CN111542617B - 牙周袋炎症面积的推定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供简便地预测炎症面积(PISA值、CAPRS值)等牙周组织的炎症程度的方法及该方法中使用的器件(DNA芯片等)。本发明提供检测唾液中2种以上细菌的细菌量并以得到的检测结果作为指标来推定牙周袋炎症面积的方法，被检测的细菌包含：该细菌的细菌量与牙周袋炎症面积显示出正相关关系的细菌、以及该细菌的细菌量与牙周袋炎症面积显示出负相关关系的细菌。
Description
技术领域
本发明涉及推定牙周袋炎症面积的方法。
背景技术
牙周病的诊断通过牙周袋的测定、附着水平、X射线影像诊断等来进行。然而，这些诊断方法对受检者造成的负担大，特别是在对大量的人实施诊断时需要相当多的时间。另外，这些牙周病诊断方法的操作步骤繁杂，因基于牙科医生的经验、技能而存在判定基准方面存在个人差异等的问题。
因此，一直以来提出了简便的牙周病的诊断方法。例如，专利文献1中公开了一种利用龈沟液中包含的蛋白质作为牙周病疾病标记物的牙周病诊断方法。另外，专利文献2中公开了一种通过分析唾液中的多种蛋白质来预测牙周袋探诊深度(PPD)、牙龈探诊出血指数(BOP)的方法。然而，通常对于PPD、BOP，由于存在168个部位(28个牙齿×6点法)的测定部位，因此实际上对哪个部位进行预测尚不清楚。
另一方面，更普遍的是如专利文献3所公开的那样实施龈沟液中存在的牙周病细菌的测定、唾液中的牙周病细菌的测定。作为与唾液中存在的牙周病细菌相对应的指标，提出了根据牙周袋探诊深度(PPD)和牙龈探诊出血指数(BOP)计算出的炎症面积(PISA值)(非专利文献1)。PISA值可通过用由牙周袋探诊深度(PPD)计算出的PESA值(牙周袋内表面积)乘以牙龈探诊出血指数(BOP)而算出。
另外，与此不同的是泷泽等人提出了CAPRS值(非专利文献2)。如文献记载所述，该指标是通过如下方式计算而得到的：根据附着水平求出临床牙根表面积(位于比龈缘靠近根尖侧的牙根的表面积的总和；Clinical Area of ToothRoot Surface；CARS)，然后由该值减去有效牙根表面积的值。实际上可认为，可置换成龈缘的位置全部与解剖学牙颈线一致的情况来计算，这与非专利文献1的Fig1.(b)所示的PESA的值相同。CAPRS值虽然没有在计算中考虑到牙龈探诊出血指数(BOP)，但如文献记载所述，面积本身可近似于袋内表面的炎症区域，可以与PISA值一同视为“牙周袋炎症面积”。
一直以来，为了简便地评价这些“牙周袋炎症面积”，对与唾液中的牙周病细菌数的关系进行了研究，但P.g菌(Porphyromonas gingivalis(牙龈卟啉单胞菌))的菌数与CAPRS值之间、以及红色络合物菌(P.g菌、T.d菌(Treponema denticola(齿垢密螺旋体))、T.f菌(Tannerella forsythensis(福赛斯坦纳氏菌)))的菌数与CAPRS值之间没有相关性(非专利文献2、图3a,b)，尚不知晓根据唾液样品来简便地预测“牙周袋炎症面积”的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2004-51536号公报
专利文献2：日本专利第5869323号
专利文献3：日本专利第4917815号
非专利文献
非专利文献1：Periodontal inflamed surface area:quantifyinginflammatory burden.J Clin Periodontol.2008Aug；35(8):668-73.
非专利文献2：“作为牙周病的全身疾病相关检查标记物的牙周袋面积评价方法的临床的意义(歯周病の全身疾患関連検査マーカーとしての歯周ポケット面積評価法の臨床的意義)”日本口腔检查学会杂志第1卷第1号：7-12、2009
发明内容
发明要解决的问题
在这样的情况下，期望提供基于唾液中的细菌量的检测结果来推定牙周袋炎症面积的方法。
另外，在这样的情况下，期望提供基于唾液中的细菌量的检测结果来简便地预测炎症面积(PISA值)等这样的牙周组织的炎症程度的方法。
用于解决问题的方法
本发明是考虑到上述情况而完成的，提供以下所示的推定牙周袋炎症面积的方法及综合地推定牙周组织的炎症程度的方法。
[1]检测唾液中2种以上细菌的细菌量并以得到的检测结果作为指标来推定牙周袋炎症面积的方法，被检测的细菌包含：
该细菌的细菌量与牙周袋炎症面积显示出正相关关系的细菌、以及
该细菌的细菌量与牙周袋炎症面积显示出负相关关系的细菌。
[2]根据[1]所述的方法，其中，所述牙周袋炎症面积由PISA或CAPRS的值表示。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，显示出正相关关系的细菌为选自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、福赛斯坦纳氏菌(Tannerella forsythia)、具核梭杆菌动物亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.animalis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus)、具核梭杆菌具核亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.nucleatum)、有害月形单胞菌(Selenomonas noxia)、小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)、戈氏链球菌(Streptococcus gordonii)、具核梭杆菌文氏亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii)、中间链球菌(Streptococcusintermedius)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)、生痰二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga sputigena)、伴放线菌团聚杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans)、具核梭杆菌多形亚种(Fusobacterium nucleatumsubsp.polymorphum)、牙周梭杆菌(Fusobacterium periodonticum)、SR1 sp.OT 345、卡托氏卟啉单胞菌(Porphyromonas catoniae)、生痰月形单胞菌(Selenomonas sputigena)、变黄奈瑟氏球菌(Neisseria flavescens)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、微小小单胞菌(Parvimonas micra)、胃消化链球菌(Peptostreptococcus stomatis)、索氏密螺旋体(Treponema socranskii)、隐藏真杆菌(Eubacterium saphenum)、缠结真杆菌(Eubacterium nodatum)、中间密螺旋体(Treponema medium)、龈沟产线菌(Filifactoralocis)及牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis)中的至少1种。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，显示出负相关关系的细菌为选自变异链球菌(Streptococcus mutans)、龋齿放线菌(Actinomyces odontolyticus)、缓症链球菌bv 2(Streptococcus mitis bv 2)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、简明弯曲杆菌(Campylobacter concisus)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga gingivalis)、苍白普雷沃氏菌(Prevotella pallens)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、沟迹真杆菌(Eubacterium sulci)、胶胨罗斯氏菌(Rothia mucilaginosa)、栖牙普雷沃氏菌(Prevotella denticola)、非典型韦荣氏球菌(Veillonella atypica)、栖组织普雷沃氏菌(Prevotella histicola)、小核桃形巨球形菌(Megasphaera micronuciformis)及副血链球菌(Streptococcus parasanguinis)中的至少1种。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其具有以下的工序(1)～(4)：
(1)从牙周袋炎症面积已知的被检者的唾液样品检测唾液中的各种细菌的细菌量的工序；
(2)对于该各种细菌的细菌量，求出每种菌固有的与牙周袋炎症面积的相关系数，构建各种细菌的细菌量与牙周袋炎症面积的关系式，并制作预测模型的工序；
(3)从牙周袋炎症面积未知的被检者的唾液样品检测唾液中的各种细菌的细菌量的工序；
(4)将(3)中得到的各种细菌量代入(2)中得到的关系式来推定牙周袋炎症面积的工序。
[6]根据[5]所述的方法，其中，所述预测模型的制作方法为使用选自线性回归、回归树、模型树、神经网络、支持向量机、套袋法(bagging)、提升方法(boosting)、随机森林的机器学习算法中的1种方法。
[7]一种综合地推定牙周组织的炎症程度的方法，该方法包括：检测唾液中1种以上的细菌的细菌量并以得到的检测结果作为指标。
[8]根据[7]所述的方法，其中，牙周组织的炎症程度为PISA或CAPRS的值。
[9]根据[7]或[8]所述的方法，其中，被检测的细菌的细菌量为唾液中的该细菌的拷贝数。
[10]根据[7]～[8]中任一项所述的方法，其中，被检测的细菌的细菌量是基于唾液中该细菌的16S rRNA序列信息的细菌量。
[11]根据[7]～[10]中任一项所述的方法，其中，被检测的细菌为属于选自卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、坦纳氏菌属(Tannerella)、密螺旋体属(Treponema)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、团聚杆菌属(Aggregatibacter)、二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)、艾肯氏菌属(Eikenella)、放线菌属(Actinomyces)、韦荣氏球菌属(Veillonella)及月形单胞菌属(Selenomonas)中的至少1个属的细菌。
[12]根据[7]～[11]中任一项所述的方法，其中，被检测的细菌为选自变异链球菌、龋齿放线菌、缓症链球菌bv 2、缓症链球菌、简明弯曲杆菌、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、昭和弯曲杆菌(Campylobacter showae)、变黑普雷沃氏菌(Prevotella nigrescens)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、内氏放线菌II(Actinomyces naeslundii II)、星群链球菌(Streptococcusconstellatus)、纤细弯曲杆菌(Campylobacter gracilis)、牙周梭杆菌、具核梭杆菌多形亚种、伴放线菌团聚杆菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、中间链球菌、具核梭杆菌文氏亚种、戈氏链球菌、小韦荣氏球菌、有害月形单胞菌、具核梭杆菌具核亚种、直肠弯曲杆菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌动物亚种、福赛斯坦纳氏菌及齿垢密螺旋体中的至少1种。
[13]根据[7]～[12]中任一项所述的方法，其中，被检测的细菌包括该细菌的细菌量与牙周组织的炎症程度可以成为正相关关系的细菌。
[14]根据[13]所述的方法，其中，所述可以成为正相关关系的细菌为选自牙周梭杆菌、具核梭杆菌多形亚种、伴放线菌团聚杆菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、中间链球菌、具核梭杆菌文氏亚种、戈氏链球菌、小韦荣氏球菌、有害月形单胞菌、具核梭杆菌具核亚种、直肠弯曲杆菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌动物亚种、福赛斯坦纳氏菌及齿垢密螺旋体中的至少1种。
[15]根据[7]～[12]中任一项所述的方法，其中，被检测的细菌包括该细菌的细菌量与牙周组织的炎症程度可以成为负相关关系的细菌。
[16]根据[15]所述的方法，其中，所述可以成为负相关关系的细菌为选自变异链球菌、龋齿放线菌、缓症链球菌bv 2、缓症链球菌、简明弯曲杆菌、中间普雷沃氏菌、昭和弯曲杆菌、变黑普雷沃氏菌、啮蚀艾肯氏菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、内氏放线菌II、星群链球菌及纤细弯曲杆菌中的至少1种。
发明的效果
根据本发明，能够基于唾液中的细菌量的检测结果简便地预测牙周袋炎症面积。即，即使不进行精密的牙周病检查(袋实测、影像)，也可以通过使用采集到的唾液来简便地推定口腔整体的炎症程度。
另外，根据本发明，能够基于唾液中的细菌量的检测结果简便地预测炎症面积(PISA值、CAPRS值)这样的牙周组织的炎症程度。即，即使不进行精密的牙周病检查(袋实测、影像)，也可以通过使用采集到的唾液来简便地推定口腔整体的炎症程度(炎症指标数值)。
附图说明
图1-1是示出由各细菌量的SN比计算出的PISA预测的模型树的图。
图1-2是示出由各细菌量的SN比计算出的PISA预测的模型树的图(图1-1的延续。图1-1的用方框包围的编号1号与图1-2的21号连接。)。
图2是示出根据图1的模型树预测的PISA值(横轴)与PISA实测值(纵轴)的散点图的图。
图3是示出基于芯片间校正后的各细菌量的SN比制作模型树并根据该模型树预测的PISA值(横轴)与PISA实测值(纵轴)的散点图的图。
图4-1是示出使用全部46个数据中的34个数据并根据芯片间校正后的各细菌量的SN比计算出的PISA预测的模型树的图。
图4-2是示出使用全部46个数据中的34个数据并根据芯片间校正后的各细菌量的SN比计算出的PISA预测的模型树的图(图4-1的延续。图4-1的用方框包围的编号1号与图4-2的11号、且图4-1的13号与图4-2的12号连接。)。
图5是示出用于制作图4的模型树的34个数据所预测的PISA值(横轴)与PISA实测值(纵轴)的散点图的图。
图6是示出全部46个数据中、未用于制作模型的剩余12个数据的PISA实测值(纵轴)与根据图4的模型树预测的PISA值(横轴)的散点图的图。
图7是示出PISA实测值与“相对于总菌量的3种菌的比率(公知)”的散点图(左)、PISA实测值与PISA预测值的散点图(右)的比较的图。
图8是示出PISA实测值和显示出正相关的细菌与显示出负相关的细菌之比(“平衡指标”)的散点图的图。
图9是用56种样品进行试验，以确认到与PISA值(横轴)在统计学上显著相关的细菌种类的细菌量作为解释变量，通过多元回归分析制作预测模型式来预测PISA值(纵轴)的结果的散点图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细地说明。本发明的范围不受这些说明的限制，在以下的示例以外，可以在不损害本发明主旨的范围内适宜变更并实施。需要说明的是，本说明书中所引用的全部刊物、例如现有技术文献及公开公报、专利公报、其它专利文献作为参照引入本说明书中。
作为本发明的第一方式的推定牙周袋炎症面积的方法的发明(以下也称为“第一发明组”)包括以下的工序。
i)检测唾液中2种以上的细菌的细菌量的工序、以及ii)以得到的检测结果作为指标来推定牙周袋炎症面积的工序。
作为本发明的第二的方式的综合地推定牙周组织的炎症程度的方法(以下也称为“第二发明组”)的发明包括以下的工序。
