CFU / mL
  • Class 1 at 100,000 CFU / mL or more and less than 500,000 CFU / mL
  • Class 2 at 500000 CFU / mL or more and less than 1000000 CFU / mL
  • Class 3 at 1000000 CFU / mL or more
  • CFU is a unit that forms colonies during culture, and it is known that approximately 1 CFU is 100 genome copies.
  • 1 ml of human saliva contains about 1,000,000,000 genome copies of bacteria. Therefore, based on this numerical value, the case of “class 0” is “low” in this specification, the case of “class 1” is “medium”, the case of “class 2 and 3” in this specification. Then, the above standard of “high” was set.
  • the periodontal disease and caries state determination obtained by the present invention is a determination of a state estimated from the number of bacteria to the last, and does not represent an accurate pathological condition. That is, an accurate diagnosis of a disease state requires a diagnosis by a dentist.
  • the periodontal disease and caries can be easily determined, so that early detection and early treatment of periodontal disease and caries are possible, and prevention thereof is also possible. .
  • the method of B) is not limited as the method of B), but specifically, for example, In the first aspect, i) the amount of specific bacteria in the oral sample from the oral sample collected from the subject, ii) the total amount of bacteria present in the oral sample, or iii) the specific amount A step of measuring both the amount of bacteria and the total amount of bacteria present in the oral sample, and a step of determining the severity of periodontal disease by performing statistical analysis on the obtained measurement results; The method containing is mentioned.
  • the method including the process to do is mentioned.
  • the method includes a step of measuring both the total amount of bacteria present in the cell and a step of determining a risk of worsening periodontal disease based on the ratio of the obtained amount of bacteria.
  • a DNA chip can be used when measuring the amount of oral bacteria from an oral sample collected from a subject, and the DNA chip includes, for example, the following probe (a) and In addition, at least one of the probes (b) and (c) can be mounted.
  • a DNA chip is a general term for a substrate on which probes are arranged. In the present specification, the names of DNA chips, DNA microarrays, and the like are not distinguished from each other but are synonymous.
  • Probes comprising nucleic acids that specifically hybridize to each bacterial gene to be detected
  • B Total amount index probe comprising nucleic acids that hybridize to all bacterial genes
  • C a probe comprising a nucleic acid that specifically hybridizes to one or more kinds of absolute quantity indicators
  • the oral bacteria to be measured are not limited, Bacteria belonging to the genus Porphyromonas, bacteria belonging to the genus Tannerella, bacteria belonging to the genus Treponema, bacteria belonging to the genus Prevotella, bacteria belonging to the genus Campylobacter, bacteria belonging to the genus Fusobacterium, bacteria belonging to the genus Parvimonacus, bacteria belonging to the genus Streptococcus Bacteria belonging to the genus Capnocytophaga, bacteria belonging to the genus Eikenella, bacteria belonging to the genus Actinomyces, bacteria belonging to the genus Velillella, bacteria belonging to the genus Selenomonas, bacteria belonging to the genus Lactobacillus, bacteria belonging to the genus Pseudomonas, Bacteria, Bacteria belonging to lebsiella genus, bacteria belonging to the genus Serratia, bacteria
  • Porphyromonas gingivalis Tannerella forsythia, Treponema denticola, Prevotella intermediatebumactemactiminobetium, Aggregabacteractinumetium, which is considered to be currently associated with periodontal disease.
  • Vincentii Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Fusobacterium nucleatum subsp. animalis, Fusobacterium nucleatum subsp.
  • Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum, Campylobacter rectus, Streptococcus constellatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis it is more preferable to be detected or the like Streptococcus sanguinis and Veillonella parvula, among them More preferably, at least one, preferably two or more of these are to be detected. By measuring and comparing the amount of these bacteria before and after treatment of periodontal disease, the therapeutic effect of periodontal disease can be objectively determined.
  • the amount of bacteria is highly correlated or inversely correlated with clinical information and serves as an index indicating the severity of periodontal disease. Detailed information on the severity of periodontal disease indicating whether there are many high-grade or low-grade bacteria among total bacteria can be obtained.
  • the oral bacteria to be measured when determining the risk of worsening periodontal disease is at least one selected from the group consisting of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia and Treponema denticola, and Fusobacterium nucleatum. Detection of Fusobacterium nucleatum due to growth of Fusobacterium nucleatum before the periodontal disease, which is clinical information, becomes deeper and the periodontal disease worsens, or before the “Red Complex”, which is the previous stage, grows. Is an index of early periodontal disease.
  • the bacterial quantity of Fusobacterium nucleatum is determined based on the total amount of three types of Porphyromonas gingivalis, “Tannella forsythia” and “Treponedenticola”, which are “Red Complex”.
  • the oligo DNA that can be used as the probe (a) is capable of hybridizing with a base sequence in a specific region of a base sequence of a nucleic acid derived from oral bacteria.
  • the nucleic acid may be any of DNA and RNA including chromosomal DNA and plasmid DNA, but is not limited, but is preferably chromosomal DNA.
  • the oligonucleotide used as a probe in the present invention is capable of hybridizing with the base sequence of the 16S rRNA gene in the chromosomal DNA of the oral bacteria.
  • the probe that can be used in the present invention, it is preferable to select a region that has a base sequence specific to various oral bacteria to be detected and design the base sequence of the region.
  • Tm melting temperature
  • Specific base sequences corresponding to each species of oral bacteria can be found by means of, for example, taking multiple alignments and designing probes in different regions between species.
  • the algorithm for taking the alignment is not particularly limited, but as a more specific analysis program, for example, a program such as ClustalX1.8 can be used.
  • the parameters for the alignment may be executed in the default state of each program, but can be adjusted as appropriate according to the type of program.
  • the specificity of the probe may be one that collectively detects bacteria of the same genus based on the specificity at the genus level, or may be the specificity that can be detected at the individual species level, Appropriate judgment can be made according to the purpose of bacteria detection.
  • the total amount index probe is a probe intended to capture all bacteria in the specimen that can be amplified with a specific primer pair. In detecting bacteria, what percentage of the total number of bacteria, including non-detected bacteria, is, and how much bacteria are present in the sample in the first place It is also extremely important to detect the total amount of bacteria from the viewpoint.
  • Non-detection target bacteria can be understood as the sum (total) of bacteria whose existence and type are known but not required to be detected, and bacteria whose presence and type are unknown.
  • the total amount of bacteria for example, it is possible to measure the total amount of bacteria independently of the DNA chip, but by mounting a probe that is an indicator of the total amount of bacteria in the DNA chip. The ease of operation is improved.
  • a base sequence common to many types of bacteria may be used from among the base sequences amplified by the primer pair. When such a sequence is not found, a plurality of relatively common sequences may be designed, and the total amount index probe may be determined by comprehensively judging them.
  • the total amount index probe is preferably a probe that hybridizes to a nucleic acid derived from a bacterium contained in a specimen, and more specifically, a plurality of types of bacteria to be detected among the base sequences amplified by the specific primer pair.
  • This probe contains a common base sequence. Examples of total amount index probes are shown in Table 2-1 (SEQ ID NO: 159). Since the total amount index represents the total amount of amplification products specific to individual bacterial species, the amount is generally large, and the target signal intensity may exceed the detectable signal intensity range. .
  • the amount of sample to be subjected to hybridization is desirable to limit.
  • the Tm value of the probe is lowered. Specifically, a method of reducing the GC content or shortening the probe sequence length itself can be considered.
  • the absolute quantity index probe is a probe that hybridizes only to the nucleic acid of the absolute quantity index.
  • the absolute quantity index is a nucleic acid added to a sample in a certain amount before an amplification reaction or a hybridization reaction.
  • the absolute quantity index is a nucleic acid that can be reliably amplified when a normal amplification reaction is performed, and serves as a so-called positive control. Therefore, if a probe specific to the absolute quantity index is mounted on the DNA chip, it can be confirmed from the detection result whether the amplification reaction, hybridization, or the like has been appropriately performed.
  • the signal intensity of the absolute quantity index obtained from a plurality of DNA chips should be constant, and when the amplification efficiency or hybridization efficiency slightly increases or decreases, A correction factor can be calculated by comparing the signal intensities. In a plurality of DNA chips, the corrected signal intensity can be compared.
  • probes specific to each bacterium are shown in Table 2-1 (SEQ ID NOs: 93 to 158).
  • Examples of absolute quantity index probes are shown in Table 2-1 (SEQ ID NOs: 160 to 174), and examples of absolute quantity indices are shown in Table 2-2 (SEQ ID NOs: 175 to 189). If an absolute quantity index is added before the amplification reaction, it is detected by hybridization that it is a nucleic acid amplified by a specific primer pair, that is, possesses a base sequence complementary to the primer pair. For this purpose, it is necessary to possess a base sequence that is not possessed by either the detection target bacteria or the non-detection target bacteria.
  • the specific primer means that the sequence to be amplified is limited, and the primer pair is not necessarily one pair.
  • a multiplex method using two or more primer pairs can be applied as necessary. Examples of primer pairs are shown in Table 2-3.
  • Bacterial amplification primer pairs SEQ ID NOs: 192 to 204
  • absolute quantity index primer pairs SEQ ID NOs: 190 and 191
  • variable region showing the diversity of bacteria to be analyzed
  • a highly conserved universal primer design region is selected before and after the selected variable region
  • a primer sequence is designed.
  • the variable region used as object is not limited, 16S rRNA gene which all the bacteria have among genome sequences etc. are mentioned. Of the 16S rRNA gene, it is desirable to target the full length or one or more regions of the variable region V1-V9. More preferably, the variable region V3-V4 is targeted.
  • a database that acquires a wide range of bacterial genome sequences is used. Specific examples include RDP, NCBI, KEGG, and MGDB.
  • the designed universal primer sequence is input to the Probe Match of the RDP database.
  • the number of exact matches in Total search is obtained. The closer the number of perfect matches is to Total Search, the higher the coverage.
  • “Strain” may select Type.
  • Source may select Isolates.
  • the specific primer is preferably a DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NOs: 193 to 198 and SEQ ID NOs: 201 to 204 (or a base sequence complementary to the base sequence). These primers are preferred because they have higher sequence homology to periodontal disease bacteria than existing primers.
  • the specific primer is more preferably a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 193 to 198 and 203 to 204, more preferably SEQ ID NOs: 197 to 198 and 203 to 204, particularly preferably SEQ ID NOs: 198 and 204 (or the nucleotide sequence).
  • DNA consisting of a complementary base sequence Based on the above evaluation, the DNA consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 193 to 198 and 203 to 204 (or base sequences complementary to the base sequences) has a sequence homology of 100% with respect to the periodontal disease bacteria group. It is confirmed that.
  • a DNA primer pair consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 198 and 204 (or a base sequence complementary to the base sequence) has a homology of 100 between the primer sequence and the genomic DNA sequence of the periodontal disease bacteria group. %, And the melting temperature (Tm) of the primer pair and the GC content conditions are preferred. Generally, when designing a primer pair, it is necessary that the melting temperature (Tm) is close and the secondary structure is difficult to form.
  • the absolute quantity index may be, for example, a nucleic acid standard for quantitative analysis developed by AIST or may be newly designed.
  • EXCEL software “manufactured by MICROSOFT”
  • an integer from 1 to 4 is randomly generated (X is an arbitrary number) and connected to generate 1
  • X is an arbitrary number
  • sequences only those sequences in which the sum of G and T is the same as the sum of A and T are extracted, and the extracted sequences are subjected to a Blast search against a database such as NCBI's GenBank to obtain nucleic acids derived from organisms.
  • a database such as NCBI's GenBank
  • sequence can be lengthened by connecting suitably, and it can also be partially removed and shortened.
  • the amplification product of the detection target bacteria is about 500 bp
  • the amplification product of the absolute quantity index is desirably about 300 bp to about 1000 bp.
  • the amplification product derived from the absolute index is designed to be an amplification product having a length different from that of the detection target bacteria. It is also possible to detect at a position different from that of the band and confirm the success or failure of the amplification reaction before hybridization.
  • Such stringency conditions include, for example, hybridization under conditions of 50 to 60 ° C. under tight conditions, and hybridization under conditions of 30 to 40 ° C. under mild conditions.
  • Examples of stringent conditions in hybridization conditions include, for example, “0.24M Tris ⁇ HCl / 0.24M NaCl / 0.05% Tween-20, 40 ° C.”, “0.24M Tris ⁇ HCl / 0.
  • More stringent conditions such as “24M NaCl / 0.05% Tween-20, 37 ° C.”, “0.24M Tris ⁇ HCl / 0.24M NaCl / 0.05% Tween-20, 30 ° C.” “0.24M Tris ⁇ HCl / 0.24M NaCl / 0.05% Tween-20, 50 ° C.”, “0.24M Tris ⁇ HCl / 0.24M NaCl / 0.05% Tween-20, 55 ° C.”, “ 0.06M Tris.HCl / 0.06M NaCl / 0.05% Tween Mention may be made of 20,60 °C "conditions such as. More specifically, the probe was added and kept at 50 ° C.
  • the length of the probe used in the present invention is not limited, but is preferably 10 bases or more, more preferably 16 to 50 bases, and further preferably 18 to 35 bases. If the probe length is appropriate (within the above range), nonspecific hybridization (mismatch) can be suppressed and used for specific detection.
  • Tm means a temperature at which 50% of an arbitrary nucleic acid strand hybridizes with its complementary strand, and in order to hybridize a template DNA or RNA and a probe to form a double strand, the hybridization temperature Need to be optimized. On the other hand, if this temperature is lowered too much, non-specific reactions are likely to occur, so the temperature is preferably as high as possible.
  • the Tm of the nucleic acid fragment to be designed is an important factor for hybridization.
  • probe design software can be used for confirmation of Tm.
  • software that can be used in the present invention include Probe Quest (registered trademark; Dynacom).
  • Tm can be confirmed by calculating it by itself without using software. In that case, a calculation formula based on the nearest neighbor method, the Wallance method, the GC% method, or the like can be used.
  • the average Tm is preferably about 35 to 70 ° C. or 45 to 60 ° C.
  • Other conditions that allow specific hybridization as a probe include the GC content and the like, which are well known to those skilled in the art.
  • the nucleotide constituting the probe used in the present invention may be any of DNA and RNA or PNA, and may be a hybrid of two or more of DNA, RNA and PNA.
  • Specific examples of the probe used in the present invention preferably include those containing the following DNA base sequences (d) or (e).
  • the sequences shown in Table 2-1 SEQ ID NOs: 93 to 174 can be used as probes. It is preferable to use at least two sequences selected from the base sequences shown in Nos. 1 to 82.
  • it may be a complementary sequence of at least two sequences selected from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 93 to 174, and is substantially the same as at least two sequences selected from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 93 to 174.
  • substantially identical means that it specifically hybridizes under stringent conditions to the sequences shown in SEQ ID NOs: 93 to 174 or complementary sequences.
  • SEQ ID NOs: 97, 100, 121, 122, 125, and 130 are preferable in that hydrogen bonding with the sample-derived DNA is promoted by increasing the base length of the probe sequence and improving the melting temperature (Tm).
  • SEQ ID NOs: 121, 122, 129, and 130 are preferable in that a plurality of base sequences are set in order to correspond to a single nucleotide polymorphism with reference to genomic DNA sequences of a plurality of bacterial strains to be detected. .
  • SEQ ID NOs: 120, 152, and 155 are preferable in that a region with higher specificity is selected again with reference to the genomic DNA sequence of the bacterium to be detected. These primers are preferred because they have higher sequence homology to periodontal disease bacteria than existing primers.
  • Capnocytophaga spp. Probe 1 shows the amount of bacteria combined with Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga sploisa, etc., and Capnocytophaga spp.
  • the probe 2 indicates the amount of bacteria combined with Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, and the like.
  • the probe for Fusobacterium nucleatum is Fusobacterium nucleatum subsp. Vincentii, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Fusobacterium nucleatum subsp. animalis, Fusobacterium nucleatum subsp.
  • the amount of bacteria combined with nucleatum is shown. Campylobacter spp. Probes 2 and 3 indicate the amount of bacteria combined with Campylobacter rectus, Campylobacter showere and the like.
  • the DNA of (e) is a DNA comprising the various DNAs of (d) or a complementary base sequence thereof, or a fragment thereof, which is used as a probe, colony hybridization, plaque hybridization, and Southern. It can be obtained from a cDNA library or a genomic library by performing a known hybridization method such as blotting. A library prepared by a known method may be used, or a commercially available cDNA library or genomic library may be used, and is not limited. For the detailed procedure of the hybridization method, the same one as described above can be referred to.
  • the hybridizing DNA is preferably a base sequence having at least 60% homology with the DNA base sequence of (d) above, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, More preferably, it is 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the probe used in the present invention can be prepared by, for example, chemical synthesis using a normal oligonucleotide synthesis method (purification is performed by HPLC or the like). Such a probe can be designed by, for example, Probe Quest (registered trademark: manufactured by Dynacom). Moreover, the probe of the present invention may contain an additional sequence such as a tag sequence, for example. In the method of the present invention, the base sequence of the nucleic acid possessed by the oral bacteria to be detected does not have to be the base sequence itself, and a part of the base sequence has been mutated due to deletion, substitution, insertion, etc. It may be a thing.
  • the base sequence of the nucleic acid to be detected is a mutant gene that hybridizes with a sequence complementary to the base sequence under stringent conditions and has functions and activities derived from the respective base sequences.
  • the probe can also be designed based on the base sequence of such a mutant gene.
  • the “stringent conditions” may be the same conditions as described above.
  • DNA chip for detecting bacterial genes in the oral cavity used for measuring the amount of oral bacteria can be used in the method of the present invention.
  • a plurality of nucleotide probes are arranged on a base serving as a support.
  • any form such as a flat plate (glass plate, resin plate, silicon plate, etc.), rod shape, or bead can be used.
  • a predetermined probe can be fixed for each type on the flat plate with a predetermined interval (see, for example, spotting method; Science 270, 467-470 (1995)). .
  • a DNA chip obtained by fixing a predetermined probe to each hollow fiber for each type, converging and fixing all the hollow fibers, and then repeatedly cutting in the longitudinal direction of the fiber (Hereinafter referred to as “fiber type DNA chip”) can be preferably exemplified.
  • This microarray can be described as a type in which a nucleic acid is immobilized on a through-hole substrate, and is also referred to as a so-called “through-hole type DNA chip” (see Japanese Patent No. 3510882).
  • the method for fixing the probe to the support is not limited, and any binding mode may be used. Moreover, it is not limited to fix
  • a support body can be previously coated with polymers, such as a polylysine, and a probe can also be fixed to the support body after a process.
  • a tubular body such as a hollow fiber
  • the tubular body can hold a gel-like material, and the probe can be fixed to the gel-like material.
  • the fiber type DNA chip which is one form of the DNA chip will be described in detail. This DNA chip can be produced, for example, through the following steps (i) to (iv).
  • a step of embedding the array and manufacturing a block body A step of introducing a gel precursor polymerizable solution containing an oligonucleotide probe into the hollow part of each hollow fiber of the block body to carry out a polymerization reaction and holding the gel-like substance containing the probe in the hollow part
  • the material used for the hollow fiber is not limited, but for example, materials described in JP-A No. 2004-163211 are preferable.
  • the hollow fibers are arranged three-dimensionally so that the lengths in the longitudinal direction are the same (step (i)).
  • a plurality of hollow fibers are arranged in parallel at a predetermined interval on a sheet-like material such as a pressure-sensitive adhesive sheet to form a sheet, and then the sheet is spirally wound (Japanese Patent Laid-Open No. 11-1999). No.
  • the embedded array is filled with a gel precursor polymerizable solution (gel forming solution) containing an oligonucleotide probe in the hollow part of each hollow fiber, and a polymerization reaction is performed in the hollow part (step (iii)). .
  • the gel precursor polymerizable solution is a solution containing a reactive substance such as a gel-forming polymerizable monomer, and the solution can be converted into a gel by polymerizing and crosslinking the monomer.
  • a reactive substance such as a gel-forming polymerizable monomer
  • the solution may contain a polymerization initiator and the like.
  • the block body is cut in a direction intersecting with the longitudinal direction of the hollow fiber (preferably in a direction perpendicular to the hollow fiber) to make a thin piece (step (iv)).
  • the flakes thus obtained can be used as a DNA chip.
  • the thickness of the DNA chip is preferably about 0.01 mm to 1 mm.
  • the block body can be cut by, for example, a microtome and a laser.
  • Preferred examples of the fiber-type DNA chip include a DNA chip (Genopal TM) manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
  • the probes are three-dimensionally arranged in the gel, and the three-dimensional structure can be maintained. Therefore, the detection efficiency is increased compared to a planar DNA chip in which a probe is bound to a slide glass whose surface is coated, and it becomes possible to perform a highly sensitive and highly reproducible test.
  • the number of types of probes arranged on the DNA chip is preferably 500 or less, preferably 250 or less, more preferably 100 or less, per DNA chip. By limiting the number (type) of probes arranged in this way to some extent, it becomes possible to detect target oral bacteria with higher sensitivity.
  • the type of probe is distinguished by the base sequence. Therefore, even if the probes are derived from the same gene, even if one base sequence is different, it is specified as a different type.
  • the method for detecting the bacterial gene in order to measure the amount of oral bacteria is, for example, a method comprising the following steps.
  • (I) A step of extracting a nucleic acid in a sample using an intraoral sample collected from a subject as a sample (Ii) contacting the extracted nucleic acid with the oligonucleotide probe of the present invention or the DNA chip of the present invention (iii) calculating the amount of bacteria from the signal intensity obtained from the DNA chip
  • step (i) an oral sample collected from a subject or a living organism is used as a specimen, and bacterial nucleic acids contained in the specimen are extracted.
  • the type of intraoral sample to be collected is not particularly limited.
  • saliva, plaque (subgingival plaque, epigingival plaque), tongue coating, oral washing liquid, etc. can be used.
  • Subgingival plaque collected from a location is more preferred.
  • a method for collecting the intraoral sample is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the type of the sample.
  • a method using a commercially available saliva collection kit a method of collecting saliva by using a cotton swab in the mouth, a method of collecting saliva directly in a container, and the like can be mentioned.
  • plaque When plaque is used as an intraoral sample, brushing of tooth surfaces and teeth with a toothbrush, tooth surface abrasion with a cotton swab, interdental abrasion with an interdental brush, paper point method, and the like can be mentioned. Dissolve or suspend the plaque by immersing the toothbrush, swab, interdental brush, or paper point used for collecting the plaque in sterile water and stirring as necessary, and use the resulting solution or suspension as the sample. It can also be. The amount of plaque to be collected is not particularly limited, and may be, for example, one paper point. When tongue coating is used as an intraoral sample, a method of rubbing the tongue surface with a cotton swab can be used. The solution or suspension obtained by dissolving or suspending the cotton swab used for collecting plaques can also be used as a specimen. The amount of tongue coating collected is not particularly limited, and may be, for example, one cotton swab.
  • an oral cleaning liquid as an intraoral sample
  • saliva is collected in a container together with the oral cleaning liquid or water, and the obtained solution is used as a specimen.
  • the mouth washing liquid include sterilized physiological saline.
  • the nucleic acid extraction of the bacteria which exist in the obtained intraoral sample is performed.
  • the extraction method is not limited, and a known method can be used.
  • an automatic extraction method using an instrument, a method using a commercially available nucleic acid extraction kit, a method of extracting phenol after proteinase K treatment, a method of using chloroform or a simple extraction method include a method of heating and dissolving a sample. In particular, it is possible to proceed to the next step without extracting the nucleic acid from the specimen.
  • the nucleic acid obtained from the sample may be directly contacted with a DNA chip or the like, or a desired base sequence region may be amplified by PCR or the like, and the amplified fragment may be contacted with the DNA chip or the like, and is not limited.
  • the region to be amplified using the obtained nucleic acid as a template is a site encoding a nucleic acid region containing the base sequence of the oligonucleotide used in the probe or DNA chip used in the present invention.
  • the desired region to be amplified is not limited, and can be obtained by amplifying many kinds of mixtures at once using the base sequence of the highly conserved region regardless of the species of oral bacteria.
  • the sequence for such amplification may be experimentally isolated, purified, analyzed based on the base sequence of the isolated polynucleotide, and determined based on the sequence, It may be determined by In Silico by searching a known base sequence in various databases and taking an alignment.
  • the database of nucleic acids or amino acids is not particularly limited. For example, DDBJ (DNA Data Bank of Japan), EMBL (European Molecular Biology Laboratories, EMBL numeric acidSequenceGardenGibentBudgetGem) NCBI (National Center for Biotechnology Information) Taxonomic Database, etc. can be used.
  • the desired site to be amplified is preferably a ribosomal RNA (16S rRNA) gene in the chromosomal DNA of the oral bacteria.
  • Preferred PCR primers that can be used for amplification of the region include, for example, SEQ ID NOs: 190 to 204 in Table 2-3. Amplification of nucleic acid by the PCR method can be performed according to a conventional method.
  • the nucleic acid extracted in this step and its amplified fragment can be appropriately labeled and used in the detection process after hybridization.
  • a method of labeling the end of a PCR primer with various reporter dyes a method of incorporating a reactive nucleotide analog during a reverse transcription reaction, a method of incorporating a biotin-labeled nucleotide, and the like can be considered.
  • it can be labeled with a fluorescent labeling reagent after preparation.
  • the fluorescent reagent for example, various reporter dyes (for example, Cy5, Cy3, VIC, FAM, HEX, TET, fluorescein, FITC, TAMRA, Texas red, Yakima Yellow, etc.) can be used.
