BR112020008566A2 - método para estimar área de inflamação de bolsas periodontais - Google Patents

Abstract

[Problema]. O fornecimento de um método para predizer simplesmente o grau de inflamação, como a área de inflamação (valor de PISA e valor de CAPRS), de tecido periodontal, e um dispositivo (chip de DNA etc.) que é usado para o método. [Solução] Um método em que as quantidades de dois ou mais tipos de bactérias na saliva são detectadas, e a área de inflamação de bolsas periodontais é estimada com o uso dos resultados de detecção obtidos como um índice, em que as bactérias que são detectadas incluem bactérias que indicam uma correlação positiva entre as quantidades das bactérias e a área de inflamação de bolsas periodontais, e bactérias que indicam uma correlação negativa entre as quantidades das bactérias e a área de inflamação de bolsas periodontais.

Description

“MÉTODO PARA ESTIMAR ÁREA DE INFLAMAÇÃO DE BOLSAS PERIODONTAIS” Campo da Técnica

[0001] A presente invenção refere-se a um método para estimar uma área de inflamação de bolsa periodontal. Antecedentes da técnica

[0002] O diagnóstico de doença periodontal é realizado medindo-se a bolsa periodontal, nível de fixação, diagnóstico de imagem de raio X e similares. No entanto, esses métodos de diagnóstico colocam uma carga pesada em um indivíduo, e exigem uma quantidade considerável de tempo, especialmente quando realizada em um grande número de pessoas. Além disso, esses métodos de diagnóstico de doença periodontal complicaram os procedimentos de operação, e há um problema de que há diferenças individuais em critérios de julgamento devido ao fato de que os mesmos são baseados nas experiências e habilidades dos dentistas.

[0003] Portanto, métodos simples para diagnosticar doença periodontal foram propostos até então. Por exemplo, a Literatura Patentária 1 revela um método para diagnosticar doença periodontal com uso de uma proteína contida em fluido crevicular gengival como um marcador para doença periodontal. Adicionalmente, a Literatura Patentária 2 revela um método para prever a profundidade de bolsa periodontal (PPD) e Índice de sangramento gengival (GBI) analisando-se uma pluralidade de proteínas na saliva. No entanto, em geral, para PPD e GB, visto que há 168 pontos de medição (método de 28 dentes x 6 pontos), é desconhecido qual ponto é de fato previsto.

[0004] Entretanto, de modo mais geral, conforme revelado na Literatura Patentária 3, as bactérias de doença periodontal presentes no fluido crevicular gengival e as bactérias de doença periodontal na saliva são medidos. O valor de área de superfície inflamada periodontal (PISA) calculado a partir da profundidade de bolsa periodontal (PPD) e índice de sangramento gengival (GBI) é proposto como um índice correspondente a bactérias de doença periodontal presentes na saliva (Literatura Não Patentária 1). O valor de PISA é calculado multiplicando-se o valor de área de superfície epitelial periodontal (PESA) calculado a partir da profundidade de bolsa periodontal (PPD) pelo índice de sangramento gengival (GB).

[0005] Adicionalmente a isso, o valor de CAPRS é proposto por Takizawa et al. (Literatura Não Patentária 2). Conforme descrito na literatura, esse valor é calculado obtendo-se a área clínica de superfície da raiz de dente (CARS), isto é, a área de superfície total das raízes localizadas no lado de ápice da margem gengival, a partir do nível de fixação, e então, subtraindo a área eficaz de superfície da raiz de dente do valor obtido. De fato, o valor é calculado substituindo-se o mesmo pelo caso em que a posição de margem gengival coincide com a linha cervical anatômica, e o mesmo é considerado como igual ao valor de PESA mostrado na Figura 1 (b) da Literatura Não Patentária 1. Embora o índice de sangramento gengival (GBI) não é incluído no cálculo da área ocultada na bolsa periodontal do valor de superfície da raiz de dente (CAPRS), a própria área deve ser aproximada à área de inflamação na superfície interna da bolsa conforme descrito na literatura, e deve ser considerado como a “área de inflamação de bolsa periodontal” junto com o valor de PISA.

[0006] Até agora, de modo a avaliar facilmente a “área de inflamação de bolsa periodontal," a relação com o número de bactérias de doença periodontal na saliva foi examinado. No entanto, não há correlação entre a contagem bacteriana de uma bactéria de P.g (Porphyromonas gingivalis) e o valor de CAPRS e entre a contagem bacteriana de uma bactéria de complexo vermelho (uma bactéria de P.g, uma bactéria de T.d (Treponema denticola), ou uma bactéria de T.f (Tannerella forsythensis)) e o valor de CAPRS (Literatura Não Patentária 2, Figuras 3a, 3b). Desse modo, um método para prever simplesmente a “área de inflamação de bolsa periodontal" a partir de uma amostra de saliva foi desconhecido. Lista de Citações Literatura de Patente

[0007] Literatura Patentária 1: Publicação de Patente (Kokai) nº JP 2004-51536 À

[0008] Literatura Patentária 2: Patente nº JP 5869323

[0009] Literatura Patentária 3: Patente nº JP 4917815 Literatura de não patente

[0010] Literatura Não Patentária 1: Área de superfície inflamada Periodontal: quantificar carga inflamatória. J Clin Periodontol. Ago de 2008; 35(8):668-73.

[0011] Literatura Não Patentária 2: “Clinical Significance of Periodontal Pocket Inflammation Area Evaluation Method as Systemic Disease-Related Test Marker for Periodontal Disease (em japonês)," Journal of Japanese Society for Evidence and the Dental Professional: JUSEDP, vol. 1: 7-12, 2009 Sumário da Invenção Problema da Técnica

[0012] Sob tais circunstâncias, foi desejado fornecer um método para estimar uma área de inflamação de bolsa periodontal com base nos resultados de detecção da carga bacteriana na saliva.

[0013] Além disso, sob tais circunstâncias, foi desejado fornecer um método para prever simplesmente o grau de inflamação do tecido periodontal tal como a área de superfície inflamada periodontal (valor de PISA) com base nos resultados de detecção da carga bacteriana na saliva. Solução para o Problema

[0014] A presente invenção foi criada em consideração da situação acima, e fornece os métodos a seguir para estimar uma área de inflamação de bolsa periodontal e estimar compreensivamente o grau de inflamação de tecido periodontal.

[0015] [1] A método para estimar uma área de inflamação de bolsa periodontal detectando-se cargas bacterianas de dois ou mais tipos de bactérias na saliva e com uso dos resultados de detecção obtidos como índices, em que bactérias a serem detectadas incluem:

[0016] uma bactéria que tem uma correlação positiva entre uma carga bacteriana da bactéria e a área de inflamação de bolsa periodontal; e

[0017] uma bactéria que tem uma correlação negativa entre uma carga bacteriana da bactéria e a área de inflamação de bolsa periodontal.

[0018] [2] O método, de acordo com [1], em que a área de inflamação de bolsa periodontal é representado por um valor de PISA ou CAPRS.

[0019] [3] O método, de acordo com [1] ou [2], em que a bactéria que tem a correlação positiva é pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em Treponema denticola, Tannerella forsythia, Fusobacterium nucleatum subsp. animalis,

Porphyromonas gingivalis, Campylobacter rectus, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Selenomonas noxia, Veillonella parvula, Streptococcus gordorii, Fusobacterium — nucleatum subsp. vincenti, Streptococcus intermedius, Capnocytophaga —ochraceay Capnocytophaga sputigenay Aggregatibacter actinomycetemcomitans, — Fusobacterium — nucleatum — subsp. —polymorphum, Fusobacterium periodonticum, SR1 sp. OT 345, Porphyromonas catoniae, Selenomonas sputigena, Neisseria flavescens, Streptococcus sobrinus, Parvimonas micra, Peptostreptococcus stomatis, Treponema socranskii, Eubacterium saphenum, Eubacterium nodatum, Treponema medium, Filifactor alocis e Porphyromonas endodontalis.

[0020] [4] O método, de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que a bactéria que tem a correlação negativa é pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em Streptococcus mutans, Actinomyces odontolyticus, Streptococcus mitis bv 2, Streptococcus mitis, Campylobacter concisus, Capnocytophaga gingivalis, Prevotella pallens, Streptococcus salivarius, Eubacterium sulci, Rothia mucilaginosa, Prevotella denticola, Veillonella atypica, Prevotella histicola, Megasphaera micronuciformis e Streptococcus parasanguinis.

[0021] [5] O método, de acordo com a reivindicação 1, que compreende as seguintes etapas (1) a (4): (1) uma etapa de detectar a carga bacteriana de cada bactéria na saliva a partir de uma amostra de saliva de um indivíduo com uma área de inflamação de bolsa periodontal conhecida; (2) uma etapa de obter um coeficiente de correlação da carga bacteriana de cada bactéria com uma área de inflamação de bolsa periodontal exclusiva a cada bactéria e que constrói uma expressão relacional entre a carga bacteriana de cada bactéria e a área de inflamação de bolsa periodontal, criando assim um modelo de previsão; (3) uma etapa de detectar a carga bacteriana de cada bactéria na saliva a partir de uma amostra de saliva de um indivíduo com uma área de inflamação de bolsa periodontal desconhecida;

(4) uma etapa inserir a carga bacteriana de cada bactéria obtida em (3) na expressão relacional obtida em (2), estimando assim a área de inflamação de bolsa periodontal.

[0022] [6] O método, de acordo com [5], em que um método para criar o modelo de previsão é um método com uso de um selecionado dentre máquina que aprende algoritmos de regressão linear, árvore de regressão, árvore modelo, rede neural, máquina de vetor de suporte, ensacagem, intensificação e floresta aleatória.

[0023] [7] A método para estimar compreensivamente o grau de inflamação do tecido periodontal detectando-se uma carga bacteriana de pelo menos um tipo de bactéria na saliva e com uso dos resultados de detecção obtidos como índices.

[0024] [8] O método, de acordo com [7], em que o grau de inflamação do tecido periodontal é representado por um valor de PISA ou CAPRS.

[0025] [9] O método, de acordo com [7] ou [8], em que a carga bacteriana da bactéria detectada é um número de cópia da bactéria na saliva.

[0026] [10] O método, de acordo com qualquer um de [7] e [8], em que a carga bacteriana da bactéria detectada é baseado em informações de sequência de 16S rRNA da bactéria na saliva.

[0027] [11] O método, de acordo com qualquer um de [7] a [10], em que a bactéria detectada é uma bactéria pertencente a pelo menos um gênero selecionado dentre os gêneros Porphyromonas, Tannerella, Treponema, Prevotella, Campylobacter, Fusobacterium, Streptococcus, Aggregatibacter, Capnocytophaga, Eikenella, Actinomyces, Veillonella e Selenomonas.

[0028] [12] O método, de acordo com qualquer um de [7] a [11], em que a bactéria detectada é uma bactéria pertencente a pelo menos um selecionado dentre Streptococcus mutans, Actinomyces odontolyticus, Streptococcus mitis bv 2, Streptococcus mitis, Campylobacter concisus, Prevotella intermedia, Campylobacter showae, Prevotella nigrescens, Eikenella corrodens, Capnocytophaga gingivalis, Actinomyces naeslundii Il, Streptococcus constellatus, Campylobacter gracilis, Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Capnocytophaga sputigena,

Capnocytophaga ochracea, Streptococcus intermedius, Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula, Selenomonas noxia, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Campylobacter rectus, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum subsp. animalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola.

[0029] [13] O método, de acordo com qualquer um de [7] a [12], em que a bactéria detectada inclui uma bactéria que pode ter uma correlação positiva entre a carga bacteriana da bactéria e o grau de inflamação do tecido periodontal.

[0030] [14] O método, de acordo com [13], em que a bactéria que pode ter a correlação positiva é pelo menos uma selecionada dentre Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Capnocytophaga sputigena, Capnocytophaga ochracea, Streptococcus intermedius, Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula, Selenomonas noxia, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Campylobacter rectus, Porphyromonas gingivalisó, Fusobacterium nucleatum subsp. animalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola.