i)检测唾液中(受检者、特别是人的唾液中)1种以上的细菌的细菌量的工序、以及ii)以得到的检测结果作为指标来综合地推定牙周组织的炎症程度的工序。
1.用于检测唾液中的细菌的细菌量的寡核苷酸探针
在本发明的方法中，在从被检者采集到的唾液中测定口腔内的细菌量时，可以使用DNA芯片。该DNA芯片能够搭载例如以下的探针(a)(细菌特异性探针)，另外，还能够搭载探针(b)(总量指标探针)、探针(c)(绝对量指标探针)。
(a)细菌特异性探针：包含与成为检测对象的细菌的基因(或其一部分)特异性杂交的核酸的探针
(b)总量指标探针：包含与全部细菌的基因杂交的核酸的探针
(c)绝对量指标探针：由分别与1种或多种绝对量指标特异性杂交的核酸组成的探针
需要说明的是，通常DNA芯片是配置有探针的基板的总称。另外，对DNA芯片及DNA微阵列等名称不分别进行区分，作为同义词处理。
(1)成为检测对象的唾液中的细菌
在本发明的方法中，作为成为检测对象(细菌量的测定对象)的唾液中的细菌，没有限定，例如，优选为属于以下所列举的各属的细菌，即优选为属于选自卟啉单胞菌属、坦纳氏菌属、密螺旋体属、普雷沃氏菌属、弯曲杆菌属、梭杆菌属、链球菌属、团聚杆菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、艾肯氏菌属、放线菌属、韦荣氏球菌属、月形单胞菌属、真杆菌属(Eubacterium)、小单胞菌属(Parvimonas)、产线菌属(Filifactor)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、细小杆菌属(Solobacterium)、罗斯氏菌属(Rothia)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、孪生球菌属(Gemella)、棒杆菌属(Corynebacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、短链小球菌属(Granulicatella)、巨球形菌属(Megasphaera)、以及SR1门中的至少1种的属的细菌。
更具体而言，更优选以选自以下所列举的各种细菌中的至少1种或2种以上作为检测对象。
牙龈卟啉单胞菌
福赛斯坦纳氏菌
齿垢密螺旋体
纤细弯曲杆菌
直肠弯曲杆菌
昭和弯曲杆菌
具核梭杆菌文氏亚种
具核梭杆菌多形亚种
具核梭杆菌动物亚种
具核梭杆菌具核亚种
牙周梭杆菌
中间普雷沃氏菌
变黑普雷沃氏菌
星群链球菌
伴放线菌团聚杆菌
简明弯曲杆菌
牙龈二氧化碳嗜纤维菌
黄褐二氧化碳嗜纤维菌
生痰二氧化碳嗜纤维菌
啮蚀艾肯氏菌
戈氏链球菌
中间链球菌
缓症链球菌
缓症链球菌bv 2
龋齿放线菌
小韦荣氏球菌
内氏放线菌II
有害月形单胞菌
变异链球菌
缠结真杆菌
微小小单胞菌
龈沟产线菌
表兄链球菌
巴斯德卟啉单胞菌(Porphyromonas pasteri)
非典型韦荣氏球菌
副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)
拟普雷沃氏菌属(A.rava,OT 308)
副血链球菌
衣氏放线菌
苍白普雷沃氏菌
洛氏普雷沃氏菌(Prevotella loescheii)
栖组织普雷沃氏菌
莫氏细小杆菌(Solobacterium moorei)
产黑色素普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)
生痰月形单胞菌
龋齿罗斯氏菌(Rothia dentocariosa)
胶胨罗斯氏菌
罗氏韦荣氏球菌(Veillonella rogosae)
胃消化链球菌
栖牙普雷沃氏菌
牙髓卟啉单胞菌
唾液链球菌
葛氏放线菌(Actinomyces graevenitzii)
中间密螺旋体
索氏密螺旋体
溶血孪生球菌(Gemella sanguinis)
卡托氏卟啉单胞菌
马氏棒杆菌(Corynebacterium matruchotii)
隐藏真杆菌
变黄奈瑟氏球菌
邻接短链小球菌(Granulicatella adiacens)
沟迹真杆菌
小核桃形巨球形菌
夏氏普雷沃氏菌(Prevotella shahii)
SR1 sp.OT 345
在“第一发明组”中，可使用细菌的细菌量与牙周袋炎症面积显示出正相关关系(细菌量增加时牙周袋炎症面积增加的关系)的细菌(以下，有时简称为“显示出正相关关系的细菌”)、以及细菌的细菌量与牙周袋炎症面积显示出负相关关系(细菌量增加时牙周袋炎症面积减少的关系)的细菌(以下，有时简称为“显示出负相关关系的细菌”)。
牙周袋炎症面积是包含PISA(periodontal inflamed surface area：牙周炎症表面积)、CAPRS(conccaled area in periodontal pockt of tooth root surfase：牙周袋内牙根表面积)的表示炎症的面积，只要是相同概念的指标就也包括该指标。
PISA值是以平方毫米(mm2)表示口腔整体的牙周组织的炎症部位面积的值，可以基于牙周袋表面积(PESA)和探诊时的有无出血(bleeding on probing：BOP)来计算。牙周袋表面积(PESA)可以根据按牙齿种类事先规定的面积和牙周袋的深度(PPD)来计算。作为非专利文献1的追加信息，附加了6点法的自动计算电子表格(Excel文件)(https://www.parsprototo.info/pisa.html)，只要看到Excel文件中记载的计算式，任何人都能够确认上述计算方法。
如文献记载所述，CAPRS值是基于附着水平求出临床牙根表面积(位于比龈缘更靠近根尖侧的牙根的表面积的总和；Clinical Area of ToothRoot Surface；CARS)后，由该值减去有效牙根表面积的值而计算得到的。实际上可认为，可置换成龈缘的位置全部与解剖学牙颈线一致的情况来计算，这与非专利文献1的Fig1.(b)所示的PESA的值相同。CAPRS值虽然没有在计算中考虑到牙龈出血指数(BOP)，但如文献记载所述，面积本身可近似于袋内表面的炎症区域，可以与PISA值一同视为“牙周袋炎症面积”。牙周袋炎症面积优选以PISA或CAPRS的值表示。
显示出正相关关系的细菌和显示出负相关关系的细菌可以利用能够测定细菌量(或SN比这样的与细菌量成比例的测定量)的工具来确认。工具没有特别限定，例如可以使用DNA芯片。
在使用DNA芯片进行确认时，用DNA芯片测定口腔内试样，然后计算出牙周袋炎症面积与各细菌的细菌量或SN比这样的测定量的相关系数，可以分类、鉴定为相关系数为正值的细菌群和为负值的细菌群。对于这些细菌而言，测定次数为40次以上的情况下，相关系数的绝对值优选为0.02以上，更优选为0.1以上，进一步优选为0.2以上，特别优选为0.4以上，最优选为0.6以上。
在后述的用于推定牙周袋炎症面积的预测模型的制作中使用实验误差校正后的数据时，细菌群的分类也使用实验误差校正后的数据。
作为显示出正相关关系的细菌，例如，可优选列举出以下所列举的细菌。优选将这些细菌中的至少1种、更优选将2种以上作为检测对象。
齿垢密螺旋体
福赛斯坦纳氏菌
具核梭杆菌动物亚种
牙龈卟啉单胞菌
直肠弯曲杆菌
具核梭杆菌具核亚种
有害月形单胞菌
小韦荣氏球菌
戈氏链球菌
具核梭杆菌文氏亚种
中间链球菌
黄褐二氧化碳嗜纤维菌
生痰二氧化碳嗜纤维菌
伴放线菌团聚杆菌
具核梭杆菌多形亚种
牙周梭杆菌
SR1 sp.OT 345
卡托氏卟啉单胞菌
生痰月形单胞菌
变黄奈瑟氏球菌
表兄链球菌
微小小单胞菌
胃消化链球菌
索氏密螺旋体
隐藏真杆菌
缠结真杆菌
中间密螺旋体
龈沟产线菌
牙髓卟啉单胞菌
作为显示出负相关关系的细菌，例如，可优选列举出以下所列举的细菌。优选将这些细菌中的至少1种、更优选将2种以上作为检测对象。
变异链球菌
龋齿放线菌
缓症链球菌bv 2
缓症链球菌
简明弯曲杆菌
牙龈二氧化碳嗜纤维菌
苍白普雷沃氏菌
唾液链球菌
沟迹真杆菌
胶胨罗斯氏菌
栖牙普雷沃氏菌
非典型韦荣氏球菌
栖组织普雷沃氏菌
小核桃形巨球形菌
副血链球菌
对于“第二发明组”而言，分别优选列举出细菌的细菌量相对于牙周组织的炎症程度等(PISA值或CAPRS值)具有正相关关系的细菌或具有负相关关系的细菌。
作为上述具有正相关关系的细菌，例如可优选列举出以下所列举的细菌，优选将这些细菌中的至少1种、更优选将2种以上作为检测对象。
齿垢密螺旋体
福赛斯坦纳氏菌
具核梭杆菌动物亚种
牙龈卟啉单胞菌
直肠弯曲杆菌
具核梭杆菌具核亚种
有害月形单胞菌
小韦荣氏球菌
戈氏链球菌
具核梭杆菌文氏亚种
中间链球菌
黄褐二氧化碳嗜纤维菌
生痰二氧化碳嗜纤维菌
伴放线菌团聚杆菌
具核梭杆菌多形亚种
牙周梭杆菌
另外，作为上述具有负相关关系的细菌，例如，可优选列举出以下所列举的细菌，优选将这些细菌中的至少1种、更优选将2种以上作为检测对象。
变异链球菌
龋齿放线菌
缓症链球菌bv 2
缓症链球菌
简明弯曲杆菌
牙龈二氧化碳嗜纤维菌
(2)细菌特异性探针
在本发明中，可用作细菌特异性探针的寡聚DNA是能够与唾液中的细菌来源的核酸的碱基序列中特定区域中的碱基序列进行杂交的寡聚DNA。这里，该核酸只要是包括染色体DNA、质粒DNA等的DNA及RNA中的任意一者即可，没有限定，优选为染色体DNA。具体而言，本发明中用作探针的寡核苷酸是能够与上述细菌的染色体DNA中的16S rRNA基因的碱基序列进行杂交的寡核苷酸。
可用于本发明的探针优选选择对作为检测目标的各细菌特异性的碱基序列的区域来设计该区域的碱基序列。通常，在进行探针的设计时，除了选择特异性的区域以外，还需要熔解温度(Tm)一致、不易形成二级结构。
例如，可以通过采用多序列比对在物种之间不同的区域设计探针等方法找到对应于唾液中的各种细菌的特异性的碱基序列。用于进行比对的算法没有特别限定，作为更具体的分析程序，例如，可以利用ClustalX1.8等程序。进行比对时的参数可以在各程序的默认状态下实行，可以根据程序的种类等进行适当调整。
探针的特异性可以是以属水平的特异性为基础一次性全部检测相同属的细菌的特异性，也可以是能够以各物种水平进行检测的特异性，可以根据检测目的进行适宜选择、设计。
将本发明中可使用的细菌特异性的探针的例子示于下述的表A(序列号1～29)。
(3)总量指标探针
总量指标探针是能够用特定的引物对扩增且用于捕捉检体中(唾液中)的全部细菌的探针。在检测细菌方面，从检测对象细菌在包含非检测对象细菌的全体细菌中为何种程度的比例、以及在原本检体中存在多少量的细菌的观点出发，检测细菌的总量也是很重要的。
非检测对象细菌可以理解为存在及种类已知但并非作为检测对象的细菌、以及存在及种类未知的细菌的总和(总计)。
为了检测细菌的总量，例如，还可以与DNA芯片分开独立地测定细菌的总量，但通过在DNA芯片中预先搭载作为细菌总量的指标的探针，可提高操作的简便性。对于探针，在利用引物对而扩增的碱基序列中，可以使用与多个菌种共通的碱基序列。在没有发现这样的序列的情况下，可以设计多个相对共通的序列，对它们进行综合地判断而用作总量指标探针。总量指标探针优选为与检体中包含的细菌来源的核酸进行杂交的探针，具体而言，为包含利用上述特定的引物对而扩增的碱基序列中作为检测对象的多种细菌所共通具有的碱基序列的探针。将总量指标探针的例子示于下述的表A(序列号31)。
总量指标表示各菌种特异性的扩增产物的总量，因此通常量很大，因而目标信号强度有时会超出可检测的信号强度的范围。
为了防止这样的情况，期望限制供于杂交的检体量。或者，在设计探针时，例如降低该探针的Tm值。具体而言，可以考虑减少GC含量、缩短探针的序列长度本身的方法。
另外，在进行杂交时，通过添加对所扩增的核酸与总量指标探针的杂交具有竞争性作用的核酸，可以实现信号强度的降低。作为这样的核酸，例如可列举出具有与总量指标探针全部或部分相同的序列的核酸、或者全部或部分地具有总量指标探针的互补序列的核酸等。
(4)绝对量指标探针
绝对量指标探针是仅与绝对量指标的核酸进行杂交的探针。
在本说明书中，绝对量指标是指在扩增反应、杂交反应之前在检体中以一定量添加的核酸。绝对量指标是只要进行通常的扩增反应就会可靠地进行扩增反应的核酸，发挥作为所谓的阳性对照的作用。
因此，如果预先将对绝对量指标特异性的探针搭载于DNA芯片，则可以根据其的检测结果确认是否适当地实施了扩增反应、杂交等。另外，将绝对量指标设定为1种时，在扩增效率、杂交效率稍有增减的情况下，也可以通过对绝对量指标的信号强度进行比较来计算出校正系数。在多个DNA芯片中可以对校正后的信号强度进行比较。
将绝对量指标用探针的例子示于下述的表A(序列号30)。
另外，将绝对量指标的例子示于下述的序列号74。
绝对量指标用探针：
CTATTCGACCAGCGATATCACTACGTAGGC(序列号30)
绝对量指标：
GTGAGAAGCCTACACAAACGTAACGTCAGGGCTAAGACAAACGCTAACGGTACACCCTAGATGGGAGCTTGTAGCTAGATCGCTAAGTCCTACCGACATGTAGGCATACTCACGAAGGCAATTCCCTGAAAGCCTCGTCTTATCCCGAACTTGGCATCTGCTGATACGTCAGGTTGAACGCGTACATTTACCTGTCATGCGTGGGCCTTCTCCGAATAGCCTACGTAGTGATATCGCTGGTCGAATAGGCGGATTGCTCATAAATGCACATTGGCTAAGGCCCACGGAACACGAATCACGTGAGATCACTTACTATTCGACGGAACTACTATACGCACCGGGACATGCAAGTAGCGTCCCACAAGCATAAGGAACTCTATACTCGCCATCTACGCAGCTACAGGGGATACACGTATGAGCGGTTACGAAGTAAAGCCGAGATAGAGCGGTCTTTAGAGAAAAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC(序列号74)
如果在扩增反应前添加绝对量指标，则需要是通过特定的引物对而扩增的核酸，即具有与引物对互补的碱基序列；而且，为了通过杂交进行检测，需要具有在检测对象细菌、非检测对象细菌中均没有的碱基序列。
特定的引物是指扩增对象序列受到限定，引物对未必一定是1对。也可以根据需要利用使用2对以上的引物对的多重方法。将引物对的例子示于下述的表B。可以利用细菌扩增用引物对(序列号32、33)、绝对量指标用引物对(序列号34、35)。
绝对量指标例如可以利用产业技术总合研究所开发的定量分析用核酸标准物质，还可以进行新的设计。在进行设计时，例如，可以使用软件“EXCEL”(MICROSOFT公司制)的RNDBETWEEN函数随机生成X个(X为任意的数)1～4的整数，将它们连接起来成为仅由1～4的数值构成的X位的数值，将1置换为A、将2置换为T、将3置换为C、将4置换为G，由此得到大量基于X个碱基的ATGC的随机序列。
对于这些序列，仅挑选G与T之和跟A与T之和相同的序列，使用NCBI的GenBank等数据库对挑选出的序列进行Blast检索，针对生物来源的核酸选择相似序列少的序列，并在序列的两末端添加引物序列，由此可以进行设计。另外，还可以将设计出的序列适当连接而加长，或者可以部分去除而缩短。
为了使扩增反应时的反应效率尽可能恒定，希望在检测对象细菌中被扩增的碱基长度与绝对量指标的扩增碱基长度没有很大差异。例如，如果检测对象细菌的扩增产物为500bp左右，则希望绝对量指标的扩增产物为300bp～1000bp左右。
另一方面，对于在扩增后通过电泳等对扩增链长度进行确认的情况，可以设计成成为与检测对象细菌的长度不同的扩增产物，并在此基础上在与检测对象细菌的条带不同的位置检测出绝对量指标来源的扩增产物，在杂交之前确认扩增反应的成败。
最后，在检体中包含的绝对量指标的浓度过高时，在扩增反应中与检测对象的细菌的竞争变得激烈，原本应检测出的检测对象细菌也可能变得无法检测出来，因此需要根据应用而进行适当调整浓度。
表A
| 序列号 | 序列 | 探针名称 |
| 1 | TTCAATGCAATACTCGTATC | 牙龈卟啉单胞菌 |
| 2 | CACGTATCTCATTTTATTCCCCTGT | 福赛斯坦纳氏菌 |
| 3 | CCTCTTCTTCTTATTCTTCATCTGC | 栖牙普雷沃氏菌 |
| 4 | GCCTTCGCAATAGGTATT | 纤细弯曲杆菌 |
| 5 | GTCATAATTCTTTCCCAAGA | 直肠弯曲杆菌 |
| 6 | CAATGGGTATTCTTCTTGAT | 昭和弯曲杆菌 |
| 7 | TAGTTATACAGTTTCCAACG | 具核梭杆菌文氏亚种 |
| 8 | CCAGTACTCTAGTTACACA | 具核梭杆菌多形亚种 |