  • various reporter dyes for example, Cy5, Cy3, VIC, FAM, HEX, TET, fluorescein, FITC, TAMRA, Texas red, Yakima Yellow, etc.
  • step (ii) the nucleic acid obtained in step (i) or its amplified fragment is brought into contact with the probe or DNA chip used in the present invention.
  • a hybridization solution is prepared, and nucleic acids and the like in the solution are bound (hybridized) to an oligonucleotide probe mounted on a DNA chip.
  • the hybridization solution can be appropriately prepared according to a conventional method using a buffer solution such as SDS or SSC.
  • the reaction conditions type of buffer, pH, temperature, etc.
  • the reaction conditions are set so that the nucleic acid in the hybridization solution can hybridize with the oligonucleotide probe mounted on the DNA chip under stringent conditions. It can be set appropriately.
  • stringent conditions refers to conditions under which cross-hybridization due to a similar sequence is unlikely to occur or nucleic acid cross-hybridized with a similar sequence is dissociated. It means the washing condition of the DNA chip after or after hybridization.
  • the reaction temperature is preferably 35 to 70 ° C., more preferably 40 to 65 ° C., and the time for hybridization is preferably about 1 minute to 16 hours.
  • the composition of the washing solution is preferably 0.24 M Tris ⁇ HCl / 0.24 M NaCl / 0.05% Tween-20, and the temperature during washing is 35 It is preferably -80 ° C or 40-65 ° C, more preferably 45-60 ° C. More specifically, the condition that the salt (sodium) concentration is 48 to 780 mM and the temperature is 37 to 80 ° C. is preferable, and the salt concentration is preferably 97.5 to 390 mM and the temperature is 45 to 60 ° C. Is a condition.
  • the detection intensity is measured for each spot using an apparatus capable of detecting a label such as a nucleic acid bound to the probe.
  • an apparatus capable of detecting a label such as a nucleic acid bound to the probe.
  • various fluorescence detection devices such as CRBIO (manufactured by Hitachi Software Engineering), arrayWoRx (manufactured by GE Healthcare), Affymetrix 428 Array Scanner (manufactured by Affymetrix, Inc.), GenePix (Axon Instruments), ScanArray (PerkinElmer), Geno Pearl Reader (Mitsubishi Rayon), etc. can be used to measure fluorescence intensity.
  • scanning can be performed by appropriately adjusting the laser output and the sensitivity of the detection unit, and in the case of a CCD camera type scanner, the exposure time can be adjusted appropriately.
  • a scan can be performed.
  • the quantification method based on the scan result is performed by quantification software.
  • the quantification software can be performed using the average value, median value, etc. of the fluorescence intensity of the spots. Further, in quantification, it is preferable to make adjustments such as using the fluorescence intensity of a spot not equipped with a probe as the background in consideration of the dimensional accuracy of the spot range of the DNA fragment.
  • Step (iii) the amount of bacteria of the detection target strain is calculated from the signal intensity obtained by the above procedure.
  • the signal intensity obtained by the above procedure For example, there is a method of showing the signal-to-noise ratio from the signal intensity of the probe and the background signal intensity for detecting the detection target bacteria.
  • a method of obtaining the concentration of the chromosomal DNA from the signal intensities obtained under the respective conditions is preferable.
  • a correction coefficient is calculated for each DNA chip so that the signal intensity of the absolute quantity index probe obtained from the detection of a plurality of DNA chips is constant, and the correction coefficient is calculated for the signal intensity of the bacteria to be detected on each DNA chip. Considering the above, comparison between DNA chips may be performed.
  • the severity of periodontal disease can be determined based on each bacterial amount. In the determination, specifically, the detection pattern of the labeling substance on the DNA chip used for detection is considered to indicate the characteristics of the oral bacteria of the subject. As another determination mode, there is a mode in which a statistical analysis is performed on a detection pattern of a labeling substance on a DNA chip used for detection for a plurality of specimens.
  • Statistic analysis methods include, for example, correlation analysis, hierarchical clustering, and non-hierarchical clustering. More specifically, methods such as Pearson correlation and Cosine coefficient are used as the distance function used in the correlation analysis.
  • examples of hierarchical clustering include a technique such as UPGMA (unweighted-pair group methodic algorithmic averages). By performing cluster analysis using such an analysis technique, it is possible to group subjects, and to determine the analogy of subjects.
  • the results of detection of oral bacteria in a sample are statistically analyzed together with the detection results of samples accumulated so far, and from the similarity, a periodontal disease sample, a periodontal disease initial sample, or a healthy sample It can be classified into groups according to the severity of any of the specimens. As a result of this classification, that is, the amount of bacteria in the specimen, potential disease activity can be suggested. In addition, based on these results, the regression analysis is performed by regarding the amount of bacteria of specific types of bacteria as independent variables, and in the prediction of the corresponding group of periodontal disease severity and the prediction of periodontal pocket depth. Prediction accuracy can also be calculated. According to the first aspect of the method of the present invention, since the severity of periodontal disease can be accurately determined from information of a plurality of bacteria, it is an objective index indicating the severity of periodontal disease.
  • the method for determining periodontal disease treatment effect in the above-described second aspect of the method of the present invention is obtained using the method for detecting an oral bacterial gene described in Section 3 above. This is a method for determining the therapeutic effect of periodontal disease using the detected result of bacteria as an index.
  • the effect of treatment can be objectively determined by clarifying the bacteria that have increased or decreased before and after treatment.
  • the bacteria data after treatment can reveal bacteria that were difficult to reduce by treatment, and can be specifically treated.
  • Treatment refers to treatment generally performed by dentists and dental hygienists at the dental site.
  • basic periodontal treatment includes plaque control (tooth brushing guidance) and calculus removal (scaling / root planing). ) And adjustment of meshing.
  • calculus has penetrated deep into the pocket and cannot be removed.
  • plastic surgeries periodontal plastic surgery.
  • the detection pattern of the labeling substance on the DNA chip used for detection is considered to indicate the characteristics of the oral bacteria of the subject.
  • Examples of statistical analysis methods include t-test and non-parametric method correlation analysis. More specifically, a Student's t test or a Welch's t test in the case of different variances can be used. Using such an analysis technique, it is possible to test the clinical information of the specimen and the significant difference in the amount of bacteria, and to determine the therapeutic effect.
  • the comparison results before and after the treatment are the total bacterial amount, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema Denticola, Campylobacter rectus, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Aggression of non-disease .
  • the therapeutic effect of periodontal disease can be determined from information of a plurality of bacteria, it becomes an objective index of the therapeutic effect of periodontal disease.
  • the method for determining periodontal disease deterioration risk in the aforementioned third aspect of the method of the present invention uses the method for detecting an oral bacterial gene described in Section 3 above.
  • the risk of worsening periodontal disease is determined using the obtained bacterial detection result as an index.
  • the deterioration risk can be monitored by periodically determining one subject.
  • the severity of periodontal disease can be determined.
  • Bacteria of high-grade periodontal disease bacteria are not detected at all or hardly, but in the case of a specimen in which the amount of bacteria of a specific bacteria is significantly high, it is determined that there is a risk of deterioration. Deterioration means that the depth of the periodontal pocket will become deeper in the future, or that the bacterial amount of periodontal disease bacteria with high malignancy will increase.
  • the detection pattern of the labeling substance on the DNA chip used for detection is considered to indicate the characteristics of the oral bacteria of the subject.
  • Example 1-1 Determination of periodontal disease / caries status using saliva samples
  • ⁇ Preparation of DNA> A saliva evaluation test was conducted in cooperation with five healthy adults (men and women in their 20s to 50s). The five subjects were subjects A, B, C, D, and E, and saliva was evaluated. Saliva collection was performed by collecting ⁇ -collect swab RI (Eiken Chemical) in the mouth for 1 minute. ⁇ collect swab RI was immersed in water in a tube and allowed to stand at room temperature for 5 minutes to elute bacterial components. Thereafter, the ⁇ collect swab RI was removed and the tube was centrifuged. DNA was extracted from the obtained pellet using DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN).
  • DNeasy Blood & Tissue Kit QIAGEN
  • DNA was diluted to about 10 pg, PCR was performed with GeneAmp9700 (Applied Biosystems), and amplified and labeled. SEQ ID NOs: 1, 2, 91, and 92 were used as primers.
  • the PCR solution composition (20 ⁇ L system) is as shown in Table 1-3.
  • hybridization reaction solution 48 ⁇ L of 1M Tris-HCl, 48 ⁇ L of 1M NaCl, 20 ⁇ L of 0.5% Tween20, 65 ⁇ L of water
  • Hybridization was performed at 50 ° C. for 2 hours using an automatic hybrid washing apparatus (Mitsubishi Rayon). It was then washed.
  • the probes mounted on the DNA chip used for the measurement are as shown in Table 1-5.
  • “mild” if the total number of at least one of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythesis and Treponema denticola is less than 0.05% of the total number of bacteria, Criteria for determining 0.05% or more to less than 0.5% of the number as “medium” and 0.5% or more of the total number of bacteria as “severe” (in this specification) Based on the determination criterion 2), the determination of the subject A on periodontal disease was “mild”.
  • test subject B the total number of bacteria of the three types of bacteria, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythesis, and Treponema denticola was 0, and the ratio to the total amount of bacteria was 0%. Based on the same criteria as the subject A, it was determined as “mild”.
  • test subject C the total number of bacteria of three types of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythesis, and Treponema denticola was 3577812, and the ratio to the total amount was 1.7%. Based on the same criteria as the subject A, it was determined as “severe”.
  • subject D the total number of bacteria of three types of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythesis and Treponema denticola was 0, and the ratio to the total amount of bacteria was 0%.
  • the total number of bacteria of three types of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythesis and Treponema denticola was 339241, and the ratio to the total amount of bacteria was 0.4%. Based on the same criteria as the subject A, it was determined as “medium”.
  • the number of Streptococcus mutans bacteria was 18862, and the ratio to the total amount of bacteria was 0.01%. Based on the same criteria as the subject A, it was determined as “mild”.
  • the number of Streptococcus mutans bacteria was 0, and the ratio to the total amount of bacteria was 0%. Based on the same criteria as the subject A, it was determined as “mild”.
  • subject D the number of Streptococcus mutans bacteria was 17736, and the ratio to the total amount of bacteria was 0.05%. Based on the same criteria as the subject A, it was determined as “medium”.
  • subject E the number of Streptococcus mutans bacteria was 18808, and the ratio to the total amount of bacteria was 0.02%. Based on the same criteria as the subject A, it was determined as “mild”.
  • the information of bacteria related to periodontal disease and dental caries could be obtained comprehensively by sampling once, and the status could be determined simultaneously from the number of bacteria of periodontal disease and dental caries (Table). 1-7).
  • Subjects A and B were found to have mild periodontal disease and caries.
  • Subject C was found to have severe periodontal disease and mild caries.
  • Subject D was found to have mild periodontal disease and moderate caries.
  • Subject E was found to have moderate periodontal disease and mild caries.
  • ⁇ Preparation of subgingival plaque specimen> A subgingival plaque evaluation test was conducted at Osaka University Dental Hospital with the cooperation of five subjects. These five subjects were subjects F, G, H, I, and J, and subgingival plaque was evaluated. Two subgingival plaques, Absorbent paper points (ISO Color-Coded) # 40 (manufactured by DENSPLY MAILLEFER), were inserted into the periodontal pocket and placed for 30 seconds. Thereafter, a paper point was put into a microtube containing 0.15 mL of sterile distilled water, and vortexed for 20 seconds. Paper points were removed with sterilized tweezers and stored frozen at ⁇ 20 ° C. until detection.
  • ISO Color-Coded Absorbent paper points
  • PCR was carried out using GeneAmp9700 (Applied Biosystems), and amplified and labeled. SEQ ID NOs: 1, 2, 91, and 92 were used as primers.
  • the PCR solution composition (20 ⁇ L system) is as shown in Table 1-8.
  • hybridization reaction solution 48 ⁇ L of 1M Tris-HCl, 48 ⁇ L of 1M NaCl, 20 ⁇ L of 0.5% Tween20, 65 ⁇ L of water
  • Hybridization was performed at 50 ° C. for 2 hours using an automatic hybrid washing apparatus (Mitsubishi Rayon). It was then washed.
  • the probes mounted on the DNA chip used for the measurement are as shown in Table 1-10.
  • the determination of the subject F on periodontal disease was “severe”.
  • subject G the total number of bacteria of three types of bacteria, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythesis, and Treponema denticola was 0, and the ratio to the total amount of bacteria was 0%. Based on the same criteria as the subject F, it was determined to be “mild”.
  • subject H the total number of bacteria of three types of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythesis and Treponema denticola was 0, and the ratio to the total amount of bacteria was 0%. Based on the same criteria as the subject F, it was determined to be “mild”. In the subject I, the total number of bacteria of three types of bacteria, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythesis, and Treponema denticola was 84, and the ratio to the total amount of bacteria was 0.23%.
  • subject F Based on the same standard as subject F, it was classified as “medium”. In subject J, the total number of bacteria of three types of bacteria, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythesis and Treponema denticola was 0, and the ratio to the total amount of bacteria was 0%. Based on the same criteria as the subject F, it was determined to be “mild”.
  • subject G the number of Streptococcus mutans bacteria was 3, and the ratio to the total amount of bacteria was 0.06%. Based on the same standard as subject F, it was determined as “medium”. In subject H, the number of Streptococcus mutans bacteria was 6, and the ratio to the total amount of bacteria was 0%. Based on the same criteria as the subject F, it was determined to be “mild”.
  • subject I the number of Streptococcus mutans bacteria was 0, and the ratio to the total amount of bacteria was 0%. Based on the same criteria as the subject F, it was determined to be “mild”.
  • subject J the number of Streptococcus mutans bacteria was 0, and the ratio to the total amount of bacteria was 0%. Based on the same criteria as the subject F, it was determined to be “mild”.
  • the information of bacteria related to periodontal disease and dental caries could be obtained comprehensively by sampling once, and the status could be determined simultaneously from the number of bacteria of periodontal disease and dental caries (Table). 1-12).
  • Subjects H and J were found to have mild periodontal disease and caries.
  • Subject F was found to have severe periodontal disease and mild caries.
  • Subject G was found to have mild periodontal disease and moderate caries.
  • Subject I was found to have moderate periodontal disease and mild caries.
  • Subgingival plaques were collected from 220 subjects of males and females in their 20s to 70s in the state before periodontal treatment at Osaka University Dental Hospital. Two subgingival plaques, Absorbent paper points (ISO Color-Coded) # 40 (manufactured by DENSPLY MAILLEFER), were inserted into the periodontal pocket and placed for 30 seconds. Thereafter, a paper point was put into a microtube containing 0.15 mL of sterile distilled water, and vortexed for 20 seconds. Paper points were removed with sterilized tweezers and stored frozen at ⁇ 20 ° C. until detection.
  • ISO Color-Coded Absorbent paper points
  • Clinical information was quantified according to the following criteria for all specimens. The following 4 items are indexes widely used in dentistry.
  • Periodontal pocket depth Indicates the distance from the gingival margin to the probe tip when the periodontal probe is inserted into the pocket. The value was expressed in units of 1 mm.
  • Bleeding during probing BOP: indicates the presence or absence of bleeding when the periodontal probe is inserted into the pocket. The case where there was no bleeding was set to 0, and the case where there was bleeding was set to 1.
  • Gingival Index Indicates the degree of inflammation of the gingiva. The case where inflammation was not observed was 0, the case of mild inflammation was 1, the case of moderate inflammation was 2, and the case of severe inflammation was 3.
  • Plaque Index indicates the amount of plaque deposited on the tooth surface adjacent to the gingiva. The case where no plaque was observed was defined as 0, the case where the plaque was not visually recognized but scratched with a probe was 1, the case where the plaque was visually recognized was 2, and the case where a large amount of plaque was observed was defined as 3.
  • PCR PCR was performed with the following reaction solution composition and reaction conditions.
  • the PCR kit was Premix Ex Taq TM Hot Start Version (manufactured by Takara) and GeneAmp9700 (manufactured by Applied Biosystems). Primers having the following sequences were used.
  • the forward primer used was one whose 5 ′ end was labeled with Cy5.
  • ⁇ Reaction solution composition > 2 x Premix Ex Taq (registered trademark) Hot Start Version 10 ⁇ L 4 ⁇ M forward primer (for bacterial amplification) 1 ⁇ L 4 ⁇ M reverse primer (for bacterial amplification) 1 ⁇ L 4 ⁇ M forward primer (for absolute quantity index amplification) 1 ⁇ L 4 ⁇ M reverse primer (for absolute quantity index amplification) 1 ⁇ L Template DNA 5 ⁇ L Absolute quantity index 1 ⁇ L Total 20 ⁇ L
  • ⁇ DNA chip Manufacture of DNA chip for detection of oral bacteria> A through-hole type DNA chip was produced by a method similar to the method described in Example 2-1 of JP-A-2007-74950 (method for detecting methylated DNA and / or unmethylated DNA). However, probes having the sequence information shown in Table 2-4 were used as the mounted oligonucleotide probes.
  • DNA amplification product obtained after PCR 20 ⁇ L 1M Tris-HCl 48 ⁇ L 1M NaCl 48 ⁇ L 0.5% Tween20 20 ⁇ L 64 ⁇ L of water Total 200 ⁇ L
  • the fluorescence intensity of the spot loaded with the probe for detection target bacteria is divided by the background value (the median value of the fluorescence intensity of the spot not loaded with the probe), and the fluorescence intensity derived from hybridization (hereinafter referred to as signal intensity). ) was calculated.
  • the signal-to-noise ratio is represented by a logarithmic function Log2. For all 220 specimens, data of SN ratio from 0 to a maximum value of 10 was obtained for each detection target bacterium. Due to the nature of the logarithmic function, it is detected at 1 or more, and less than 1 is determined to be below the detection limit.
  • each cluster is designated as groups 1, 2, and 3, and the average value and standard deviation of Pd, BOP, GI, PlI and the amount of each bacteria for each group were calculated ( Table 2-5).
  • the treatment plan for periodontal disease changes under the condition that Pd is 6 mm or more, or 4 to 5 mm, or less, so that group 1 is a severe periodontal disease specimen, group 2 is an initial periodontal disease specimen, group 3 is considered to correspond to a healthy sample.
  • clinical information and bacteria detection items were roughly classified into three clusters as shown in FIG.
  • the index which shows the severity of periodontal disease from the result of FIG. 3 was found as follows. In the heat map of FIG. 3, the numerical value of each item is displayed from green to red (light to dark) from the lowest.
  • Group A consists of clinical information and “Red Complex”, which includes the following: It had been.
  • the item of group A was detected highest in the samples of group 1, and the amount of detection decreased as it became group 2 or group 3.
  • the bacterial amount of the seven bacteria is information that is highly correlated or inversely correlated with clinical information, and can be said to be an index indicating the severity of periodontal disease.
  • the detection amount of Fusobacterium nucleatum was detected as high as that of Group 1, but subgroup 2-1 was found with low clinical information PD and numerical values of “Red Complex”.
  • the amount of Fusobacterium nucleatum is the index of deterioration risk relative to the sum of the amount of Porphyromonas gingivalis, the amount of Tannerella forsythia, and the amount of Treponema denticola.
  • Group B was composed of bacteria with relatively low malignancy.
  • Streptococcus spp. 3, Streptococcus intermedius and Veillonella parvula were detected low in the group 1 specimen, and the detection amount was high in the group 2 and group 3. That is, as the clinical information value decreases, Streptococcus spp. , Streptococcus intermedius, and Veillonella parvula, the amount of bacteria has increased, which can be said to be an indicator of the severity of periodontal disease.
  • the information of each bacterial amount was regarded as an independent variable, and regression analysis was performed using the severity grouping as an objective variable.
  • the coefficient of determination approached 1 in the case of 3 bacterial species, 6 bacterial species, and even 8 bacterial species as compared with the information of 1 bacterial species.
  • the information on each bacterial amount was regarded as an independent variable, and regression analysis was performed using the periodontal pocket value as an objective variable.
  • the accuracy of prediction of clinical information such as prediction of severity groups and periodontal pockets increased by increasing the number of bacteria to be measured.
  • ⁇ DNA chip Manufacture of DNA chip for detection of oral bacteria> A through-hole type DNA chip was produced by a method similar to the method described in Example 2-1 of JP-A-2007-74950 (method for detecting methylated DNA and / or unmethylated DNA). As the mounted oligonucleotide probe, a probe having the sequence information shown in Table 2-7 was used. PCR, hybridization to a DNA chip, and detection were performed in the same manner as in Example 2-1.
  • ⁇ Result> Subtract the background value (the median value of the fluorescence intensity of the spot without the probe and three times the standard deviation) from the fluorescence intensity of the spot loaded with the probe for the detection target bacteria, and calculate the signal intensity derived from hybridization. Calculated. Subsequently, the signal intensity of the absolute amount index probe was compared with a plurality of DNA chips, the correction coefficient of each DNA chip was obtained, and the signal intensity of the detection target bacteria was corrected so that comparison was possible. Then, each bacterial amount calculation coefficient determined in advance was multiplied, and the bacterial amount of each detection target was calculated by the number of genome copies.
  • the background value the median value of the fluorescence intensity of the spot without the probe and three times the standard deviation
  • Each bacterial quantity calculation coefficient was obtained by measuring the signal intensity when each bacterial-derived genomic DNA was detected and preparing a calibration curve, and obtaining a coefficient for back-calculating each bacterial quantity from the signal intensity of each bacteria. Finally, the number of bacteria per paper point was calculated by multiplying the dilution rate of the detection specimen used for the PCR template. Based on the above calculation, data on the number of bacteria from 0 to 10 to the 7th power was obtained for all 130 samples for each of the detection target bacteria. Subsequently, the average value and standard deviation of each item before and after treatment were calculated (Table 2-8).
  • the amount of bacteria before and after treatment particularly Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponedentola, Fusobacterium nucleatum, Campylobacter rectus, Streptococcus sp. It was found that the therapeutic effect of periodontal disease can be determined by comparing the amount of bacteria.
  • the tartar removal rate in molars is reported to be 91% when Pd is 1 to 3 mm, 61% when Pd is 4 to 6 mm, and 37% when Pd is 7 mm or more, even for specialists.
  • the amount of “Red Complex” bacteria decreased in about 90% of cases, and it can be said that this study was a good test as long as there was no contradiction even when compared with the reported examples.
  • the universal primer of the present invention comprises the following sequences. 1 above. V3 and V4 were selected as variable regions of 16S rRNA according to the procedure in the section. A highly conserved universal primer design region was selected before and after the V3 and V4 regions, and the sequences shown in SEQ ID NOs: 192 to 204 were designed.
  • For the designed universal primer sequence use the Probe Match function of the Ribosomal Database Project (RDP) database.
  • RDP Ribosomal Database Project
  • Strain selects Type Source selects ISolates, and extracts each score “Hits” did. The completeness was evaluated by the value of the score “Hits” with respect to the total number. However, sample no. In combinations 1 to 5, the homology between the genomic DNA of the periodontal disease bacteria and the primer sequence is 100%. In the combinations of 6 to 8, the above homology was not 100%.
  • PCR RNA-derived genomic DNAs purchased from ATCC were used as measurement targets.
  • PCR was carried out under the following reaction solution composition and reaction conditions.
  • the PCR kit was a Premix Ex Taq TM Hot Start Version (manufactured by Takara), and the amplification reaction was performed by GeneAmp9700 (manufactured by Applied Biosystems). Primer conditions were as shown in Table 2-10.
  • the forward primer used was labeled at the 5 ′ end with Cy5 to label the end of the amplified product.
  • ⁇ Reaction solution composition > 2 x Premix Ex Taq (registered trademark) Hot Start Version 10 ⁇ L 4 ⁇ M forward primer (for bacterial amplification) 1 ⁇ L 4 ⁇ M reverse primer (for bacterial amplification) 1 ⁇ L Template DNA 5 ⁇ L Absolute quantity index 1 ⁇ L 2 ⁇ L of water Total 20 ⁇ L
  • ⁇ DNA chip Manufacture of DNA chip for detection of oral bacteria> A through-hole type DNA chip was produced by a method similar to the method described in Example 2-1 of JP-A-2007-74950 (method for detecting methylated DNA and / or unmethylated DNA). However, the oligonucleotide probe used was a probe having the sequence information shown in Table 2-11.
  • DNA amplification product obtained after PCR 20 ⁇ L 1M Tris-HCl 48 ⁇ L 1M NaCl 48 ⁇ L 0.5% Tween20 20 ⁇ L 64 ⁇ L of water Total 200 ⁇ L
  • Example 2-3 Cy5-Universal16S-FWD6 and Universal RVS4 2016 score “Hits” relative to the total number was higher than Cy5-Universal16S-FWD and Universal RVS2 2014.
  • the results were consistent with the results of improvement in the ability to detect bacterial genomic DNA of Cy5-Universal16S-FWD6 and Universal RVS4 2016.
  • the DNA probe for bacterial detection of the present invention is intended for the sequences of SEQ ID NOs: 97, 100, 120, 121, 122, 129, 130, 152, and 155.
  • V3 and V4 were selected as variable regions of 16S rRNA. Among the V3 and V4 regions, a sequence that each bacterium specifically has was selected. When the specificity was already sufficient, a sequence that improved Tm was selected. In addition, when a bacterial strain has a polymorphic sequence, a plurality of sequences were set in consideration of this point.
  • PCR RNA-derived genomic DNAs purchased from ATCC were used as measurement targets.
  • PCR was carried out under the following reaction solution composition and reaction conditions.
  • the PCR kit was a Premix Ex Taq TM Hot Start Version (manufactured by Takara), and the amplification reaction was performed by GeneAmp9700 (manufactured by Applied Biosystems). Primer conditions were as follows. The forward primer used was labeled at the 5 ′ end with Cy5 to label the end of the amplified product.
  • ⁇ Reaction solution composition > 2 x Premix Ex Taq (registered trademark) Hot Start Version 10 ⁇ L 4 ⁇ M forward primer (for bacterial amplification) 1 ⁇ L 4 ⁇ M reverse primer (for bacterial amplification) 1 ⁇ L Template DNA 5 ⁇ L Absolute quantity index 1 ⁇ L 2 ⁇ L of water Total 20 ⁇ L
  • ⁇ DNA chip Manufacture of DNA chip for detection of oral bacteria> A through-hole type DNA chip was produced by a method similar to the method described in Example 2-1 of JP-A-2007-74950 (method for detecting methylated DNA and / or unmethylated DNA). However, a DNA microarray containing the sequences of SEQ ID NOs: 95, 97, 99, 100, 120, 122, 123, 124, 127, 129, 130, 151, 152, 154, 155, 159 is prepared as a bacterial probe. did.
  • DNA amplification product obtained after PCR 20 ⁇ L 1M Tris-HCl 48 ⁇ L 1M NaCl 48 ⁇ L 0.5% Tween20 20 ⁇ L 64 ⁇ L of water Total 200 ⁇ L
  • SEQ ID NO: 1 to 206 Synthetic nucleic acid