[0031] [15] O método, de acordo com qualquer um de [7] a [12], em que a bactéria detectada inclui uma bactéria que pode ter uma correlação negativa entre a carga bacteriana da bactéria e o grau de inflamação do tecido periodontal.

[0032] [16] O método, de acordo com [15], em que a bactéria que pode ter a correlação negativa é pelo menos uma selecionada dentre Streptococcus mutans, Actinomyces odontolyticus, Streptococcus mitis bv 2, Streptococcus mitis, Campylobacter concisus, Prevotella intermedia, Campylobacter showae, Prevotella nigrescens, Eikenella corrodens, Capnocytophaga gingivalis, Actinomyces naeslundii Il, Streptococcus constellatus e Campylobacter gracilis. Efeitos Vantajosos da Invenção

[0033] De acordo com a presente invenção, é possível prever simplesmente a área de inflamação de bolsa periodontal baseada nos resultados de detecção de cargas bacterianas na saliva. Em outras palavras, é possível simplesmente estimar o grau de inflamação da cavidade oral inteira com uso de saliva coletada, sem realizar exame de doença periodontal preciso (medição ou imageamento de bolsa).

[0034] Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, é possível simplesmente prever o grau de inflamação de tecido periodontal tal como uma área inflamada (valor de PISA ou CAPRS) com base nos resultados de detecção de cargas bacterianas na saliva. Em outras palavras, é possível simplesmente estimar o grau de inflamação (valor de índice de inflamação) da cavidade oral inteira com uso de saliva coletada, sem realizar exame de doença periodontal preciso (medição ou imageamento de bolsa).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0035] [Figura 1-1] A Figura 1-1 é uma Figura que mostra uma árvore modelo de precisão de PISA calculada a partir da razão de SN de cada carga bacteriana.

[0036] [Figura 1-2] A Figura 1-2 é uma Figura que mostra uma árvore modelo de previsão de PISA calculada a partir da razão de SN de cada carga bacteriana (continuação da Figura 1-1; número 1 circundado por um quadrado na Figura 1-1 é conectado ao número 21 na Figura 1-2).

[0037] [Figura 2] A Figura 2 é uma Figura que mostra um diagrama de dispersão de valores de PISA (eixo geométrico horizontal) previsto a partir da árvore modelo na Figura 1 e valores de medição de PISA (eixo geométrico vertical).

[0038] [Figura 3] A Figura 3 é uma Figura que mostra um diagrama de dispersão de valores de PISA (eixo geométrico horizontal) previsto a partir de uma árvore modelo criada a partir da razão de S/N de cada carga bacteriana após correção entre chips e valores de medição de PISA (eixo geométrico vertical).

[0039] [Figura 4-1] A Figura 4-1 é uma Figura que mostra uma árvore modelo de previsão de PISA calculada a partir da razão de SN de cada carga bacteriana após a correção entre chips com uso de 34 dados de 46 dados no total.

[0040] [Figura 4-2] A Figura 4-1 é uma Figura que mostra um árvore modelo de previsão de PISA calculada a partir da razão de SN de cada carga bacteriana após a correção entre chips com uso de 34 dados de 46 dados no total (continuação da Figura 4-1; número 1 circundado por um quadrado na Figura 4-1 é conectado ao número 11 na Figura 4-2, e número 13 circundado por um quadrado na Figura 4-1 é conectado ao número 12 na Figura 4-2).

[0041] [Figura 5] A Figura 5 é uma Figura que mostra um diagrama de dispersão de valores de PISA (eixo geométrico horizontal) previsto para 34 dados usados para criar a árvore modelo na Figura 4 e valores de medição de PISA (eixo geométrico vertical).

[0042] [Figura 6] A Figura 6 é uma Figura que mostra um diagrama de dispersão de valores de medição de PISA dos 12 dados restantes não usados para modelagem dos 46 dados no total (eixo geométrico vertical) e valores de PISA (eixo geométrico horizontal) previstos a partir da árvore modelo na Figura 4.

[0043] [Figura 7] A Figura 7 é uma Figura que mostra uma comparação de um diagrama de dispersão (esquerdo) de valores de medição de PISA e “proporções de três bactérias em relação à carga bacteriana total (conhecida na técnica)” e um diagrama de dispersão (direita) de valores de medição real de PISA e valores de previsão de PISA.

[0044] [Figura 8] A Figura 8 é uma Figura que mostra um diagrama de dispersão de valores de medição de PISA e razões de bactérias que mostram uma correlação positiva e bactérias que mostram uma correlação negativa (“índice de equilíbrio”).

[0045] [Figura 9] A Figura 9 é uma Figura que mostra um diagrama de dispersão obtido conduzindo-se um teste com 56 amostras, com uso da carga bacteriana de espécies bacterianas que tiveram uma correlação estatisticamente significativa com valores de PISA (eixo geométrico horizontal) como uma variável explicativa, e criando uma fórmula de modelo de previsão por análise de regressão múltipla para prever valores de PISA (eixo geométrico vertical). Descrição das Modalidades

[0046] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes. O escopo da presente invenção não é limitado a essas descrições e, diferente dos exemplos a seguir, o escopo da presente invenção pode ser apropriadamente modificado e implantado dentro de uma faixa que não afeta a essência da presente invenção. Todas as publicações citadas no presente relatório descritivo, por exemplo, antes da literatura da técnica, publicações, publicações de patente, e outra Literatura Patentária são incorporadas no presente documento a título de referência.

[0047] A invenção do método para estimar a área de inflamação de bolsa periodontal (doravante, também denominada como “primeiro grupo de invenção”), que é um primeiro aspecto da presente invenção, inclui as seguintes etapas: i) uma etapa de detectar cargas bacterianas de dois ou mais tipos de bactérias na saliva; e ii) uma etapa de estimar uma área de inflamação de bolsa periodontal com uso dos resultados de detecção obtidos como índices.

[0048] A invenção do método para estimar compreensivamente o grau de inflamação de tecido periodontal (doravante, também denominado como “segundo grupo de invenção”), que é um segundo aspecto da presente invenção, inclui as seguintes etapas: i) uma etapa de detectar uma carga bacteriana de pelo menos um tipo de bactéria na saliva (isto é, saliva de um indivíduo, especialmente um humano); e ii) uma etapa de estimar compreensivamente o grau de inflamação de tecido periodontal com uso dos resultados de detecção obtidos como índices.

1. Sondas de Oligonucleotídeo para Detectar Cargas Bacterianas de Bactérias na Saliva

[0049] No método da presente invenção, um chip de DNA pode ser usado ao medir a carga de bactérias na cavidade oral da saliva coletada de um indivíduo. Por exemplo, a sonda (a) a seguir (sonda específica de bactéria) pode ser montada no chip de DNA e, além disso, a sonda (b) (sonda de índice de carga total) e a sonda (c) (sonda de Índice de carga absoluta) pode ser montada no mesmo.

(a) Sonda específica bacteriana: Uma sonda que consiste em um ácido nucleico que hibridiza especificamente com um gene bacteriano alvo de detecção (ou parte do mesmo) (b) Sonda de índice de carga total: Uma sonda que consiste em ácidos nucleicos que hibridizam com todos os genes bacterianos (c) Sonda de índice de carga absoluta: Uma sonda que consiste em ácidos nucleicos que hibridizam específica e separadamente com um ou mais tipos de índices de carga absoluta

[0050] Adicionalmente, em geral, um chip de DNA é um termo geral para um substrato no qual sondas são dispostas. Além disso, nomes tais como chip de DNA e microarranjo de DNA não são distinguidos entre si e são sinônimos. (1) Bactérias alvo de detecção na saliva

[0051] No método da presente invenção, bactérias alvo de detecção na saliva (alvos para medir a carga bacteriana) não são limitadas, mas são preferencialmente bactérias que pertencem ao gênero listado conforme a seguir, isto é, bactérias que pertencem a pelo menos um gênero selecionado dentre: o gênero Porphyromonas, Tannerella, Treponema, Prevotella, Campylobacter, Fusobacterium, Streptococcus, Aggregatibacter, Capnocytophaga, Eikenella, Actinomyces, Veillonella, Selenomonas, Eubacterium, Parvimonas, Filifactor, Haemophilus, Alloprevotella, Solobacterium, Rothia, Peptostreptococcus, Gemella, Corynebacterium, Neisseria, Granulicatella e Megasphaera; e o gênero do filo SR1.

[0052] Mais especificamente, é mais preferencial detectar pelo menos um tipo ou dois ou mais tipos selecionados dentre várias bactérias listadas abaixo.

[0053] Porphyromonas gingivalis

[0054] Tannerella forsythia

[0055] Treponema denticola

[0056] Campylobacter gracilis

[0057] Campylobacter rectus

[0058] Campylobacter showae

[0059] Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii

[0060] Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum

[0061] Fusobacterium nucleatum subsp. animalis

[0062] Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum

[0063] Fusobacterium periodonticum

[0064] Prevotella intermedia

[0065] Prevotella nigrescens

[0066] Streptococcus constellatus

[0067] Aggregatibacter actinomycetemcomitans

[0068] Campylobacter concisus

[0069] Capnocytophaga gingivalis

[0070] Capnocytophaga ochracea

[0071] Capnocytophaga sputigena

[0072] Eikenella corrodens

[0073] Streptococcus gordonii

[0074] Streptococcus intermedius

[0075] Streptococcus mitis

[0076] Streptococcus mitis bv 2

[0077] Actinomyces odontolyticus

[0078] Veillonella parvula

[0079] Actinomyces naeslundii ||

[0080] Selenomonas noxia

[0081] Streptococcus mutans

[0082] Eubacterium nodatum

[0083] Parvimonas micra

[0084] Filifactor alocis

[0085] Streptococcus sobrinus

[0086] Porphyromonas pasteri

[0087] Veillonella atypica

[0088] Haemophilus parainfluenzae

[0089] Alloprevotella spp. (A. rava, OT 308)

[0090] Streptococcus parasanguinis

[0091] Actinomyces israelii

[0092] Prevotella pallens

[0093] Prevotella loescheii

[0094] Prevotella histicola

[0095] Solobacterium moorei

[0096] Prevotella melaninogenica

[0097] —Selenomonas sputigena

[0098] Rothia dentocariosa

[0099] Rothia mucilaginosa

[0100] Veillonella rogosae

[0101] Peptostreptococcus stomatis

[0102] Prevotella denticola

[0103] Porphyromonas endodontalis

[0104] Streptococcus salivarius

[0105] Actinomyces graevenitzii

[0106] Treponema medium

[0107] Treponema socranskii

[0108] Gemella sanguinis

[0109] Porphyromonas catoniae

[0110] Corynebacterium matruchotii

[0111] Eubacterium saphenum

[0112] Neisseria flavescens

[0113] Granulicatella adiacens

[0114] Eubacterium sulci

[0115] Megasphaera micronuciformis

[0116] Prevotella shahii

[0117] SR1sp. OT 345

[0118] No “primeiro grupo de invenção”, uma bactéria que tem uma correlação positiva entre a carga bacteriana da bactéria e a área de inflamação de bolsa periodontal (uma relação na qual a área de inflamação de bolsa periodontal aumenta quando a carga bacteriana aumenta) (doravante algumas vezes abreviada como “bactéria que tem uma correlação positiva”), e uma bactéria que tem uma correlação negativa entre a carga bacteriana da bactéria e a área de inflamação de bolsa periodontal (uma relação na qual a área de inflamação de bolsa periodontal diminui quando a carga bacteriana aumenta) (doravante algumas vezes abreviada como “bactéria que tem uma correlação negativa”) são usadas.

[0119] A área de inflamação de bolsa periodontal é a área de inflamação, que inclui a área de superfície inflamada periodontal (PISA) e/ou a área ocultada na bolsa periodontal de superfície da raiz de dente (CAPRS). Se houver um índice de um conceito similar, o índice é também incluído.