| 9 | TTTCTTTCTTCCCAACTGAA | 具核梭杆菌动物亚种 |
| 10 | TACATTCCGAAAAACGTCAT | 具核梭杆菌具核亚种 |
| 11 | TATGCAGTTTCCAACGCAA | 牙周梭杆菌 |
| 12 | CGAAGGGTAAATGCAAAAAGGC | 中间普雷沃氏菌 |
| 13 | CTTTATTCCCACATAAAAGC | 变黑普雷沃氏菌 |
| 14 | AAGTACCGTCACTGTGTG | 星群链球菌 |
| 15 | GTCAATTTGGCATGCTATTAACACACC | 伴放线菌团聚杆菌 |
| 16 | CCCAAGCAGTTCTATGGT | 简明弯曲杆菌 |
| 17 | TACACGTACACCTTATTCTT | 牙龈二氧化碳嗜纤维菌 |
| 18 | CAACCATTCAAGACCAACA | 黄褐二氧化碳嗜纤维菌 |
| 19 | TCAAAGGCAGTTGCTTAGT | 生痰二氧化碳嗜纤维菌 |
| 20 | CTCTAGCTATCCAGTTCAG | 啮蚀艾肯氏菌 |
| 21 | CACCCGTTCTTCTCTTACA | 戈氏链球菌 |
| 22 | ACAGTATGAACTTTCCATTCT | 中间链球菌 |
| 23 | TCTCCCCTCTTGCACTCA | 缓症链球菌 |
| 24 | TCCCCTCTTGCACTCAAGT | 缓症链球菌bv 2 |
| 25 | AAGTCAGCCCGTACCCA | 龋齿放线菌 |
| 26 | TCCTTCTAACTGTTCGC | 小韦荣氏球菌 |
| 27 | CCACCCACAAGGAGCAG | 内氏放线菌II |
| 28 | TTCGCATTAGGCACGTTC | 有害月形单胞菌 |
| 29 | CACACGTTCTTGACTTAC | 变异链球菌 |
| 30 | CTATTCGACCAGCGATATCACTACGTAGGC | 对照DNA |
| 31 | CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC | 总细菌 |
表B
| 序列号 | 作用 | 序列(5’→3’) |
| 32 | 正向引物(细菌扩增用) | TCCTACGGGAGGCAGCAGT |
| 33 | 反向引物(细菌扩增用) | CAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACC |
| 34 | 正向引物(绝对量指标扩增用) | GAGAAGCCTACACAAACGTAACGTC |
| 35 | 反向引物(绝对量指标扩增用) | CTCTAAAGACCGCTCTATCTCGG |
在设计本发明中使用的探针时，优选考虑到杂交中的严格性。通过将严格性在一定程度上设得严苛，即使各种细菌中在各自的核酸中的特定区域间存在相似的碱基序列区域，也能够与其它的不同区域相区别地进行杂交。另外，在该特定区域间的碱基序列基本上不相同的情况下，可以缓和地设定严格性。
作为这样的严格的条件，例如，严苛条件的情况是在50～60℃的条件下的杂交，温和条件的情况是在30～40℃的条件下的杂交。杂交的条件中，作为严格的条件，例如可以列举出“0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、40℃”、“0.24M Tris·HCl/0.24MNaCl/0.05％Tween-20、37℃”、“0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、30℃”，作为更严格的条件，例如可以列举出“0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、50℃”，“0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20、55℃”，“0.06M Tris·HCl/0.06MNaCl/0.05％Tween-20、60℃”等条件。更详细而言，还有如下方法：添加探针并在50℃保持1小时以上，使其形成杂交体，然后，在0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20中以50℃进行4次20分钟的清洗，最后，用0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl以50℃进行1次10分钟的清洗。通过提高杂交或清洗时的温度，可以设定更严格的条件。作为本领域技术人员，除了这样的缓冲剂的盐浓度、温度等条件以外，还可以考虑其它探针浓度、探针的长度、反应时间等各种条件来设定条件。对于杂交方法的详细的步骤，可以参照“Molecular Cloning,A Laboratory Manual 4th ed.”(Cold Spring Harbor Press(2012)、“CurrentProtocols in Molecular Biology”(John Wiley&Sons(1987-1997))等。
本发明中使用的探针的长度没有限定，例如，优选为10个碱基以上，更优选为16～50个碱基，进一步优选为18～35个碱基。如果探针的长度合适(如果为上述范围内)，则能够抑制非特异性的杂交(错配)，用于特异性的检测。
在设计本发明中使用的探针时，优选预先确认Tm。Tm是指任意的核酸链的50％与其互补链形成杂交体的温度，为了使模板DNA或RNA与探针形成双链而进行杂交，需要将杂交的温度最优化。另一方面，如果该温度过度降低，则容易发生非特异性的反应，因此希望温度尽可能高。因此，想要设计的核酸片段的Tm在进行杂交方面是重要的因素。Tm的确认可以利用公知的探针设计用软件，作为本发明中可以利用的软件，例如可列举出Probe Quest(注册商标；DYNACOM公司)等。另外，Tm的确认还可以在不使用软件的情况下通过自行计算来进行。在该情况下，可以利用基于最近邻法(Nearest Neighbor Method)、Wallance法、GC％法等的计算式。本发明的探针没有限定，平均Tm优选为约35～70℃或45～60℃。需要说明的是，作为能够以探针的形式进行特异性杂交的条件，除此以外还有GC含量等，其条件是本领域技术人员公知的。
另外，构成本发明中使用的探针的核苷酸可以是DNA及RNA、或PNA中的任一者，也可以是DNA、RNA及PNA中2种以上的杂交体。
作为本发明中使用的探针，具体而言，例如可以优选列举出包含以下的(d)或(e)的DNA的碱基序列的探针。例如，在使用表B所示的引物(序列号32～35)进行扩增时，可以将前面列举的表A(序列号1～31)所示的序列作为探针，优选使用选自序列号1～31所示的碱基序列中的至少2个序列。另外，可以是选自序列号1～31所示的碱基序列中的至少2个序列的互补序列，还可以是与选自序列号1～31所示的碱基序列中的至少2个序列实质上相同的序列、或与选自序列号1～31所示的碱基序列中的至少2个序列的互补序列实质上相同的序列。
这里，实质上相同是指在严格的条件下与序列号1～31所记载的序列或互补序列特异性地进行杂交。
(d)由序列号1～31所示的碱基序列组成的DNA
(e)在严格的条件下和由与上述(d)的DNA互补的碱基序列组成的DNA进行杂交、且具有能够检测唾液中的细菌来源的核酸的碱基序列中的至少一部分碱基序列的功能的DNA
针对上述(d)的各种DNA，关于它们的具体的碱基序列、探针名、成为检测对象的口腔内细菌，可以参照前面列举的表A的记载。
另外，上述(e)的DNA可以使用上述(d)的各种DNA或由与其互补的碱基序列组成的DNA或将它们进行片段化而得到的物质作为探针，实施菌落杂交、噬菌斑杂交及southern印记杂交等公知的杂交法，由cDNA文库、基因组文库获得。文库可以利用通过公知的方法而制得的文库，也可以利用市售的cDNA文库、基因组文库，没有限定。对于杂交方法的详细的步骤，可以参照与上述同样的情况。关于上述(e)的DNA，“严格的条件”是指杂交时的条件，是缓冲剂的盐浓度为24～390mM、温度为40～65℃、优选盐浓度为48.8～195mM、温度为45～60℃的条件。具体而言，可以列举出例如在97.5mM下50℃等的条件。另外，除了这样的盐浓度、温度等条件以外，还考虑探针浓度、探针的长度、反应时间等各种条件，可以适当设定用于得到上述(e)的DNA的条件。作为进行杂交的DNA，优选为与上述(d)的DNA的碱基序列至少具有60％以上的相同性的碱基序列，更优选为80％以上、进一步优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为98％以上、最优选为99％以上。
本发明中使用的探针例如可以通过使用通常的寡核苷酸合成法进行化学合成(纯化通过HPLC等进行)来制作。这样的探针例如可以利用Probe Quest(注册商标：DYNACOM公司制)进行设计。另外，本发明的探针例如还可以包含标签序列等附加序列。
在本发明的方法中，作为检测目标的上述唾液中的细菌所具有的核酸的碱基序列不必是该碱基序列本身，可以是碱基序列的一部分通过缺失、置换、插入等而发生了突变的碱基序列。因此，检测目标的核酸的碱基序列可以以和与该碱基序列互补的序列在严格的条件下进行杂交、且具有源自各碱基序列的功能、活性的突变型基因作为对象，探针也可以以这样的突变型基因的碱基序列作为基础进行设计。这里，“严格的条件”可以应用与上述同样的条件。
2.DNA芯片
如上所述，在本发明的方法中，唾液中的细菌量的检测/测定可以使用DNA芯片。该DNA芯片用于综合地推定牙周组织的炎症程度这样的用途，是多个上述1.项中说明的各种寡核苷酸探针配置于作为支撑体的基板上而成的。
作为成为支撑体的基板的形态，可以使用平板(玻璃板、树脂板、有机硅板等)、棒状、珠等任意的形态。在使用平板作为支撑体的情况下，可以在该平板上隔开给定间隔按种类来固定给定的探针(斑点法等；参照Science 270,467-470(1995)等)。另外，还可以在平板上的特定位置按种类依次合成给定的探针(光刻法等；参照Science 251,767-773(1991)等)。作为其它优选的支撑体的形态，可列举出使用中空纤维的形态。在使用中空纤维作为支撑体的情况下，可以优选示例出：按种类将给定的探针固定于各中空纤维，将全部中空纤维聚集成束并固定后，通过沿纤维的长度方向反复切断而得到的DNA芯片(以下也称为“纤维型DNA芯片”)。还可以将该微阵列描述为将核酸固定于通孔基板的类型，也称为所谓的“通孔型DNA芯片”(参照日本特许第3510882号公报等)。
将探针固定于支撑体的方法没有限定，可以是任何结合方式。另外，并不限定于直接固定于支撑体的情况，例如，也可以是预先用聚赖氨酸等聚合物对支撑体进行涂层处理，将探针固定在处理后的支撑体上。另外，在使用中空纤维等管状体作为支撑体的情况，也可以使凝胶状物保持在管状体中，将探针固定于该凝胶状物。
以下，对作为DNA芯片的一个方式的纤维型DNA芯片进行详细说明。该DNA芯片例如可以经过下述的工序(i)～(iv)来制作。
(i)以中空纤维的长度方向为相同方向的方式将多根中空纤维三维地排列来制造排列体的工序
(ii)包埋上述排列体，制造块体的工序
(iii)将包含寡核苷酸探针的凝胶前体聚合性溶液导入上述块体的各中空纤维的中空部中，进行聚合反应，使包含探针的凝胶状物保持于中空部的工序
(iv)沿与中空纤维的长度方向交叉的方向切断而使块体薄片化的工序
作为中空纤维中使用的材料，没有限定，例如可优选列举出日本特开2004-163211号公报等中记载的材料。
中空纤维以其长度方向的长度相同的方式被三维地排列(工序(i))。作为排列方法，例如可列举出如下方法：将多根中空纤维以隔开给定间隔的方式平行地配置于粘合片等片状物，制成片状后，将该片卷绕成螺旋状的方法(参照日本特开平11-108928号公报)；将2片隔开给定间隔设有多个孔的多孔板重叠，使得孔部对齐，使中空纤维通过这些的孔部，然后打开2片多孔板的间隔并进行临时固定，使固化性树脂原料充满2片多孔板间的中空纤维的周边并使其固化(参照日本特开2001-133453号公报)等。
制得的排列体以不使其排列混乱的方式被包埋(工序(ii))。作为包埋的方法，除了将聚氨酯树脂及环氧树脂等流入纤维之间的间隙的方法以外，还可以优选举出通过热熔粘将纤维彼此粘接的方法等。
对于被包埋的排列体，在各中空纤维的中空部填充包含寡核苷酸探针的凝胶前体聚合性溶液(凝胶形成溶液)，在中空部内进行聚合反应(工序(iii))。由此，可以使固定有探针的凝胶状物保持于各中空纤维的中空部。
凝胶前体聚合性溶液是含有凝胶形成聚合性单体等反应性物质的溶液，是能够通过使该单体等聚合、交联而使该溶液成为凝胶状物的溶液。作为这样的单体，例如可列举出丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、乙烯基吡咯烷酮、亚甲基双丙烯酰胺等。在该情况下，溶液中可以包含聚合引发剂等。
将探针固定于中空纤维内之后，在与中空纤维的长度方向交叉的方向(优选正交的方向)上切断块体来进行薄片化(工序(iv))。由此得到的薄片可以用作DNA芯片。该DNA芯片的厚度优选为0.01mm～1mm左右。块体的切断例如可以利用切片机及激光等来进行。
作为上述的纤维型DNA芯片，例如可优选列举出三菱化学株式会社制DNA芯片(Genopal TM)等。
在纤维型DNA芯片中，如上所述，探针在凝胶内被三维地排列，能够保持三维结构。因此，与探针结合到表面经涂层的载玻片上的平面DNA芯片相比，检测效率提高，能够以高灵敏度进行高重现性的检查。
另外，配置于DNA芯片中的探针种类的数量优选1个DNA芯片为500种以下、优选为250种以下、进一步优选为100种以下。通过在一定程度上限制这样配置的探针数(种类)，能够以更高灵敏度检测目标的口腔内细菌。需要说明的是，探针的种类可通过碱基序列进行区分。因此，通常即使是来自于相同基因的探针，只要碱基序列有1个不同，就鉴定为其它种类。
3.唾液中的细菌的检测(细菌量的测定)
在本发明的方法中，为了测定唾液中的细菌量而检测该细菌的方法例如是包括下述的工序的方法。
(i)将从被检者采集到的作为口腔内试样的唾液作为检体，提取检体中(唾液中)的核酸的工序
(ii)使提取的核酸与上述的本发明的寡核苷酸探针或本发明的DNA芯片接触的工序
(iii)根据由DNA芯片得到的信号强度计算出细菌量的工序
以下，按工序对该检测方法的详情进行说明。
(1)关于工序(i)
在本工序中，将从被检者或被检生物采集到的作为口腔内试样的唾液作为检体，提取检体中(唾液中)中包含的细菌的核酸。采集唾液的方法没有特别限定，例如可列举出如下方法：利用市售的唾液采集试剂盒的方法、用棉棒采集口中所含唾液的方法、将唾液直接采集至容器中的方法等。
采集唾液的被检者没有特别限定，例如，除了患有牙周病等口腔炎症的患者以外，还可以是自己未意识到患有牙周病等口腔炎症的人、或患有心脏疾病等可能与牙周病相关的全身性疾病的患者、孕妇等，或者还可以是没有牙周病患病嫌疑的健康人。
接着，进行存在于得到的唾液中的细菌的核酸提取。提取的方法没有限定，可以使用公知的方法。例如可列举出如下方法：利用设备进行的自动提取法、利用市售的核酸提取试剂盒的方法、在蛋白酶K处理后进行酚提取的方法、利用氯仿的方法、或作为简易提取方法而将试样加热、溶解的方法等。另外，特别是可以在不从检体中提取核酸的情况下进行下一工序。
从检体得到的核酸可以直接与DNA芯片等接触，也可以通过PCR等将希望的碱基序列区域扩增，使该扩增片段与DNA芯片等接触，没有限定。将得到的核酸作为模板进行扩增的区域是编码包含本发明所使用的探针或DNA芯片中配置的寡核苷酸的碱基序列的核酸区域的部位。进行扩增的希望区域没有限定，可以利用无论细菌种类如何均保守性高的区域的碱基序列，一次性对多种混合物进行扩增。用于进行这样的扩增的序列可以通过实验进行分离、纯化，对分离后的多聚核苷酸的碱基序列进行分析，基于该序列来确定，另外，也可以用碱基序列等各种数据库对已知的碱基序列进行检索，进行比对等，从而根据计算机模拟(In Silico)来确定。核酸或氨基酸等数据库没有特别限定，例如，可以利用日本DNA数据库(DDBJ:DNA Data Bank of Japan)、欧洲分子生物学实验室(EMBL:European MolecularBiology Laboratry，EMBL核酸序列数据库(EMBL nucleic acid sequence datalibrary)、遗传序列数据库(GenBank:Genetic sequence data bank)、美国国家生物技术信息中心(NCBI:National Center for Biotechnology Information)的分类数据库等。