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Abstract

簡便な方法で、歯周病及びう蝕の状態を判定することができる方法や、口腔内細菌検出により歯周病の重症度、治療効果、悪化リスクを判定することができる方法等を提供する。本発明は、例えば、被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中に存在する細菌量を測定することにより、歯周病及び／又はう蝕の状態を判定する、口腔内検査方法である。

Description

口腔内検査方法
　本発明は、歯周病及び／又はう蝕の状態を判定する口腔内検査方法等に関する。
　口内の２大疾患である歯周病及びう蝕（う蝕）は、複数の細菌が関与する細菌感染症である。
　歯周病は原因細菌（細菌因子）、免疫（宿主因子）及び生活習慣が関与して進行する多因子疾患であるが、その発症には、必ず歯周病原性細菌が関与する。

　歯周病原性細菌としては、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ等が報告され（非特許文献１及び２）、その中でもＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３菌種は「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」と呼ばれ、慢性歯周炎の原因菌として重要視されている。「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」が存在すると歯周病の悪性度が高くなることが知られており、「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」を構成する細菌は臨床上重要な細菌とされている。
その他、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓは侵襲性歯周炎の原因菌として、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａは思春期性あるいは妊娠性歯周炎の原因菌として報告されている（非特許文献１及び２）。
　歯周病の細菌検査として、プラークあるいは唾液中の”Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ”の３種類の細菌を合計した値と歯周病の状態（進行度）の関連が報告されている。具体的には、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの少なくとも１種の細菌数の合計が、総菌数に対して０．５％未満の場合を「低」、総菌数に対して０．５％以上５％未満の場合を「中」、総菌数に対して０．５％以上の場合を、「高」であると判定する（非特許文献３）。
　う蝕は、原因細菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓが知られており、この原因細菌が糖類を代謝することにより乳酸を産生し、この結果、口内環境が酸性になり、エナメル質の脱灰が起こることが知られている。
　う蝕の細菌検査としては、ミュータンス連鎖球菌群と乳酸杆菌を培養して検査するキットが市販されており、診断の一つの材料として利用されている。培養した結果から、目視で、およそのコロニー数として判定する。
　培養評価では、１０００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス０」、１０００００ＣＦＵ／ｍＬ以上５０００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス１」、５０００００ＣＦＵ／ｍＬ以上１００００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス２」、１００００００ＣＦＵ／ｍＬ以上で「クラス３」と分類されている。
　歯周病又はう蝕の原因菌の細菌検査法としては、顕微鏡による観察法、培養法、酵素活性法、免疫学的手法、ＤＮＡプローブ法、ＰＣＲ法、ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ法がある。
　歯周病又はう蝕のどちらか一項目に関連し、細菌数を算出する方法はこれまでにも多く報告されている。たとえば、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、唾液中におけるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ及び／又はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｏｒｓｙｔｈｕｓの菌体数を検出する方法が挙げられる（特許文献１）。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、総連鎖球菌の菌数に対するミュータンス連鎖球菌の比率を算出するなどがあげられる（特許文献２）。

　ところで、歯周病原性細菌数を算出する方法としては、たとえば、培養法、リアルタイムＰＣＲ、次世代シーケンサー、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法が報告されている。より詳細には、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、唾液中におけるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ及び／又はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｏｒｓｙｔｈｕｓの菌体数を個別に検出する報告もある（特許文献３及び４）。

　また、細菌叢のゲノムＤＮＡを回収して制限酵素処理し、断片化されたＤＮＡの情報から細菌叢を、パターンの類似度を指標として認識するＴ－ＲＦＬＰ法も報告されている（特許文献５）。この報告によれば、歯科臨床指標と相関のある細菌叢由来のパターンが特定された。しかしながら、個々の具体的な細菌数の情報は含まれておらず、それ以上の解釈には至っていなかった。Ｔ－ＲＦＬＰ法は、細菌群集の構成をピークパターンとして表すことができ容易に多検体の比較解析が可能であるが、一方で、各ピークが必ずしも１細菌種に由来しないことから、細菌群集構成の把握は困難である（非特許文献４）。
また、総細菌を検出する方法として、各微生物間において保存性の高い領域を選択したユニバーサルプライマーを利用した報告もある（特許文献６～８）。
　ＤＮＡマイクロアレイの例では、検体調製のＰＣＲの工程において１組のユニバーサルプライマーを設定して、口腔内細菌２０種類を検出した報告がある（非特許文献５～８）。
　これまで、「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」の少なくとも１種類の細菌数を測定し、歯周病重症度の指標とするような例もあった。しかし、歯周病は複数の細菌が原因となる疾患であるため、限られた細菌の測定では、十分なエビデンスにならないばかりか、歯周病の重症度又は原因細菌を見過ごすことも想定される。
　また、歯周病の治療効果の判断指標は、歯科医師の経験に基づいて取得される臨床情報によるものが基本であり、ほとんどの場合において、細菌が除去されたことまでは、確認されていない。
　さらに、歯周病の初期段階における歯周病悪化の指標はなかった。したがって、多くの患者が歯周病に罹患したと気付づく頃には既に歯周病は進行しており、歯周病の症状に気づいてからその治療を開始したとしても、その治療が効果を奏さないことが多いため、歯周病の悪化に関して効果的な予測方法も求められている。
特許第４２５２８１２号 特開２００８－２０６５１６号公報 特開２００４－２２９５３７号公報 国際公開第２００２／０１０４４４号 特開２０１１－１９３８１０号公報 国際公開第０３／１０６６７６号 特表２００４－５０４０６９号公報 特開２００７－０６８４３１号公報
Ｓｏｃｒａｎｓｋｙ，Ｓ．Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３７，１４２６－３０，１９９９ 細菌検査を用いた歯周治療のコンセプト　医学情報社　編著：三辺正人、吉野敏明、Ｐ．３、平成１７年６月発行 歯周疾患者における抗菌療法の診療ガイドライン　日本歯周病学会編集 常在細菌叢が操るヒトの健康と疾患　羊土社　編集：大野博司、服部正平　Ｐ．９７、２０１４年３月発行 Ｅｂｅｒｈａｒｄ，Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｏｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２００８；２３：２１－８． Ｔｏｐｃｕｏｇｌｕ，Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｐｅｄｉａｔｒ　Ｄｅｎｔ　２０１３；３８：１５５－６０． Ｔｏｐｃｕｏｇｌｕ，Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎａｅｒｏｂｅ　２０１５；３５：３５－４０． Ｈｅｎｎｅ，Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｏｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　２０１４；６：２５８７４．

　そこで、本発明は、簡便な方法で、歯周病及び／又はう蝕の状態を判定することができる方法を提供することを目的とする。
　本発明は、詳細に口腔内細菌を検出することにより、歯周病の重症度、歯周病の治療効果、又は歯周病の悪化リスクを判定することができる方法などを提供することを目的とする。

　本発明者は、前記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、口腔内試料中に存在する細菌の総菌数に対する特定の細菌数の割合を求めることにより、歯周病及び／又はう蝕の状態を判定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。　また、本発明者は、口腔内試料中に存在する特定の細菌数を求めることにより、歯周病の重症度、歯周病の治療効果、歯周病の悪化リスクなどを判定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中に存在する細菌量を測定することにより、歯周病及び／又はう蝕の状態を判定する、口腔内検査方法。
（２）口腔内試料中に存在する細菌の総菌数に対する特定の細菌の菌数の割合を求めることにより、歯周病及び／又はう蝕の状態を判定する、前記（１）記載の方法。
（３）口腔内試料として唾液を用いる場合、唾液中に存在する細菌のうち、
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａからなる群から選ばれる少なくとも１種類の細菌の菌数の合計が、
総菌数に対して０．０１％未満の場合を、歯周病の症状が「軽度」、
総菌数に対して０．０１％以上０．５％未満の場合を、歯周病の症状が「中程度」、
総菌数に対して０．５％以上の場合を、歯周病の症状が「重度」
であると判定する、前記（２）記載の方法。
（４）口腔内試料として唾液を用いる場合、唾液中に存在する細菌のうち、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの菌数が、
総菌数に対して０．０５％未満の場合を、う蝕の症状が「軽度」、
総菌数に対して０．０５％以上２．５％未満の場合を、う蝕の症状が「中程度」、
総菌数に対して２．５％以上の場合を、う蝕の症状が「重度」
であると判定する、前記（２）記載の方法。
（５）口腔内試料としてプラークを用いる場合、プラーク中に存在する細菌のうち、
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａからなる群から選ばれる少なくとも１種類の細菌の菌数の合計が、
総菌数に対して０．１％未満の場合を、歯周病の症状が「軽度」、
総菌数に対して０．１％以上５％未満の場合を、歯周病の症状が「中程度」、
総菌数に対して５％以上の場合を、歯周病の症状が「重度」
であると判定する、前記（２）記載の方法。
（６）被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中の
特定の細菌の細菌量、
口腔内試料中に存在する総菌量、又は
特定の細菌量と口腔内試料中に存在する総菌量の両方
を測定する工程、及び
　得られた測定結果について統計解析を行うことにより、歯周病の重症度を判定する工程
を含む、前記（１）記載の方法。
（７）歯周病の治療前後における被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中の
特定の細菌の細菌量、
口腔内試料中に存在する総菌量、又は
特定の細菌量と口腔内試料中に存在する総菌量の両方
を測定する工程、
　前記治療前における細菌量と前記治療後における細菌量との比較結果に基づいて、歯周病の治療効果を判定する工程
を含む、前記（１）記載の方法。
（８）被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中の
特定の細菌の細菌量、
口腔内試料中に存在する総菌量、又は
特定の細菌量と口腔内試料中に存在する総菌量の両方
を測定する工程、及び
　得られた細菌量の比率に基づいて、歯周病の悪化リスクを判定する工程
を含む、前記（１）記載の方法。
（９）口腔内試料中の特定の細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属及びＣａｎｄｉｄａ属に属する細菌からなる群から選ばれる少なくとも一種である、前記（６）又は（７）に記載の方法。
（１０）口腔内試料中の特定の細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ　ｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ　ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ　ｂｖ　２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｕｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ　ＩＩ及びＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｎｏｘｉａからなる群から選ばれる少なくとも一種である、前記（６）又は（７）記載の方法。
（１１）口腔内試料中の特定の細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ及びＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｕｌａからなる群から選ばれる少なくとも一種である、前記（６）又は（７）記載の方法。
（１２）口腔内試料中の特定の細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａからなる群から選ばれる少なくとも一種及びＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍである、前記（８）記載の方法。
（１３）以下の（１）～（３）の工程を含む細菌数の算定方法により口腔内試料中に存在する細菌数を測定する、請求項１記載の方法。
　（１）被検サンプルから得られるデータを絶対量指標プローブのシグナル強度と比較し、補正する工程
　（２）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から細菌数算出式を求める工程
　（３）上記（２）の工程で得た算出式を用いて、上記（１）の工程で補正したシグナル強度から各検出対象菌種の細菌数を算定する工程
（１４）配列番号１９３～１９８及び２０１～２０４に示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡのうちの１種又は２種以上からなる、プライマー又はプライマーセット。
（１５）配列番号９７、１００、１２０、１２１、１２２、１２９、１３０、１５２若しくは１５５に示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは、
　該ＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ口腔内細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列を検出し得る機能を有するＤＮＡ
を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。

　本発明によれば、簡便な方法で、歯周病及び／又はう蝕の状態を判定することができる。
　また、本発明によれば、簡便な方法で、口腔内細菌を検出することにより、歯周病の重症度、歯周病の治療効果、歯周病の悪化リスクを判定することができる。特に、従来の培養法と比較して、当該判定をより高い精度で行うことができ、さらにリアルタイムＰＣＲ及びシーケンサーより作業効率よく安価に行うことができる。

クラスター分類の結果を示す図である。 クラスター分類の結果を示す図である。 ヒートマップを示す図である。

　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１６－１３６５７９号明細書（2016年7月11日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
　本発明の口腔内検査方法は、前述のとおり、口腔内試料中に存在する細菌量を測定することにより、歯周病及び／又はう蝕の状態を判定する方法である。
　当該口腔内検査方法の具体的な態様としては、限定はされないが、例えば、
　Ａ）口腔内試料中に存在する細菌の総菌数に対する特定の細菌の菌数の割合を求めることにより、前記判定をする方法や、　Ｂ）被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中細菌量を測定し、得られた測定結果に基づいて、前記判定をする方法