[0120] O valor de PISA indica a área de inflamação do tecido periodontal da cavidade oral inteira em milímetros quadrados (mm?). Isso pode ser calculado a partir da área de superfície epitelial periodontal (PESA) e a presença ou ausência de sangramento na sondagem (BOP) durante a sondagem. A área de superfície epitelial periodontal (PESA) pode ser calculada a partir da área definida antecipadamente para cada tipo de dente e a profundidade de bolsa periodontal (PPD). Uma planilha de cálculo automático (arquivo de Excel) para o método de 6 pontos é distribuído como informações adicionais na Literatura Não Patentária 1 (https://www.parsprototo.info/pisa.html). Um elemento versado na técnica pode confirmar o método de cálculo acima consultando-se a fórmula de cálculo descrita no arquivo de Excel.

[0121] Conforme descrito na literatura, o valor de CPRS é calculado obtendo-se a área clínica de superfície da raiz de dente (CARS), isto é, a área de superfície total das raízes localizadas no lado de ápice da margem gengival, a partir do nível de fixação, e então, subtraindo a área eficaz de superfície da raiz de dente do valor obtido. De fato, o valor é calculado substituindo-se o mesmo pelo caso em que a posição de margem gengival coincide com a linha cervical anatômica, e o mesmo é considerado como igual ao valor de PESA mostrado na Figura 1 (b) da Literatura Não Patentária 1. Embora o índice de sangramento gengival (GBI) não seja incluído no cálculo da CAPRS, a própria área deve ser aproximada à área de inflamação na superfície interna da bolsa conforme descrito na literatura, e deve ser considerado como a “área de inflamação de bolsa periodontal” junto com o valor de PISA.

[0122] A área de inflamação de bolsa periodontal é preferencialmente representada pelo valor de PISA ou CAPRS.

[0123] Uma bactéria que tem uma correlação positiva e uma bactéria que tem uma correlação negativa pode ser confirmada por uma ferramenta com capacidade de medir a carga bacteriana (ou uma quantidade medida proporcional à carga bacteriana tal como razão de SN). A ferramenta não é particularmente limitada e, por exemplo, um chip de DNA pode ser usada.

[0124] Quando um chip de DNA é usado para confirmação, uma amostra oral é medida com o chip de DNA, e então, um coeficiente de correlação entre a área de inflamação de bolsa periodontal e a carga bacteriana de cada bactéria ou a quantidade medida tais como a razão de SN é calculada. Desse modo, as bactérias podem ser classificadas e identificadas como um grupo bacteriano que tem um coeficiente de correlação positiva e um grupo bacteriano que tem um coeficiente de correlação negativa. O valor absoluto do coeficiente de correlação para essas bactérias é preferencialmente 0,02 ou mais, mais preferencialmente 0,1 ou mais, ainda mais preferencialmente, 0,2 ou mais, com preferência particular, 0,4 ou mais, e, com máxima preferência, 0,6 ou mais quando o número de medições é 40 ou mais.

[0125] Ao usar os dados de erro corrigido experimentais para criar um modelo de previsão para estimar a área de inflamação de bolsa periodontal, que será descrita posteriormente, os dados de erro corrigido experimentais são também usados para a classificação de grupos bacterianos.

[0126] Exemplos preferenciais de uma bactéria que tem uma correlação positiva incluem as bactérias listadas abaixo. É mais preferencial detectar pelo menos uma, preferencialmente duas ou mais dessas bactérias.

[0127] Treponema denticola

[0128] Tannerella forsythia

[0129] Fusobacterium nucleatum subsp. animalis

[0130] Porphyromonas gingivalis

[0131] Campylobacter rectus

[0132] Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum

[0133] Selenomonas noxia

[0134] Veillonella parvula

[0135] Streptococcus gordonii

[0136] —Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii

[0137] Streptococcus intermedius

[0138] Capnocytophaga ochracea

[0139] Capnocytophaga sputigena

[0140] Aggregatibacter actinomycetemcomitans

[0141] Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum

[0142] Fusobacterium periodonticum

[01483] —SR1sp. OT 345

[0144] Porphyromonas catoniae

[0145] Selenomonas sputigena

[0146] Neisseria flavescens

[0147] Streptococcus sobrinus

[0148] Parvimonas micra

[0149] Peptostreptococcus stomatis

[0150] Treponema socranskii

[0151] Eubacterium saphenum

[0152] Eubacterium nodatum

[0153] Treponema medium

[0154] Filifactor alocis

[0155] Porphyromonas endodontalis

[0156] Exemplos preferenciais de uma bactéria que tem uma correlação negativa incluem as bactérias listadas abaixo. É mais preferencial detectar pelo menos uma, preferencialmente duas ou mais dessas bactérias.

[0157] Streptococcus mutans

[0158] — Actinomyces odontolyticus

[0159] Streptococcus mitis bv 2

[0160] Streptococcus mitis

[0161] Campylobacter concisus

[0162] Capnocytophaga gingivalis

[0163] Prevotella pallens

[0164] Streptococcus salivarius

[0165] Eubacterium sulci

[0166] Rothia mucilaginosa

[0167] Prevotella denticola

[0168] Veillonella atypica

[0169] Prevotella histicola

[0170] Megasphaera micronuciformis

[0171] Streptococcus parasanguinis

[0172] No “segundo grupo de invenção,” uma bactéria que tem uma correlação positiva entre a carga bacteriana da bactéria e o grau de inflamação de tecido periodontal (valor de valor de PISA ou CAPRS) e uma bactéria que tem uma correlação negativa entre as mesmas são preferencialmente exemplificadas.

[0173] Exemplos preferenciais da bactéria que tem uma correlação positiva incluem, por exemplo, as bactérias listadas abaixo. É mais preferencial detectar pelo menos uma, preferencialmente duas ou mais dessas bactérias.

[0174] Treponema denticola

[0175] Tannerella forsythia

[0176] Fusobacterium nucleatum subsp. animalis

[0177] Porphyromonas gingivalis

[0178] Campylobacter rectus

[0179] Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum

[0180] Selenomonas noxia

[0181] Veillonella parvula

[0182] Streptococcus gordonii

[0183] Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii

[0184] Streptococcus intermedius

[0185] Capnocytophaga ochracea

[0186] Capnocytophaga sputigena

[0187] Aggregatibacter actinomycetemcomitans

[0188] — Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum

[0189] Fusobacterium periodonticum

[0190] Adicionalmente, exemplos preferenciais da bactéria que tem uma correlação negativa incluem, por exemplo, as bactérias listadas abaixo. É mais preferencial detectar pelo menos uma, preferencialmente duas ou mais dessas bactérias.

[0191] Streptococcus mutans

[0192] Actinomyces odontolyticus

[0193] Streptococcus mitis bv 2

[0194] Streptococcus mitis

[0195] Campylobacter concisus

[0196] —Capnocytophaga gingivalis (2) Sonda específica bacteriana

[0197] Na presente invenção, um oligo DNA que pode ser usado como uma sonda específica bacteriana é aquela que pode hibridizar com uma sequência de base em uma região específica de uma sequência de base de um ácido nucleico de uma bactéria na saliva. Aqui, o ácido nucleico pode ser qualquer um de DNA e RNA incluindo DNA cromossômico e DNA de plasmídeo, e não é limitado, mas DNA cromossômico é preferencial. Especificamente, um oligonucleotídeo usado como uma sonda na presente invenção tem capacidade de hibridizar com a sequência de base do gene de 16S rRNA no DNA cromossômico bacteriano.

[0198] É preferencial que as sondas que podem ser usadas na presente invenção sejam projetadas selecionando-se uma região que tem uma sequência de base específica a cada uma das bactérias a serem detectadas e projetando uma sequência de base da região. Em geral, ao projetar uma sonda, adicionalmente a selecionar uma região específica, é necessário que a temperatura de fusão (Tm) seja uniforme e que uma estrutura secundária seja difícil de se formar.

[0199] A sequência de base específica correspondente a cada espécie bacteriana na saliva pode ser encontrada por meio de, por exemplo, realizar alinhamento múltiplo e projetar sondas em diferentes regiões entre espécies. O algoritmo para alinhamento não é particularmente limitado, mas como um mais programa de análise específica, por exemplo, um programa, tal como ClustalX1.8 pode ser usado. Os parâmetros usados para o alinhamento pode ser executado no estado padrão de cada programa, mas pode ser ajustado conforme apropriado de acordo com o tipo de programa.

[0200] A especificidade de sonda pode ser uma especificidade que detecta coletivamente bactérias do mesmo gênero com base na especificidade de nível de gênero ou pode ser uma especificidade que pode ser detectada no nível de espécie individual. Sondas podem ser apropriadamente selecionadas e projetadas de acordo com o propósito de detecção.

[0201] Exemplos de sondas específicas bacterianas que podem ser usadas na presente invenção são mostradas na Tabela A abaixo (SEQ ID NOS: 1 a 29). (3) Sonda de índice de carga total

[0202] Uma sonda de índice de carga total é uma sonda para capturar todas as bactérias em um espécime (na saliva) que pode ser amplificado com um par de iniciador específico. Ao detectar bactérias, é também importante que a carga bacteriana total dos pontos de vista da proporção de bactérias alvo de detecção em relação às bactérias inteiras incluindo bactérias não alvo de detecção e a abundância geral de bactérias presentes em um espécime.

[0203] As bactérias não alvo de detecção podem ser entendidas como a soma (total) das bactérias de tipos conhecidos que são conhecidos como presentes, mas podem não ser detectados, e bactérias de tipos desconhecidos que são conhecidos como presentes.

[0204] De modo a detectar a carga bacteriana total, por exemplo, é possível medir a carga bacteriana total independentemente de um chip de DNA. Entretanto, a simplicidade da operação é aprimorada montando-se uma sonda, que é um índice da carga bacteriana total, no chip de DNA. Em relação às sondas, uma sequência de base comum a muitos tipos de espécie bacteriana pode ser usada a partir das sequências de base amplificadas pelo par iniciador. Quando tal sequência não pode ser encontrada, uma pluralidade de sequências relativamente comuns pode ser projetada e compreensivamente julgada como usada como a sonda de índice de carga total. A sonda de índice de carga total é preferencialmente uma sonda que hibridiza com um ácido nucleico a partir de uma bactéria contida em um espécime,

especificamente, uma sonda que inclui uma sequência de base comum em uma Pluralidade de tipos de bactérias alvo de detecção a partir da sequência de base amplificada pelo par de iniciador específico. Exemplos da sonda de índice de carga total são mostrados na Tabela A abaixo (SEQ ID NO: 31).

[0205] O índice de carga total geralmente aumenta devido ao fato de que isso representa a quantidade total de produtos de amplificação específicos a espécies individuais. Portanto, a intensidade de sinal de interesse pode exceder a faixa de intensidades de sinal detectáveis.

[0206] De modo a evitar tal situação, é desejável limitar a quantidade de um espécime usado para hibridização. Alternativamente, ao projetar uma sonda, por exemplo, o valor de Tm da sonda é abaixado. Especificamente, é concebível reduzir o teor de GC ou encurtar o comprimento de sequência de sonda por si só.

[0207] Além disso, no tempo de hibridização, é possível reduzir a intensidade de sinal adicionando-se um ácido nucleico que atua de forma competitiva na hibridização entre o ácido nucleico amplificado e a sonda de índice de carga total. Exemplos de tal ácido nucleico incluem um ácido nucleico que tem uma sequência que é total ou parcialmente a mesma que a da sonda de índice de carga total, ou um ácido nucleico que tem total ou parcialmente uma sequência complementar da sonda de índice de carga total. (4) Sonda de índice de carga absoluta

[0208] Uma sonda de índice de carga absoluta é uma sonda que hibridiza somente com um ácido nucleico correspondente a um índice de carga absoluta.

[0209] No presente relatório descritivo, o índice de carga absoluta se refere a um ácido nucleico que é adicionado a um espécime em uma quantidade fixada antes de uma reação de amplificação ou uma reação de hibridização. O índice de carga absoluta se refere a um ácido nucleico que pode ser certamente amplificado por uma reação de amplificação normal, e serve como um denominado controle positivo.

[0210] Portanto, quando uma sonda específica ao índice de carga absoluta é montada em um chip de DNA, pode ser confirmado a partir dos resultados de detecção se a reação de amplificação, hibridização, ou similares foi apropriadamente realizado.