具体而言，作为进行扩增的希望的位点，优选为细菌的染色体DNA中的核糖体RNA(16S rRNA)基因。作为可用于扩增该区域的PCR引物，例如可优选列举出前面列举的表B的序列号32、33。需要说明的是，基于PCR法的核酸扩增可以依据常规方法进行。
本工序中提取的核酸及其扩增片段也可以适当标记化并在使其杂交后的检测过程中使用。具体而言，可以考虑：用各种报告色素预先标记PCR引物的末端的方法、在逆转录反应时导入反应性的核苷酸类似物的方法、导入生物素标记后的核苷酸的方法等。另外，还可以在制备后与荧光标记试剂反应而进行标记。作为荧光试剂，例如可以使用各种报告色素(例如，Cy5、Cy3、VIC、FAM、HEX、TET、荧光素、FITC、TAMRA、Texas red、Yakima Yellow等)。
(2)关于工序(ii)
在本工序中，使工序(i)中得到的核酸或其扩增片段与本发明中使用的探针或DNA芯片接触，具体而言，制备包含该核酸等的杂交溶液，使该溶液中的核酸等与DNA芯片上搭载的寡核苷酸探针结合(杂交)。杂交溶液可以使用SDS、SSC等缓冲液依据常规方法适当进行制备。
杂交反应可以适当设定反应条件(缓冲液的种类、pH、温度等)，使得能够使杂交溶液中的核酸等在严格的条件下与DNA芯片上搭载的寡核苷酸探针进行杂交。需要说明的是，这里所谓的“严格的条件”是指不易发生由类似序列所致的交叉杂交或由于类似序列而使交叉杂交的核酸解离的条件，具体而言，是指杂交反应时或杂交后的DNA芯片的清洗条件。
例如，作为杂交反应时的条件，反应温度优选为35～70℃，更优选为40～65℃，进行杂交时的时间优选为约1分钟～16小时。
另外，作为杂交后的DNA芯片的清洗条件，清洗液组成优选为0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl/0.05％Tween-20，清洗时的温度优选为35～80℃或40～65℃，更优选为45～60℃。更具体而言，优选盐(钠)浓度为48～780mM、温度为37～80℃的条件，更优选盐浓度为97.5～390mM、温度为45～60℃的条件。
在清洗后，利用能够检测出与探针结合的核酸等的标记的装置，按斑点测定检测强度。例如，在对上述核酸等进行了荧光标记化的情况下，可以使用各种荧光检测装置、例如CRBIO(Hitachi Software Engineering公司制)、arrayWoRx(GE Healthcare公司制)、Affymetrix 428Array Scanner(Affymetrix公司制)、GenePix(Axon Instruments公司制)、ScanArray(PerkinElmer公司制)、GenoPearlReader(三菱化学株式会社制)等来测定荧光强度。对于这些装置，在荧光扫描仪的情况下，例如，可以适当调整激光的输出功率、检测部的灵敏度来进行扫描，在CCD照相机型的扫描仪的情况下，可以适当调节曝光时间来进行扫描。基于扫描结果的定量方法利用定量软件来进行。定量软件没有特别限定，可以使用斑点的荧光强度的平均值、中值等进行定量。另外，在定量时，优选考虑到DNA片段的斑点范围的尺寸精度等，进行将未搭载探针的斑点的荧光强度用作背景等的调整。
(3)关于工序(iii)
在本工序中，根据上述的步骤中得到的信号强度计算出检测对象菌种的细菌的细菌量。例如，有根据用于对检测对象细菌进行检测的探针的信号强度和背景的信号强度而以SN比的形式进行表示的方法。或者，优选如下方法：预先对各细菌改变细菌的染色体DNA的浓度并在多个条件下进行检测，以在各浓度条件下得到的信号强度为基础，预先获得按照各细菌对染色体DNA浓度进行计算的换算系数(校准曲线)，根据各条件下得到的信号强度计算出染色体DNA的浓度的方法等。在本发明中，例如，优选基于检测对象的细菌的16SrRNA序列信息，根据信号强度计算出细菌量。另外，还可以优选采用将检测对象的细菌的基因组拷贝数作为细菌量的方法。基因组拷贝数可以用DNA芯片中检测出的信号强度乘以事先确定的各细菌量计算系数(并且，根据需要乘以检测检体的稀释率)来计算。对于各细菌量计算系数而言，测定检测出各细菌来源基因组DNA时的信号强度，预先制作校准曲线，以根据各细菌的信号强度反算各细菌量的系数的形式预先求出。
在任意的情况下，优选考虑各DNA芯片的检测对象细菌的信号强度的校正系数。
4.牙周组织的炎症程度的推定
本发明的方法是以唾液中的细菌的细菌量的检测结果作为指标来推定牙周袋炎症面积的方法。另外，本发明的方法是以上述检测结果作为指标来综合地推定牙周组织的炎症程度的方法。
唾液中的细菌的细菌量的检测可以使用任意的工具，可以列举：如上述3.项中说明的那样使用DNA芯片的方法、以及通过酶活性来确认菌的存在的方法、测定电阻来测定菌的总量的方法、通过相差显微镜和染色来计算细菌的方法、进行培养并测定活菌数的方法、通过实时PCR对各细菌数进行定量的方法等。
在该推定中，作为细菌量或与细菌量成比例的测定量，基于DNA芯片的荧光强度、信号强度的SN比、实时PCR的Ct值、酶活性值、进行电测定时的电阻值、通过目视计数的计数值等来推定牙周袋炎症面积、牙周组织的炎症程度。
作为推定牙周袋炎症面积的具体方法，可以列举出以下的方法。
(1)从牙周袋炎症面积(PISA值、CAPRS值等)已知的(可由实际测得的PPD等计算出的)被检者的唾液样品检测唾液中的各种细菌的细菌量。
(2)对于该各种细菌的细菌量，求出每种菌固有的与牙周袋炎症面积的相关系数，构建各种细菌的细菌量与牙周袋炎症面积的关系式，制作预测模型。
(3)从牙周袋炎症面积未知的被检者的唾液样品检测唾液中的各种细菌的细菌量。
(4)将(3)中得到的各种细菌量代入(2)中得到的关系式，推定牙周袋炎症面积。
预测模型的制作方法没有特别限定，例如可列举出线性回归、回归树、模型树、神经网络、支持向量机、套袋法、提升方法、随机森林等机器学习算法等各种使用统计分析法的方法。其中，在后述的实施例中所示的模型树中，无需预先规定模型，具体而言，可优选列举出使用了统计软件“R”(R Development Core Team)的“caret”软件包并利用“M5”方法的最优化。
实际测定了牙周袋炎症面积的被检者的唾液样品(用于制作预测模型的数据数量)优选使用用于制作预测模型的细菌数(变量)以上的数量。可以在每次积累数据数量时更新预测模型。
在“第一发明组”中，作为待检测的用于制作预测模型的细菌，使用细菌的细菌量与牙周袋炎症面积显示出正相关关系的细菌、以及细菌的细菌量与牙周袋炎症面积显示出负相关关系的细菌这两者。原因在于，在牙周病未发展的健康人中，多数情况下检测不到与牙周袋炎症面积显示出正相关关系的细菌(细菌数为0)，在仅显示出正相关关系的细菌的情况下，无法对牙周袋炎症面积小的值的范围制作预测模型。
用于制作预测模型的细菌的示例如上述1.项中记载所述，为了提高最终预测精度，对于细菌而言，不仅考虑到菌单独的相关系数的大小进行选择，还考虑到响应牙周袋炎症面积变动的该菌的变化量的准确性、菌彼此的细菌量的相关系数(避免多重共线关系)来进行选择。
作为显示出正相关的细菌，可优选列举出以下的细菌。
牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、直肠弯曲杆菌、具核梭杆菌文氏亚种、具核梭杆菌多形亚种、具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种、牙周梭杆菌、伴放线菌团聚杆菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、戈氏链球菌、中间链球菌、小韦荣氏球菌、有害月形单胞菌、莫氏细小杆菌、洛氏普雷沃氏菌、罗氏韦荣氏球菌、衣氏放线菌、马氏棒杆菌、SR1 sp.OT 345、卡托氏卟啉单胞菌、生痰月形单胞菌、变黄奈瑟氏球菌、表兄链球菌、微小小单胞菌、胃消化链球菌、索氏密螺旋体、隐藏真杆菌、缠结真杆菌、中间密螺旋体、龈沟产线菌、牙髓卟啉单胞菌
作为显示出正相关的细菌，可优选进一步选列举出以下的细菌。
牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、直肠弯曲杆菌、具核梭杆菌动物亚种、具核梭杆菌具核亚种、小韦荣氏球菌、有害月形单胞菌、隐藏真杆菌、缠结真杆菌、中间密螺旋体、龈沟产线菌、牙髓卟啉单胞菌
作为显示出正相关的细菌，优选使用1种以上，更优选使用4种以上，进一步优选使用8种以上，特别优选使用12种以上。另外，优选使用100种以下，更优选使用75种以下，进一步优选使用50种以下，特别优选使用25种以下。
作为显示出负相关的细菌，可优选列举出以下的细菌。缓症链球菌、缓症链球菌bv2、龋齿放线菌、变异链球菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、苍白普雷沃氏菌、唾液链球菌、沟迹真杆菌、胶胨罗斯氏菌、栖牙普雷沃氏菌、非典型韦荣氏球菌、栖组织普雷沃氏菌、小核桃形巨球形菌、副血链球菌、溶血孪生球菌、拟普雷沃氏菌属(A.rava、OT 308)、产黑色素普雷沃氏菌、葛氏放线菌、夏氏普雷沃氏菌(Prevotella shahii)、龋齿罗斯氏菌、邻接短链小球菌、巴斯德卟啉单胞菌、副流感嗜血杆菌
作为显示出负相关的细菌，可优选进一步选列举出以下的细菌。龋齿放线菌、变异链球菌、苍白普雷沃氏菌
作为显示出负相关的细菌，优选使用1种以上，更优选使用2种以上，进一步优选使用4种以上，特别优选使用8种以上。另外，优选使用100种以下，更优选使用75种以下，进一步优选使用50种以下，特别优选使用25种以下。
另外，在本发明中，对预定数量的被检者(1次母样本)进行统计分析处理，预先存储于数据库中。然后，根据牙周组织的炎症程度与唾液中的细菌量之间的相关关系的分析结果，能够推定出各被检者具有何种的牙周组织的炎症程度、或是否具有牙周袋内牙根表面积。因此，在进行被检者个人(一个人)的检查时，通过将来自于上述多个被检者的数据作为母样本，调查该被检者个人的数据处于预先存储于数据库中的母样本数据的哪个位置或是否与其符合，从而能够推定出针对该被检者个人的牙周组织的炎症程度或牙周袋内牙根表面积。需要说明的是，可以将上述被检者个人的数据导入母样本的值中，进行再次统计分析处理，然后调查该被检者个人位于母样本的哪个位置。
根据本发明的方法，基于唾液中的细菌种及其细菌量，可以推定/预测牙周组织的炎症程度(PISA值、CAPRS值)，因此，与现有的对PISA值、CAPRS值进行实际测得的情况相比，能够非常简便地、且即使对于大量的受检者也可在一定的计算基准下计算出牙周组织的炎症程度。另外，在本发明中，作为牙周组织的炎症程度，不仅是阳性度，而且阴性度也包含在推定/预测的范围内。因此，在着眼于细菌量与牙周组织的炎症程度为反相关的细菌种类(常驻菌)的情况下，也可以推定/预测受检者的口腔内是否保持了健康状态。另外，相对于牙周组织的炎症程度，可以将细菌量为相关的细菌种类、为反相关的细菌种类之比作为指标。
以下列举实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明并不限定于此。
实施例1
唾液样品的采集
在大阪大学齿学部附属医院，从牙周病治疗中的20多岁～70多岁的男女被检者总计46人采集了唾液1ml以上、46个样品。采集到的唾液在-20℃下冷冻保管至使用前。
与唾液样品对应的PISA值的计算
＜临床信息的获得＞
对于全部样品，记录了下述的临床信息。下述两个项目是在牙科中广泛使用的指标。
(i)牙周袋的深度(PPD)：表示将牙周探针插入袋中时从牙龈边缘至探针前端的距离。利用6点法测定颊侧近心、颊侧中央、颊侧远心、舌侧近心、舌侧中央、舌侧远心，以1mm单位进行数值化。
(ii)探诊时的出血(BOP)：表示将牙周探针插入袋中时有无出血。将在与上述6点法对应的位置无出血的情况作为0，将有出血的情况作为1。
将(i)牙周袋的深度(PPD)和(ii)探诊时的出血(BOP)归纳于表1。
表1-1
表1-2
表1-3
表1-4
表1-5
表1-6
表1-7
表1-8
表1-9
表1-10
表1-11
表1-12
表1-13
表1-14
表1-15
表1-16
＜PISA值的计算＞
接下来，根据记录的基于6点法的牙周病检查结果，参照公知文献(Nesse，W.,Abbas,F.,van der Ploeg,I.,Spijkervet,F.K.,Dijkstra,P.U.,Vissink,A.:Periodontal inflamed surface area:quantifying inflammatory burden.Journal ofClinical Periodontology,35:668-673,2008.)如表2所示计算出PISA(Periodontalinflamed surface area)。PISA是以平方毫米(mm2)表示口腔整体的牙周组织的炎症部位面积的值。
将46人的PISA值归纳示于表3。
表2-1
表2-2
表3
唾液样品中的口腔内细菌的检测
＜从唾液中提取DNA＞
1-1珠破碎
在2ml的试管中加入上述的唾液中的400μl、灭菌水400μl、以及0.1mm玻璃珠0.4g(Tomy Seiko公司制#GB-01)，将盖子盖紧，然后置于微粉碎装置(Tomy Seiko公司制)，以3200rpm进行5分钟的珠破碎。然后，为了去除珠等而将试管置于离心机中，以1800g轻微离心分离5分钟。将上清400μl分注于新的1.5ml试管中。
1-2酶处理
在1-1的样品中混合QIAGEN公司的Buffer ATL90μl、蛋白酶k 10μl、Buffer AL100μl，使总计为600μl，在56℃下孵育1小时。
1-3柱纯化
在孵育后加入乙醇120μl并进行涡旋混合。接着使用QIAamp DNA Micro Kit(QIAGEN公司)，向试剂盒的柱中加入总量720μl，以14000rpm进行1分钟的离心，然后废弃溶出液。然后，按照试剂盒的方案，用Buffer AW1 500μl、Buffer AW2 500μl清洗柱。接着，在空的状态下以14000rpm进行1分钟的离心分离，然后用灭菌水20μl将DNA溶出。从46个样品中分别获得约4～20ng/μl的DNA溶液。
＜细菌DNA的扩增反应＞
将上述的DNA溶液稀释成20pg/μl，将其作为PCR模板。为了对样品中的口腔内细菌的16SrRNA的检测对象区域的序列进行扩增，按照以下的反应液组成及反应条件实施了PCR。PCR用试剂盒使用了Premix Ex Taq(TM)热启动版本(Takara公司制)，通过ProFlex(TM)PCR系统(Thermo Fisher Scientific公司制)来进行。引物使用了具有下述的序列的引物。需要说明的是，正向引物使用5’末端被Cy5标记的引物。
正向引物(细菌扩增用)：
5’-Cy5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’(序列号32)
反向引物(细菌扩增用)：
5’-CAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACC-3’(序列号33)
正向引物(绝对量指标扩增用)：
5’-Cy5-GAGAAGCCTACACAAACGTAACGTC-3’(序列号34)
反向引物(绝对量指标扩增用)：
5’-CTCTAAAGACCGCTCTATCTCGG-3’(序列号35)
＜反应液组成＞
＜反应条件＞
在95℃下加热1分钟后，将“解离：98℃(10秒钟)→退火：55℃(30秒钟)→合成：72℃(20秒钟)”作为1次循环，总计进行40次循环，在4℃下冷却，得到了扩增产物。
＜DNA芯片：口腔内细菌检测用DNA芯片的制造＞
利用与日本特开2007-74950号公报(甲基化DNA和/或非甲基化DNA的检测方法)的实施例1中记载的方法同样的方法进行了通孔型的DNA芯片的制造。
其中，搭载的寡核苷酸探针使用了具有表4所示的序列信息的探针。
表4
| 序列号 | 序列 | 探针名称 |
| 1 | TTCAATGCAATACTCGTATC | 牙龈卟啉单胞菌 |
| 2 | CACGTATCTCATTTTATTCCCCTGT | 福赛斯坦纳氏菌 |
| 3 | CCTCTTCTTCTTATTCTTCATCTGC | 栖牙普雷沃氏菌 |
| 4 | GCCTTCGCAATAGGTATT | 纤细弯曲杆菌 |
| 5 | GTCATAATTCTTTCCCAAGA | 直肠弯曲杆菌 |
| 6 | CAATGGGTATTCTTCTTGAT | 昭和弯曲杆菌 |
| 7 | TAGTTATACAGTTTCCAACG | 具核梭杆菌文氏亚种 |
| 8 | CCAGTACTCTAGTTACACA | 具核梭杆菌多形亚种 |