などが挙げられる。
　以下、これらＡ）及びＢ）の方法について、それぞれ説明する。
Ｉ．前記Ａ）の方法について
　本明細書においては、口腔内試料中の細菌の菌数を測定する方法については、ＤＮＡチップを用いた方法を中心に述べるが、ＤＮＡチップを用いる方法以外の方法、例えば、インベーダー法、リアルタイムＰＣＲ法、インベーダーＰＣＲ法等によって口腔内試料中の細菌の菌数を測定することもできる。
　１．口腔内細菌量の測定に用いるオリゴヌクレオチドプローブ
本発明の方法においては、被験者から採取された口腔内試料から口腔内細菌量を測定する際に、ＤＮＡチップを使用することができ、当該ＤＮＡチップには、例えば、以下のプローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも一方のプローブとを搭載することができる。なお、一般的に、ＤＮＡチップとは、プローブが配置された基盤の総称である。また、本明細書においては、ＤＮＡチップ及びＤＮＡマイクロアレイ等の名称については、それぞれ区別はせず、同義語であるとする。

（ａ）検出対象の細菌の遺伝子それぞれに特異的にハイブリダイズする核酸からなるプローブ

（ｂ）すべての細菌の遺伝子にハイブリダイズする核酸からなる総量指標プローブ

（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標それぞれに特異的にハイブリダイズする核酸からなるプローブ

（１）測定対象となる口腔内細菌　

　本発明の検査方法において、測定対象となる口腔内細菌としては、限定はされないが、
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属に属する細菌、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属に属する細菌、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属に属する細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属に属する細菌、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属に属する細菌、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属に属する細菌、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属に属する細菌、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属に属する細菌、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属に属する細菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に属する細菌、Ｓｅｒｒａｔｉａ属に属する細菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属に属する細菌、及びＣａｎｄｉｄａ属に属する細菌などを、検出対象菌種とすることができる。

　より詳細には、例えば、現在歯周病やう蝕に関連していると考えられる、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ　ｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ　ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ　ｂｖ　２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｕｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ　ＩＩ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｎｏｘｉａ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓなどのうち少なくとも一種の細菌を検出対象菌種とすることが好ましく、より好ましくは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓである。

（２）プローブ（ａ）について

　本発明において、プローブ（ａ）として使用され得るオリゴＤＮＡは、口腔内細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの特定の領域中の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。ここで、当該核酸は、染色体ＤＮＡやプラスミドＤＮＡ等を含むＤＮＡ及びＲＮＡのいずれでもよく限定はされないが、染色体ＤＮＡであることが好ましい。具体的には、本発明においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、前記口腔内細菌の染色体ＤＮＡ中の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。

　本発明に用い得るプローブは、検出目的となる各種の前記口腔内細菌に特異的な塩基配列となるような領域を選択してその領域の塩基配列を設計することが好ましい。一般的に、プローブの設計の際には、特異的な領域を選択することに加え、融解温度（Ｔｍ）がそろっていて、二次構造を形成しにくいものである必要がある。　　

　口腔内細菌の各々の種に対応する特異的な塩基配列は、例えば、マルチプルアラインメントをとり、種間で異なる領域にプローブを設計するなどの手段により見出すことができる。アラインメントをとるためのアルゴリズムには、特に限定はないが、より具体的な解析プログラムとしては、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８等のプログラムを利用することができる。アラインメントをとる際のパラメータは、各プログラムのデフォルト状態で実行してもよいが、プログラムの種類などに応じて適宜調整することができる。　　

　一方で、プローブの特異性は、属レベルの特異性を基に同じ属の細菌を一括に検出するものであってもよいし、個々の種レベルで検出可能な特異性であってもよく、細菌検出の目的に応じて適宜判断が可能である。

（３）プローブ（ｂ）について

　総量指標プローブは、特定のプライマー対で増幅できた、検体の中のすべての細菌を捕捉する目的のプローブである。細菌を検出する上では、検出対象細菌が、非検出対象細菌を含む全体の細菌の中でどの程度の割合であるのか、また、そもそも検体中にどれくらいの量の細菌が存在しているのかといった観点から細菌の総量を検出することもきわめて重要となる。

　非検出対象細菌は、存在や種類は分かっているが検出対象としなくてもよい細菌、及び存在や種類が不明である細菌の和（合計）として理解できる。

　細菌の総量を検出するためには、例えば、ＤＮＡチップとは独立に細菌の総量を測定することも可能であるが、ＤＮＡチップ中に細菌の総量の指標となるプローブを搭載しておくことにより操作の簡便性が向上する。プローブについては、プライマー対によって増幅される塩基配列の中から、多種類の菌種に共通な塩基配列を使用してもよい。そのような配列が見つからない場合は、比較的共通な配列を複数設計し、それらを総合的に判断することで総量指標プローブとしてもよい。総量指標プローブは、好ましくは、検体に含まれる細菌に由来する核酸にハイブリダイズするプローブ、詳しくは、前記特定のプライマー対により増幅される塩基配列のうちの、検出対象となる複数種類の細菌が共通に有する塩基配列を含むプローブである。総量指標プローブの例を、表１－１－１（配列番号６０）に示す。

　総量指標は、個々の菌種特異的な増幅産物の合計量を表すため、一般的に量が多くなることから、目的のシグナル強度が、検出可能なシグナル強度の範囲を超えてしまうことがある。

　そのような状況を防ぐためには、ハイブリダイゼーションに供する検体量を制限することが望ましい。又は、プローブを設計する際には、例えば当該プローブのＴｍ値を低くする。具体的にはＧＣ含量を少なくすることや、プローブの配列長自体を短くする方法が考えられる。

　また、ハイブリダイゼーションに際して、増幅された核酸と総量指標プローブとのハイブリダイゼーションに対して競合的に作用するような核酸を添加することで、シグナル強度の低減化を図ることが可能である。このような核酸としては、例えば、総量指標プローブと全て又は部分的に同じ配列を有する核酸、又は総量指標プローブの相補配列を全て又は部分的に有する核酸などが挙げられる。

（４）プローブ（ｃ）について

　絶対量指標プローブは、絶対量指標の核酸にのみハイブリダイズするプローブである。

　本明細書において、絶対量指標とは、増幅反応やハイブリダイゼーション反応の前に、検体中に一定量添加する核酸である。絶対量指標は、通常の増幅反応を行えば増幅反応が確実に行われる核酸であり、いわゆる陽性コントロールとしての役割を果たす。

　従って、絶対量指標に特異的なプローブを、ＤＮＡチップに搭載しておけば、その検出結果から、増幅反応やハイブリダイゼーション等が適切に実施されたかを確認することができる。また、絶対量指標を１種類設定した場合、複数のＤＮＡチップから得られる絶対量指標のシグナル強度は一定になるはずであり、多少増幅効率やハイブリダイゼーション効率が増減した場合に、絶対量指標のシグナル強度を比較することにより補正係数を算出することができる。複数のＤＮＡチップにおいて、補正したシグナル強度は比較することができる。

　細菌それぞれに特異的なプローブの例を、表１－１－１に示す（配列番号３～５９）。また、絶対量指標用プローブの例を表１－１－１（配列番号６１～７５）に、また絶対量指標の例を表１－１－２（配列番号７６～９０）に示す。

　絶対量指標を増幅反応前に添加するのであれば、特定のプライマー対にて増幅される核酸であること、すなわちプライマー対と相補な塩基配列を所持していること、かつ、ハイブリダイゼーションで検出するためには、検出対象細菌、非検出対象細菌いずれにおいても所持していない塩基配列を所持している必要がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　特定のプライマーとは、増幅対象配列が限定されるという意味であり、プライマー対は必ずしも１対である必要はない。必要に応じて２対以上のプライマー対を用いるマルチプレックス手法も適用できる。プライマー対の例を表１－２に示す。細菌増幅用プライマー対（配列番号１、２）や、絶対量指標用プライマー対（配列番号９１、９２）を利用することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明のプライマー設計方法は、まず、解析対象細菌の多様性を示す可変領域を少なくともひとつ選択し、選択した可変領域の前後に、保存性の高いユニバーサルプライマー設計領域を選択し、プライマー配列を設計する。対象となる可変領域は、限定はされないが、ゲノム配列のうち、すべての細菌が有する１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子などが挙げられる。１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のうち、全長又は、可変領域Ｖ１－Ｖ９の一つ以上の領域を対象とすることが望ましい。より好ましくは、可変領域Ｖ３－Ｖ４を対象とすることが望ましい。
　プライマーの網羅性を評価するために、細菌のゲノム配列を広範囲に取得しているデータベースを活用する。具体的には、ＲＤＰ、ＮＣＢＩ、ＫＥＧＧ、ＭＧＤＢなどが挙げられる。
　一例として、設計したユニバーサルプライマー配列を、ＲＤＰのデータベースのＰｒｏｂｅ　Ｍａｔｃｈに入力する。結果の一覧において、Ｔｏｔａｌ　ｓｅａｒｃｈ中の完全一致数が得られる。完全一致数がＴｏｔａｌ　Ｓｅａｒｃｈに近いほど、その網羅性が高い。このとき、条件として、Ｓｔｒａｉｎは、Ｔｙｐｅを選択しても良い。また、Ｓｏｕｒｓｅは、Ｉｓｏｌａｔｅｓを選択しても良い。
　絶対量指標は、例えば、産業技術総合研究所が開発した定量解析用核酸標準物質を利用しても良いし、新たに設計しても良い。設計する場合には、例えば、ソフトウェア「ＥＸＣＥＬ」（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ社製）のＲＮＤＢＥＴＷＥＥＮ関数を使用し、１から４までの整数をランダムにＸ個（Ｘは任意の数）発生させ、それをつなげて１から４までの数値のみから構成されるＸ桁の数値とし、１をＡ、２をＴ、３をＣ、４をＧと置き換えることにより、ＡＴＧＣのＸ塩基によるランダム配列を多数得ることができる。
　これらの配列につき、ＧとＴの和がＡとＴの和と同数になる配列のみを抜粋し、抜粋された配列を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに対してＢｌａｓｔ検索し、生物由来の核酸に対し、類似配列の少ないものを選抜し、配列の両末端にプライマー配列を付加することで、設計可能である。また、設計された配列を適宜連結させて長くしたり、部分的に除去して短くしたりすることも可能である。
　増幅反応時における反応効率をなるべく一定にするために、検出対象細菌にて増幅される塩基長と絶対量指標の増幅塩基長は大きな差のないようにすることが望ましい。例えば、検出対象細菌の増幅産物が５００ｂｐ程度となるのであれば、絶対量指標の増幅産物は３００ｂｐから１０００ｂｐ程度とすることが望ましい。
　一方で、増幅後に電気泳動等で増幅鎖長を確認する場合においては、検出対象細菌とは異なる長さの増幅産物となるように設計した上で、絶対量指標由来の増幅産物を検出対象細菌のバンドとは異なる位置で検出し、ハイブリダイゼーションの前に増幅反応の成否を確認することも可能である。
　最後に、検体中に含まれる絶対量指標はあまりにも濃度が高いと検出対象の細菌と増幅反応における競合が激しくなり、本来検出できるはずの検出対象細菌が検出できなくなる可能性もあるため、アプリケーションに応じて適宜濃度調整をする必要がある。
　本発明に用いるプローブを設計する際は、ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーを考慮する必要がある。ストリンジェンシーをある程度緊密にすることによって、各種の口腔内細菌において各々の核酸中の特定の領域間で類似する塩基配列領域が存在しても、他の異なる領域を区別してハイブリダイズすることができる。また、当該特定の領域間の塩基配列がほとんど異なる場合は、ストリンジェンシーを緩やかに設定することができる。　　
　このようなストリンジェンシーの条件としては、例えば緊密条件の場合は５０～６０℃の条件下でのハイブリダイゼーションであり、ゆるやかな条件の場合は３０～４０℃の条件下でのハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーションの条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、４０℃」、「０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、３７℃」、「０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、３０℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、５０℃」、「０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、５５℃」、「０．０６Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．０６Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、６０℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、プローブを添加して１時間以上５０℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０中、５０℃で２０分の洗浄を４回、最後に、０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ、５０℃で１０分の洗浄を１回行う方法もある。ハイブリダイゼーション、又は洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件を設定することができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　４ｔｈ　ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　（２０１２）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７－１９９７））　等を参照することができる。
　本発明に用いるプローブの長さは、限定はされないが、例えば、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６～５０塩基であり、さらに好ましくは１８～３５塩基である。プローブの長さが適切であれば（前記範囲内であれば）、非特異的なハイブリダイゼーション（ミスマッチ）を抑制し、特異的な検出に使用することができる。
　本発明に用いるプローブの設計の際には、Ｔｍを確認しておくことが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッド形成する温度を意味し、鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡとプローブとが二本鎖を形成してハイブリダイズするためには、ハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こりやすくなるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとする核酸断片のＴｍはハイブリダイゼーションを行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプローブ設計用ソフトウェアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウェアとしては、例えばＰｒｏｂｅ　Ｑｕｅｓｔ（登録商標；ダイナコム社）などが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウェアを使わずに自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ　Ｎｅｉｇｈｂｏｒ　Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明のプローブにおいては、限定はされないが、平均Ｔｍが約３５～７０℃又は４５～６０℃であることが好ましい。なお、プローブとして特異的なハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量等があり、その条件は当業者に周知である。
　また、本発明に用いるプローブを構成するヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡ、又はＰＮＡのいずれであってもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡの２種以上のハイブリッドであってもよい。　　
　本発明に用いるプローブとしては、具体的には、例えば、以下の（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡの塩基配列を含むものが好ましく挙げられる。例えば、表１－２に示すプライマー（配列番号１、２）を用いて増幅する場合、前掲の表１－１－１（配列番号３～５９）に示す配列をプローブとすることが可能であり、配列番号３～５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列を用いることが好ましい。また、配列番号３～５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列の相補配列であってもよく、配列番号３～５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列と実質的に同一の配列又は配列番号３～５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列の相補配列と実質的に同一の配列であってもよい。
　ここで、実質的に同一とは、配列番号３～５９に記載の配列又は相補配列に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするものである。
　（ｄ）　配列番号３～５９に示される塩基配列からなるＤＮＡ　　
　（ｅ）　前記（ｄ）のＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ口腔内細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列を検出し得る機能を有するＤＮＡ　　
　前記（ｄ）の各種ＤＮＡについて、それらの具体的な塩基配列、プローブ名、検出対象となる口腔内細菌については、前掲の表１－１－１の記載が参照できる。
　また、前記（ｅ）のＤＮＡは、前記（ｄ）の各種ＤＮＡ若しくはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらを断片化したものをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、及びサザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、ｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、前記と同様のものを参照することができる。ハイブリダイズするＤＮＡとしては、前記（ｄ）のＤＮＡの塩基配列に対して少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
　本発明に用いるプローブは、例えば、通常のオリゴヌクレオチド合成法を使用して化学合成する（精製はＨＰＬＣ等により行う）ことにより作製することができる。そのようなプローブは、例えば、Ｐｒｏｂｅ　Ｑｕｅｓｔ（登録商標：ダイナコム社製）により設計することができる。また、本発明のプローブには、例えば、タグ配列などの付加配列が含まれていてもよい。

　本発明の方法において、検出目的となる前記口腔内細菌が有する核酸の塩基配列は、当該塩基配列そのものである必要はなく、塩基配列の一部が欠失、置換、挿入等により変異が生じたものであってもよい。したがって、検出目的の核酸の塩基配列は、当該塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつそれぞれの塩基配列に由来する機能や活性を有する変異型遺伝子も対象とすることができ、プローブは、このような変異型遺伝子の塩基配列を基礎として設計することもできる。ここで「ストリンジェントな条件」は、前記と同様の条件を適用することができる。
　２．口腔内細菌量の測定に用いる口腔内細菌遺伝子検出用ＤＮＡチップ
　前記したように、本発明の方法においては、ＤＮＡチップを用いることができ、当該ＤＮＡチップは、前記１.項で説明した各種オリゴヌクレオチドプローブが支持体となる基盤に複数配置されたものである。

　支持体となる基盤の形態としては、平板（ガラス板、樹脂板、シリコン板等）、棒状、ビーズ等のいずれの形態のものも使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔もって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０，　４６７－４７０　（１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１，　７６７－７７３　（１９９１）等参照）。他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、所定のプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるＤＮＡチップ（以下「繊維型ＤＮＡチップ」と言う）が好ましく例示できる。このマイクロアレイは、貫通孔基板に核酸を固定化したタイプのものと説明することもでき、いわゆる「貫通孔型ＤＮＡチップ」とも言われる（特許第３５１０８８２号公報等参照）。

　プローブの支持体への固定方法は限定されず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定することもできる。　　

　以下、ＤＮＡチップの一形態である繊維型ＤＮＡチップに関して詳細に説明する。このＤＮＡチップは、例えば、下記（ｉ）～（ｉｖ）の工程を経て作製することができる。

　（ｉ）　複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列して配列体を製造する工程　　

　（ｉｉ）　前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程　　

　（ｉｉｉ）　オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程　　

　（ｉｖ）　中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程　　

　中空繊維に使用される材料としては、限定はされないが、例えば、特開２００４－１６３２１１号公報等に記載の材料が好ましく挙げられる。

　中空繊維は、その長手方向の長さが同一となるように３次元に配列される（工程（ｉ））。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１－１０８９２８号公報参照）や、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ね合わせ、それらの孔部に中空繊維を通過させ、その後２枚の多孔板の間隔を開いて仮固定し、２枚の多孔板間における中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させて硬化させる方法（特開２００１－１３３４５３号公報参照）などが挙げられる。

　製造された配列体はその配列が乱れないように包埋される（工程（ｉｉ））。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂及びエポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法のほか、繊維どうしを熱融着により接着する方法等が好ましく挙げられる。

　包埋された配列体には、各中空繊維の中空部に、オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液（ゲル形成溶液）を充填し、中空部内で重合反応を行う（工程（ｉｉｉ））。これにより、各中空繊維の中空部に、プローブが固定されたゲル状物を保持させることができる。　　

　ゲル前駆体重合性溶液とは、ゲル形成重合性モノマー等の反応性物質を含有する溶液であって、該モノマー等を重合、架橋させることにより該溶液がゲル状物となることが可能な溶液をいう。そのようなモノマーとしては、例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドン、メチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。この場合、溶液には重合開始剤等が含まれていてもよい。　　

　中空繊維内にプローブを固定した後、中空繊維の長手方向と交差する方向（好ましくは直交する方向）で、ブロック体を切断して薄片化する（工程（ｉｖ））。このようにして得られた薄片は、ＤＮＡチップとして使用できる。当該ＤＮＡチップの厚みは、０．０１ｍｍ～１ｍｍ程度であることが好ましい。ブロック体の切断は、例えば、ミクロトーム及びレーザー等により行うことができる。　　

　前記した繊維型ＤＮＡチップとしては、例えば、三菱レイヨン社製ＤＮＡチップ（Ｇｅｎｏｐａｌ　ＴＭ）等が好ましく挙げられる。

　繊維型ＤＮＡチップでは、前記のように、プローブはゲル内で３次元的に配列され、３次元構造を維持することが可能となる。そのため、表面をコートしたスライドガラスにプローブを結合させた平面ＤＮＡチップに比べて、検出効率が上昇し、高感度で高再現性の検査をすることが可能となる。　　

　また、ＤＮＡチップに配置されるプローブの種類の数は、１つのＤＮＡチップに５００種類以下、好ましくは２５０種類以下、さらに好ましくは１００種類以下が好ましい。このように配置されたプローブ数（種類）をある程度制限することにより、目的の口腔内細菌をより高感度で検出することが可能となる。なお、プローブの種類は塩基配列によって区別される。従って、通常、同じ遺伝子に由来のプローブであっても塩基配列が１個でも異なれば別の種類として特定する。　　
３．口腔内細菌遺伝子の検出
　本発明の方法において、口腔内細菌量を測定するために当該細菌の遺伝子を検出する方法は、例えば、下記の工程を含む方法である。
（ｉ）被験者から採取した口腔内試料を検体とし、検体中の核酸を抽出する工程　　
（ｉｉ）抽出した核酸を、前記した本発明のオリゴヌクレオチドプローブ又は本発明のＤＮＡチップに接触させる工程
（ｉｉｉ）ＤＮＡチップから得られたシグナル強度から細菌量を算出する工程
　以下に、当該検出方法の詳細を工程ごとに説明する。
（１）工程（ｉ）について　　
　本工程では、被験者又は被生物から採取した口腔内試料を検体とし、検体中に含まれる細菌の核酸を抽出する。採取する口腔内試料の種類は、特には限定されない。例えば、唾液、プラーク（歯肉縁下プラーク、歯肉縁上プラーク）、舌苔、口腔洗浄液等を使用することができ、これらの中でもプラークが好ましく、その中でも、歯周病細菌が最も多く棲息している場所から採取する歯肉縁下プラークがより好ましい。

　口腔内試料を採取する方法は特には限定されず、試料の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、口腔内試料として唾液を使用する場合は、市販の唾液採取キットを利用する方法、綿棒を口に含み唾液を採取する方法、唾液を容器に直接採取する方法等が挙げられる。

　口腔内試料としてプラークを使用する場合、歯ブラシによる歯面や歯間のブラッシング、綿棒による歯面擦過、歯間ブラシによる歯間擦過、ペーパーポイント法等が挙げられる。プラークの採取に使用した歯ブラシ、綿棒、歯間ブラシ又はペーパーポイントを滅菌水中に浸して必要に応じて撹拌等することにより、プラークを溶解又は懸濁させ、得られた溶液又は懸濁液を検体とすることもできる。採取するプラークの量は特には限定されず、例えば、ペーパーポイント１本分あれば良い。