Além disso, quando um tipo de índice de carga absoluta é definido, se a eficiência de amplificação ou eficiência de hibridização for ligeiramente aumentada ou diminuída, o coeficiente de correção pode ser calculado comparando-se as intensidades de sinal do índice de carga absoluta. A intensidade de sinal corrigida pode ser comparada entre uma pluralidade de chips de DNA.

[0211] Exemplos da sonda de índice de carga absoluta são mostrados na Tabela A abaixo (SEQ ID NO: 30).

[0212] Adicionalmente, um exemplo do índice de carga absoluta é apresentado na SEQ ID NO: 74 abaixo.

[0213] Sonda de índice de carga absoluta:

[02141] — CTATTCOGACCAGCGATATCACTACGTAGGC (SEQ ID NO: 30)

[0215] Índice de carga absoluta:

[0216] — GTGAGAAGCCTACACAAACGTAACGTCAGGGCTAAGACAAACGCTAA

CGGTACACCCTAGATGGGAGCTTGTAGCTAGATCGCTAAGTCCTACCGACATGT AGGCATACTCACGAAGGCAATTCCCTGAAAGCCTCGTCTTATCCCGAACTTGGC ATCTGCTGATACGTCAGGTTGAACGCGTACATTTACCTGTCATGCGTGGGCCTT CTCCGAATAGCCTACGTAGTGATATCGCTGGTCGAATAGGCGGATTGCTCATAA ATGCACATTGGCTAAGGCCCACGGAACACGAATCACGTGAGATCACTTACTATT CGACGGAACTACTATACGCACCGGGACATGCAAGTAGCGTCCCACAAGCATAA GGAACTCTATACTCGCCATCTACGCAGCTACAGGGGATACACGTATGAGCGGTT

ACGAAGTAAAGCCGAGATAGAGCGGTCTTTAGAGAAAAAACAGGATTAGATACC CTGGTAGTCC (SEQ ID NO: 74)

[0217] Em um caso no qual o índice de carga absoluta é adicionado antes de uma reação de amplificação, é necessário que a mesma seja um ácido nucleico que é amplificado por um par de iniciadores específico, ou seja, é necessário que a mesma seja uma sequência de base complementar o par de iniciadores. Adicionalmente, de modo a detectar o índice de carga absoluta por hibridização, é necessário que a mesma tenha uma sequência de nucleotídeos de que nem bactérias alvo de detecção nem bactérias não alvo de detecção têm.

[0218] O iniciador específico significa que a sequência a ser amplificada é limitada, e o par de iniciadores não tem de ser necessariamente um par. Um método de multiplex que usa dois ou mais pares de iniciadores também pode ser aplicado conforme necessário. Exemplos de pares de iniciadores são mostrados na Tabela B abaixo. Um par de iniciadores para amplificação bacteriana (SEQ ID NOS: 32 e 33) e um par de índices de carga absoluta iniciadores (SEQ ID NOS: 34 e 35) pode ser usado.

[0219] Como o índice de carga absoluta, por exemplo, uma substância padrão de ácido nucleico para análise quantitativa desenvolvida pelo Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (AIST) pode ser usado ou o mesmo pode ser novamente projetado. Ao projetar o índice de carga absoluta, por exemplo, é possível usar a função RNDBETWEEN do software “EXCEL” (fabricado pela MICROSOFT), gerar aleatoriamente X números inteiros de 1 a 4 (XK é um número arbitrário), conectar os mesmos para criar um valor numérico de X dígitos que consiste somente em valores numéricos 1 a 4, e substituir 1 por A, 2 por T, 3 por C, e 4 por G, obtendo assim um grande número de sequências aleatórias com base nas X bases de ATGC.

[0220] Dessas sequências, somente as sequências no qual a soma de G e T é igual à soma de A e T são extraídas, e as sequências extraídas são pesquisadas por BLAST com um banco de dados tal como o GenBank do NCBI para selecionar uma sequência que inclui algumas sequências similares a um ácido nucleico biologicamente derivado, e sequências de iniciadores são adicionados a ambas as extremidades da sequência. Desse modo, o índice de carga absoluta pode ser projetado. Além disso, a sequência projetada pode ser apropriadamente ligada para aumentar o comprimento, ou pode ser parcialmente removida para encurtar o comprimento.

[0221] De modo a tornar a eficiência de reação durante a reação de amplificação a mais constante possível, é desejável que o comprimento de base amplificado em uma bactéria alvo de detecção e o comprimento de base amplificado do índice de carga absoluta não têm uma grande diferença. Por exemplo, se o produto de amplificação da bactéria alvo de detecção for cerca de 500 bp, o produto de amplificação do índice de carga absoluta é preferencialmente cerca de 300 bp a 1000 bp.

[0222] Entretanto, em um caso no qual o comprimento de cadeia amplificada é confirmado por eletroforese após a amplificação, é também possível projetar um produto de amplificação com um comprimento diferente daquele da bactéria alvo de detecção e detectar o produto de amplificação a partir do índice de carga absoluta em uma posição diferente da banda da bactéria alvo de detecção, confirmando assim o sucesso ou falha da reação de amplificação antes da hibridização.

[0223] Por fim, se o índice de carga absoluta no espécime for excessivamente alto em termos de concentração, competição com bactérias alvo de detecção em uma reação de amplificação pode se tornar intensa, e há uma possibilidade de que bactérias alvo de detecção, que devem ser detectadas, podem não ser detectadas. Portanto, é necessário ajustar apropriadamente a concentração de acordo com a aplicação. [Tabela A] [é ematecetammermettGAT — campyobactershonae — | E sreneemames — [est nes so Po frmermemecemereas am mesm eb TACATTCCGAAAAACGTCAT Fusobacterium nucleatum subsp.

FEEL TO [mo mmecemmocAnceoA — Fusobacterium periodontcum — |

CACC actinomycetemcomitans [Tabela B] bacteriana) T 33 Iniciador Reverso (para amplificação) CAGGGTATCTAATCCTGTT |

Do | bacteriana) TGCTACC Iniciador dianteiro (para amplificação de| GAGAAGCCTACACAAACGT Índice de carga absoluta) AACGTC Índice de carga absoluta) TCGG

[0224] Ao projetar sondas usadas na presente invenção, é preferencial considerar a severidade na hibridização. Definindo-se a severidade a um grau denso a uma determinada extensão, mesmo se houverem regiões de sequência de nucleotídeos similares entre regiões específicas em cada ácido nucleico em várias bactérias, outras regiões diferentes podem ser distinguidas e hibridizadas. Quando as sequências de base entre as regiões específicas são quase diferentes, a severidade pode ser definida a um nível brando.

[0225] Tais condições de severidade incluem, por exemplo, hibridização a 50 ºC a 60 ºC sob as condições densas e hibridização a 30 ºC a 40 ºC sob as condições brandas. Para condições de hibridização, exemplos de condições severas incluem, por exemplo, “0,24 M de Tris: HCIV0,24M de NaCl/0,05% de Tween-20, 40 ºC,” “0,24 M de Tris - HCI/0,24M de NaCl/0,05% de Tween-20, 37 ºC,” e “0,24 M de Tris- HCI/0,24 M de NaCl/0,05% de Tween-20, 30 ºC,” e exemplos de condições mais severas incluem, por exemplo, “0,24M de Tris-HCI/0,24 M de NaCl/0,05% de Tween-20, 50 ºC,” “0,24 M de Tris-HCI/0,24 M de NaCl/0,05% de Tween-20, 55 ºC,” e “0,06M de Tris: HCIV0,06M de NaCl/0,05% de Tween-20, 60 ºC.” Mais especificamente, há também um método no qual hibridização é realizada adicionando-se uma sonda e mantendo a mesma a 50 ºC por 1 hora ou mais, e então lavando a mesma a 0,24 M de Tris: HCI/0,24 M de NaCl/0,05% de Tween-20 quatro vezes por 20 minutos a 50 “ºC, e lavando a mesma uma vez com 0,24 M de Tris:HCI/0,24 M de NaCl a 50 ºC por 10 minutos no final. Aumentando-se a temperatura durante hibridização ou lavagem, mais condições severas podem ser definidas. Um elemento versado na técnica pode definir as condições considerando-se várias condições tais como a concentração de sonda, o comprimento de sonda, e o tempo de reação, adicionalmente às condições tais como a concentração de sal de tampão e a temperatura. Para o procedimento detalhado do método de hibridização, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th ed." (Cold Spring Harbor Press (2012), "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997)), e similares podem ser referenciados.

[0226] O comprimento de uma sonda usada na presente invenção não é limitado, mas é preferencialmente de 10 bases ou mais, mais preferencialmente, 16 a 50 bases e, ainda mais preferencialmente, 18 a 35 bases. Desde que o comprimento de uma sonda seja apropriado (dentro da faixa acima), a hibridização não específica (incompatibilidade) pode ser suprimida e tal sonda pode ser usada para detecção específica.

[0227] É preferencial confirmar Tm ao projetar uma sonda usada na presente invenção. Tm significa a temperatura na qual 50% de qualquer sequência de ácido nucleico hibridiza com sua sequência complementar. Para que o DNA ou RNA de modelo e a sonda formem uma sequência dupla e hibridizem entre si, a temperatura de hibridização precisa ser otimizada. Entretanto, se a temperatura abaixar excessivamente, uma reação não específica é propensa a ocorrer e, portanto, a temperatura é preferencialmente a mais alta possível. Consequentemente, a Tm de um fragmento de ácido nucleico a ser projetado é um fator importante para hibridização. O software de projeto de sonda conhecido pode ser usado para confirmação de Tm, e exemplos de software usáveis na presente invenção incluem Sonda Quest (nome comercial registrado; DYNACOM Co,, Ltd.). A confirmação de Tm também pode ser realizada por cálculo manual sem o uso de software. Nesse caso, uma fórmula de cálculo baseada no método de vizinho mais próximo, o método Wallance, o método de GC%, ou similares podem ser usados. Na sonda da presente invenção, a Tm média é preferencialmente, porém, sem limitação, cerca de 35 ºC a 70 ºC ou 45 ºC a 60 ºC. Observe que outras condições que permitem que a sonda alcance hibridização específica incluem o teor de GC e similares, e as condições são conhecidas aos elementos versados na técnica.

[0228] Adicionalmente, o nucleotídeo que constitui a sonda usada na presente invenção pode ser qualquer um dentre DNA, RNA, ou PNA, e pode ser um híbrido de dois ou mais tipos de DNA, RNA e PNA.

[0229] Especificamente, exemplos preferenciais da sonda usadas na presente invenção incluem aqueles que contêm a sequência de base dos DNAs (d) ou (e) a seguir. Por exemplo, quando amplificação é realizada com uso dos iniciadores (SEQ ID NOS: 32 a 35) mostrados na Tabela B, as sequências mostradas na Tabela A (SEQ ID NOS: 1 a 31) acima podem ser usadas como uma sonda. É preferencial usar pelo menos duas sequências selecionadas dentre as sequências de base apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 a 31. Além disso, tais sequências podem ser sequências complementares a pelo menos duas sequências selecionadas dentre as sequências de base apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 a 31, e podem ser sequências substancialmente idênticas a pelo menos duas sequências selecionadas dentre as sequências de base apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 a 31 ou sequências substancialmente idênticas a sequências complementares a pelo menos duas sequências selecionadas dentre as sequências de base apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 a 31.

[0230] Aqui, as sequências “substancialmente idênticas” se referem àquelas que hibridizam especificamente com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 a 31 ou suas sequências complementares sob condições severas. (d) DNAs que consistem nas sequências de base apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 a 31 (e) DNAs cada um com capacidade de hibridizar com um DNA que tem uma sequência de base complementar ao DNA de (d) acima sob condições severas e detectar pelo menos uma parte da sequência de base de um ácido nucleico de uma bactéria na saliva

[0231] Em relação aos vários DNAs de (d) acima, a descrição da Tabela A acima pode ser denominada para suas sequências de base específicas, nomes de sonda, e bactérias orais a serem detectadas.