| 9 | TTTCTTTCTTCCCAACTGAA | 具核梭杆菌动物亚种 |
| 10 | TACATTCCGAAAAACGTCAT | 具核梭杆菌具核亚种 |
| 11 | TATGCAGTTTCCAACGCAA | 牙周梭杆菌 |
| 12 | CGAAGGGTAAATGCAAAAAGGC | 中间普雷沃氏菌 |
| 13 | CTTTATTCCCACATAAAAGC | 变黑普雷沃氏菌 |
| 14 | AAGTACCGTCACTGTGTG | 星群链球菌 |
| 15 | GTCAATTTGGCATGCTATTAACACACC | 伴放线菌团聚杆菌 |
| 16 | CCCAAGCAGTTCTATGGT | 简明弯曲杆菌 |
| 17 | TACACGTACACCTTATTCTT | 牙龈二氧化碳嗜纤维菌 |
| 18 | CAACCATTCAAGACCAACA | 黄褐二氧化碳嗜纤维菌 |
| 19 | TCAAAGGCAGTTGCTTAGT | 生痰二氧化碳嗜纤维菌 |
| 20 | CTCTAGCTATCCAGTTCAG | 啮蚀艾肯氏菌 |
| 21 | CACCCGTTCTTCTCTTACA | 戈氏链球菌 |
| 22 | ACAGTATGAACTTTCCATTCT | 中间链球菌 |
| 23 | TCTCCCCTCTTGCACTCA | 缓症链球菌 |
| 24 | TCCCCTCTTGCACTCAAGT | 缓症链球菌bv 2 |
| 25 | AAGTCAGCCCGTACCCA | 龋齿放线菌 |
| 26 | TCCTTCTAACTGTTCGC | 小韦荣氏球菌 |
| 27 | CCACCCACAAGGAGCAG | 内氏放线菌II |
| 28 | TTCGCATTAGGCACGTTC | 有害月形单胞菌 |
| 29 | CACACGTTCTTGACTTAC | 变异链球菌 |
| 30 | CTATTCGACCAGCGATATCACTACGTAGGC | 对照DNA |
| 31 | CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC | 总细菌 |
<与DNA芯片的杂交>
如以下所述将各溶液混合，制备了杂交溶液。
DNA芯片的杂交、清洗使用了自动混合清洗装置(型号：AHF-200、三菱化学株式会社制)。
使200μL的杂交溶液与上述DNA芯片接触，在50℃下杂交16小时。
在杂交后，按照下述的条件清洗了DNA芯片。用0.24M Tris·HCl/0.24MNaCl/0.05％Tween-20溶液1000μL重复进行12次220秒钟的清洗，接着，用1000μL的0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl重复进行4次220秒钟的清洗。
在清洗结束后，将各芯片移至室温的0.24M Tris·HCl/0.24M NaCl混合溶液中。
＜检测＞
在上述清洗后，使用GenoPearlReader(型号：GR-S1、三菱化学株式会社制)在下述条件下测定了DNA芯片的各斑点的荧光强度。
＜检测条件＞
中心激发波长：633nm
曝光时间：0.1、1、4、40秒钟
＜结果＞
用搭载了检测对象细菌用探针的斑点的荧光强度除以背景值(未搭载探针的斑点的荧光强度的中值)，计算出源自杂交的荧光强度(以下，称为信号强度)的SN比。
基于细菌量的PISA值的预测
＜PISA值与细菌量的相关分析＞
首先，使PISA值及表示各细菌量的SN比的数据对应于各样品。将其结果示于表5。
表5-1
表5-2
表5-3
表5-4
然后，使用Excel的“数据分析”求出PISA与细菌的SN比的相关系数，归纳于表6。
表6
| PISA | |
| 变异链球菌 | -0.41 |
| 龋齿放线菌 | -0.37 |
| 缓症链球菌bv 2 | -0.31 |
| 缓症链球菌 | -0.30 |
| 简明弯曲杆菌 | -0.19 |
| 中间普雷沃氏菌 | -0.09 |
| 昭和弯曲杆菌 | -0.09 |
| 变黑普雷沃氏菌 | -0.07 |
| 啮蚀艾肯氏菌 | -0.07 |
| 牙龈二氧化碳嗜纤维菌 | -0.06 |
| 内氏放线菌II | -0.04 |
| 星群链球菌 | -0.02 |
| 总细菌 | -0.01 |
| 纤细弯曲杆菌 | -0.01 |
| 牙周梭杆菌 | 0.01 |
| 具核梭杆菌多形亚种 | 0.09 |
| 对照DNA | 0.12 |
| 伴放线菌团聚杆菌 | 0.13 |
| 生痰二氧化碳嗜纤维菌 | 0.14 |
| 黄褐二氧化碳嗜纤维菌 | 0.17 |
| 中间链球菌 | 0.18 |
| 具核梭杆菌文氏亚种 | 0.22 |
| 戈氏链球菌 | 0.23 |
| 小韦荣氏球菌 | 0.35 |
| 有害月形单胞菌 | 0.37 |
| 具核梭杆菌具核亚种 | 0.42 |
| 直肠弯曲杆菌 | 0.45 |
| 牙龈卟啉单胞菌 | 0.57 |
| 具核梭杆菌动物亚种 | 0.58 |
| 福赛斯坦纳氏菌 | 0.67 |
| 齿垢密螺旋体 | 0.67 |
在表示各细菌量的SN比与口腔内整体的PISA值的比较中，从相关性高者起依次为齿垢密螺旋体、福赛斯坦纳氏菌、具核梭杆菌动物亚种、牙龈卟啉单胞菌、直肠弯曲杆菌。这些当中包含“红色复合体(Red Complex)”，可认为是口腔整体的炎症程度的指标。另一方面，作为显示出反相关的菌株，为变异链球菌、龋齿放线菌、缓症链球菌bv 2、缓症链球菌、简明弯曲杆菌。可以认为这些是口腔整体的健康程度的指标。
接着，使用表5所示的数据，以各细菌量的SN比基础，使用机器学习的方法，进行了用模型树预测PISA值的模型的制作。分析使用了统计软件“R”(R Development Core Team)的“caret”软件包，进行了利用“M5”方法的最优化。
将表5的数据读取为“bacteria”后，执行了以下的命令。
m<-train(PISA～.,data＝bacteria,method＝"M5")
是将PISA作为目标变量、并将解释变量作为表5的细菌全部种类来生成模型树的命令。使用了全部46个样品数据。
输入m$finalModel和结果的输出命令，输出执行的最优模型，结果得到了以下的预测模型。将结果示于图1。
M5未修剪的模型树：
(使用平滑的线性模型)
龋齿放线菌<＝20.1：
|简明弯曲杆菌<＝2.2：
||生痰二氧化碳嗜纤维菌<＝2.15：
|||福赛斯坦纳氏菌<＝6.9：
||||变异链球菌<＝5.3：LM1(2/12.282％)
||||变异链球菌>5.3：LM2(2/32.179％)
|||福赛斯坦纳氏菌>6.9：
||||变异链球菌<＝2.95：LM3(3/16.447％)
||||变异链球菌>2.95：LM4(3/2.075％)
||生痰二氧化碳嗜纤维菌>2.15：
|||戈氏链球菌<＝35.45：LM5(2/1.965％)
|||戈氏链球菌>35.45：LM6(3/26.323％)
|简明弯曲杆菌>2.2：
||齿垢密螺旋体<＝15.35：
|||具核梭杆菌具核亚种<＝38.35：LM7(3/2.882％)
|||具核梭杆菌具核亚种>38.35：
||||龋齿放线菌<＝10.9：LM8(3/4.64％)
||||龋齿放线菌>10.9：LM9(2/2.948％)
||齿垢密螺旋体>15.35：LM10(3/39.648％)
龋齿放线菌>20.1：
|福赛斯坦纳氏菌<＝2.85：
||戈氏链球菌<＝19.6：
|||内氏放线菌II<＝4.05：LM11(5/2.414％)
|||内氏放线菌II>4.05：LM12(3/3.304％)
||戈氏链球菌>19.6：
|||对照DNA<＝837.15：LM13(3/4.132％)
|||对照DNA>837.15：LM14(2/0.098％)
|福赛斯坦纳氏菌>2.85：
||星群链球菌<＝1.75：LM15(3/14.832％)
||星群链球菌>1.75：
|||牙龈卟啉单胞菌<＝1.35：LM16(2/9.58％)
|||牙龈卟啉单胞菌>1.35：LM17(2/2.751％)
LM num:1
.outcome＝
5.9609*齿垢密螺旋体
+2.719*戈氏链球菌
-2.4637*龋齿放线菌
-43.3698*变异链球菌
+161.5714*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-0.4833*对照DNA
+3.734*福赛斯坦纳氏菌
+1510.5973
LM num:2
.outcome＝
5.9609*齿垢密螺旋体
+2.719*戈氏链球菌
-2.4637*龋齿放线菌
-43.3698*变异链球菌
+161.5714*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-0.4833*对照DNA
+3.734*福赛斯坦纳氏菌
+1507.5864
LM num:3
.outcome＝
5.9609*齿垢密螺旋体
+2.719*戈氏链球菌
-2.4637*龋齿放线菌
-26.3717*变异链球菌
+161.5714*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-0.4833*对照DNA
+3.9077*福赛斯坦纳氏菌
+1392.5945
LM num:4
.outcome＝
5.9609*齿垢密螺旋体
+2.719*戈氏链球菌
-2.4637*龋齿放线菌
-26.3717*变异链球菌
+161.5714*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-0.4833*对照DNA
+3.9077*福赛斯坦纳氏菌
+1394.1708
LM num:5
.outcome＝
5.9609*齿垢密螺旋体
+1.2546*戈氏链球菌
-2.4637*龋齿放线菌
-26.3717*变异链球菌
+201.9643*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-0.4833*对照DNA
+5.5586*福赛斯坦纳氏菌
+1565.177
LM num:6
.outcome＝
5.9609*齿垢密螺旋体
+1.336*戈氏链球菌
-2.4637*龋齿放线菌
-26.3717*变异链球菌
+201.9643*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-0.4833*对照DNA
+5.5586*福赛斯坦纳氏菌
+1555.611
LM num:7
.outcome＝
13.3672*齿垢密螺旋体
+2.719*戈氏链球菌
-2.4637*龋齿放线菌
-30.4289*变异链球菌
-0.4833*对照DNA
+5.5586*福赛斯坦纳氏菌
-0.3524*具核梭杆菌具核亚种
+1314.4003
LM num:8
.outcome＝
13.3672*齿垢密螺旋体
+2.719*戈氏链球菌
-1.3817*龋齿放线菌
-30.4289*变异链球菌
-0.4833*对照DNA
+5.5586*福赛斯坦纳氏菌
-0.3171*具核梭杆菌具核亚种
+1293.9573
LM num:9
.outcome＝
13.3672*齿垢密螺旋体
+2.719*戈氏链球菌
-1.3181*龋齿放线菌
-30.4289*变异链球菌
-0.4833*对照DNA
+5.5586*福赛斯坦纳氏菌
-0.3171*具核梭杆菌具核亚种
+1294.0756
LM num:10
.outcome＝
15.293*齿垢密螺旋体
+2.719*戈氏链球菌
-2.4637*龋齿放线菌
-30.4289*变异链球菌
-0.4833*对照DNA
+5.5586*福赛斯坦纳氏菌
+1320.5275
LM num:11
.outcome＝
3.3786*齿垢密螺旋体
+5.1956*戈氏链球菌
-2.8861*龋齿放线菌
-0.5662*对照DNA
+29.9183*福赛斯坦纳氏菌
-2.6289*内氏放线菌II
+826.1665
LM num:12
.outcome＝
3.3786*齿垢密螺旋体
+5.1956*戈氏链球菌
-2.8861*龋齿放线菌
-0.5662*对照DNA
+29.9183*福赛斯坦纳氏菌
-2.9643*内氏放线菌II
+825.1613
LM num:13
.outcome＝
3.3786*齿垢密螺旋体
+5.4972*戈氏链球菌
-2.8861*龋齿放线菌
-0.6637*对照DNA
+29.9183*福赛斯坦纳氏菌
+0.4481*内氏放线菌II
+906.7614
LM num:14
.outcome＝
3.3786*齿垢密螺旋体
+5.4972*戈氏链球菌
-2.8861*龋齿放线菌
-0.6694*对照DNA
+29.9183*福赛斯坦纳氏菌
+0.4481*内氏放线菌II
+910.6162
LM num:15
.outcome＝
-215.5803*牙龈卟啉单胞菌
+3.3786*齿垢密螺旋体
+3.1851*戈氏链球菌
-2.8861*龋齿放线菌
-56.1926*星群链球菌
-0.5662*对照DNA
+36.302*福赛斯坦纳氏菌
+1327.7476
LM num:16
.outcome＝
-221.29*牙龈卟啉单胞菌
+3.3786*齿垢密螺旋体
+3.1851*戈氏链球菌
-2.8861*龋齿放线菌
-53.2351*星群链球菌
-0.5662*对照DNA
+36.302*福赛斯坦纳氏菌
+1307.8776
LM num:17
.outcome＝
-221.29*牙龈卟啉单胞菌
+3.3786*齿垢密螺旋体
+3.1851*戈氏链球菌
-2.8861*龋齿放线菌
-53.2351*星群链球菌
-0.5662*对照DNA
+36.302*福赛斯坦纳氏菌
+1307.1008
输入p<-predict(m,newdata＝bacteria)命令，将实际测得的46个样品量的各细菌量的SN比数据代入制成的预测模型“m”中，得到了与46个样品对应的预测PISA值“p”。
接着，输入cor(p,bacteria$PISA)命令，计算预测PISA值“p”和实际测定的PISA值的相关系数，结果是相关系数为0.8759666。
将预测PISA值“p”和实际测定的PISA值的散点图示于图2。
如该模型所示，可以根据DNA芯片的SN比来预测PISA值。
特别是在表6所示的表示各细菌量的SN比与口腔内整体的PISA值的比较中，显示出能够根据具有负相关系数的变异链球菌、龋齿放线菌、简明弯曲杆菌、内氏放线菌II、星群链球菌、和具有正相关系数的生痰二氧化碳嗜纤维菌、福赛斯坦纳氏菌、戈氏链球菌、齿垢密螺旋体、具核梭杆菌具核亚种、牙龈卟啉单胞菌的细菌群的SN比来预测PISA值。
实施例2
使用与实施例1相同的检测结果，进行了基于细菌量的PISA值的预测。
＜PISA值与细菌量的相关分析＞
首先，使PISA值及表示各细菌量的SN比的数据与各样品对应。然后，计算出全部样品的绝对量指标探针的SN比的中值，用各样品的绝对量指标探针的SN比除以该中值。将其作为芯片间校正值。接着，通过用各样品的全部细菌的SN比数据除以各样品的芯片间校正值，对芯片间的SN比数据进行标准化。将其结果示于表7。
表7-1
表7-2
表7-3
表7-4
然后，使用Excel的“数据分析”求出PISA与细菌的SN比的相关系数，示于表8。
表8
| PISA | |
| 变异链球菌 | -0.38 |
| 龋齿放线菌 | -0.32 |
| 缓症链球菌bv 2 | -0.28 |
| 缓症链球菌 | -0.26 |
| 简明弯曲杆菌 | -0.12 |
| 牙龈二氧化碳嗜纤维菌 | -0.01 |
| 内氏放线菌II | 0.00 |
| 牙周梭杆菌 | 0.09 |
| 星群链球菌 | 0.11 |
| 中间普雷沃氏菌 | 0.12 |
| 伴放线菌团聚杆菌 | 0.20 |
| 啮蚀艾肯氏菌 | 0.20 |
| 昭和弯曲杆菌 | 0.20 |
| 总细菌 | 0.22 |
| 纤细弯曲杆菌 | 0.24 |
| 变黑普雷沃氏菌 | 0.24 |
| 具核梭杆菌多形亚种 | 0.25 |
| 中间链球菌 | 0.26 |
| 生痰二氧化碳嗜纤维菌 | 0.27 |
| 黄褐二氧化碳嗜纤维菌 | 0.29 |
| 具核梭杆菌文氏亚种 | 0.29 |
| 具核梭杆菌具核亚种 | 0.38 |
| 直肠弯曲杆菌 | 0.38 |
| 小韦荣氏球菌 | 0.39 |
| 戈氏链球菌 | 0.45 |
| 有害月形单胞菌 | 0.47 |
| 具核梭杆菌动物亚种 | 0.60 |
| 牙龈卟啉单胞菌 | 0.65 |
| 齿垢密螺旋体 | 0.68 |
| 福赛斯坦纳氏菌 | 0.68 |