　口腔内試料として舌苔を使用する場合、綿棒による舌面擦過する方法等が挙げられる。プラークの採取に使用した綿棒を溶解又は懸濁させ、得られた溶液又は懸濁液を検体とすることもできる。採取する舌苔の量は特には限定されず、例えば、綿棒１本分あれば良い。

　口腔内試料として口腔洗浄液を使用する場合、口腔洗浄液又は水を口に含み、口腔洗浄液又は水とともに唾液を容器に採取し、得られた溶液を検体とする方法が挙げられる。口腔洗浄液としては、例えば滅菌された生理食塩水等が挙げられる。

　次いで、得られた口腔内試料中に存在する細菌の核酸抽出を行う。抽出の方法は限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、機器による自動抽出法、市販の核酸抽出キットを利用する方法、プロテイナーゼＫ処理後にフェノール抽出する方法、クロロホルムを利用する方法又は簡易抽出方法として、試料を加熱、溶解する方法等が挙げられる。また、特に検体中から核酸を抽出せず、次の工程に進んでも良い。

　検体から得られた核酸は、そのままＤＮＡチップ等に接触させてもよいし、ＰＣＲ等により所望の塩基配列領域を増幅し、その増幅断片をＤＮＡチップ等に接触させてもよく、限定はされない。得られた核酸をテンプレートとして増幅する領域は、本発明に用いるプローブ、又はＤＮＡチップに配置したオリゴヌクレオチドの塩基配列を含む核酸領域をコードする部位である。増幅する所望の領域は、限定はされず、前記口腔内細菌の種を問わず保存性の高い領域の塩基配列を利用し、多種類の混合物を一度に増幅して得ることができる。このような増幅のための配列は、実験的に単離、精製し、単離されたポリヌクレオチドの塩基配列を解析し、その配列に基づいて決定してもよいし、また、塩基配列等の各種データベースで既知の塩基配列を検索し、アラインメントを取ることなどによって、Ｉｎ　Ｓｉｌｉｃｏで決定してもよい。核酸又はアミノ酸などのデータベースは、特に限定されるものではないが、例えば、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ）、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｒｙ，　ＥＭＢＬ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔａ　ｌｉｂｒａｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔａ　ｂａｎｋ）、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＴａｘｏｎｏｍｙデータベース等を利用できる。

　具体的に、増幅する所望の部位としては、前記口腔内細菌の染色体ＤＮＡ中のリボソームＲＮＡ　（１６Ｓ　ｒＲＮＡ）遺伝子であることが好ましい。当該領域の増幅に用い得るＰＣＲプライマーとしては、例えば、表１－２の配列番号１、２が好ましく挙げられる。なお、ＰＣＲ法による核酸の増幅は、定法に従って行うことができる。

　本工程において抽出した核酸及びその増幅断片は、適宜標識化し、ハイブリダイズさせた後の検出過程において利用することも可能である。具体的には、ＰＣＲプライマーの末端を各種レポーター色素で標識しておく方法、反応性のヌクレオチドアナログを逆転写反応時に取り込ませる方法、ビオチン標識したヌクレオチドを取り込ませる方法などが考えられる。さらに、調製後に蛍光標識試薬と反応させて標識することも可能である。蛍光試薬としては、例えば、各種レポーター色素（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＶＩＣ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ　ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ　Ｙｅｌｌｏｗ等）を用いることができる。　　

（２）工程（ｉｉ）について

　本工程では、工程（ｉ）で得た核酸又はその増幅断片を、本発明に用いるプローブ又はＤＮＡチップに接触させるが、具体的には、当該核酸等を含むハイブリダイゼーション溶液を調製し、当該溶液中の核酸等を、ＤＮＡチップに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブに結合（ハイブリダイズ）させる。ハイブリダイゼーション溶液は、ＳＤＳやＳＳＣ等の緩衝液を用いて、定法に従い、適宜調製することができる。

　ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション溶液中の核酸等が、ＤＮＡチップに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう、反応条件（緩衝液の種類、ｐＨ、温度等）を適宜設定して行うことができる。なお、ここで言う「ストリンジェントな条件」とは、類似配列によるクロスハイブリダイゼーションを生じにくい、又は類似配列によってクロスハイブリダイゼーションした核酸を解離させる条件のことをいい、具体的には、ハイブリダイゼーション反応時又はハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの洗浄条件を意味する。

　例えば、ハイブリダイゼーション反応時の条件としては、反応温度は、３５～７０℃が好ましく、より好ましくは４０～６５℃であり、ハイブリダイズさせる際の時間は、約１分～１６時間が好ましい。

　また、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの洗浄条件としては、洗浄液組成は、０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０であることが好ましく、洗浄時の温度は、３５～８０℃又は４０～６５℃が好ましく、より好ましくは４５～６０℃である。より具体的には、塩（ナトリウム）濃度が４８～７８０ｍＭであり、温度が３７～８０℃である条件が好ましく、より好ましくは塩濃度が９７．５～３９０ｍＭであり、温度が４５～６０℃である条件である。

　洗浄後は、プローブに結合した核酸等の標識を検出できる装置により、スポットごとに検出強度を測定する。例えば、前記核酸等を蛍光標識化していた場合は、各種蛍光検出装置、例えば、ＣＲＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）、ａｒｒａｙＷｏＲｘ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ　４２８　Ａｒｒａｙ　Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，社製）、ＧｅｎｅＰｉｘ（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＳｃａｎＡｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）、ジェノパールリーダー（三菱レイヨン社製）などを用いて、蛍光強度を測定することができる。これらの装置については、蛍光スキャナーの場合は、例えば、レーザーの出力、検出部の感度を適宜調整してスキャンを行うことができ、ＣＣＤカメラ型のスキャナーの場合は、露光時間を適宜調節してスキャンを行うことができる。スキャンの結果に基づく定量方法は、定量ソフトウェアにより行う。定量ソフトウェアに特に限定はなく、スポットの蛍光強度の平均値、中央値等を用いて定量することができる。また、定量にあたっては、ＤＮＡフラグメントのスポット範囲の寸法精度などを考慮し、プローブを搭載していないスポットの蛍光強度をバックグラウンドとして用いるなど、調整を行うことが好ましい。

（３）工程（ｉｉｉ）について

　本工程では、前記の手順で得られたシグナル強度より、検出対象菌種の細菌の細菌量を算出する。たとえば、検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度とバックグラウンドのシグナル強度からＳＮ比として示す方法がある。又は、あらかじめ細菌ごとに細菌の染色体ＤＮＡの濃度を変えて複数条件にて検出し、各濃度条件で得られるシグナル強度を元に、細菌ごとに染色体ＤＮＡ濃度を算出する換算係数（検量線）を取得しておき、それぞれの条件で得られたシグナル強度から染色体ＤＮＡの濃度を算出する方法などが好ましい。

　いずれの場合でも、複数のＤＮＡチップの検出から得られる絶対量指標プローブのシグナル強度が一定となるようにＤＮＡチップごとに補正係数を算出し、各ＤＮＡチップの検出対象細菌のシグナル強度に補正係数を考慮することで、ＤＮＡチップ間の比較をしても良い。　　
　４．歯周病及び／又はう蝕の状態の判定
　（１）歯周病の状態判定　判定基準１
　口腔内試料として唾液中に含まれる細菌のうち、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの少なくとも１種類の細菌の菌数の合計が、総菌数に対して０．０１％未満の場合を「軽度」、総菌数に対して０．０１％以上０．５％未満の場合を「中程度」、総菌数に対して０．５％以上の場合を、「重度」であると判定する。
　口腔内試料としてプラークを用いる場合は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの少なくとも１種類の細菌の菌数の合計が、総菌数に対して０．１％未満の場合を「軽度」、総菌数に対して０．１％以上５％未満の場合を「中程度」、総菌数に対して５％以上の場合を、「重度」であると判定する。
　これは、歯周病の細菌検査として、プラークあるいは唾液中の”Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ”の３種類の細菌を合計した値を用いて、歯周病の状態を４段階に分類する報告をもとにした。３種類の細菌数を基準にしており、複数の臨床研究報告及び総説からまとめた参考値で、日本歯周病学会のガイドラインとされており、十分根拠のある値と考えられる。唾液の場合を想定し、基準値をプラークの場合の１０分の１とした。４段階の分類のうち、中央の２段階をひとつにし、検査を受ける者が分かりやすいよう、３段階に分類した（非特許文献３）。
　（２）う蝕の状態判定　　判定基準２
　また、口腔内試料として唾液中に含まれる細菌のうち、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの菌数が、総菌数に対して０．０５％未満の場合を、う蝕の状態が「軽度」、総菌数に対して０．０５％以上２．５％未満の場合を、う蝕の状態が「中程度」、総菌数に対して２．５％以上の場合を、う蝕の状態が「重度」であると判定する。
　この判定基準は、例えば、Ｉｖｏｃｌａｒ　ｖｉｖａｄｅｎｔ社製カリエスリスクテスト等のキットを用いたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの培養評価のう蝕リスク４段階判定（Ｊ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｃａｒｅ　Ｄｅｎｔ．２０００，２，４－１７）に基づいて定めた。
　この培養評価は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓを培養して生じたコロニーを目視で判定した結果が、
　１０００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス０」、
　１０００００ＣＦＵ／ｍＬ以上５０００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス１」、
　５０００００ＣＦＵ／ｍＬ以上１００００００ＣＦＵ／ｍＬ未満で「クラス２」、
　１００００００ＣＦＵ／ｍＬ以上で「クラス３」、
と分類するものである。
　ＣＦＵとは培養時にコロニー形成する単位であり、およそ１ＣＦＵは１００ゲノムコピーであることが知られている。また、ヒトのだ液１ｍＬ中にはおよそ１０００００００００ゲノムコピーの細菌が含まれている。
　従って、この数値に基づいて、「クラス０」の場合を本明細書では「低」、「クラス１」の場合を本明細書では「中」、「クラス２及び３」の場合を本明細書では「高」とする上記の基準を設定した。
　（３）その他
　本発明により得られた歯周病及びう蝕の状態判定は、あくまで細菌数から推定する状態の判定であり、正確な病態を表すものではない。すなわち、正確な病態の診断は歯科医による診断が必要である。
　しかし、本発明によれば、歯周病及びう蝕の状態を簡便に判定することができるため、歯周病やう蝕の早期発見・早期治療が可能になると共に、これらの予防も可能となる。
ＩＩ．前記Ｂ）の方法について
　前記Ｂ）の方法としては、限定はされないが、具体的には、例えば、
　第一の態様としては、　被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中の、ｉ）特定の細菌の細菌量、ｉｉ）口腔内試料中に存在する総菌量、又は、ｉｉｉ）特定の細菌量と口腔内試料中に存在する総菌量の両方、を測定する工程と
　得られた測定結果について統計解析を行うことにより、歯周病の重症度を判定する工程と

を含む方法が挙げられる。
　第二の態様としては、
　歯周病の治療前後における被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中の、ｉ）特定の細菌の細菌量、ｉｉ）口腔内試料中に存在する総菌量、又は、ｉｉｉ）特定の細菌量と口腔内試料中に存在する総菌量の両方、を測定する工程と　前記治療前における細菌量と前記治療後における細菌量との比較結果に基づいて、歯周病の治療効果を判定する工程
を含む方法が挙げられる。
　第三の態様としては、
　被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中の、ｉ）特定の細菌の細菌量、ｉｉ）口腔内試料中に存在する総菌量、又は、ｉｉｉ）特定の細菌量と口腔内試料中に存在する総菌量の両方、を測定する工程と
　得られた細菌量の比率に基づいて、歯周病の悪化リスクを判定する工程
を含む方法が挙げられる。

　１．口腔内細菌量の測定に用いるオリゴヌクレオチドプローブ

　本発明の方法においては、被験者から採取された口腔内試料から口腔内細菌量を測定する際に、ＤＮＡチップを使用することができ、当該ＤＮＡチップには、例えば、以下のプローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも一方のプローブとを搭載することができる。なお、一般的に、ＤＮＡチップとは、プローブが配置された基盤の総称である。また、本明細書においては、ＤＮＡチップ及びＤＮＡマイクロアレイ等の名称については、それぞれ区別はせず、同義語であるとする。

（ａ）検出対象の細菌の遺伝子それぞれに特異的にハイブリダイズする核酸からなるプローブ

（ｂ）すべての細菌の遺伝子にハイブリダイズする核酸からなる総量指標プローブ

（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標それぞれに特異的にハイブリダイズする核酸からなるプローブ

（１）測定対象となる口腔内細菌　

　本発明の検査方法において、測定対象となる口腔内細菌としては、限定はされないが、
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属に属する細菌、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属に属する細菌、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属に属する細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属に属する細菌、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属に属する細菌、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属に属する細菌、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属に属する細菌、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属に属する細菌、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属に属する細菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に属する細菌、Ｓｅｒｒａｔｉａ属に属する細菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属に属する細菌、及びＣａｎｄｉｄａ属に属する細菌などを、検出対象菌種とすることができる。

　より詳細には、例えば、現在歯周病に関連していると考えられる、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ　ｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ　ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ　ｂｖ　２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｕｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ　ＩＩ、及びＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｎｏｘｉａなどのうち少なくとも一種の細菌を検出対象菌種とすることが好ましい。

　本発明においては、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ及びＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｕｌａ等を検出対象とすることがより好ましく、これらうちの少なくとも１種、好ましくは２種以上を検出対象とすることが更に好ましい。　歯周病の治療前後において、これらの細菌量を測定および比較することにより、歯周病の治療効果を客観的に判定可能である。細菌数が十分減少していれば治療効果があり、減少していなければ治療効果がなく、別の治療法を実施する必要がある。
　また、これら細菌量は臨床情報と相関又は逆相関の高い情報であり、歯周病重症度を示す指標となる。総細菌のうち、悪性度の高い細菌が多いのか、あるいは、悪性度の低い細菌が多いのかを示す歯周病重症度に関する詳細な情報が得られる。

　但し、歯周病悪化リスクを判定する場合の測定対象の口腔内細菌としては、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａからなる群から選ばれる少なくとも一種及びＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍであることが好ましい。臨床情報である歯周ポケットの深さＰＤが深くなり歯周病が悪化する、あるいはその前段階である「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」が増殖する前に、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの細菌が増殖するため、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの検出が歯周病初期の指標となる。つまり、「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」である３種類のＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの細菌量、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａの細菌量、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの細菌量の合計に対する、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの細菌量が悪化リスクの判定指標になる。

（２）プローブ（ａ）について

　本発明において、プローブ（ａ）として使用され得るオリゴＤＮＡは、口腔内細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの特定の領域中の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。ここで、当該核酸は、染色体ＤＮＡやプラスミドＤＮＡ等を含むＤＮＡ及びＲＮＡのいずれでもよく限定はされないが、染色体ＤＮＡであることが好ましい。具体的には、本発明においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、前記口腔内細菌の染色体ＤＮＡ中の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。

　本発明に用い得るプローブは、検出目的となる各種の前記口腔内細菌に特異的な塩基配列となるような領域を選択してその領域の塩基配列を設計することが好ましい。一般的に、プローブの設計の際には、特異的な領域を選択することに加え、融解温度（Ｔｍ）がそろっていて、二次構造を形成しにくいものである必要がある。　　

　口腔内細菌の各々の種に対応する特異的な塩基配列は、例えば、マルチプルアラインメントをとり、種間で異なる領域にプローブを設計するなどの手段により見出すことができる。アラインメントをとるためのアルゴリズムには、特に限定はないが、より具体的な解析プログラムとしては、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８等のプログラムを利用することができる。アラインメントをとる際のパラメータは、各プログラムのデフォルト状態で実行してもよいが、プログラムの種類などに応じて適宜調整することができる。　　

　一方で、プローブの特異性は、属レベルの特異性を基に同じ属の細菌を一括に検出するものであってもよいし、個々の種レベルで検出可能な特異性であってもよく、細菌検出の目的に応じて適宜判断が可能である。

（３）プローブ（ｂ）について

　総量指標プローブは、特定のプライマー対で増幅できた、検体の中のすべての細菌を捕捉する目的のプローブである。細菌を検出する上では、検出対象細菌が、非検出対象細菌を含む全体の細菌の中でどの程度の割合であるのか、また、そもそも検体中にどれくらいの量の細菌が存在しているのかといった観点から細菌の総量を検出することもきわめて重要となる。

　非検出対象細菌は、存在や種類は分かっているが検出対象としなくてもよい細菌、及び存在や種類が不明である細菌の和（合計）として理解できる。

　細菌の総量を検出するためには、例えば、ＤＮＡチップとは独立に細菌の総量を測定することも可能であるが、ＤＮＡチップ中に細菌の総量の指標となるプローブを搭載しておくことにより操作の簡便性が向上する。プローブについては、プライマー対によって増幅される塩基配列の中から、多種類の菌種に共通な塩基配列を使用してもよい。そのような配列が見つからない場合は、比較的共通な配列を複数設計し、それらを総合的に判断することで総量指標プローブとしてもよい。総量指標プローブは、好ましくは、検体に含まれる細菌に由来する核酸にハイブリダイズするプローブ、詳しくは、前記特定のプライマー対により増幅される塩基配列のうちの、検出対象となる複数種類の細菌が共通に有する塩基配列を含むプローブである。総量指標プローブの例を、表２－１（配列番号１５９）に示す。

　総量指標は、個々の菌種特異的な増幅産物の合計量を表すため、一般的に量が多くなることから、目的のシグナル強度が、検出可能なシグナル強度の範囲を超えてしまうことがある。

　そのような状況を防ぐためには、ハイブリダイゼーションに供する検体量を制限することが望ましい。又は、プローブを設計する際には、例えば当該プローブのＴｍ値を低くする。具体的にはＧＣ含量を少なくすることや、プローブの配列長自体を短くする方法が考えられる。

　また、ハイブリダイゼーションに際して、増幅された核酸と総量指標プローブとのハイブリダイゼーションに対して競合的に作用するような核酸を添加することで、シグナル強度の低減化を図ることが可能である。このような核酸としては、例えば、総量指標プローブと全て又は部分的に同じ配列を有する核酸、又は総量指標プローブの相補配列を全て又は部分的に有する核酸などが挙げられる。

（４）プローブ（ｃ）について

　絶対量指標プローブは、絶対量指標の核酸にのみハイブリダイズするプローブである。

　本明細書において、絶対量指標とは、増幅反応やハイブリダイゼーション反応の前に、検体中に一定量添加する核酸である。絶対量指標は、通常の増幅反応を行えば増幅反応が確実に行われる核酸であり、いわゆる陽性コントロールとしての役割を果たす。

　従って、絶対量指標に特異的なプローブを、ＤＮＡチップに搭載しておけば、その検出結果から、増幅反応やハイブリダイゼーション等が適切に実施されたかを確認することができる。また、絶対量指標を１種類設定した場合、複数のＤＮＡチップから得られる絶対量指標のシグナル強度は一定になるはずであり、多少増幅効率やハイブリダイゼーション効率が増減した場合に、絶対量指標のシグナル強度を比較することにより補正係数を算出することができる。複数のＤＮＡチップにおいて、補正したシグナル強度は比較することができる。

　細菌それぞれに特異的なプローブの例を、表２－１に示す（配列番号９３～１５８）。また、絶対量指標用プローブの例を表２－１（配列番号１６０～１７４）に、また絶対量指標の例を表２－２（配列番号１７５～１８９）に示す。