[0232] Os DNAs de (e) acima podem ser obtidas a partir de uma biblioteca de CcDNA ou uma biblioteca genômica realizando-se os métodos de hibridização conhecidos, tais como hibridização de colônia, hibridização de placa e Southern blotting com uso dos vários DNAs (d) acima ou DNAs que consistem em sequências de nucleotídeos complementares dos mesmos, ou fragmentos dos mesmos como sondas. Como a biblioteca, uma biblioteca preparada por um método conhecido pode ser usado, ou uma biblioteca de cDNA comercialmente disponível ou biblioteca genômica pode ser usada sem nenhuma limitação. Para o procedimento detalhado do método de hibridização, o mesmo conforme descrito acima pode ser referenciado. Em relação aos DNAs de (e) acima, as “condições severas” são as condições durante hibridização, o que significa condições nas quais a concentração de sal de tampão é 24 a 390 mM e a temperatura é 40 ºC a 65 ºC e, preferencialmente, a concentração de sal é preferencialmente 48,8 a 195 mM e a temperatura é 45 ºC a 60 ºC. Especificamente, por exemplo, condições nas quais a concentração de sal é 97,5 mM e a temperatura é 50 ºC pode ser mencionada. Além disso, adicionalmente a tais condições da concentração de sal e temperatura, várias condições tais como a concentração de sonda, comprimento de sonda, tempo de reação, e similares são também levadas em consideração, e as condições para obter DNA de (e) acima podem ser definidas conforme apropriado. DNA que hibridiza tem uma sequência de base que é preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente 80% ou mais, ainda mais preferencialmente, 90% ou mais, ainda mais preferencialmente, 95% ou mais, com preferência particular, 98% ou mais e, com máxima preferência, 99% ou mais homólogos à sequência de base de DNA de (d) acima.

[0233] A sonda usada na presente invenção pode ser preparada, por exemplo, por síntese química baseada em um método de síntese de oligonucleotídeo usual (purificação é realizada por HPLC ou similares). Tal sonda pode ser projetada por, por exemplo, Probe Quest (nome comercial registrado; DYNACOM Co. Ltd.) Adicionalmente, a sonda da presente invenção pode incluir uma sequência adicional tal como uma sequência de etiqueta.

[0234] De acordo com o método da presente invenção, a sequência de base do ácido nucleico em posse pela bactéria na saliva a ser detectada não precisa ser a sequência de base por si só, e uma parte da sequência de base pode ser mutada por deleção, substituição, inserção, ou similares. Portanto, um gene mutado que hibridiza com uma sequência complementar à sequência de base sob condições severas e tem uma função ou atividade derivada de cada sequência de base também pode ter a sequência de base do ácido nucleico a ser detectado. A sonda também pode ser projetada com base na sequência de base de tal gene mutado. Aqui, como as “condições severas,” as mesmas condições conforme descrito acima podem ser aplicadas.

2. Chip de DNA

[0235] Conforme descrito acima, de acordo com o método da presente invenção, um chip de DNA pode ser usado para detectar/medir a carga bacteriana na saliva. O chip de DNA é usado para o propósito de estimar compreensivamente o grau de inflamação de tecido periodontal, e uma pluralidade das várias sondas de oligonucleotídeo descritas no Item 1 acima são dispostas em um substrato que serve como um suporte.

[0236] Como a forma substrato que serve como um suporte, qualquer forma tal como uma placa fina (por exemplo, uma placa de vidro, placa de resina, ou placa de silicone), um formato de roda, microesferas, ou similares podem ser usados. Quando uma placa fina é usada como o suporte, sondas predeterminadas podem ser fixadas na placa plana em intervalos predeterminados por tipo (por exemplo, o método spotting; consultar Science 270, 467 a 470 (1995), etc.). Também é possível sintetizar com sucesso sondas predeterminadas por tipo em posições específicas em uma placa plana (por exemplo, o método de fotolitografia; consultar Science 251, 767 a 773 (1991), etc.). Outras formas de suporte preferenciais incluem aquelas que usam fibras ocas. Ao usar fibras ocas como suporte, um chip de DNA obtido fixando-se uma sonda predeterminada a cada fibra oca por tipo, agrupando e fixando todas as fibras ocas, e então repetindo o corte na direção longitudinal das fibras (doravante, denominada como "chip de DNA do tipo fibra") pode ser preferencialmente exemplificada. Esse microarranjo pode ser descrito como um tipo de microarranjo preparado imobilizando- se ácidos nucleicos em um substrato de furo atravessante, e é também chamado de um denominado "chip de DNA do tipo furo atravessante" (consultar Patente nº JP 3510882).

[0237] O método de fixação das sondas ao suporte não é limitado, e qualquer modo de ligação pode ser usado. Além disso, fixação das sondas não é limitada à fixação direta ao suporte. Por exemplo, o suporte pode ser revestido antecipadamente com um polímero, tal como polilisina e as sondas podem ser fixadas ao suporte tratado. Além disso, quando um corpo tubular tal como uma fibra oca é usada como o suporte, o corpo tubular pode ser configurado para reter um material similar a gel e uma sonda pode ser fixada ao material similar a gel.

[0238] Doravante, um chip de DNA do tipo fibra, que é um aspecto do chip de DNA, será descrito em detalhes. Esse chip de DNA pode ser produzido através, por exemplo, das etapas a seguir (i) a (iv).

(i) Uma etapa de produzir um arranjo dispondo-se de modo tridimensional uma pluralidade de fibras ocas tais como as direções longitudinais das fibras ocas são a mesma direção (li) Uma etapa de produzir um corpo de bloco incorporando-se o arranjo (iii) Uma etapa de introduzir uma solução polimerizável precursora de gel que contém uma sonda de oligonucleotídeo na porção oca de cada fibra oca do corpo de bloco para realizar uma reação de polimerização e mantendo o material similar a gel que contém a sonda na porção oca (iv) Uma etapa de afinar o corpo de bloco cortando-se o mesmo na direção que corta a direção longitudinal da fibra oca

[0239] O material usado para a fibra oca não é limitado, mas, por exemplo, materiais descritos na Publicação de Patente nº JP (Kokai) nº 2004-163211 A e similares são preferenciais.

[0240] As fibras ocas são dispostas de modo tridimensional de modo que seus comprimentos na direção longitudinal sejam os mesmos (etapa (i))). Exemplos do método de disposição incluem um método para dispor uma pluralidade de fibras ocas em paralelo em um material similar à folha tal como uma folha adesiva em intervalos predeterminados para formar uma folha e enrolar a folha em um formato em espiral (consultar a Publicação de Patente nº JP (Kokai) Nº 11-108928 A (1999)) e um método no qual duas placas perfuradas dotadas de uma pluralidade de furos em intervalos predeterminados são sobrepostas de modo que os furos sejam compatíveis, fibras ocas são permitidas a atravessar esses furos, e as duas placas perfuradas são abertas com um intervalo e temporariamente fixadas e, então, um material de resina curável é preenchido ao redor de cada fibra oca entre as duas placas porosas para cura (consultar a Publicação de Patente nº JP (Kokai) Nº 2001-133453 A).

[0241] O arranjo produzido é embutido de modo que a disposição não seja perturbada (etapa (ii)). Exemplos preferenciais do método de incorporação incluem um método no qual uma resina de poliuretano, uma resina epóxi, ou similares é despejada em uma lacuna entre fibras e um método no qual fibras são ligadas entre si por fusão térmica.

[0242] No arranjo incorporado, uma solução polimerizável precursora de gel (solução de formação de gel) que contém uma sonda de oligonucleotídeo é preenchida na parte oca de cada fibra oca, e uma reação de polimerização é realizada na parte oca (etapa (iii)). Como resultado, o material similar a gel ao qual a sonda é fixada pode ser retido na porção oca de cada fibra oca.

[0243] A solução polimerizável precursora de gel é uma solução que contém uma substância reativa tal como um monômero polimerizável formador de gel, e a solução pode ser um material similar a gel realizando-se polimerização e reticulação do monômero ou similares. Exemplos de tal monômero incluem acrilamida, dimetilacrilamida, vinilpirrolidona e metilenebisacrilamida. Nesse caso, a solução pode conter um iniciador de polimerização ou similares.

[0244] Depois de fixar a sonda na fibra oca, o corpo de bloco é cortado em seções finas em uma direção que corta a direção longitudinal da fibra oca (preferencialmente em uma direção ortogonal à mesma) (etapa (iv)). As seções finas obtidas desse modo podem ser usadas como um chip de DNA. A espessura do chip de DNA é preferencialmente cerca de 0,01 mm a 1 mm. O corpo de bloco pode ser cortado com, por exemplo, um micrótomo, um laser, ou similares.

[0245] Exemplos preferenciais do chip de DNA do tipo fibra descrito acima incluem um chip de DNA (Genopal(nome comercial)) fabricado pela Mitsubishi Chemical Corporation.

[0246] No chip de DNA do tipo fibra, as sondas podem ser dispostas de modo tridimensional no gel conforme descrito acima de modo que a estrutura tridimensional possa ser mantida. Portanto, conforme comparado com um chip de DNA plano no qual uma sonda é ligada a um vidro de deslizamento revestido em superfície, a eficiência de detecção é aumentada, e um teste extremamente sensível e reproduzível pode ser realizado.

[0247] Além disso, o número de tipos de sondas disposto em um chip de DNA é preferencialmente 500 tipos ou menos, preferencialmente 250 tipos ou menos, e mais preferencialmente 100 tipos ou menos em um único chip de DNA. Limitando-se o número (tipo) de sondas dispostas desse modo em alguma extensão, torna-se possível detectar bactérias orais de interesse com maior sensibilidade. O tipo de sonda é distinguido pela sequência de base. Portanto, mesmo se sondas se originarem do mesmo gene, o mesmos são especificados como diferentes tipos a menos que não haja diferença entre suas sequências de base.

3. Detecção de Bactérias na Saliva (Medição de Carga Bacteriana)

[0248] De acordo com o método da presente invenção, o método para detectar uma bactéria para medir a carga bacteriana da mesma na saliva é, por exemplo, um método que inclui as etapas a seguir.

(i) Uma etapa de uso de saliva como um espécime, que serve como uma amostra oral coletada de um indivíduo e extração de ácidos nucleicos no espécime (na saliva) (ii) Uma etapa de trazer os ácidos nucleicos extraídos em contato com a sonda de oligonucleotídeo supracitada da presente invenção ou do chip de DNA da presente invenção

(iii) Uma etapa de calcular a carga bacteriana a partir da intensidade de sinal obtida do chip de DNA

[0249] Doravante, os detalhes do método de detecção serão descritos etapa por etapa. (1) Etapa (i)

[0250] Na etapa, saliva é usada como um espécime que serve como uma amostra oral coletada a partir de um indivíduo, e ácidos nucleicos de bactérias contidas no espécime (na saliva) são extraídos. O método para coletar saliva não é particularmente limitado, e exemplos dos mesmos incluem um método que usa um kit de coleta de saliva comercialmente disponível, um método para coletar saliva com um esfregaço na boca, e um método para coletar saliva diretamente em um recipiente.

[0251] Um indivíduo cuja saliva é coletada não é particularmente limitado, mas, por exemplo, adicionalmente a um paciente que sofre de inflamação oral tal como doença periodontal, o indivíduo pode ser uma pessoa que não está ciente de inflamação oral, tal como doença periodontal, um paciente com uma doença sistêmica tal como doença cardíaca ou uma mulher grávida que é possivelmente associada à doença periodontal, ou um indivíduo saudável sem suspeita de doença periodontal.

[0252] Em seguida, a extração de ácidos nucleicos das bactérias presentes na saliva obtida é realizada. O método de extração não é limitado, e um método conhecido pode ser usado. Por exemplo, um método de extração automático com uso de um dispositivo, um método que usa um kit de extração de ácido nucleico comercialmente disponível, um método para extração com fenol após tratamento de proteinase K, um método que usa cloroforme, ou um método de extração simples que inclui um método para aquecer e dissolver uma amostra oral pode ser exemplificado. Adicionalmente, não é particularmente necessário extrair ácidos nucleicos do espécime, e o processo pode prosseguir para a próxima etapa.