在表示各细菌量的SN比与口腔内整体的PISA值的比较中，从相关性高者起依次为福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌动物亚种、有害月形单胞菌、戈氏链球菌、小韦荣氏球菌、直肠弯曲杆菌、具核梭杆菌具核亚种。其中包含“红色复合体”，可认为是口腔整体的炎症程度的指标。另一方面，作为显示出反相关的菌株，为变异链球菌、龋齿放线菌、缓症链球菌bv 2、缓症链球菌、简明弯曲杆菌。可以认为这些是口腔整体的健康程度的指标。
接着，使用表7所示的数据，以各细菌量的SN比为基础，使用机器学习的方法，进行用模型树预测PISA值的模型的制作。分析使用统计软件“R”(R Development Core Team)的“caret”软件包，进行了利用“M5”方法的最优化。
将表7的数据读取为“bacteria”后，执行了以下的命令。
m<-train(PISA～.,data＝bacteria,method＝"M5")
是将PISA作为目标变量、并将解释变量作为表7的细菌全部种类来生成模型树的命令。使用了全部46个样品数据。
输入m$finalModel和结果的输出命令，输出执行的最优模型，结果得到了以下的预测模型。
M5未修剪的模型树：
(使用平滑的线性模型)
齿垢密螺旋体<＝6.1：
|简明弯曲杆菌<＝1.45：
||龋齿放线菌<＝53.95：
|||变异链球菌<＝15：
||||福赛斯坦纳氏菌<＝4.9：
|||||牙龈卟啉单胞菌<＝1.45：LM1(2/25.547％)
|||||牙龈卟啉单胞菌>1.45：LM2(2/24.859％)
||||福赛斯坦纳氏菌>4.9：LM3(3/3.438％)
|||变异链球菌>15：LM4(2/7.664％)
||龋齿放线菌>53.95：
|||具核梭杆菌动物亚种<＝2.2：LM5(2/3.144％)
|||具核梭杆菌动物亚种>2.2：LM6(2/2.358％)
|简明弯曲杆菌>1.45：
||黄褐二氧化碳嗜纤维菌<＝1.15：
|||牙周梭杆菌<＝2.35：LM7(2/4.372％)
|||牙周梭杆菌>2.35：LM8(2/1.326％)
||黄褐二氧化碳嗜纤维菌>1.15：
|||总细菌<＝2252.6：LM9(4/4.488％)
|||总细菌>2252.6：
||||黄褐二氧化碳嗜纤维菌<＝1.55：LM10(4/2.777％)
||||黄褐二氧化碳嗜纤维菌>1.55：
|||||福赛斯坦纳氏菌<＝2.9：
||||||福赛斯坦纳氏菌<＝2.35：LM11(2/11.398％)
||||||福赛斯坦纳氏菌>2.35：LM12(2/1.572％)
|||||福赛斯坦纳氏菌>2.9：LM13(3/17.057％)
齿垢密螺旋体>6.1：
|直肠弯曲杆菌<＝6.4：
||小韦荣氏球菌<＝1.25：
|||戈氏链球菌<＝36.15：LM14(3/12.485％)
|||戈氏链球菌>36.15：
||||福赛斯坦纳氏菌<＝11.5：LM15(2/8.205％)
||||福赛斯坦纳氏菌>11.5：LM16(2/1.572％)
||小韦荣氏球菌>1.25：LM17(3/55.578％)
|直肠弯曲杆菌>6.4：
||总细菌<＝1916.55：LM18(2/4.176％)
||总细菌>1916.55：LM19(2/1.965％)
LM num:1
.outcome＝
0.1154*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+32.2177*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-2.8479*龋齿放线菌
-4.1907*变异链球菌
+353.0028
LM num:2
.outcome＝
0.1154*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+32.2177*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-2.8479*龋齿放线菌
-4.1907*变异链球菌
+354.0939
LM num:3
.outcome＝
0.1154*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+32.2177*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-2.8479*龋齿放线菌
-4.1907*变异链球菌
+353.0353
LM num:4
.outcome＝
0.1154*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+32.2177*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-2.8479*龋齿放线菌
-5.4232*变异链球菌
+347.5507
LM num:5
.outcome＝
0.1154*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+32.2177*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-3.3806*龋齿放线菌
+263.7849
LM num:6
.outcome＝
0.1154*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+32.2177*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-3.3806*龋齿放线菌
+262.54
LM num:7
.outcome＝
0.1154*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+27.5903*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-0.6784*龋齿放线菌
+33.5894
LM num:8
.outcome＝
0.1154*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+27.5903*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-0.6784*龋齿放线菌
+32.468
LM num:9
.outcome＝
0.0649*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+43.8294*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-0.6784*龋齿放线菌
+146.6484
LM num:10
.outcome＝
0.0785*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+44.0191*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-0.6784*龋齿放线菌
+93.2371
LM num:11
.outcome＝
0.0785*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+45.0694*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-0.6784*龋齿放线菌
+91.1073
LM num:12
.outcome＝
0.0785*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+45.0694*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-0.6784*龋齿放线菌
+91.0077
LM num:13
.outcome＝
0.0785*总细菌
-87.6234*牙龈卟啉单胞菌
+45.1623*福赛斯坦纳氏菌
+3.4246*齿垢密螺旋体
+10.3816*具核梭杆菌动物亚种
+4.5488*戈氏链球菌
-0.6784*龋齿放线菌
+93.4098
LM num:14
.outcome＝
-0.0279*总细菌
-142.0103*牙龈卟啉单胞菌
+9.7177*福赛斯坦纳氏菌
+5.5503*齿垢密螺旋体
+24.5588*直肠弯曲杆菌
+16.8253*具核梭杆菌动物亚种
+10.5169*戈氏链球菌
+793.003*小韦荣氏球菌
-497.9287
LM num:15
.outcome＝
-0.0279*总细菌
-142.0103*牙龈卟啉单胞菌
+9.7177*福赛斯坦纳氏菌
+5.5503*齿垢密螺旋体
+24.5588*直肠弯曲杆菌
+16.8253*具核梭杆菌动物亚种
+10.4819*戈氏链球菌
+793.003*小韦荣氏球菌
-489.1573
LM num:16
.outcome＝
-0.0279*总细菌
-142.0103*牙龈卟啉单胞菌
+9.7177*福赛斯坦纳氏菌
+5.5503*齿垢密螺旋体
+24.5588*直肠弯曲杆菌
+16.8253*具核梭杆菌动物亚种
+10.4819*戈氏链球菌
+793.003*小韦荣氏球菌
-489.4669
LM num:17
.outcome＝
-0.0279*总细菌
-142.0103*牙龈卟啉单胞菌
+9.7177*福赛斯坦纳氏菌
+5.5503*齿垢密螺旋体
+24.5588*直肠弯曲杆菌
+16.8253*具核梭杆菌动物亚种
+10.4024*戈氏链球菌
+853.2173*小韦荣氏球菌
-506.1734
LM num:18
.outcome＝
-0.0958*总细菌
-142.0103*牙龈卟啉单胞菌
+9.7177*福赛斯坦纳氏菌
+5.5503*齿垢密螺旋体
+32.3143*直肠弯曲杆菌
+16.8253*具核梭杆菌动物亚种
+7.3721*戈氏链球菌
+686.8925*小韦荣氏球菌
+139.0553
LM num:19
.outcome＝
-0.0958*总细菌
-142.0103*牙龈卟啉单胞菌
+9.7177*福赛斯坦纳氏菌
+5.5503*齿垢密螺旋体
+32.3143*直肠弯曲杆菌
+16.8253*具核梭杆菌动物亚种
+7.3721*戈氏链球菌
+686.8925*小韦荣氏球菌
+143.569
Numbers of Rules：19
接着，输入p<-predict(m,newdata＝bacteria)命令，将实际测得的46个样品量的各细菌量的SN比数据代入制成的预测模型“m”中，得到了与46个样品对应的预测PISA值“p”。
为了计算实际的PISA值与预测PISA值的相关系数，执行cor(p,bacteria$PISA)命令，计算出预测PISA值“p”和实际测定的PISA值的相关系数，结果是得到的相关系数为0.9291664。将预测PISA值“p”和实测的PISA值的散点图示于图3。如该模型所示，可以根据DNA芯片的SN比来预测PISA值。
特别是在表8所示的表示各细菌量的SN比与口腔内整体的PISA值的比较中，显示出能够根据具有负相关系数的变异链球菌、龋齿放线菌、简明弯曲杆菌、和具有正相关系数的福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌动物亚种、戈氏链球菌、小韦荣氏球菌、直肠弯曲杆菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、牙周梭杆菌的细菌群的SN比来预测PISA值。
实施例3
使用与实施例2记载的表7相同的数据，以各细菌量的SN比为基础,使用机器学习的方法，进行用模型树预测PISA值的模型的制作。分析使用了统计软件“R”(R DevelopmentCore Team)的“caret”软件包“M5”方法。
在预测模型的构建中，从46个样品中随机抽取34个样品并用于交叉验证(cross-validation)法。交叉验证法中的模型构建训练数据与验证数据的比率为75∶25，学习次数为10次。
在模型构建后，将模型构建中完全未使用的剩余的12个样品的数据用作未来的未知数据，用于验证。
更具体而言，将表7的表设为数据框名称“bacteria”后，通过以下的命令来执行。
fitControl<-trainControl(method＝"CV",p＝0.75,number＝10)
train.index<-sample(nrow(bacteria),nrow(bacteria)*0.75)
#模型制作用数据集
data.train<-bacteria[train.index,]
#测试用数据集
data.test<-bacteria[-train.index,]
data.m5<-train(data.train[,-1],data.train$PISA,method＝"M5",trControl＝fitControl)
(交叉验证法中的模型构建训练数据与验证数据的比率为75∶25，学习次数为10次。)
data.m5$results#构建模型的表示
#利用未知数据的验证结果
PISA.pred<-predict(data.m5,newdata＝data.test[,-1])
#相关系数的计算
cor(PISA.pred,data.test$PISA)
#散点图的输出
plot(PISA.pred,data.test$PISA)
#利用训练数据的结果
PISA.predtr<-predict(data.m5,newdata＝data.train[,-1])
#相关系数的计算
cor(PISA.predtr,data.train$PISA)
#散点图的输出
plot(PISA.predtr,data.train$PISA)
其结果是，构建模型得到以下的结果(图4)。
M5未修剪的模型树：
(使用平滑的线性模型)
福赛斯坦纳氏菌<＝3.589：
|黄褐二氧化碳嗜纤维菌<＝1.085：LM1(3/3.579％)
|黄褐二氧化碳嗜纤维菌>1.085：
||中间普雷沃氏菌<＝1.135：
|||总细菌<＝2072.974：LM2(2/2.188％)
|||总细菌>2072.974：LM3(3/2.889％)
||中间普雷沃氏菌>1.135：
|||齿垢密螺旋体<＝2.289：LM4(3/0.856％)
|||齿垢密螺旋体>2.289：LM5(2/4.57％)
福赛斯坦纳氏菌>3.589：
|生痰二氧化碳嗜纤维菌<＝1.786：
||啮蚀艾肯氏菌<＝1.067：
|||牙周梭杆菌<＝1.502：LM6(3/2.054％)
|||牙周梭杆菌>1.502：
||||缓症链球菌<＝3.972：LM7(2/7.05％)
||||缓症链球菌>3.972：
|||||伴放线菌团聚杆菌<＝1.334：LM8(3/5.601％)
|||||伴放线菌团聚杆菌>1.334：LM9(2/21.879％)
||啮蚀艾肯氏菌>1.067：LM10(3/7.804％)
|生痰二氧化碳嗜纤维菌>1.786：
||福赛斯坦纳氏菌<＝12.803：
|||总细菌<＝2244.721：LM11(2/6.126％)
|||总细菌>2244.721：LM12(2/103.221％)
||福赛斯坦纳氏菌>12.803：
|||总细菌<＝1907.395：LM13(2/25.331％)
|||总细菌>1907.395：LM14(2/1.945％)
LM num:1
.outcome＝
0.1964*总细菌
+8.473*齿垢密螺旋体
-3.7524*缓症链球菌
+136.0844
LM num:2
.outcome＝
0.1872*总细菌
+8.473*齿垢密螺旋体
-102.9193*中间普雷沃氏菌
-3.7524*缓症链球菌
+297.6459
LM num:3
.outcome＝
0.1877*总细菌
+8.473*齿垢密螺旋体
-102.9193*中间普雷沃氏菌
-3.7524*缓症链球菌
+295.2116
LM num:4
.outcome＝
0.1964*总细菌
+10.9568*齿垢密螺旋体
-102.9193*中间普雷沃氏菌
-3.7524*缓症链球菌
+261.0986
LM num:5
.outcome＝
0.1964*总细菌
+11.1029*齿垢密螺旋体
-102.9193*中间普雷沃氏菌
-3.7524*缓症链球菌
+261.4416
LM num:6
.outcome＝
0.1528*总细菌
+6.7947*福赛斯坦纳氏菌
+6.5901*齿垢密螺旋体
+29.1856*伴放线菌团聚杆菌