　絶対量指標を増幅反応前に添加するのであれば、特定のプライマー対にて増幅される核酸であること、すなわちプライマー対と相補な塩基配列を所持していること、かつ、ハイブリダイゼーションで検出するためには、検出対象細菌、非検出対象細菌いずれにおいても所持していない塩基配列を所持している必要がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　特定のプライマーとは、増幅対象配列が限定されるという意味であり、プライマー対は必ずしも１対である必要はない。必要に応じて２対以上のプライマー対を用いるマルチプレックス手法も適用できる。プライマー対の例を表２－３に示す。細菌増幅用プライマー対（配列番号１９２～２０４）や、絶対量指標用プライマー対（配列番号１９０、１９１）を利用することが可能である。
　本発明のプライマー設計方法は、まず、解析対象細菌の多様性を示す可変領域を少なくともひとつ選択し、選択した可変領域の前後に、保存性の高いユニバーサルプライマー設計領域を選択し、プライマー配列を設計する。対象となる可変領域は、限定はされないが、ゲノム配列のうち、すべての細菌が有する１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子などが挙げられる。１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のうち、全長又は、可変領域Ｖ１－Ｖ９の一つ以上の領域を対象とすることが望ましい。より好ましくは、可変領域Ｖ３－Ｖ４を対象とすることが望ましい。
　プライマーの網羅性を評価するために、細菌のゲノム配列を広範囲に取得しているデータベースを活用する。具体的には、ＲＤＰ、ＮＣＢＩ、ＫＥＧＧ、ＭＧＤＢなどが挙げられる。
　一例として、設計したユニバーサルプライマー配列を、ＲＤＰのデータベースのＰｒｏｂｅ　Ｍａｔｃｈに入力する。結果の一覧において、Ｔｏｔａｌ　ｓｅａｒｃｈ中の完全一致数が得られる。完全一致数がＴｏｔａｌ　Ｓｅａｒｃｈに近いほど、その網羅性が高い。このとき、条件として、Ｓｔｒａｉｎは、Ｔｙｐｅを選択しても良い。また、Ｓｏｕｒｓｅは、Ｉｓｏｌａｔｅｓを選択しても良い。
　特定のプライマーとしては、配列番号１９３～１９８及び配列番号２０１～２０４に示される塩基配列（又は当該塩基配列に相補的な塩基配列）からなるＤＮＡからなるものが好ましい。これらのプライマーは、既存のプライマーよりも、歯周病細菌群に対して配列相同性が高いことから好ましい。
　特定のプライマーとしては、より好ましくは配列番号１９３～１９８及び２０３～２０４、さらに好ましくは配列番号１９７～１９８及び２０３～２０４、特に好ましくは配列番号１９８及び２０４に示される塩基配列（又は当該塩基配列に相補的な塩基配列）からなるＤＮＡからなるものである。
　上記の評価により、配列番号１９３～１９８及び２０３～２０４に示される塩基配列（又は当該塩基配列に相補的な塩基配列）からなるＤＮＡは、歯周病細菌群に対して配列相同性が１００％であることを確認している。
　特に、配列番号１９８及び２０４に示される塩基配列（又は当該塩基配列に相補的な塩基配列）からなるＤＮＡのプライマー対は、プライマーの配列と歯周病細菌群のゲノムＤＮＡ配列の相同性が１００％である点、及び、プライマー対の融解温度（Ｔｍ）とＧＣ含量の条件がそろう点で好ましい。一般に、プライマー対の設計の際には、融解温度（Ｔｍ）が近く、二次構造を形成しにくいものである必要がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　絶対量指標は、例えば、産業技術総合研究所が開発した定量解析用核酸標準物質を利用しても良いし、新たに設計しても良い。設計する場合には、例えば、ソフトウェア「ＥＸＣＥＬ」（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ社製）のＲＮＤＢＥＴＷＥＥＮ関数を使用し、１から４までの整数をランダムにＸ個（Ｘは任意の数）発生させ、それをつなげて１から４までの数値のみから構成されるＸ桁の数値とし、１をＡ、２をＴ、３をＣ、４をＧと置き換えることにより、ＡＴＧＣのＸ塩基によるランダム配列を多数得ることができる。
　これらの配列につき、ＧとＴの和がＡとＴの和と同数になる配列のみを抜粋し、抜粋された配列を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに対してＢｌａｓｔ検索し、生物由来の核酸に対し、類似配列の少ないものを選抜し、配列の両末端にプライマー配列を付加することで、設計可能である。また、設計された配列を適宜連結させて長くしたり、部分的に除去して短くしたりすることも可能である。
　増幅反応時における反応効率をなるべく一定にするために、検出対象細菌にて増幅される塩基長と絶対量指標の増幅塩基長は大きな差のないようにすることが望ましい。例えば、検出対象細菌の増幅産物が５００ｂｐ程度となるのであれば、絶対量指標の増幅産物は３００ｂｐから１０００ｂｐ程度とすることが望ましい。
　一方で、増幅後に電気泳動等で増幅鎖長を確認する場合においては、検出対象細菌とは異なる長さの増幅産物となるように設計した上で、絶対量指標由来の増幅産物を検出対象細菌のバンドとは異なる位置で検出し、ハイブリダイゼーションの前に増幅反応の成否を確認することも可能である。
　最後に、検体中に含まれる絶対量指標はあまりにも濃度が高いと検出対象の細菌と増幅反応における競合が激しくなり、本来検出できるはずの検出対象細菌が検出できなくなる可能性もあるため、アプリケーションに応じて適宜濃度調整をする必要がある。
　本発明に用いるプローブを設計する際は、ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーを考慮する必要がある。ストリンジェンシーをある程度緊密にすることによって、各種の口腔内細菌において各々の核酸中の特定の領域間で類似する塩基配列領域が存在しても、他の異なる領域を区別してハイブリダイズすることができる。また、当該特定の領域間の塩基配列がほとんど異なる場合は、ストリンジェンシーを緩やかに設定することができる。　　
　このようなストリンジェンシーの条件としては、例えば緊密条件の場合は５０～６０℃の条件下でのハイブリダイゼーションであり、ゆるやかな条件の場合は３０～４０℃の条件下でのハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーションの条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、４０℃」、「０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、３７℃」、「０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、３０℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、５０℃」、「０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、５５℃」、「０．０６Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．０６Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、６０℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、プローブを添加して１時間以上５０℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０中、５０℃で２０分の洗浄を４回、最後に、０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ、５０℃で１０分の洗浄を１回行う方法もある。ハイブリダイゼーション、又は洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件を設定することができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　４ｔｈ　ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　（２０１２）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７－１９９７））　等を参照することができる。
　本発明に用いるプローブの長さは、限定はされないが、例えば、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６～５０塩基であり、さらに好ましくは１８～３５塩基である。プローブの長さが適切であれば（前記範囲内であれば）、非特異的なハイブリダイゼーション（ミスマッチ）を抑制し、特異的な検出に使用することができる。
　本発明に用いるプローブの設計の際には、Ｔｍを確認しておくことが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッド形成する温度を意味し、鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡとプローブとが二本鎖を形成してハイブリダイズするためには、ハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こりやすくなるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとする核酸断片のＴｍはハイブリダイゼーションを行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプローブ設計用ソフトウェアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウェアとしては、例えばＰｒｏｂｅ　Ｑｕｅｓｔ（登録商標；ダイナコム社）などが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウェアを使わずに自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ　Ｎｅｉｇｈｂｏｒ　Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明のプローブにおいては、限定はされないが、平均Ｔｍが約３５～７０℃又は４５～６０℃であることが好ましい。なお、プローブとして特異的なハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量等があり、その条件は当業者に周知である。
　また、本発明に用いるプローブを構成するヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡ、又はＰＮＡのいずれであってもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡの２種以上のハイブリッドであってもよい。　　
　本発明に用いるプローブとしては、具体的には、例えば、以下の（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡの塩基配列を含むものが好ましく挙げられる。例えば、表２－３に示すプライマー（配列番号１９０～２０４）を用いて増幅する場合、前掲の表２－１（配列番号９３～１７４）に示す配列をプローブとすることが可能であり、配列番号１～８２に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列を用いることが好ましい。また、配列番号９３～１７４に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列の相補配列であってもよく、配列番号９３～１７４に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列と実質的に同一の配列又は配列番号９３～１７４に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列の相補配列と実質的に同一の配列であってもよい。
　ここで、実質的に同一とは、配列番号９３～１７４に記載の配列又は相補配列に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするものである。
　（ｄ）　配列番号９３～１７４に示される塩基配列からなるＤＮＡ　　
　（ｅ）　前記（ｄ）のＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ口腔内細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列を検出し得る機能を有するＤＮＡ　　
　プローブとしては、配列番号９７，１００，１２０，１２１，１２２，１２９，１３０，１５２，１５５のものが好ましい。配列番号９７，１００，１２１，１２２，１２５，１３０は、プローブ配列の塩基長を長くし、融解温度（Ｔｍ）を向上させることにより、検体由来ＤＮＡとの水素結合を促進させる点で好ましい。
　さらに、そのうちの配列番号１２１，１２２，１２９，１３０は、検出対象の細菌の複数株のゲノムＤＮＡ配列を参照し、一塩基多型に対応するために塩基配列が複数設定されている点で好ましい。
　また、配列番号１２０，１５２，１５５は、検出対象の細菌のゲノムＤＮＡ配列を参照し、より特異性の高い領域を選択し直した点で好ましい。これらのプライマーは、既存のプライマーよりも、歯周病細菌群に対して配列相同性が高いことから好ましい。
　前記（ｄ）の各種ＤＮＡについて、それらの具体的な塩基配列、プローブ名、検出対象となる口腔内細菌については、前掲の表２－１の記載が参照できる。ここで、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐｐ．用プローブは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
　ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ等を合わせた細菌量を示す。
　また、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｓｐｐ．用プローブ１は、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｓｐｕｔｉｇｅｎａ等を合わせた細菌量を示し、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｓｐｐ．用プローブ２は、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｏｃｈｒａｃｅａ等を合わせた細菌量を示す。また、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ用プローブは、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ
　ｓｕｂｓｐ．　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ等を合わせた細菌量を示す。また、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｐ．用プローブ２、３はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｓｈｏｗａｅ等を合わせた細菌量を示す。　
　また、前記（ｅ）のＤＮＡは、前記（ｄ）の各種ＤＮＡ若しくはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらを断片化したものをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、及びサザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、ｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、前記と同様のものを参照することができる。ハイブリダイズするＤＮＡとしては、前記（ｄ）のＤＮＡの塩基配列に対して少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
　本発明に用いるプローブは、例えば、通常のオリゴヌクレオチド合成法を使用して化学合成する（精製はＨＰＬＣ等により行う）ことにより作製することができる。そのようなプローブは、例えば、Ｐｒｏｂｅ　Ｑｕｅｓｔ（登録商標：ダイナコム社製）により設計することができる。また、本発明のプローブには、例えば、タグ配列などの付加配列が含まれていてもよい。
　本発明の方法において、検出目的となる前記口腔内細菌が有する核酸の塩基配列は、当該塩基配列そのものである必要はなく、塩基配列の一部が欠失、置換、挿入等により変異が生じたものであってもよい。したがって、検出目的の核酸の塩基配列は、当該塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつそれぞれの塩基配列に由来する機能や活性を有する変異型遺伝子も対象とすることができ、プローブは、このような変異型遺伝子の塩基配列を基礎として設計することもできる。ここで「ストリンジェントな条件」は、前記と同様の条件を適用することができる。
　２．口腔内細菌量の測定に用いる口腔内細菌遺伝子検出用ＤＮＡチップ
　前記したように、本発明の方法においては、ＤＮＡチップを用いることができ、当該ＤＮＡチップは、前記１.項で説明した各種オリゴヌクレオチドプローブが支持体となる基盤に複数配置されたものである。
　支持体となる基盤の形態としては、平板（ガラス板、樹脂板、シリコン板等）、棒状、ビーズ等のいずれの形態のものも使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔もって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０，　４６７－４７０　（１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１，　７６７－７７３　（１９９１）等参照）。他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、所定のプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるＤＮＡチップ（以下「繊維型ＤＮＡチップ」と言う）が好ましく例示できる。このマイクロアレイは、貫通孔基板に核酸を固定化したタイプのものと説明することもでき、いわゆる「貫通孔型ＤＮＡチップ」とも言われる（特許第３５１０８８２号公報等参照）。
　プローブの支持体への固定方法は限定されず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定することもできる。　　
　以下、ＤＮＡチップの一形態である繊維型ＤＮＡチップに関して詳細に説明する。このＤＮＡチップは、例えば、下記（ｉ）～（ｉｖ）の工程を経て作製することができる。
　（ｉ）　複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列して配列体を製造する工程　　
　（ｉｉ）　前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程　　
　（ｉｉｉ）　オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程　　
　（ｉｖ）　中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程　　
　中空繊維に使用される材料としては、限定はされないが、例えば、特開２００４－１６３２１１号公報等に記載の材料が好ましく挙げられる。
　中空繊維は、その長手方向の長さが同一となるように３次元に配列される（工程（ｉ））。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１－１０８９２８号公報参照）や、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ね合わせ、それらの孔部に中空繊維を通過させ、その後２枚の多孔板の間隔を開いて仮固定し、２枚の多孔板間における中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させて硬化させる方法（特開２００１－１３３４５３号公報参照）などが挙げられる。
　製造された配列体はその配列が乱れないように包埋される（工程（ｉｉ））。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂及びエポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法のほか、繊維どうしを熱融着により接着する方法等が好ましく挙げられる。
　包埋された配列体には、各中空繊維の中空部に、オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液（ゲル形成溶液）を充填し、中空部内で重合反応を行う（工程（ｉｉｉ））。これにより、各中空繊維の中空部に、プローブが固定されたゲル状物を保持させることができる。　　
　ゲル前駆体重合性溶液とは、ゲル形成重合性モノマー等の反応性物質を含有する溶液であって、該モノマー等を重合、架橋させることにより該溶液がゲル状物となることが可能な溶液をいう。そのようなモノマーとしては、例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドン、メチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。この場合、溶液には重合開始剤等が含まれていてもよい。　　
　中空繊維内にプローブを固定した後、中空繊維の長手方向と交差する方向（好ましくは直交する方向）で、ブロック体を切断して薄片化する（工程（ｉｖ））。このようにして得られた薄片は、ＤＮＡチップとして使用できる。当該ＤＮＡチップの厚みは、０．０１ｍｍ～１ｍｍ程度であることが好ましい。ブロック体の切断は、例えば、ミクロトーム及びレーザー等により行うことができる。　　
　前記した繊維型ＤＮＡチップとしては、例えば、三菱レイヨン社製ＤＮＡチップ（Ｇｅｎｏｐａｌ　ＴＭ）等が好ましく挙げられる。
　繊維型ＤＮＡチップでは、前記のように、プローブはゲル内で３次元的に配列され、３次元構造を維持することが可能となる。そのため、表面をコートしたスライドガラスにプローブを結合させた平面ＤＮＡチップに比べて、検出効率が上昇し、高感度で高再現性の検査をすることが可能となる。　　
　また、ＤＮＡチップに配置されるプローブの種類の数は、１つのＤＮＡチップに５００種類以下、好ましくは２５０種類以下、さらに好ましくは１００種類以下が好ましい。このように配置されたプローブ数（種類）をある程度制限することにより、目的の口腔内細菌をより高感度で検出することが可能となる。なお、プローブの種類は塩基配列によって区別される。従って、通常、同じ遺伝子に由来のプローブであっても塩基配列が１個でも異なれば別の種類として特定する。　　
　３．口腔内細菌遺伝子の検出
　本発明の方法において、口腔内細菌量を測定するために当該細菌の遺伝子を検出する方法は、例えば、下記の工程を含む方法である。
（ｉ）被験者から採取した口腔内試料を検体とし、検体中の核酸を抽出する工程　　
（ｉｉ）抽出した核酸を、前記した本発明のオリゴヌクレオチドプローブ又は本発明のＤＮＡチップに接触させる工程
（ｉｉｉ）ＤＮＡチップから得られたシグナル強度から細菌量を算出する工程
以下に、当該検出方法の詳細を工程ごとに説明する。
（１）工程（ｉ）について　　
　本工程では、被験者又は被生物から採取した口腔内試料を検体とし、検体中に含まれる細菌の核酸を抽出する。採取する口腔内試料の種類は、特には限定されない。例えば、唾液、プラーク（歯肉縁下プラーク、歯肉縁上プラーク）、舌苔、口腔洗浄液等を使用することができ、これらの中でもプラークが好ましく、その中でも、歯周病細菌が最も多く棲息している場所から採取する歯肉縁下プラークがより好ましい。
　口腔内試料を採取する方法は特には限定されず、試料の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、口腔内試料として唾液を使用する場合は、市販の唾液採取キットを利用する方法、綿棒を口に含み唾液を採取する方法、唾液を容器に直接採取する方法等が挙げられる。
　口腔内試料としてプラークを使用する場合、歯ブラシによる歯面や歯間のブラッシング、綿棒による歯面擦過、歯間ブラシによる歯間擦過、ペーパーポイント法等が挙げられる。プラークの採取に使用した歯ブラシ、綿棒、歯間ブラシ又はペーパーポイントを滅菌水中に浸して必要に応じて撹拌等することにより、プラークを溶解又は懸濁させ、得られた溶液又は懸濁液を検体とすることもできる。採取するプラークの量は特には限定されず、例えば、ペーパーポイント１本分あれば良い。
　口腔内試料として舌苔を使用する場合、綿棒による舌面擦過する方法等が挙げられる。プラークの採取に使用した綿棒を溶解又は懸濁させ、得られた溶液又は懸濁液を検体とすることもできる。採取する舌苔の量は特には限定されず、例えば、綿棒１本分あれば良い。
　口腔内試料として口腔洗浄液を使用する場合、口腔洗浄液又は水を口に含み、口腔洗浄液又は水とともに唾液を容器に採取し、得られた溶液を検体とする方法が挙げられる。口腔洗浄液としては、例えば滅菌された生理食塩水等が挙げられる。
　次いで、得られた口腔内試料中に存在する細菌の核酸抽出を行う。抽出の方法は限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、機器による自動抽出法、市販の核酸抽出キットを利用する方法、プロテイナーゼＫ処理後にフェノール抽出する方法、クロロホルムを利用する方法又は簡易抽出方法として、試料を加熱、溶解する方法等が挙げられる。また、特に検体中から核酸を抽出せず、次の工程に進んでも良い。
　検体から得られた核酸は、そのままＤＮＡチップ等に接触させてもよいし、ＰＣＲ等により所望の塩基配列領域を増幅し、その増幅断片をＤＮＡチップ等に接触させてもよく、限定はされない。得られた核酸をテンプレートとして増幅する領域は、本発明に用いるプローブ、又はＤＮＡチップに配置したオリゴヌクレオチドの塩基配列を含む核酸領域をコードする部位である。増幅する所望の領域は、限定はされず、前記口腔内細菌の種を問わず保存性の高い領域の塩基配列を利用し、多種類の混合物を一度に増幅して得ることができる。このような増幅のための配列は、実験的に単離、精製し、単離されたポリヌクレオチドの塩基配列を解析し、その配列に基づいて決定してもよいし、また、塩基配列等の各種データベースで既知の塩基配列を検索し、アラインメントを取ることなどによって、Ｉｎ　Ｓｉｌｉｃｏで決定してもよい。核酸又はアミノ酸などのデータベースは、特に限定されるものではないが、例えば、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ）、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｒｙ，　ＥＭＢＬ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔａ　ｌｉｂｒａｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔａ　ｂａｎｋ）、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＴａｘｏｎｏｍｙデータベース等を利用できる。
　具体的に、増幅する所望の部位としては、前記口腔内細菌の染色体ＤＮＡ中のリボソームＲＮＡ　（１６Ｓ　ｒＲＮＡ）遺伝子であることが好ましい。当該領域の増幅に用い得るＰＣＲプライマーとしては、例えば、表２－３の配列番号１９０～２０４が好ましく挙げられる。なお、ＰＣＲ法による核酸の増幅は、定法に従って行うことができる。
　本工程において抽出した核酸及びその増幅断片は、適宜標識化し、ハイブリダイズさせた後の検出過程において利用することも可能である。具体的には、ＰＣＲプライマーの末端を各種レポーター色素で標識しておく方法、反応性のヌクレオチドアナログを逆転写反応時に取り込ませる方法、ビオチン標識したヌクレオチドを取り込ませる方法などが考えられる。さらに、調製後に蛍光標識試薬と反応させて標識することも可能である。蛍光試薬としては、例えば、各種レポーター色素（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＶＩＣ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ　ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ　Ｙｅｌｌｏｗ等）を用いることができる。　　
（２）工程（ｉｉ）について
　本工程では、工程（ｉ）で得た核酸又はその増幅断片を、本発明に用いるプローブ又はＤＮＡチップに接触させるが、具体的には、当該核酸等を含むハイブリダイゼーション溶液を調製し、当該溶液中の核酸等を、ＤＮＡチップに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブに結合（ハイブリダイズ）させる。ハイブリダイゼーション溶液は、ＳＤＳやＳＳＣ等の緩衝液を用いて、定法に従い、適宜調製することができる。
　ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション溶液中の核酸等が、ＤＮＡチップに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう、反応条件（緩衝液の種類、ｐＨ、温度等）を適宜設定して行うことができる。なお、ここで言う「ストリンジェントな条件」とは、類似配列によるクロスハイブリダイゼーションを生じにくい、又は類似配列によってクロスハイブリダイゼーションした核酸を解離させる条件のことをいい、具体的には、ハイブリダイゼーション反応時又はハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの洗浄条件を意味する。
　例えば、ハイブリダイゼーション反応時の条件としては、反応温度は、３５～７０℃が好ましく、より好ましくは４０～６５℃であり、ハイブリダイズさせる際の時間は、約１分～１６時間が好ましい。
　また、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの洗浄条件としては、洗浄液組成は、０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０であることが好ましく、洗浄時の温度は、３５～８０℃又は４０～６５℃が好ましく、より好ましくは４５～６０℃である。より具体的には、塩（ナトリウム）濃度が４８～７８０ｍＭであり、温度が３７～８０℃である条件が好ましく、より好ましくは塩濃度が９７．５～３９０ｍＭであり、温度が４５～６０℃である条件である。
　洗浄後は、プローブに結合した核酸等の標識を検出できる装置により、スポットごとに検出強度を測定する。例えば、前記核酸等を蛍光標識化していた場合は、各種蛍光検出装置、例えば、ＣＲＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）、ａｒｒａｙＷｏＲｘ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ　４２８　Ａｒｒａｙ　Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，社製）、ＧｅｎｅＰｉｘ（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＳｃａｎＡｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）、ジェノパールリーダー（三菱レイヨン社製）などを用いて、蛍光強度を測定することができる。これらの装置については、蛍光スキャナーの場合は、例えば、レーザーの出力、検出部の感度を適宜調整してスキャンを行うことができ、ＣＣＤカメラ型のスキャナーの場合は、露光時間を適宜調節してスキャンを行うことができる。スキャンの結果に基づく定量方法は、定量ソフトウェアにより行う。定量ソフトウェアに特に限定はなく、スポットの蛍光強度の平均値、中央値等を用いて定量することができる。また、定量にあたっては、ＤＮＡフラグメントのスポット範囲の寸法精度などを考慮し、プローブを搭載していないスポットの蛍光強度をバックグラウンドとして用いるなど、調整を行うことが好ましい。
（３）工程（ｉｉｉ）について
　本工程では、前記の手順で得られたシグナル強度より、検出対象菌種の細菌の細菌量を算出する。たとえば、検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度とバックグラウンドのシグナル強度からＳＮ比として示す方法がある。又は、あらかじめ細菌ごとに細菌の染色体ＤＮＡの濃度を変えて複数条件にて検出し、各濃度条件で得られるシグナル強度を元に、細菌ごとに染色体ＤＮＡ濃度を算出する換算係数（検量線）を取得しておき、それぞれの条件で得られたシグナル強度から染色体ＤＮＡの濃度を算出する方法などが好ましい。
　いずれの場合でも、複数のＤＮＡチップの検出から得られる絶対量指標プローブのシグナル強度が一定となるようにＤＮＡチップごとに補正係数を算出し、各ＤＮＡチップの検出対象細菌のシグナル強度に補正係数を考慮することで、ＤＮＡチップ間の比較をしても良い。　　
　４．歯周病の重症度の判定
　歯周病の患者に加え、歯周病の自覚が無い者又は心疾患など歯周病と関連が示唆される全身疾患患者や妊婦に対しても、口腔内細菌の各細菌量を元に、歯周病の重症度を判定することができる。
　判定においては、具体的には、検出に使用したＤＮＡチップ上での標識物質の検出パターンが、被験者の口腔内細菌の特徴を示すものと考えられる。また、他の判定の態様としては、複数の検体に対し、検出に使用したＤＮＡチップ上での標識物質の検出パターンについて統計学的解析を行う態様が挙げられる。
　統計的解析の方法としては、例えば、相関解析、階層的クラスタリング及び非階層的クラスタリングなどがある。より具体的には、相関解析時に用いる距離関数として、Ｐｅａｒｓｏｎ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ、Ｃｏｓｉｎｅ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　等の手法が挙げられる。また、階層的クラスタリングとしては、ＵＰＧＭＡ（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ－ｐａｉｒ　ｇｒｏｕｐ　ｍｅｔｈｏｄｕｓｉｎｇ　ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ　ａｖｅｒａｇｅｓ）などの手法が挙げられる。このような解析手法を用い、クラスター解析を行うことにより、被験者のグループ化が可能であり、さらには被験者の類比などを判定することができる。
　本発明において、検体中の口腔内細菌の検出の結果を、これまで蓄積した検体の検出結果とあわせて統計解析することにより、その類似度から、歯周病検体、歯周病初期検体又は健常検体のいずれかの重症度に応じたグループに分類することができる。この分類の結果、つまり、検体の細菌量から、潜在的な疾患活動性を示唆することができる。また、これらの結果を元に、特定の複数種の細菌の細菌量を独立した変数とみなして回帰分析することにより、歯周病重症度の該当グループ予測や歯周ポケットの深さの予測における予測精度を算出することもできる。
　本発明の方法の第一の態様によれば、複数の細菌の情報から精度良く歯周病の重症度を判定することができるため、歯周病の重症度を示す客観的指標になる。
　５．歯周病の治療効果の判定
　本発明の方法の前述した第二の態様における、歯周病治療効果を判定する方法は、前記３.項で説明した口腔内細菌遺伝子の検出方法を用いて得られた細菌の検出結果を指標として、歯周病の治療効果を判定する方法である。
　歯周病治療前及び治療後に検体を採取し比較検討を行う場合は、治療前後に増減した細菌を明らかにすることにより、その治療効果を客観的に判定することができる。また、治療後の細菌データにより、治療により減少しにくかった細菌を明らかにすることができ、特異的に治療することにも可能になる。
　治療とは、歯科の現場で歯科医師や歯科衛生士が一般的に実施している治療を示し、例えば、歯周基本治療としては、プラークコントロール（歯みがき指導）及び歯石の除去（スケーリング・ルートプレーニング）及びかみ合わせの調整等が挙げられる。さらに、歯周基本治療の後の再評価検査の結果、歯石がポケットの深いところに入り込んでいて除去できず、治っていない場合に実施する外科的治療としては、フラップ手術及び歯周組織再生療法及びプラスチックサージェリー（歯周形成外科手術）等も挙げられる。
　判定においては、具体的には、検出に使用したＤＮＡチップ上での標識物質の検出パターンが、被験者の口腔内細菌の特徴を示すものと考えられる。また、他の判定の態様としては、複数の検体に対し、検出に使用したＤＮＡチップ上での標識物質の検出パターンについて統計学的解析を行う態様が挙げられる。
　統計的解析の方法としては、例えば、ｔ検定やノンパラメトリック手法相関解析などがある。より具体的には、スチューデントのｔ検定や異分散の場合はウェルチのｔ検定等の手法が挙げられる。このような解析手法を用い、検体の臨床情報や細菌量の有意差検定が可能であり、治療効果を判定することができる。
　前記治療前における細菌量と前記治療後における細菌量とを比較し、比較結果が、総菌量、又はＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのうち少なくとも一つの細菌量が減少しているときは、歯周病の治療効果が認められたと判定することができる。
　また、総菌量に対するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐｐ．の割合が、治療前における割合に比べて増加している場合も治療効果が認められたと判定できる。
　一方、治療前後における比較結果が、総菌量、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ
　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのうちのいずれの細菌量も減少していないときは、歯周病の治療効果が認められないと判定することができる。
　本発明の方法の第二の態様によれば、複数の細菌の情報から歯周病の治療効果を判定することができるため、歯周病の治療効果の客観的指標になる。
　６．歯周病の悪化リスクの判定
　本発明の方法の前述した第三の態様における、歯周病の悪化リスクを判定する方法は、前記３.項で説明した口腔内細菌遺伝子の検出方法を用いて得られた細菌の検出結果を指標として、歯周病の悪化リスクを判定する方法である。　　
　例えば、一名の被験者に対し、定期的に判定することにより、その悪化リスクをモニタリングすることができる。歯周病の患者に加え、歯周病の自覚が無い者又は心疾患など歯周病と関連が示唆される全身疾患患者や妊婦に対しても、口腔内細菌の各細菌量を元に、歯周病の重症度を判定することができる。
　悪性度の高い歯周病細菌の細菌はまったく、又は、ほとんど検出されないが、ある特定の細菌の細菌量が有意に高い検体の場合、悪化のリスクがあると判定する。悪化とは、今後、歯周ポケットの深さが深くなることや、又は、悪性度の高い歯周病細菌の細菌量が増加していくことを示す。
　判定においては、具体的には、検出に使用したＤＮＡチップ上での標識物質の検出パターンが、被験者の口腔内細菌の特徴を示すものと考えられる。また、他の判定の態様としては、複数の検体に対し、検出に使用したＤＮＡチップ上での標識物質の検出パターンについて統計学的解析を行う態様が挙げられる。
本発明において、口腔内細菌の検出において、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａのうちいずれもまったく、又は、ほとんど検出されず、さらにＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの細菌量が有意に検出された場合、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの細菌量、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａの細菌量及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの細菌量の合計に対する、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの細菌量の比率が大きいような場合、歯周病悪化リスクが高いと判定することができる。
　一方、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａのうちいずれも検出されず、さらにＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの細菌量も有意に検出されない場合、又はＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの細菌量、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａの細菌量及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの細菌量の合計に対する、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの細菌量の比率が小さい場合は、歯周病悪化リスクが低いと判定することができる。
　本発明の方法の第三の態様によれば、複数の細菌の情報から精度良く歯周病の悪化リスクを判定することができるため、予防に活かすことができる。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[実施例１－１]
唾液検体を用いた歯周病/う蝕の状態の判定
＜ＤＮＡの調製＞
　成人健常者５名（２０歳代から５０歳代の男女）の協力により唾液評価試験を実施した。この５名を被験者Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅとし、唾液を評価した。
　唾液採取は、γコレクトスワブＲＩ（栄研化学）を１分間口に含み唾液を採取する方法とした。γコレクトスワブＲＩをチューブ中の水に浸漬し室温で５分静置し、細菌成分を溶出させた。その後、γコレクトスワブＲＩを取り出し、チューブを遠心分離機にかけた。得られたペレットに対し、ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡを抽出した。
＜ＤＮＡの評価＞
ＤＮＡを１０ｐｇ程度に希釈し、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてＰＣＲを行い、増幅、標識した。プライマーには配列番号１，２，９１，９２を利用した。ＰＣＲ液組成（２０μＬ系）は表１－３に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
ＰＣＲ条件は表１－４に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　ＰＣＲ終了後、それぞれにハイブリダイゼーション反応液１８０μＬ（１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　４８μＬ，　１Ｍ　ＮａＣｌ　４８μＬ，　０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０　２０μＬ，　水　６５μＬ）を添加した。ハイブリ前処理として、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００にて９４℃１分反応させ、４℃で待機させた。
　自動ハイブリ洗浄装置（三菱レイヨン）にて、５０℃２時間ハイブリダイゼーションした。その後洗浄した。
　測定に使用したＤＮＡチップに搭載したプローブは表１－５に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　検出には、ジェノパールリーダー（三菱レイヨン）を用いて、露光時間０．１、１，４，４０秒で評価した。
　＜結果＞
  １ｍＬ唾液中の細菌数として表１－６に示す結果が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　＜判定＞
（１）歯周病の状態の判定
　被験者Ａは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。
　口腔内試料中に含まれる細菌のうち、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの少なくとも１種類の細菌数の合計が、総菌数に対して０．０５％未満の場合を「軽度」、総菌数に対して０．０５％以上０．５％未満の場合を「中程度」、総菌数に対して０．５％以上の場合を「重度」であると判定する基準（本明細書中の判定基準２）に基づいて、被験者Ａの歯周病に対する判定は「軽度」であった。
　被験者Ｂは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。
　被験者Ａと同様の基準に基づいて、「軽度」と判定された。
　被験者Ｃは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が３５７７８１２となり、総菌量に対する割合は１．７％であった。
　被験者Ａと同様の基準に基づいて、「重度」と判定された。
　被験者Ｄは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。
　被験者Ａと同様の基準をもとにすると、「軽度」に分類された。
　被験者Ｅは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が３３９２４１となり、総菌量に対する割合は０．４％であった。
　被験者Ａと同様の基準に基づいて、「中程度」と判定された。
　（２）う蝕の状態の判定
　被験者Ａは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。
　口腔内試料中に存在する細菌のうち、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの細菌数が、総菌数に対して０．０５％未満の場合を「軽度」、総菌数に対して０．０５％以上２．５％未満の場合を「中程度」、総菌数に対して２．５％以上の場合を「重度」であると判定する基準（本明細書中の判定基準５）に基づいて、「軽度」であると判定された。
　被験者Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの細菌数が１８８６２となり、総菌量に対する割合は０．０１％であった。被験者Ａと同様の基準に基づいて、「軽度」と判定された。
　被験者Ｃは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。被験者Ａと同様の基準に基づいて、「軽度」と判定された。
　被験者Ｄは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの細菌数が　１７７３６となり、総菌量に対する割合は０．０５％であった。被験者Ａと同様の基準に基づいて、「中程度」と判定された。
　被験者Ｅは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの細菌数が　１８８０８となり、総菌量に対する割合は０．０２％であった。被験者Ａと同様の基準に基づいて、「軽度」と判定された。
　１度のサンプリングで、歯周病及びう蝕に関連する細菌の情報を包括的に取得することができ、歯周病及びう蝕の細菌数から状態の判定を同時に行うことができた（表１－７）。
　被験者Ａ及びＢは、歯周病の状態もう蝕の状態も軽度であることが分かった。被験者Ｃは、歯周病の状態は重度でう蝕の状態は軽度であることが分かった。被験者Ｄは、歯周病の状態は軽度でう蝕の状態は中程度であることが分かった。被験者Ｅは、歯周病の状態は中程度でう蝕の状態は軽度であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
[実施例１－２]
プラーク検体を用いた歯周病/う蝕の状態の判定
＜歯肉縁下プラーク検体の調製＞