[0253] Os ácidos nucleicos obtidos do espécime podem ser diretamente colocado em contato com um chip de DNA ou similares, ou uma região de sequência de base desejada pode ser amplificada por PCR ou similares, e o fragmento amplificado pode ser colocado em contato com o chip de DNA ou similares, sem nenhuma limitação. A região a ser amplificada com uso do ácido nucleico como um modelo é uma região que codifica a região de ácido nucleico incluindo a sequência de base da sonda usada na presente invenção ou o oligonucleotídeo disposto no chip de DNA. A região desejada a ser amplificada não é limitada e pode ser obtida com uso da sequência de base de uma região altamente conservada independentemente das espécies de bactérias e amplificada de uma mistura de muitos tipos de uma vez. A sequência de tal amplificação pode ser experimentalmente isolada e purificada, e a sequência de base do polinucleotídeo isolado podem ser analisadas e determinadas com base na sequência. Alternativamente, a sequência pode ser determinada in silico pesquisando- se uma sequência de base conhecida em vários bancos de dados e obtendo-se um alinhamento. O banco de dados de ácidos nucleicos ou aminoácidos não é particularmente limitado, mas, por exemplo, um banco de dados Taxonomy ou similares está disponível em DDBJ (Banco de Dados de DNA do Japão), EMBL (Laboratório de Biologia Molecular Europeu, EMBL biblioteca de dados de sequência de ácido nucleico), GenBank (Banco de dados de sequência Genética), e NCBI (Centro Nacional de Informações de Biotecnologia).

[0254] Especificamente, o local desejado a ser amplificado é preferencialmente o gene de RNA ribossômico (168 rRNA) em DNA cromossômico de uma bactéria. Exemplos preferenciais de iniciadores de PCR que pode ser usado para amplificação da região incluem SEQ ID NOS: 32 e 33 mostradas na Tabela B acima. A amplificação de ácidos nucleicos pelo método de PCR pode ser realizada de acordo com um método padrão.

[0255] O ácido nucleico extraído nessa etapa e um fragmento amplificado do mesmo podem ser rotulados apropriadamente e usados no processo de detecção após a hibridização. Especificamente, um método para rotular uma extremidade de um iniciador de PCR com vários corantes de reporter, um método para incorporar um análogo de nucleotídeo reativo em uma reação de transcrição reversa, um método para incorporar um nucleotídeo rotulado com biotina e similares podem ser considerados. Além disso, é também possível rotular o ácido nucleico ou um fragmento do mesmo reagindo-se o mesmo com um reagente de rotulação fluorescente após a preparação. Como o reagente fluorescente, por exemplo, vários corantes de reporter (por exemplo, Cy5, Cy3, VIC, FAM, HEX, TET, fluoresceína, FITC, TAMRA, Texas red e Yakima Yellow) podem ser usados. (2) Etapa (ii)

[0256] Nessa etapa, o ácido nucleico ou um fragmento amplificado do mesmo obtido na etapa (i) é colocado em contato com a sonda ou chip de DNA usado na presente invenção. Especificamente, uma solução de hibridização que contém o ácido nucleico ou similares é preparada, e o ácido nucleico ou similares no mesmo é ligada (hibridizada) a uma sonda de oligonucleotídeo montada no chip de DNA. A solução de hibridização pode ser apropriadamente preparada com uso de uma solução de tampão tal como SDS ou SSC de acordo com um método padrão.

[0257] A reação de hibridização pode ser realizada definindo-se apropriadamente as condições de reação (por exemplo, tipo de solução de tampão, pH, e temperatura) de modo que o ácido nucleico ou similares na solução de hibridização pode hibridizar com a sonda de oligonucleotídeo montada no chip de DNA sob condições severas. O termo "condições severas" conforme usado no presente documento se refere a condições no qual hibridização cruzada devido a sequências similares é improvável de ocorrer ou ácidos nucleicos hibridizados com cruzamento por sequências similares são dissociados. Especificamente, isso significa que as condições de lavagem do chip de DNA durante a reação de hibridização ou após a hibridização.

[0258] Por exemplo, assim como para as condições durante a reação de hibridização, a temperatura de reação é preferencialmente 35 ºC a 70 ºC, mais preferencialmente 40 ºC a 65 ºC, e o tempo de hibridização é preferencialmente cerca de 1 minuto a 16 horas.

[0259] Assim como as condições de lavagem, o chip de DNA após a hibridização, a composição de solução de lavagem compreende preferencialmente 0,24 M de Tris: HCI/0,24 M de NaCl/0,05% de Tween-20, e a temperatura durante a lavagem é preferencialmente 35 ºC a 80 ºC ou 40 ºC a 65 ºC, mais preferencialmente 45 ºC a 60 ºC. Mais especificamente, as condições no qual a concentração de sal (sódio) é 48 a 780 mM e a temperatura é 37 ºC a 80 ºC são preferenciais, e as condições no qual a concentração de sal é 97,5 a 390 mM e a temperatura é 45 ºC a 60 ºC são mais preferenciais.

[0260] Após a lavagem, a intensidade de detecção é medida para cada ponto com um aparelho com capacidade de detectar um rótulo tal como um ácido nucleico ligado a uma sonda. Por exemplo, em um caso no qual o ácido nucleico ou similares é rotulado de modo fluorescente, a intensidade de fluorescência pode ser medida com uso de vários dispositivos de detecção de fluorescência, tal como CRBIO (fabricado por Hitachi Software Engineering Co., Ltd.), arrayWoRx (fabricado por GE Healthcare), Afíymetrix 428 Array Scanner (fabricado por Affymetrix, Inc.), GenePix, (Axon Instruments), ScanArray (PerkinElmer), e Genopal Reader (Mitsubishi Chemical Corporation). Em relação a esses dispositivos, no caso de um leitor de fluorescência, a leitura pode ser realizada, por exemplo, ajustando-se apropriadamente a saída de laser e a sensibilidade da unidade de detecção. No caso de um leitor do tipo câmera CCD, varredura pode ser realizada ajustando-se apropriadamente o tempo de exposição. O método de quantificação baseado no resultado de leitura é realizado por software de quantificação. O software de quantificação não é particularmente limitado, e quantificação pode ser realizada com uso da média, mediano ou similares das intensidades de fluorescência de pontos. Além disso, mediante quantificação, é preferencial realizar ajustes em consideração da precisão dimensional da faixa de ponto de um fragmento de DNA ou similares, com uso da intensidade de fluorescência de um ponto sem uma sonda como fundo.

(3) Etapa (iii)

[0261] Nessa etapa, a carga bacteriana de uma bactéria alvo de detecção é calculada a partir da intensidade de sinal obtida pelo procedimento acima. Por exemplo, há um método para expressar a carga bacteriana como a razão de SN a partir da intensidade de sinal de uma sonda para detectar uma bactéria alvo de detecção e a intensidade de sinal do fundo. Alternativamente, métodos preferenciais incluem um método no qual detecção é realizada sob uma pluralidade de condições mudando-se a concentração de DNA cromossômico de cada bactéria antecipadamente, o fator de conversão (curva de calibração) é obtido para calcular a concentração de DNA cromossômico para cada bactéria com base na intensidade de sinal obtida sob cada condição de concentração, e a concentração de DNA cromossômico é calculada a partir da intensidade de sinal obtida sob cada condição. Na presente invenção, por exemplo, a carga bacteriana é preferencialmente calculada a partir da intensidade de sinal com base nas informações de sequência de 16S rRNA de uma bactéria alvo de detecção. Além disso, é também preferencial adotar o número de cópia de genoma da bactéria alvo de detecção como a carga bacteriana. O número de cópia de genoma pode ser calculado multiplicando-se a intensidade de sinal detectada pelo chip de DNA por um coeficiente de cálculo anteriormente determinado de cada carga bacteriana (e, e for necessário, multiplicando-se a radiação de diluição do espécime detectado). O coeficiente de cálculo para cada carga bacteriana pode ser obtido como um coeficiente para retro-calcular cada carga bacteriana a partir da intensidade de sinal de cada bactéria medindo-se a intensidade de sinal ao detectar o DNA genômico de cada bactéria e criando uma curva de calibração.

[0262] Em qualquer caso, é preferencial considerar o coeficiente de correção para a intensidade de sinal de cada bactéria alvo de detecção no chip de DNA. 4, Estimativa de Grau de Inflamação de Tecido Periodontal

[0263] O método da presente invenção é um método para estimar a área de inflamação de bolsa periodontal com uso dos resultados de detecção da carga bacteriana de uma bactéria na saliva como índices. O método da presente invenção é um método para estimar compreensivamente o grau de inflamação de tecido periodontal com uso dos resultados de detecção como índices.

[0264] Qualquer ferramenta pode ser usada para detectar a carga bacteriana de uma bactéria na saliva. Conforme descrito no Item 3 acima, um método que usa um chip de DNA e outros métodos tais como um método para confirmar a presença de bactérias pela atividade de enzima, um método para medir a resistência elétrica para determinar a carga bacteriana total, um método para contar bactérias por um microscópio de contraste de fase e manchamento, um método para cultivar células e medir a contagem de célula viável, e um método para quantificar contagens bacterianas individuais por POR em tempo real pode ser exemplificado.

[0265] Na estimativa, a área de inflamação de bolsa periodontal e o grau de inflamação de tecido periodontal são estimados com base em, como carga bacteriana ou uma quantidade medida proporcional à carga bacteriana, a razão de SN de intensidade de fluorescência e intensidade de sinal do chip de DNA, o valor de Ct de PCR em tempo real, o valor de atividade de enzima, o valor de resistência mediante medição elétrica, ou o valor visualmente contado.

[0266] Métodos específicos para estimar a área de inflamação de bolsa periodontal incluem os métodos a seguir.

(1) A carga bacteriana de cada bactéria na saliva de uma amostra de saliva de um indivíduo com uma área de inflamação de bolsa periodontal conhecida (por exemplo, um valor de PISA ou CAPRS) (que pode ser calculado a partir do PPD atualmente medido ou similares) é detectado.

(2) Um coeficiente de correlação da carga bacteriana de cada bactéria com uma área de inflamação de bolsa periodontal exclusiva a cada bactéria e é obtido e uma expressão relacional entre a carga bacteriana de cada bactéria e a área de inflamação de bolsa periodontal é construída, criando assim um modelo de previsão.

(3) A carga bacteriana de cada bactéria na saliva a partir de uma amostra de saliva de um indivíduo com uma área de inflamação de bolsa periodontal desconhecida é detectada.

(4) A carga bacteriana de cada bactéria obtida em (3) é inserida na expressão relacional obtida em (2), estimando assim a área de inflamação de bolsa periodontal.

[0267] O método para criar um modelo de previsão não é particularmente limitado. No entanto, exemplos do método incluem métodos com uso de várias técnicas de análise estatística tais como algoritmos de aprendizado em máquina de regressão linear, árvore de regressão, árvore modelo, rede neural, máquina de vetor de suporte, ensacagem, intensificação e floresta aleatória. Desses, na árvore modelo mostrada nos Exemplos descritos posteriormente, não é necessário especificar o modelo antecipadamente. Especificamente, a otimização pelo método “M5"” com uso do pacote de "cursor" do software estatístico “R” (R Development Core Team) é preferencialmente exemplificada.

[0268] O número de amostras de saliva de indivíduos cujas áreas de inflamação de bolsa periodontal são de fato medidas (o número de dados usados para criar o modelo de previsão) a serem usadas no presente documento é preferencialmente um número igual ou maior do que a contagem bacteriana (variável) que é usada para criar o modelo de previsão. O modelo de previsão pode ser atualizado a cada vez que o número de dados é acumulado.

[0269] No “primeiro grupo de invenção,” como bactérias a serem detectadas que são usadas para criar o modelo de previsão, tanto uma bactéria que tem uma correlação positiva entre a carga bacteriana da bactéria e a área de inflamação de bolsa periodontal quanto uma bactéria que tem uma correlação negativa entre a carga bacteriana da bactéria e a área de inflamação de bolsa periodontal são usadas. Isso se dá devido ao fato de que em pessoas saudáveis sem a progressão de doença periodontal, bactérias que têm uma correlação positiva com a área de inflamação de bolsa periodontal são frequentemente não detectadas (a contagem bacteriana torna- se 0), e portanto, um modelo preditivo para uma faixa de pequenas áreas de inflamação de bolsa periodontal não pode ser criado somente com as bactérias que têm uma correlação positiva.