+74.536*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-197.1112*啮蚀艾肯氏菌
-5.6233*缓症链球菌
+637.0725
LM num:7
.outcome＝
0.1528*总细菌
+6.7947*福赛斯坦纳氏菌
+6.5901*齿垢密螺旋体
+32.1268*伴放线菌团聚杆菌
+74.536*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-197.1112*啮蚀艾肯氏菌
-5.6233*缓症链球菌
+625.658
LM num:8
.outcome＝
0.1528*总细菌
+6.7947*福赛斯坦纳氏菌
+6.5901*齿垢密螺旋体
+32.301*伴放线菌团聚杆菌
+74.536*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-197.1112*啮蚀艾肯氏菌
-5.6233*缓症链球菌
+627.695
LM num:9
.outcome＝
0.1528*总细菌
+6.7947*福赛斯坦纳氏菌
+6.5901*齿垢密螺旋体
+32.3574*伴放线菌团聚杆菌
+74.536*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-197.1112*啮蚀艾肯氏菌
-5.6233*缓症链球菌
+627.9978
LM num:10
.outcome＝
0.1528*总细菌
+6.7947*福赛斯坦纳氏菌
+6.5901*齿垢密螺旋体
+22.9812*伴放线菌团聚杆菌
+74.536*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-273.7656*啮蚀艾肯氏菌
-5.6233*缓症链球菌
+673.9955
LM num:11
.outcome＝
0.1989*总细菌
+14.1331*福赛斯坦纳氏菌
+6.5901*齿垢密螺旋体
+90.7394*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-6.2112*缓症链球菌
+410.322
LM num:12
.outcome＝
0.1989*总细菌
+14.1331*福赛斯坦纳氏菌
+6.5901*齿垢密螺旋体
+90.7394*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-6.2112*缓症链球菌
+409.7214
LM num:13
.outcome＝
0.1989*总细菌
+14.1331*福赛斯坦纳氏菌
+6.5901*齿垢密螺旋体
+90.7394*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-6.2112*缓症链球菌
+497.6085
LM num:14
.outcome＝
0.1989*总细菌
+14.1331*福赛斯坦纳氏菌
+6.5901*齿垢密螺旋体
+90.7394*生痰二氧化碳嗜纤维菌
-6.2112*缓症链球菌
+501.0283
Numbers of Rules:14
在将训练数据输入构建的模型而得到的结果中，实际的PISA的值与预测值的相关系数为0.9318094。将其结果用图5的散点图示出。
另一方面，在将未知数据输入构建的模型而得到的验证结果中，实际的PISA的值与预测值的相关系数为0.5986115。将其结果用图6的散点图示出。
该结果表明，对于未知的数据，也能够预测PISA的值。
特别是在表8所示的表示各细菌量的SN比与口腔内整体的PISA值的比较中，显示出能够根据具有负相关系数的缓症链球菌、和具有正相关系数的福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、啮蚀艾肯氏菌、伴放线菌团聚杆菌、中间普雷沃氏菌、牙周梭杆菌的细菌群的SN比来预测PISA值。
实施例4
＜与现有的判定方法的比较＞
对于以唾液作为检体的牙周病的状态的判定，可以根据牙周疾病患者的抗菌疗法的诊疗指南(日本牙周病学会编辑)，将牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌及齿垢密螺旋体这3种细菌的总数相对于总菌数低于0.05％的情况判定为“轻度”，将相对于总菌数为0.05％以上且低于0.5％的情况判定为“中等程度”，将相对于总菌数为0.5％以上的情况判定为“重度”。
因此，在表7所示的SN比当中，计算出作为红色复合体的牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳氏菌、齿垢密螺旋体这3个菌种的SN比的总计值、与表示总菌量的总细菌的SN比的比率，作为现有的指标。根据该指标，判定了上述的“轻度”、“中等程度”、“重度”。
将判定的结果、PISA实际测定值、基于实施例3的结果的PISA预测值、3种菌的SN比、总细菌的SN比归纳于表9。
表9
将以表9所示的PISA实际测定值作为X轴、以现有的“3种菌的比率”作为Y轴的图示于图7的左图。另外，同样地，将以PISA实际测定值作为X轴、以PISA预测值作为Y轴的图示于图7的右图。对于与PISA实际测定值的确定系数而言，现有的方法为0.41左右，本发明的方法为0.66左右，表明能够比现有的方法更精度良好地预测牙周病的状态。另外表明，现有的方法中判定为“重度”的样品的“PISA预测”的平均值为1424，判定为“中等程度”的样品的PISA预测的平均值为736，也能够与现有的指标进行比较。
实施例5
以表7、8的数据为基础，选择细菌量与PISA显示出“正相关”的前3个菌种(牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、福赛斯坦纳氏菌)、以及细菌量与PISA显示出“负相关”的前3个菌种(变异链球菌、龋齿放线菌、缓症链球菌bv 2)，计算出分别各3种细菌的SN比的总计之比(显示出正相关的细菌与显示出负相关的细菌之比：作为“平衡指标”)。
将计算出的值(X轴)和PISA值(Y轴)的散点图示于图8。其结果是可知，对于X与Y的关系，存在确定系数为0.41左右的相关性。即，可知在使用了平衡指标的情况下也能够推定PISA。
实施例6
为了研究近些年来新讨论的细菌种类，与实施例1同样地新制作了搭载有表10所示的细菌探针的DNA芯片。
表10
| 序列号 | 名称 | 探针序列 |
| 30 | 对照DNA | CTATTCGACCAGCGATATCACTACGTAGGC |
| 31 | 总细菌 | CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC |
| 36 | 缠结真杆菌用探针 | CCTACGCTTACTTAACCACCTA |
| 37 | 微小小单胞菌用探针 | GTGCTTAATGAGGTTAAGCC |
| 38 | 龈沟产线菌用探针 | CCCCTACTACAGAGTTTTACGA |
| 39 | 表兄链球菌用探针 | TACACACGTTCTTCCCCTAC |
| 40 | 巴斯德卟啉单胞菌用探针 | ACACGTGACTCTTGTTATTC |
| 41 | 非典型韦荣氏球菌用探针 | CGTCAAATCCTCGCACTATTC |
| 42 | 副流感嗜血杆菌用探针 | AGTTAACGTCAATCACCTAG |
| 43 | 拟普雷沃氏菌属(A.rava，OT 308)用探针 | TTCCCAACTAAAAGCAGTTTA |
| 44 | 副血链球菌用探针 | CTGGTAAGTTACCGTCAC |
| 45 | 衣氏放线菌用探针 | GCGCTTCATAACCCGGCTAC |
| 46 | 苍白普雷沃氏菌用探针 | GAGGTGCATCAAATTATTCTCG |
| 47 | 洛氏普雷沃氏菌用探针 | CCTACTTTCAGCGCACTCAA |
| 48 | 栖组织普雷沃氏菌用探针 | CACGTGACTGACTTTATCCC |
| 49 | 莫氏细小杆菌用探针 | CCAACAATTTAACCACTTAC |
| 50 | 产黑色素普雷沃氏菌用探针 | AATAGGGACACGTCCCTAAC |
| 51 | 生痰月形单胞菌用探针 | GTACCGTCACCCAAACTCAATA |
| 52 | 龋齿罗斯氏菌用探针 | ACCCACTGCAAAACCAGGGT |
| 53 | 胶胨罗斯氏菌用探针 | TCTCTTCTTCCCTGCTAACA |
| 54 | 罗氏韦荣氏球菌用探针 | ACCGTCAATTCCTCTAACTATT |
| 55 | 胃消化链球菌用探针 | ACCACCGACTTGAAGGACCA |
| 56 | 栖牙普雷沃氏菌用探针 | AGTCAGACGTTGGGCGCCTA |
| 57 | 牙髓卟啉单胞菌用探针 | TACATGCATCTCAGCTACACGT |
| 58 | 唾液链球菌用探针 | CACACTCGTTCTTGACTTAC |
| 59 | 葛氏放线菌用探针 | AAAAAGCAGTGCCTTGTTCC |
| 60 | 中间密螺旋体用探针 | GTCGATTACCGTCATCAGATG |
| 61 | 索氏密螺旋体用探针 | TTCCTCCAAAACTTATTCCT |
| 62 | 溶血孪生球菌用探针 | CCGTCTCTACTGTATATAGT |
| 63 | 牙龈卟啉单胞菌用探针 | GGTACATTCACTATGGTACACG |
| 64 | 马氏棒杆菌用探针 | TCTTAACAAAGGTACCGTCACC |
| 65 | 隐藏真杆菌用探针 | CCCTAGGACAGAGGCTTACA |
| 66 | 变黄奈瑟氏球菌用探针 | AGCTGTCGATATTAGCAACAG |
| 67 | 邻接短链小球菌用探针 | GTCAAGGCGCTAACAGTTAC |
| 68 | 沟迹真杆菌用探针 | AAACCCTGCGCTTAAGGTGC |
| 69 | 小核桃形巨球形菌用探针 | TAACCACAAGATTATTCGTC |
| 70 | 夏氏普雷沃氏菌用探针 | ACGTGGGCTCTTTTATCCCC |
| 71 | SR1 sp.OT 345用探针 | CGTCATTCGTCTTCTGCCAA |
对于从与实施例1相同的样品中部分追加收集的56个样品，也收集了PISA的数据，对于这些样品，用表10所示的新型的DNA芯片获得了荧光强度数据。获得时的实验条件与实施例1同样地实施，仅对以下的2点进行了变更。
如下所示变更了PCR中使用的引物来实施。
R、Y表示混合碱基，R表示A和G，Y表示C和T。
正向引物(细菌扩增用)：
5’-Cy5-TACGGGAGGCAGCAG-3’(序列号72)
反向引物(细菌扩增用)：
5’-CRGGGTATCTAATCCYGTT-3’(序列号73)
正向引物(绝对量指标扩增用):
5’-Cy5-GAGAAGCCTACACAAACGTAACGTC-3’(序列号34)
反向引物(绝对量指标扩增用):
5’-CTCTAAAGACCGCTCTATCTCGG-3’(序列号35)
另外，杂交温度、时间设为50℃下16小时。
接着，对得到的荧光强度进行如下处理。
用搭载了检测对象细菌用探针的斑点的荧光强度减去背景值(未搭载探针的斑点的荧光强度的中值)，计算出源自杂交的信号强度。此时，如果信号强度低于某个阈值，则判断为噪声并设为“0”。这里，作为阈值，使用了从30个未搭载探针的斑点的荧光强度中去除了前5个和后5个后的20个值的标准偏差的3倍的值。
另外，用检测对象细菌的探针的信号强度除以总菌量指标用探针的信号强度，计算出各细菌相对于总体细菌的相对比。在随后的分析中，使用了以log10对这些相对于总量的相对比进行变换而得到的值。其中，由于值为“0”的情况无法计算，因此将log10变换后的数值替换为-4。由此，得到了全部56个检体的数据。对于该结果和PISA，按各检体归纳示于表11。
表11-1
表11-2
表11-3
表11-4
表11-5
表11-6
对于全部36个种类，计算出PISA和各细菌的log10(相对于总量的相对比)的值的相关系数，进一步挑选出这些相关系数的绝对值大于0.2的细菌种类。将相关系数显示出正值的菌种、显示出负值的菌种示于以下(表12)。
表12
| 探针 | 相关系数 |
| 苍白普雷沃氏菌 | -0.3564 |
| 唾液链球菌 | -0.2738 |
| 沟迹真杆菌 | -0.2659 |
| 胶胨罗斯氏菌 | -0.2556 |
| 栖牙普雷沃氏菌 | -0.2330 |
| 非典型韦荣氏球菌 | -0.2261 |
| 栖组织普雷沃氏菌 | -0.2255 |
| 小核桃形巨球形菌 | -0.2176 |
| 副血链球菌 | -0.2106 |
| 探针 | 相关系数 |
| SR1 sp.OT 345 | 0.2053 |
| 卡托氏卟啉单胞菌 | 0.2278 |
| 生痰月形单胞菌 | 0.2281 |
| 变黄奈瑟氏球菌 | 0.2301 |
| 表兄链球菌 | 0.2500 |
| 微小小单胞菌 | 0.2560 |
| 胃消化链球菌 | 0.2860 |
| 索氏密螺旋体 | 0.3357 |
| 隐藏真杆菌 | 0.3647 |
| 缠结真杆菌 | 0.4170 |
| 中间密螺旋体 | 0.4386 |
| 龈沟产线菌 | 0.4983 |
| 牙髓卟啉单胞菌 | 0.5607 |
相关系数显示出负值的细菌群为苍白普雷沃氏菌、唾液链球菌、沟迹真杆菌、胶胨罗斯氏菌、栖牙普雷沃氏菌、非典型韦荣氏球菌、栖组织普雷沃氏菌、小核桃形巨球形菌、副血链球菌这9个菌种。
相关系数显示出正值的细菌群为SR1 sp.OT 345、卡托氏卟啉单胞菌、生痰月形单胞菌、变黄奈瑟氏球菌、表兄链球菌、微小小单胞菌、胃消化链球菌、索氏密螺旋体、隐藏真杆菌、缠结真杆菌、中间密螺旋体、龈沟产线菌、牙髓卟啉单胞菌这13个菌种。
接下来，将上述的22个菌种的log10变换后的数值作为解释变量，将PISA值作为目标变量，进行了利用多元回归分析进行预测的模型的制作。分析中使用了统计软件“R”(RDevelopment Core Team)，使用“lm”函数来执行。
将表11的PISA和该细菌的数据(22种、56个样品数据)读取为“data01”，然后执行了以下的命令。
res1<-lm(PISA～.,data＝data01)
(将PISA作为目标变量、将22种细菌作为解释变量、利用56个样品的数据实施多元回归分析的命令)
将各细菌量的数据代入执行的预测模型式res1而得到的预测PISA值与实际的PISA的相关系数为0.8618542。将其散点图示于图9。
序列表自由文本
序列号1～74：合成DNA
序列表
<110> 三菱化学株式会社(Mitsubishi Chemical Corporation)
<120> 牙周袋炎症面积的推定方法
<130> G1907WO
<150> JP 2017-212403
<151> 2017-11-02
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 1
ttcaatgcaa tactcgtatc 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 2
cacgtatctc attttattcc cctgt 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 3
cctcttcttc ttattcttca tctgc 25
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 4
gccttcgcaa taggtatt 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 5
gtcataattc tttcccaaga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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caatgggtat tcttcttgat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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tagttataca gtttccaacg 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 8