　大阪大学歯学部附属病院にて、被験者５名の協力により歯肉縁下プラーク評価試験を実施した。この５名を被験者Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊとし、歯肉縁下プラークを評価した。
　歯肉縁下プラークは、Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ　ｐａｐｅｒ　ｐｏｉｎｔｓ（ＩＳＯ　Ｃｏｌｏｒ－Ｃｏｄｅｄ）＃４０（ＤＥＮＴＳＰＬＹ　ＭＡＩＬＬＥＦＥＲ社製）を２本、歯周ポケットに挿入して３０秒間置いた。その後、０．１５ｍＬの滅菌蒸留水を入れたマイクロチューブにペーパーポイントを投入し、２０秒間ボルテックスした。ペーパーポイントを滅菌したピンセットで取り出して、検出まで－２０℃で凍結して保管した。
　凍結保管していた検体を融解し、ＰＣＲテンプレートとした。、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてＰＣＲを行い、増幅、標識した。プライマーには配列番号１，２，９１，９２を利用した。ＰＣＲ液組成（２０μＬ系）は表１－８に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
ＰＣＲ条件は表１－９に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　ＰＣＲ終了後、それぞれにハイブリダイゼーション反応液１８０μＬ（１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　４８μＬ，　１Ｍ　ＮａＣｌ　４８μＬ，　０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０　２０μＬ，　水　６５μＬ）を添加した。ハイブリ前処理として、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００にて９４℃１分反応させ、４℃で待機させた。
　自動ハイブリ洗浄装置（三菱レイヨン）にて、５０℃２時間ハイブリダイゼーションした。その後洗浄した。
　測定に使用したＤＮＡチップに搭載したプローブは表１－１０に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　検出には、ジェノパールリーダー（三菱レイヨン）を用いて、露光時間０．１、１，４，４０秒で評価した。
　＜結果＞
  ペーパーポイント１本中の細菌数として表１－１１に示す結果が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　＜判定＞
（１）歯周病の状態の判定
　被験者Ｆは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が２４５８となり、総菌量に対する割合は６．５％であった。
　口腔内試料中に含まれる細菌のうち、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの少なくとも１種類の細菌数の合計が、総菌数に対して０．０５％未満の場合を「軽度」、総菌数に対して０．０５％以上０．５％未満の場合を「中程度」、総菌数に対して０．５％以上の場合を「重度」であると判定する基準（本明細書中の判定基準１）に基づいて、被験者Ｆの歯周病に対する判定は「重度」であった。
　被験者Ｇは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。
　被験者Ｆと同様の基準に基づいて、「軽度」と判定された。
　被験者Ｈは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。
　被験者Ｆと同様の基準に基づいて、「軽度」と判定された。
　被験者Ｉは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が８４となり、総菌量に対する割合は０．２３％であった。
　被験者Ｆと同様の基準をもとにすると、「中程度」に分類された。
　被験者Ｊは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの３種類の菌の合計細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。
　被験者Ｆと同様の基準に基づいて、「軽度」と判定された。
　（２）う蝕の状態の判定
　被験者Ｆは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。
　口腔内試料中に存在する細菌のうち、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの細菌数が、総菌数に対して０．０５％未満の場合を「軽度」、総菌数に対して０．０５％以上２．５％未満の場合を「中程度」、総菌数に対して２．５％以上の場合を「重度」であると判定する基準（本明細書中の判定基準２）に基づいて、「軽度」であると判定された。
　被験者Ｇは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの細菌数が３となり、総菌量に対する割合は０．０６％であった。被験者Ｆと同様の基準に基づいて、「中程度」と判定された。
　被験者Ｈは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの細菌数が６となり、総菌量に対する割合は０％であった。被験者Ｆと同様の基準に基づいて、「軽度」と判定された。
　被験者Ｉは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。被験者Ｆと同様の基準に基づいて、「軽度」と判定された。
　被験者Ｊは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの細菌数が０となり、総菌量に対する割合は０％であった。被験者Ｆと同様の基準に基づいて、「軽度」と判定された。
　１度のサンプリングで、歯周病及びう蝕に関連する細菌の情報を包括的に取得することができ、歯周病及びう蝕の細菌数から状態の判定を同時に行うことができた（表１－１２）。　被験者Ｈ及びＪは、歯周病の状態もう蝕の状態も軽度であることが分かった。被験者Ｆは、歯周病の状態は重度でう蝕の状態は軽度であることが分かった。被験者Ｇは、歯周病の状態は軽度でう蝕の状態は中程度であることが分かった。被験者Ｉは、歯周病の状態は中程度でう蝕の状態は軽度であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
[実施例２－１]
歯周病の重症度、悪化リスクの判定
　歯肉縁下プラーク検体中の口腔内細菌の検出
＜歯肉縁下プラーク検体の調製＞
　大阪大学歯学部附属病院にて、歯周病治療前の状態の２０歳代から７０歳代の男女２２０名の被験者から、歯肉縁下プラークを採取した。歯肉縁下プラークは、Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ　ｐａｐｅｒ　ｐｏｉｎｔｓ（ＩＳＯ　Ｃｏｌｏｒ－Ｃｏｄｅｄ）＃４０（ＤＥＮＴＳＰＬＹ　ＭＡＩＬＬＥＦＥＲ社製）を２本、歯周ポケットに挿入して３０秒間置いた。その後、０．１５ｍＬの滅菌蒸留水を入れたマイクロチューブにペーパーポイントを投入し、２０秒間ボルテックスした。ペーパーポイントを滅菌したピンセットで取り出して、検出まで－２０℃で凍結して保管した。
＜臨床情報の取得＞
　すべての検体について臨床情報を下記の基準に従って数値化した。下記４項目は歯科において広く活用されている指標である。
　（ｉ）歯周ポケットの深さ（Ｐｄ）：歯周プローブをポケットに挿入した際の，歯肉辺縁からプローブ先端までの距離を示す。１ｍｍ単位で数値化した。
　（ｉｉ）プロービング時の出血（ＢＯＰ）：歯周プローブをポケットに挿入した際に出血の有無を示す。出血がない場合を０、出血がある場合を１とした。
　（ｉｉｉ）Ｇｉｎｇｉｖａｌ　Ｉｎｄｅｘ（ＧＩ）：歯肉の炎症の程度を示す。炎症が認められない場合を０、軽度の炎症の場合を１、中等度の炎症の場合を２、高度の炎症の場合を３とした。
　（ｉｖ）Ｐｌａｑｕｅ　Ｉｎｄｅｘ（ＰｌＩ）：歯肉に隣接した歯面のプラーク沈着量を示す。プラークは認められない場合を０、プラークが肉眼的には認められないがプローブで擦過して認められる場合を１、プラークが視認できる場合を２、プラークが多量に認められる場合を３とした。
＜ＰＣＲ＞
　前記の凍結保管していたすべての検体を融解し、ＰＣＲテンプレートとした。検体中の口腔内細菌の１６ＳｒＲＮＡの検出対象領域の配列を増幅するために、以下の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ用キットは、Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑTM　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により行った。プライマーは下記の配列を有するプライマーを用いた。なお、フォワードプライマーは５’末端がＣｙ５で標識化されているものを用いた。
フォワードプライマー（細菌増幅用）：
　５’－Ｃｙ５－ＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ－３’（配列番号１９２）
リバースプライマー（細菌増幅用）：
　５’－ＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＡＣＣ－３’（配列番号２００）
フォワードプライマー（絶対量指標増幅用）:
　５’－Ｃｙ５－ＧＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＧＴＡＡＣＧＴＣ－３’（配列番号１９０）
リバースプライマー（絶対量指標増幅用）:
　５’－ＣＴＣＴＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＧＧ－３’（配列番号１９１）
＜反応液組成＞
２×Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）
　　Hot Start Version　　　　　　　　　　　　　　 １０μＬ　　
４μＭフォワードプライマー（細菌増幅用）　　　　　　１μＬ　　
４μＭリバースプライマー（細菌増幅用）　　　　　　　１μＬ　　
４μＭフォワードプライマー（絶対量指標増幅用）　　　１μＬ　　
４μＭリバースプライマー（絶対量指標増幅用）　　　　１μＬ　　
テンプレートＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　５μＬ　　
絶対量指標　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μＬ　　
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μＬ
＜反応条件＞
　９５℃で１分間加熱後、「解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（３０ｓｅｃ）→合成：７２℃（２０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計４０サイクル行い、４℃で冷却し、増幅産物を得た。
＜ＤＮＡチップ：口腔内細菌検出用ＤＮＡチップの製造＞
　貫通孔型のＤＮＡチップを、特開２００７－７４９５０号公報（メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡの検出方法）の実施例２－１に記載の方法と同様の方法で製造を行った。　
　ただし、搭載させたオリゴヌクレオチドプローブは、表２－４に示す配列情報をもつプローブを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
＜ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション＞
　以下のように各溶液を混合し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
ＰＣＲ後に得たＤＮＡ増幅産物　　２０μＬ
１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　　　　　４８μＬ
１Ｍ　ＮａＣｌ　　　　　　　　　４８μＬ
０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０　　　　２０μＬ
水　　　　　　　　　　　　　　　６４μＬ　 
合計　　　　　　　　　　　　　　２００μＬ
　２００μＬのハイブリダイゼーション溶液を前記ＤＮＡチップに接触させ、５０℃で２時間ハイブリダイゼーションした。
　ハイブリダイゼーション後、下記の条件でＤＮＡチップを洗浄した。０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０溶液１０００μＬで２２０秒の洗浄を１２回繰り返し、続いて、０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ１０００μＬで２２０秒の洗浄を４回繰り返した。
　洗浄終了後に、各チップを室温の０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ混合溶液に移した。
＜検出＞
　前記洗浄後、ジェノパールリーダー（三菱レイヨン社製）を用い、下記条件でＤＮＡチップの各スポットの蛍光強度を測定した。
＜検出条件＞
中心励起波長　：６３３ｎｍ　　
露光時間　：０．１、１、４、４０秒
＜結果＞
　検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度を、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）で除算し、ハイブリダイゼーションに由来する蛍光強度（以後、シグナル強度と呼ぶ）のＳＮ比を算出した。ＳＮ比は対数関数Ｌｏｇ２で示した。２２０検体すべてについて、検出対象細菌ごとに、０から最大値１０のＳＮ比のデータを得た。対数関数の性質より、１以上で検出され、１未満は検出限界以下と判断する。
＜臨床情報と細菌量の相関解析：歯周病の重症度＞　まず、検体ごとに、各臨床情報及び各細菌量を示すＳＮ比のデータを対応させた。その後、検体の臨床情報及び細菌量を類似度によって分類するためクラスター分析を行った。臨床情報４項目（Ｐｄ，ＢＯＰ，ＧＩ，ＰｌＩ）及び表２－４のプローブから得られた細菌量２８種類の数値をクラスター分析し、各クラスターのヒートマップを作成した。クラスター解析には、統計ソフトウェア「Ｒ」（Ｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏｒｅ　Ｔｅａｍ）を用いた。解析条件は、生物学の統計解析で一般的に用いられる条件である、距離関数はＰｅａｒｓｏｎ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを、クラスターの結合方法はＷａｒｄ法を利用した。
＜結果＞
　検体は図１のように、大きく３つのクラスターに分類された。３つのクラスターの臨床情報の特徴を明らかにするため、各クラスターをグループ１，２，３と示し、グループごとのＰｄ、ＢＯＰ、ＧＩ、ＰｌＩ及び各細菌量の平均値及び標準偏差を算出した（表２－５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　「歯周病の検査・診断・治療計画の指針　２００８」歯周病学会編 Ｐ．１６によると
、Ｐｄが６ｍｍ以上、又は４～５ｍｍ、又はそれ以下の条件で歯周病の治療計画が変わることから、グループ１は重度歯周病検体、グループ２は歯周病初期検体、グループ３は健常検体に相当すると考えられる。
　一方、臨床情報及び細菌の検出項目は、図２のように大きく３つのクラスターに分類された。
　また、図３の結果より、歯周病の重症度を示す指標を下記のように見出した。図３のヒートマップでは、各項目の数値が低いほうから緑→赤（淡→濃）と表示した。
　グループＡは、臨床情報と「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」であるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」の次に悪性度が高いグループに属するＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ等から構成されていた。グループＡの項目はグループ１の検体において最も高く検出され、グループ２さらにはグループ３になるにつれ、検出量が少なくなった。前記の７菌の細菌量は臨床情報と相関又は逆相関の高い情報であり、歯周病重症度を示す指標といえる。
　ここで、グループ２の検体のうち、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの検出量はグループ１と同じように高く検出されているが、臨床情報ＰＤや「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」の数値は低いサブグループ２－１を見出した。このサブグループは、「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」が増殖する前にＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍが増加している状態で、今後「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」が増殖し、Ｐｄの増加等歯周病が悪化していく可能性が高いと考えられる。つまり、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの細菌量、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａの細菌量、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａの細菌量の合計に対する、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの細菌量が悪化リスクの判定指標になると考えられる。
　続いて、グループＢは、比較的悪性度の低い細菌から構成されていた。特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐｐ．３、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｕｌａの３菌はグループ１の検体において低く検出され、グループ２及びグループ３において検出量が高くなった。つまり、臨床情報の数値が下がるにつれ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｕｌａの３菌の細菌量が増加しており、これらは歯周病重症度を示す指標といえる。
　続いて、各細菌量の情報を独立した変数とみなし、重症度のグループ分けを目的変数として、回帰分析した。その結果、1菌種の情報と比較して、３菌種、６菌種、さらには８菌種の場合に、その決定係数は１に近づいた。また、同様に各細菌量の情報を独立した変数とみなし、歯周ポケットの数値を目的変数として、回帰分析したところ、同様の傾向であった。このように、測定細菌種類を増やすことで、重症度グループの予測及び歯周ポケット等の臨床情報の予測精度が高まった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
[実施例２－２]
歯周病の治療効果の判定
　治療前及び治療後のプラーク検体の細菌検出
＜プラーク検体の調製＞
　治療前及び治療後のプラーク検体の細菌量を比較する為に、大阪大学歯学部附属病院にて、歯周病治療前及び治療後の歯肉縁下プラークを２０歳代から７０歳代の男女６５症例から採取した。治療は、歯周基本治療である、歯石の除去（スケーリング・ルートプレーニング）を実施した。
　歯肉縁下プラークは、Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ　ｐａｐｅｒ　ｐｏｉｎｔｓ（ＩＳＯ　Ｃｏｌｏｒ－Ｃｏｄｅｄ）＃４０（ＤＥＮＴＳＰＬＹ　ＭＡＩＬＬＥＦＥＲ社製）を２本、歯周ポケットに挿入して３０秒間置いた。その後、０．１５ｍＬの滅菌蒸留水を入れたマイクロチューブにペーパーポイントを投入し、２０秒間ボルテックスした。ペーパーポイントを滅菌したピンセットで取り出して、検出まで－２０℃で凍結して保管した。
＜ＤＮＡチップ：口腔内細菌検出用ＤＮＡチップの製造＞
　貫通孔型のＤＮＡチップを、特開２００７－７４９５０号公報（メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡの検出方法）の実施例２－１に記載の方法と同様の方法で製造を行った。
　搭載させたオリゴヌクレオチドプローブは、表２－７に示す配列情報をもつプローブを用いた。
　ＰＣＲ，ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション、検出までは実施例２－１と同様に実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
＜結果＞
　検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度から、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値及び標準偏差の３倍）を減算し、ハイブリダイゼーションに由来するシグナル強度を算出した。続いて、複数枚のＤＮＡチップに対し、絶対量指標プローブのシグナル強度を比較し、各ＤＮＡチップの補正係数を求め、検出対象細菌のシグナル強度を補正し比較できるようにした。その後、事前に決定していた各細菌量算出係数を乗算し、各検出対象の細菌量をゲノムコピー数で算出した。各細菌量算出係数は、各細菌由来ゲノムＤＮＡを検出したときのシグナル強度を測定し検量線を作成しておき、各細菌のシグナル強度から各細菌量を逆算する係数を求めておいた。最後に、ＰＣＲテンプレートに利用した検出検体の希釈率を乗算し、ペーパーポイント１本あたりの細菌数を算出した。
　前記の計算により、のべ１３０検体すべてについて、検出対象細菌ごとに、０から１０の７乗の位まで細菌数のデータを得た。続いて、治療前及び治療後の各項目の平均値及び標準偏差を算出した（表２－８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
＜治療前及び治療後の細菌データの比較＞
　治療前の細菌量から治療後の細菌量を減算した結果、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ
　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ及び総菌数の細菌量は低下していた。これらの増減は、スチューデントのｔ検定で有意差基準５％を基準すると、いずれも有意差が認められた。また、総菌数に対する各細菌量の割合を算出し、治療前後で比較した場合、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐｐ．の割合は有意に増加していた。
　以上の結果から、治療前後の細菌量、特にＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐｐ．の細菌量を比較することで、歯周病の治療効果を判定可能であることを見出した。
　また、６５症例のうち、治療後に「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」の細菌量が減少していない症例は７症例あった。これらの歯は、いずれも臼歯であり、解剖学的に臼歯の歯石除去が困難である事実と一致する。また、７症例の中には、Ｐｄの数値が増加して臨床情報としても悪化している唯一の症例が含まれており、治療効果が得られなかった症例を見逃さずにとらえていた。さらに、その他の６症例は、Ｐｄは改善傾向又は同程度であり、「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」の細菌量は、同程度又は増加傾向であった。これらの結果から、細菌量は臨床情報として観察される情報と相関があり、かつ、疾患活動性を示す指標として提案できると考えられる。
　ここで、Ｊ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｃａｒｅ　Ｄｅｎｔ．　２００３；　５：　４２－６１．によると、臼歯における歯石除去率は、専門医であってもＰｄが１～３ｍｍの場合９１％、Ｐｄが４～６ｍｍの場合６１％、Ｐｄが７ｍｍ以上の場合３７％と報告されている。本検討は、約９０％の症例で「Ｒｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ」の細菌量が減少しており、報告例と比較しても矛盾のない範囲で、良好な試験であったといえる。
[実施例２－３]
ユニバーサルプライマーの設計
　本発明のユニバーサルプライマーは、以下の配列含む。
前記１．項の手順に従って、１６ＳｒＲＮＡの可変領域として、Ｖ３及びＶ４を選択した。Ｖ３及びＶ４領域の前後に、保存性の高いユニバーサルプライマー設計領域を選択し、配列番号１９２～２０４に示す配列を設計した。設計したユニバーサルプライマー配列を、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　Ｄａｔａｂａｓｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）のデータベースのＰｒｏｂｅ　Ｍａｔｃｈの機能を利用し、条件として、Ｓｔｒａｉｎは、Ｔｙｐｅを選択し、Ｓｏｕｒｓｅは、Ｉｓｏｌａｔｅｓを選択し、各スコア「Ｈｉｔｓ」を抽出した。総数に対するスコア「Ｈｉｔｓ」の値で、その網羅性を評価した。
　ただし、サンプルＮｏ．１～５の組み合わせにおいては、歯周病細菌のゲノムＤＮＡとプライマー配列の相同性が１００％であり、サンプルＮｏ．６～８の組み合わせにおいては、上記の相同性が１００％でなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
[実施例２－４]
ユニバーサルプライマーの網羅性評価
＜測定対象＞
　ＡＴＣＣより購入した、各種細菌由来ゲノムＤＮＡを測定対象とした。
＜ＰＣＲ＞
　細菌由来ゲノムＤＮＡの１６ＳｒＲＮＡの検出対象領域の配列を増幅するために、以下の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ用キットは、Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑTM　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、増幅反応を実施した。プライマーは表２－１０に示すプライマー条件とした。なお、フォワードプライマーは５’末端がＣｙ５で標識化されているものを用いて、増幅産物の末端を標識した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
＜反応液組成＞　　
２×Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）
　　Hot Start Version　　　　　　　　　　　　　 　１０μＬ　　
４μＭフォワードプライマー（細菌増幅用）　　　　　　１μＬ　　
４μＭリバースプライマー（細菌増幅用）　　　　　　　１μＬ　　
テンプレートＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　５μＬ　　
絶対量指標　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μＬ　
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μＬ　　　
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μＬ　　
＜反応条件＞　　
　９５℃で１分間加熱後、「解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（３０ｓｅｃ）→合成：７２℃（２０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計４０サイクル行い、４℃で冷却し、増幅産物を得た。　　
＜ＤＮＡチップ：口腔内細菌検出用ＤＮＡチップの製造＞
　貫通孔型のＤＮＡチップを、特開２００７－７４９５０号公報（メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡの検出方法）の実施例２－１に記載の方法と同様の方法で製造を行った。　　
　ただし、搭載させたオリゴヌクレオチドプローブは、表２－１１に示す配列情報をもつプローブを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
＜ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション＞
　以下のように各溶液を混合し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
ＰＣＲ後に得たＤＮＡ増幅産物　　２０μＬ
１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　　　　　４８μＬ
１Ｍ　ＮａＣｌ　　　　　　　　　４８μＬ
０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０　　　　２０μＬ
水　　　　　　　　　　　　　　　６４μＬ　　
合計　　　　　　　　　　　　　２００μＬ
　自動ハイブリ洗浄装置（三菱レイヨン社製）を用い、２００μＬのハイブリダイゼーション溶液を前記ＤＮＡチップに接触させ、５０℃で２時間ハイブリダイゼーションした。
　ハイブリダイゼーション後、下記の条件でＤＮＡチップを洗浄した。０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０溶液１０００μＬで２２０秒の洗浄を１２回繰り返し、続いて、０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ１０００μＬで２２０秒の洗浄を４回繰り返した。
　洗浄終了後に、各チップを室温の０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ混合溶液に移した。
＜検出＞
　前記洗浄後、ジェノパールリーダー（三菱レイヨン社製）を用い、下記条件でＤＮＡチップの各スポットの蛍光強度を測定した。
＜検出条件＞
中心励起波長　：６３３ｎｍ　　
露光時間　：０．１、１、４、４０秒
＜結果＞
　検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度から、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）を減算し、ハイブリダイゼーションに由来する蛍光強度（以後、シグナル強度と呼ぶ）を算出した。その結果、表２－１２に示すとおり、サンプルＮｏ．６，７，８でシグナル強度が３０００以下と十分得られなかったゲノムＤＮＡに対して、サンプルＮｏ．２，３，４では、目的のプローブスポットにおいて、３００００以上の十分量のシグナル強度が得られた。また、いずれのプライマー対でも配列相同性が１００％であり、ポジティブコントロールとして設定した、サンプルＮｏ．１，５では、ともに十分量のシグナル強度が得られていた。
　実施例２－３において、Ｃｙ５－Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ１６Ｓ－ＦＷＤ６及びＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＲＶＳ４　２０１６の、総数に対するスコア「Ｈｉｔｓ」の値が、Ｃｙ５－Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ１６Ｓ－ＦＷＤ及びＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＲＶＳ２　２０１４よりも高かったことは、本実施例（実施例２－４）において、Ｃｙ５－Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ１６Ｓ－ＦＷＤ６及びＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＲＶＳ４　２０１６の細菌由来ゲノムＤＮＡの検出能力が向上した結果と整合性のある結果であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
[実施例２－５]
細菌検出用ＤＮＡプローブの設計
　本発明の細菌検出用ＤＮＡプローブは、配列番号９７，１００，１２０，１２１，１２２，１２９，１３０，１５２，１５５の配列が対象である。
　１６ＳｒＲＮＡの可変領域として、Ｖ３及びＶ４を選択した。Ｖ３及びＶ４領域のうち、各細菌が特異的に有する配列を選抜し、特異性がすでに十分な場合は、よりＴｍが向上するような配列を選択した。また、細菌の株によって、多型配列を有する場合は、その点を考慮し、複数の配列を設定した。
［比較例１］
細菌検出用ＤＮＡプローブの評価
＜測定対象＞
　ＡＴＣＣより購入した、各種細菌由来ゲノムＤＮＡを測定対象とした。
＜ＰＣＲ＞
　細菌由来ゲノムＤＮＡの１６ＳｒＲＮＡの検出対象領域の配列を増幅するために、以下の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ用キットは、Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑTM　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、増幅反応を実施した。プライマーは以下に示すプライマー条件とした。なお、フォワードプライマーは５’末端がＣｙ５で標識化されているものを用いて、増幅産物の末端を標識した。
＜プライマー配列＞
フォワードプライマー：
　５’Ｃｙ５－ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’（配列番号２０５）
リバースプライマー：
　５’－ＣＲＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＹＧＴＴ－３’（配列番号２０６；ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）
＜反応液組成＞
２×Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）
　Hot Start Version　　　　　　　　　　　　　 　１０μＬ　　
４μＭフォワードプライマー（細菌増幅用）　　　　　１μＬ　　
４μＭリバースプライマー（細菌増幅用）　　　　　　１μＬ　　
テンプレートＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　５μＬ　　
絶対量指標　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μＬ　
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μＬ　　　　
合計　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　２０μＬ　　
＜反応条件＞
　９５℃で１分間加熱後、「解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（３０ｓｅｃ）→合成：７２℃（２０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計４０サイクル行い、４℃で冷却し、増幅産物を得た。
＜ＤＮＡチップ：口腔内細菌検出用ＤＮＡチップの製造＞
　貫通孔型のＤＮＡチップを、特開２００７－７４９５０号公報（メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡの検出方法）の実施例２－１に記載の方法と同様の方法で製造を行った。　　
　ただし、細菌検出用ＤＮＡプローブとして、配列番号９５、９７、９９、１００、１２０、１２２、１２３、１２４、１２７、１２９、１３０、１５１、１５２、１５４、１５５、１５９の配列を含むＤＮＡマイクロアレイを作成した。
＜ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション＞
　以下のように各溶液を混合し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
ＰＣＲ後に得たＤＮＡ増幅産物　　　　２０μＬ
１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　　　　　　　４８μＬ
１Ｍ　ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　４８μＬ
０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０　　　　　　２０μＬ
水　　　　　　　　　　　　　　　　　６４μＬ　　
合計　　　　　　　　　　　 　　　２００μＬ
　自動ハイブリ洗浄装置（三菱レイヨン社製）を用い、２００μＬのハイブリダイゼーション溶液を前記ＤＮＡチップに接触させ、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションした。
　ハイブリダイゼーション後、下記の条件でＤＮＡチップを洗浄した。０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０溶液１０００μＬで２２０秒の洗浄を１２回繰り返し、続いて、０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ１０００μＬで２２０秒の洗浄を４回繰り返した。
　洗浄終了後に、各チップを室温の０．２４Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ　ＮａＣｌ混合溶液に移した。
＜検出＞
　前記洗浄後、ジェノパールリーダー（三菱レイヨン社製）を用い、下記条件でＤＮＡチップの各スポットの蛍光強度を測定した。
＜検出条件＞
中心励起波長　：６３３ｎｍ
露光時間　：０．１、１、４、４０秒
＜結果＞
　検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度から、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）を減算し、ハイブリダイゼーションに由来する蛍光強度（以後、シグナル強度と呼ぶ）を算出した。その結果、表２－１３に示すとおり、既存プローブの配列番号９５，９９，１１９，１２７，１５１、１５４のシグナル強度と比較して、本発明のプローブである配列番号９７，１００，１２０，１２１，１２２，１２９，１３０，１５２，１５５では、目的のプローブスポットにおいて、およそ２から５倍程度高いシグナル強度が得られた。
　以上の結果より、本発明のプローブはいずれも検出感度の高い改良プローブであることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　配列番号１～２０６：合成核酸