[0270] Exemplos de bactérias usadas para criar um modelo de previsão são descritas no Item 1 acima. No entanto, de modo a aprimorar a precisão de previsão no final, bactérias são selecionadas em consideração de não somente a magnitude do coeficiente de correlação de uma bactéria por si só, mas também a precisão da quantidade de mudança da bactéria em resposta a uma mudança na área de inflamação de bolsa periodontal e o coeficiente de correlação de carga bacteriana entre bactérias (evitando uma relação multicolinear).

[0271] Exemplos preferenciais de uma bactéria que tem uma correlação positiva incluem as seguintes bactérias:

[0272] — Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Campylobacter rectus, Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii,

Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Fusobacterium nucleatum subsp. animalis, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Fusobacterium periodonticum, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Veillonella parvula, Selenomonas noxia, Solobacterium moorei, Prevotella loescheii, Veillonella rogosae, Actinomyces israelii, Corynebacterium matruchotii, SR1 sp. OT 345, Porphyromonas catoniae, Selenomonas sputigena, Neisseria flavescens, Streptococcus sobrinus, Parvimonas micra, Peptostreptococcus stomatis, Trteponema socranskii, Eubacterium saphenum, Eubacterium nodatum , Treponema medium, Filifactor alocis e Porphyromonas endodontalis.

[0273] Mais exemplos preferenciais de uma bactéria que tem uma correlação positiva incluem as seguintes bactérias:

[0274] Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Campylobacter rectus, Fusobacterium nucleatum subsp. animalis, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Veillonella parvula, Selenomonas noxia, Eubacterium saphenum, Eubacterium nodatum , Treponema medium, Filifactor alocis e Porphyromonas endodontalis.

[0275] Como a bactéria que tem uma correlação positiva, é preferencial usar 1 ou mais espécies, mais preferencialmente 4 ou mais espécies, ainda mais preferencialmente 8 ou mais espécies, e com preferência particular, 12 ou mais espécies. Além disso, é preferencial usar 100 ou menos espécies, mais preferencialmente 75 ou menos espécies, ainda mais preferencialmente 50 ou menos espécies, e com preferência particular, 25 ou menos espécies.

[0276] Exemplos preferenciais de uma bactéria que tem uma correlação negativa incluem as seguintes bactérias:

[0277] Streptococcus mitis, Streptococcus mitis bv 2, Actinomyces odontolyticus, Streptococcus mutans, — Campylobacter concisus, Capnocytophaga gingivalisó, —Prevotela pallens, Streptococcus = salivarius, Eubacterium sulci, Rothia mucilaginosa, Prevotella denticola, Veillonella atypica,

Prevotella histicola, Megasphaera micronuciformis, Streptococcus parasanguinis, Gemella sanguinis, Alloprevotella spp. (A. rava, OT 308), Prevotella melaninogenica, Actinomyces graevenitzii, Prevotella shahii, Rothia dentocariosa, Granulicatella adiacens, Porphyromonas pasteri e Haemophilus parainfluenzae.

[0278] Mais exemplos preferenciais de uma bactéria que tem uma correlação negativa incluem as seguintes bactérias:

[0279] Actinomyces odontolyticus, Streptococcus mutans e Prevotella pallens.

[0280] Como a bactéria que tem uma correlação negativa, é preferencial usar 1 ou mais espécies, mais preferencialmente e ou mais espécies, ainda mais preferencialmente 4 ou mais espécies e, com preferência particular, 8 ou mais espécies. Além disso, é preferencial usar 100 ou menos espécies, mais preferencialmente 75 ou menos espécies, ainda mais preferencialmente 50 ou menos espécies, e com preferência particular, 25 ou menos espécies.

[0281] Como alternativa, de acordo com a presente invenção, processamento de análise estatística é realizado em um número predeterminado de indivíduos (população de amostra primária) e armazenado no banco de dados. A partir dos resultados de análise da correlação entre o grau de inflamação de tecido periodontal e a carga bacteriana na saliva, é possível estimar qual grau de inflamação de tecido periodontal ou quanta área ocultada na bolsa periodontal de superfície da raiz de dente cada dos indivíduos tem. Portanto, ao testar um paciente individual (uma pessoa), com uso dos dados a partir de uma pluralidade de indivíduos como uma população de amostra para examinar onde os dados do paciente individual estão localizados ou se aplica aos dados da população de amostra armazenada no banco de dados, é possível estimar o grau de inflamação de tecido periodontal ou a área ocultada na bolsa periodontal de superfície da raiz de dente para o paciente individual. É também possível incorporar os dados do paciente individual nos valores da população de amostra, realizar processamento de análise estatística novamente, e então examinar onde o paciente individual está localizado na população de amostra.

[0282] De acordo com o método da presente invenção, o grau de inflamação de tecido periodontal (o valor de valor de PISA ou CAPRS) pode ser estimado e previsto com base na espécie bacteriana na saliva e a carga bacteriana do mesmo. Portanto, em comparação ao caso em que o valor de valor de PISA ou CAPRS foi de fato medido no passado, é possível calcular o grau de inflamação de tecido periodontal com base em um determinado padrão de cálculo mesmo para um grande número de indivíduos de maneira significativamente conveniente. Além disso, na presente invenção, o grau de inflamação de tecido periodontal inclui não somente o grau positivo, mas também o grau negativo na faixa de estimativa/previsão. Consequentemente, ao se focar em espécies bacterianas (bactérias indígenas) com uma carga bacteriana que é inversamente correlacionado com o grau de inflamação de tecido periodontal, é também possível estimar/prever se o estado saudável da cavidade oral do indivíduo é mantido ou não. Além disso, a razão das espécies bacterianas correlacionadas com a carga bacteriana ou as espécies bacterianas inversamente correlacionadas com o grau de inflamação de tecido periodontal podem ser usadas como um índice.

[0283] Doravante, a presente invenção será descrita em mais detalhes em referência aos Exemplos abaixo, mas a presente invenção não é limitada a isso.

EXEMPLOS

EXEMPLOS Exemplo 1 Coleta de Amostra de Saliva

[0284] No Hospital Dental da Universidade de Osaka, 46 amostras de 1 ml de saliva foram coletados de um total de 46 indivíduos masculinos e femininos na idade de 20 a 70 anos que passam por tratamento de doença periodontal. A saliva coletada foi congelada e armazenada em —20 ºC antes do uso. Cálculo de Valores de PISA Associado com Amostras de Saliva <Aquisição de Informações Clínicas>

[0285] As informações clínicas a seguir foram registradas para todas as amostras. Os dois itens a seguir são índices que são amplamente usados na dentística. (i) Profundidade de bolsa periodontal (PPD): PPD se refere à distância da margem gengival à ponta de uma sonda periodontal quando a sonda é inserida na bolsa. A mesial bucal, centro bucal, distal bucal, mesial bucal, central lingual, e centríga lingual foram medidos pelo método de 6 pontos, e valores numéricos foram calculados em unidades de 1 mm.

(ii) Sangramento na Sondagem (BOP): BOP se refere à presença ou ausência de sangramento quando uma sonda periodontal é inserida na bolsa. O caso no qual não houve sangramento nas posições correspondentes ao método de 6 pontos acima foi definido para 0, e o caso no qual houve sangramento foi definido para 1.

[0286] A Tabela 1 resume (i) profundidade de bolsa periodontal (PPD) e (ii) sangramento na sondagem (BOP).

[TABELA 1-1] LL LL pewoempembemacmDcWDCMWCDNWCDMCDMCoMEDMCDNCP e eo est e | 3) 2 fome sem ferrooloco for lonolona| local rooloor /oro| 2º fue fumo ca fo asalass aaa] lazalezal asa | | lozalons 204 2 fome oo ana ro [sas ane fast] lasalere| ssa | | loselans 07 af fas, peposre fio pesboel boo | Tronfooaloor e fume bela bl | [rooleoaea raros roolroa ana fm pel e] | Jesse esa] TT 2 fume eles pe | fasalasalasaloaaloncloselaaa santa fm fee be orosrooebarhesleaoea o mp e O oo fado e do o o

IJSNNSTSNNNNNNSSNSNNDO a je | Ca feroool oco foasl lonolaa| O loooloco ooo ne] feias fo pes assa] fes | | TT eselsss [ss] nr] fseafst fo fossas] ese TT eslsas se] a jr O Es na per ooo ooo oco loooloaa | looolooo ooo an je | esa po) | fooolonolonolonolone one aa lana la ade esa] | frei larasealaaafasalrelazalez| | | |

21 IMandíbula Lado 222 /323/222/222 323 424/222/322|222 inferior Labial Mandíbula Lado a je pesa bol | Jooolonolono none ano a onalaa al m Mobilidade de inferior mei " Mobilidade de 22 PME] ao Mandbaia mandíbula si superior Tor mf) feels perco oro osfrco on eco asas lona rosfoseooo| | superior |bucal Mandíbula | Lad: a fm ES be af ee | Visita isuperior |palatinal imei Mandíbula | Lad: 2 fm bem ldna porlooo) ooo Jonoloo 1 ooo ooo rolo lone ana rola Primeira | IMandíbula Lado 2 fe pese el) | Jontlonolonolone onolona anel n alan imei Mandíbula | Lad: 2 fue eli po | | | Janslasslasslaes|saslesalasa leis isita inferior Labial imei Mandíbula | Lad: 2 eai fo | | Jlonoltoo icone loool oo roalonalae mei 1 Mobilidade de 22 |Púmeia Mandíbula mandíbula 2 2 / 2/2 |/2 tenor inferior [TABELA 1-2] Y Mobilidade de Rr [4 | Mandouia) mandíbula 1/2 2 Up! superior

[2] nº | |Mandbua) tado [B8OP|100/000 o0o/ono onolonolotofonolonolonolonotoo | superior | bucal Mandíbula | Lado 433/3833 423 /433/323|323|655/335/443/433/333|335 superior | bucal [=] A | [Mandôva| Lado [PD jaso/osa ass 527 sas asales7 sas ass ssa asse | | superior | palatinal Mandíbula | Lado |BOP 100/010/001/000 111 superior | palatinal [a] A | |Mandbua) tado [Bor | | Joo1lonolonolonolto1jonifonolonolroo inferior | Lingual Mandíbula | Lado 344 /433/322/322/446|/326/323/644/633 inferior | Lingual inferior | Labial Mandíbula | Lado |BoPp 010/000/010 inferior | Labial Y Mobilidade de Rr Mandíbula mandíbula 1 lo 1 | 1 inferior Primeira| - | Mandíbula | Mobilidade de Visita | 5 | superior | Mandíbula superior Primeira Mandíbula | Lado [2 rr] Pego] sã Jeorloolooofo oo ooo loool oo o ooo solo o fo nolooolo o ole oleo

Primeira| | Mandíbula | Lado Primeira Mandíbula | Lado [Efe fes as ro ese adeus espessa Primeira) | Mandíbula | Lado [E fim [e ns oo rrdroaerdvo [er ood eso poslesopaslrogoaelroa a Primeira) | Mandíbula | Lado [E A feto ua for ereroa e leoaereood ecoa free oanlrogoaelroas Primeira Mandíbula | Lado [a rsss] [rasto] 12 [ro ese: sas essas es ess rss as res esspsaesatea Primeira) |Mandíbula | Lado [5 fes frases] 15 [ro rea ess ses ess paseas essa dias ssafeasssteaaess Primeira) | Mandíbula | Lado | mr] Mi] ta [sor ovo looolone coa ooolone coa loo slone coa ooo ne ooo mei Tuta | Mobilidade de Púmeiral — | Mandíoula) mandíbula oo inferior bula | Mobilidade de Rr | 6 | Mandoua) mandíbula oo P' superior Mandíbula | Lado Rr Mandíbula || Lado 433/332|323/323/322/222/223/222/222/322/323/323/323/334 superior | bucal Mandíbula | Lado [Es] e] est nte] ro astra asse rea ese eaaeze ras res as s99 as Mandíbula | Lado [E] e] e Ss oo ereeoeeeoa esa ood eso pesleso pas isa arjinaa Mandíbula | Lado [Es] e] ist tas for ereeodereeoaeseooaesopeslesoreslrogoselroa rs Rr Mandíbula || Lado 433 323 323/323/322/223/222/222/222/222/323/323|333/323 inferior | Lingual Rr Mandíbula || Lado 333 323 323/323/323/222/222/222/222/323/323/323|323/323 inferior | Labial Mandíbula | Lado [Es] 5] [est] 18 fo rege: oo eso peoos roger ooslronesooaelroatss 1, | Mobilidade de Mandíbula a [| " inferior Mnteror [o e e e e ele lo jo lo lo o o | inferior [TABELA 1-3] Mobilidade de superior superior Mandíbula|Lado Rr Mandíbula/Lado 334/433/333/433/333/423/323/323|334/423/335/323] 336 433 superior |bucal Mandíbula|Lado fm] fstntta Jo fudisaezspesrsapaslisa pastas Rr Mandíbula/Lado — Igop log 001/001/ 000 000/000/100 superior |palatinal Mandíbula|Lado