ccagtactct agttacaca 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 9
tttctttctt cccaactgaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 10
tacattccga aaaacgtcat 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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tatgcagttt ccaacgcaa 19
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 12
cgaagggtaa atgcaaaaag gc 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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ctttattccc acataaaagc 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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aagtaccgtc actgtgtg 18
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 15
gtcaatttgg catgctatta acacacc 27
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 16
cccaagcagt tctatggt 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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tacacgtaca ccttattctt 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 18
caaccattca agaccaaca 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 19
tcaaaggcag ttgcttagt 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 20
ctctagctat ccagttcag 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 21
cacccgttct tctcttaca 19
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 22
acagtatgaa ctttccattc t 21
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 23
tctcccctct tgcactca 18
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 24
tcccctcttg cactcaagt 19
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 25
aagtcagccc gtaccca 17
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 26
tccttctaac tgttcgc 17
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 27
ccacccacaa ggagcag 17
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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ttcgcattag gcacgttc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 29
cacacgttct tgacttac 18
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 30
ctattcgacc agcgatatca ctacgtaggc 30
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 31
cgtattaccg cggctgctgg cac 23
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 32
tcctacggga ggcagcagt 19
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 33
cagggtatct aatcctgttt gctacc 26
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 34
gagaagccta cacaaacgta acgtc 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 35
ctctaaagac cgctctatct cgg 23
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 36
cctacgctta cttaaccacc ta 22
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 37
gtgcttaatg aggttaagcc 20
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 38
cccctactac agagttttac ga 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 39
tacacacgtt cttcccctac 20
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 40
acacgtgact cttgttattc 20
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 41
cgtcaaatcc tcgcactatt c 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 42
agttaacgtc aatcacctag 20
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 43
ttcccaacta aaagcagttt a 21
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 44
ctggtaagtt accgtcac 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 45
gcgcttcata acccggctac 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 46
cacgtgcatc aaattattct cg 22
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 47
cctactttca gcgcactcaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 48
cacgtgactg actttatccc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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ccaacaattt aaccacttac 20
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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aatagggaca cgtccctaac 20
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<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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gtaccgtcac ccaaactcaa ta 22
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<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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acccactgca aaaccagggt 20
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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tctcttcttc cctgctaaca 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
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accgtcaatt cctctaacta tt 22
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 55
accaccgact tgaaggacca 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成DNA
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agtcagacgt tgggcgccta 20
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<220>
<223> 合成DNA
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tacatgcatc tcagctacac gt 22
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<213> 人工
<220>
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<223> 合成DNA
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tcttaacaaa ggtaccgtca cc 22
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<220>
<223> 合成DNA
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<223> 合成DNA
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gtcaaggcgc taacagttac 20
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<211> 20
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<223> 合成DNA
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<223> 合成DNA
<400> 73
crgggtatct aatccygtt 19
<210> 74
<211> 488
<212> DNA
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<220>
<223> 合成DNA
<400> 74
gtgagaagcc tacacaaacg taacgtcagg gctaagacaa acgctaacgg tacaccctag 60
atgggagctt gtagctagat cgctaagtcc taccgacatg taggcatact cacgaaggca 120
attccctgaa agcctcgtct tatcccgaac ttggcatctg ctgatacgtc aggttgaacg 180
cgtacattta cctgtcatgc gtgggccttc tccgaatagc ctacgtagtg atatcgctgg 240
tcgaataggc ggattgctca taaatgcaca ttggctaagg cccacggaac acgaatcacg 300
tgagatcact tactattcga cggaactact atacgcaccg ggacatgcaa gtagcgtccc 360
acaagcataa ggaactctat actcgccatc tacgcagcta caggggatac acgtatgagc 420
ggttacgaag taaagccgag atagagcggt ctttagagaa aaaacaggat tagataccct 480
ggtagtcc 488
Claims (4)
1.唾液中细菌的细菌量检测用寡核苷酸探针在诊断牙周组织或口腔整体的炎症程度的DNA芯片的制造中的使用，
其中，检测唾液中2种以上细菌的细菌量并以得到的检测结果作为指标来推定牙周袋炎症面积，被检测的细菌包含：
该细菌的细菌量与牙周袋炎症面积显示出正相关关系的细菌、以及
该细菌的细菌量与牙周袋炎症面积显示出负相关关系的细菌，
所述显示出正相关关系的细菌为选自齿垢密螺旋体、福赛斯坦纳氏菌、具核梭杆菌动物亚种、牙龈卟啉单胞菌、直肠弯曲杆菌、具核梭杆菌具核亚种、有害月形单胞菌、小韦荣氏球菌、戈氏链球菌、具核梭杆菌文氏亚种、中间链球菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、伴放线菌团聚杆菌、具核梭杆菌多形亚种、牙周梭杆菌、SR1 sp.OT 345、卡托氏卟啉单胞菌、生痰月形单胞菌、变黄奈瑟氏球菌、表兄链球菌、微小小单胞菌、胃消化链球菌、索氏密螺旋体、隐藏真杆菌、缠结真杆菌、中间密螺旋体、龈沟产线菌及牙髓卟啉单胞菌中的至少1种，
所述显示出负相关关系的细菌为选自变异链球菌、龋齿放线菌、缓症链球菌bv 2、缓症链球菌、简明弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、苍白普雷沃氏菌、唾液链球菌、沟迹真杆菌、胶胨罗斯氏菌、栖牙普雷沃氏菌、非典型韦荣氏球菌、栖组织普雷沃氏菌、小核桃形巨球形菌及副血链球菌中的至少1种。
2.根据权利要求1所述的使用，其中，所述牙周袋炎症面积由PISA或CAPRS的值表示。
3.根据权利要求1所述的使用，其具有以下的工序(1)～(4)：
(1)从牙周袋炎症面积已知的被检者的唾液样品检测唾液中的各种细菌的细菌量的工序；
(2)对于该各种细菌的细菌量，求出每种菌固有的与牙周袋炎症面积的相关系数，构建各种细菌的细菌量与牙周袋炎症面积的关系式，并制作预测模型的工序；
(3)从牙周袋炎症面积未知的被检者的唾液样品检测唾液中的各种细菌的细菌量的工序；
(4)将(3)中得到的各种细菌量代入(2)中得到的关系式来推定牙周袋炎症面积的工序。
4.根据权利要求3所述的使用，其中，所述预测模型的制作方法为使用选自线性回归、回归树、模型树、神经网络、支持向量机、套袋法、提升方法、随机森林的机器学习算法中的1种方法。
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