Claims (15)

  1. 　被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中に存在する細菌量を測定することにより、歯周病及び／又はう蝕の状態を判定する、口腔内検査方法。
  2. 　口腔内試料中に存在する細菌の総菌数に対する特定の細菌の菌数の割合を求めることにより、歯周病及び／又はう蝕の状態を判定する、請求項１記載の方法。
  3. 　口腔内試料として唾液を用いる場合、唾液中に存在する細菌のうち、
    Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａからなる群から選ばれる少なくとも１種類の細菌の菌数の合計が、
    総菌数に対して０．０１％未満の場合を、歯周病の症状が「軽度」、
    総菌数に対して０．０１％以上０．５％未満の場合を、歯周病の症状が「中程度」、
    総菌数に対して０．５％以上の場合を、歯周病の症状が「重度」
    であると判定する、請求項２記載の方法。
  4. 　口腔内試料として唾液を用いる場合、唾液中に存在する細菌のうち、
    Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓの菌数が、
    総菌数に対して０．０５％未満の場合を、う蝕の症状が「軽度」、
    総菌数に対して０．０５％以上２．５％未満の場合を、う蝕の症状が「中程度」、
    総菌数に対して２．５％以上の場合を、う蝕の症状が「重度」
    であると判定する、請求項２記載の方法。
  5. 　口腔内試料としてプラークを用いる場合、プラーク中に存在する細菌のうち、
    Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａからなる群から選ばれる少なくとも１種類の細菌の菌数の合計が、
    総菌数に対して０．１％未満の場合を、歯周病の症状が「軽度」、
    総菌数に対して０．１％以上５％未満の場合を、歯周病の症状が「中程度」、
    総菌数に対して５％以上の場合を、歯周病の症状が「重度」
    であると判定する、請求項２記載の方法。
  6. 　被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中の
    特定の細菌の細菌量、
    口腔内試料中に存在する総菌量、又は
    特定の細菌量と口腔内試料中に存在する総菌量の両方
    を測定する工程、及び
    　得られた測定結果について統計解析を行うことにより、歯周病の重症度を判定する工程
    を含む、請求項１記載の方法。
  7. 　歯周病の治療前後における被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中の
    特定の細菌の細菌量、
    口腔内試料中に存在する総菌量、又は
    特定の細菌量と口腔内試料中に存在する総菌量の両方
    を測定する工程、
    　前記治療前における細菌量と前記治療後における細菌量との比較結果に基づいて、歯周病の治療効果を判定する工程
    を含む、請求項１記載の方法。
  8. 　被験者から採取された口腔内試料から口腔内試料中の
    特定の細菌の細菌量、
    口腔内試料中に存在する総菌量、又は
    特定の細菌量と口腔内試料中に存在する総菌量の両方
    を測定する工程、及び
    　得られた細菌量の比率に基づいて、歯周病の悪化リスクを判定する工程
    を含む、請求項１記載の方法。
  9. 　口腔内試料中の特定の細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属及びＣａｎｄｉｄａ属に属する細菌からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項６又は７に記載の方法。
  10. 　口腔内試料中の特定の細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ　ｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ　ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ　ｂｖ　２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｕｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ　ＩＩ及びＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｎｏｘｉａからなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項６又は７記載の方法。
  11. 　口腔内試料中の特定の細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｒｅｃｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ及びＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｕｌａからなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項６又は７記載の方法。
  12. 　口腔内試料中の特定の細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａからなる群から選ばれる少なくとも一種及びＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍである、請求項８記載の方法。
  13. 　以下の（１）～（３）の工程を含む細菌数の算定方法により口腔内試料中に存在する細菌数を測定する、請求項１記載の方法。
    （１）被検サンプルから得られるデータを絶対量指標プローブのシグナル強度と比較し、補正する工程
    （２）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から細菌数算出式を求める工程
    （３）上記（２）の工程で得た算出式を用いて、上記（１）の工程で補正したシグナル強度から各検出対象菌種の細菌数を算定する工程
  14. 　配列番号１９３～１９８及び２０１～２０４に示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡのうちの１種又は２種以上からなる、プライマー又はプライマーセット。
  15. 　配列番号９７、１００、１２０、１２１、１２２、１２９、１３０、１５２若しくは１５５に示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは、
    　該ＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ口腔内細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列を検出し得る機能を有するＤＮＡ
    を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
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