[2] Rr | fuansbaslcaso. Po 333|253|533l5s5lss5 222 222 220] 5255 23[5zal52a] 555 [557]

E inferior Peingual UU A Mandíbula|Lado Mandíbula|Lado [ee] me | pel for boolooolonolooolooo loool colono no foo lo nelona oo oo bula| Mobilidade de Rr Mandibula mandíbula 3 inferior Primeira| ; |Mandíbula| Mobilidade de 1 o Visita | * [superior 25X, Primeira] |MandíbulaLado Primeira IMandíbula|Lado Primeira IMandíbula|Lado [sf] ss fo po] fufas] nrdededta rea: Primeira) |Mandíbula|Lado [Pine] senti por oosloos] - fesoeses rod ese fere ossloostroa oo oos Primeira] |MandíbulaLado Primeira IMandíbula|Lado Primeira) |Mandíbula|Lado Primeira) |Mandíbula|Lado Passe] pescelcs for| Josolovolooolona lool calo ooo ooo o nalone| nor hoo Primeira] | |Mandíbuta| Mobilidade de Visita | linferior — mandíbula 3? inferior íbula| Mobilidade de Rr | 9 [Mandibuial mandíbula 1 Pp! superior Mandíbula|Lado [es mr | fc ae [sor colo — Iroslonolonolan1[toalooe oosltonlone ooo Joca Mandíbula|Lado Mandíbula|Lado Rr IMandíbula|Lado BOP |001 000/000 100/000/000 000 superior |palatinal Mandíbula|Lado Mandíbula|Lado Rr Mandíbula/Lado 353/313/223/324/312/213/312/213/212/213/223 336 inferior — [Labial Mandíbula|Lado [soe | perl for] Jorelocolnoolonaloolocaltooonafoaolnalone| loor bula) Mobilidade de Rr Mandibula mandíbula inferior

[TABELA 1-4] - uu, Mobilidade de 27 Prmeira| 10 [Mandíbula mandíbula 1 2/2/2/0|/ 2 2 /1|/3 'P Isuperior Primeira) — |Mandíbula|Lado Primeira) — |Mandíbula|Lado Primeira Mandíbula|Lado sta superior jpalatinal |PD sasj64al674 434|556 644 676/647 767/867/10710 ss10| s47/1081 Primeira) — |Mandíbula|Lado Primeira) — |Mandíbula|Lado Primeira| — |Mandíbula|Lado Primeira) — |Mandíbula|Lado 103 Primeira) — |Mandíbula|Lado - bula Mobilidade de Primeira] — |Mandíbula | Mobil Visita inferior inferior º | dede pe pede de e e | inferior bula Mobilidade de RR 11 [Mandbula mandíbula o 1/1 /ojlo| | 'P' Isuperior Mandibula|Lado Mandíbula|Lado Mandíbula|Lado R Mandíbulaltado — gop |o90 000/000 000|/100/000| 001 superior |palatinal Mandíbula|Lado R MandíbulalLado — |po 323/325/412/213/312/213/212/223/325/212] 224 [212]/323] 426 inferior — |Lingual Mandíbula|Lado Mandibula|Lado bula Mobilidade de R Mandibula mandíbula o 1/2 /0 inferior mei bula Mobilidade de Primeira) 12 [Mandibulal mandíbula 1/2 2/1 /1| o superior = Isuperior Primeira) — |Mandíbula|Lado Primeira) — |Mandíbula|Lado 113 Primeira) — |Mandíbula|Lado 19

[29]Primeira| " |Mandíbula|Lado — [BOP 000 000100 o0o/100/100looo| 000/1000] 101 [101/1101] 000 |

[visita || [superior Jpatatinal UU Primeira Mandíbula|Lado Primeira) — |Mandíbula|Lado Primeira| — |Mandíbula|Lado Primeira) — |Mandíbula|Lado - ua Mobilidade de Primeira) — |Mandíbula| Mobi me :k mandíbula 1/1 /0 /0o| | 1 É Visita inferior inferior | ele le is e e e ss [TABELA 1-5] as bula Mobilidade de on 13 Mandioula mandíbula 1 1/0 1 1 jo 'P Isuperior Primeira Mandíbula|Lado 30 |Primeira/ — Mandíbulaliado — pn |g64/539 624 /323/623/512/223/324/323/423| 365 /835/766 Visita superior bucal Primeira Mandíbula|Lado Primeira Mandíbula|Lado Primeira Mandíbula|Lado 30 [Visa inferior Junguar 1BOP | | Jeooloooloo: 101/0000 ooo ocjoooloo x 101 bb 11 Primeira Mandibula|Lado 30 [Viena inferior Junguar PD | | fe2s/329[820 424/312 223|312/223|220 534 la47 546 Primeira Mandíbula|Lado Primeira Mandíbula|Lado mei bula] Mobilidade de Primeira Mandíbula P' inferior inferior [dede e ele e ele e [e] inferior ua Mobilidade de 14 Mandíbula mandíbula 1 o la 1/1 1/1 /3|3 Pp Isuperior MandíbulalLado — lgop 1091 001 o01/000/100 100/101/100 /100/010 superior bucal MandíbulalLado — py lagaleza 423 323/3823 a22/222/322/223/523/2810/936 superior bucal Mandíbula|Lado Mandíbula|Lado Mandíbula|Lado MandíbulalLado — lpy 222/323 /424/424/222/222/222 224/8333] 654 a46/443 inferior — |Lingual Mandíbula|Lado Mandíbula|Lado

" Mobilidade de Mandioula mandíbula 1 1/1 inferior Primeira 1. IMandíbula| Mobilidade de Visita superior ; superior Primeira Mandíbula|Lado Primeira Mandíbula|Lado Primeira Mandíbula|Lado Primeira Mandíbula|Lado [on tao] asse fama Porlo1o fone| non ooo no oloroloaafeoi| Jor |1robrooloos| Primeira| Mandíbula|Lado Primeira Mandíbula|Lado SEDAN Mandíbula Lado — pn 443 333|333 344 /444|/645/434/434/333/434/433 434 Visita inferior Labial Primeira Mandíbula|Lado Jonas] orla forca fool nes Joosfotanos ronfonelonolona oco] rea Primeira| — |Mandíbula| Mobilidade de Visita inferior — mandíbula inferior [TABELA 1-6] moi " Mobilidade de Asma | 16 MAO * | mandíbula 2 superior Bo Mandíbula Lado = gop | 1091 110/0071 001 / 111 111/1000 | 101 [001 | 111 [oool100| oo Visita superior — |bucal Bumeira Mandíbula | Lado 1095 |746|744/634 434 |756 |567 7104 1069 4310/9109 4335445410 Visita superior — |bucal [omisso [sãtna Po ese lose |ss4[5o4 [404 oselo7r [04 | 200 407 | 206 [00 osal 7, | Primeira Mandíbula |Lado [32 Poe | superior palatinal Primeira Mandíbula |Lado [aa Pos | tnferior Lingual [or [om [vb es os es dens res [ros [100 | roo Joos [os [107 | ão A 7 10 32 Prúmeira Mandíbula Lado | 1044 | 14º [19º 676 /667] 745] 10 987 | 434 |765]|547] 746 isita inferior ingual do ima : 10 Primeira Mandíbula |Lado uu [ae rm) | inferior labial [o [rn Joss [eee eso lona ["370]| 38 Joan] vez lou] 000 [ess [aan 067 Primeira Mandíbula |Lado | aa mer | inferior Labial [oe | 1os Joos [100100 [ros [111 bens [ 115 [444 [104 | 100 [oos [ros] oo imoi, ; Mobilidade de Primeira) — | Mandíbula | mandíbula 2 2 da o | inferior | 35 | Primeira | 17 | Mancíbuta | Mobiidade del o | jr jr dr dr ds ja [| | pa po |

Visita superior mandíbula superior Primeira Mandíbula |Lado Primeira Mandíbula | Lado 445 |478 747 734 | 444 679 | 434 | 437 | 734 |534|844]| 484 Visita superior — |bucal imei o Lado nn Primeira Mandíbula | patatin 443 |548/434/756]/775/546] 11 [113 [444 [667 | 777 444/9094] 444 Visita superior — À nu |" mai 1 Lado Primeira Mandíbula mai, " Lado Primeira Mandíbula

ESEC ENNEINDENNDNÇEO mai 1 Lado Primeira Mandíbula | 104 33 | visita | | inferior Lingua e | 548] 767 567767 867 |768| 557 | 667 | 855 | 677 |449| 7 |544 Primeira Mandíbula |Lado 103 33 | Visita | | inferior Lâbial leo | | 746|565/546/537 934 [834] 436 | 737 | 736 | 945 |667| 1%? | 746 Primeira Mandíbula |Lado [ee rum) | inferior Labial [sor | [ooo lona oooliis 11 dinda fans oco [vos ros loncb ros | mai, ny Mobilidade de Primeira Mandíbula 7 33 | visita inferior mandíbula 1 1 1 1 2 2 2 2 1 2 2 1 o inferior " Mobilidade = de Mandíbula 1 sp. superior To55to, o eps ps e dede e e e De e superior Mandíbula Lado |g9p 001 001 000 /000| 001 superior — |bucal 33 Mandíbula | Lado 333 |333/433/334 /333]|333 333 | 333 | 433 |324 634] 494 superior — |bucal " Lado 33 Mandíbula | a1atin 334 |434/333/333|533|333 435 | 344 | 433 |333]733]| 433 superior — |PÍ m Lado Mandíbula | paratin | BOP 100 001 000 /100| 000 superior — À " Lado Mandíbula | fe] me | fume fiialoor || Joca eeoloce[00a 007 [20s] soe [2000] 000 eae eoo| cos m Lado po ss | eee o [o eo] | Mandíbula |Lado

[6] se | | inferior Labial [Po | fessleso [sos [92 [994299200 [400 [904 | soa | apso Mandíbula |Lado =) | | inferior Labial [sor | [ocolono[ono [on ooo local ooo | oca [oca] von loca ooo o " Mobilidade de Mandibula. | mandíbula 1a 1) inferior

[TABELA 1-7] Primeira Mandíbula |Mobilidade de| o 1 o 1 1 Visita superior | mandíbula superior Primeira Mandíbula PRE] Estao fofo api ro oieee rosrasjoos isita superior Primeira Mandíbula Primeira Mandíbula PRB] fisica mem for of po voos rolo raise roalro-roa Primeira Mandíbula PRE] [Eta fofo ope eee Primeira Mandíbula Primeira Mandíbula ; 103 103 Primeira Mandíbula i Primeira Mandíbula Mobilidade defol, ada dada Visita inferior — |mandíbula inferior Primeira Mandíbula |Mobilidade de| [ 25] “itata" | 20 Jlpator Imandibuia supere 2 | 10 o o 1/1 0 o o 0 ol: je) Primeira Mandíbula [es ve] oe icenea — Bor ii froolooolonaloolt tro ol oalooolooalo oo le oaloo oh: 11 Primeira Mandíbula 119 RB Eos o [Esses eee edededr) Primeira Mandíbula || ao palatinal 115 |734/434/433/334|746/764/433/333/337|534/434/435] 47 isita superior 4 u Primeira Mandíbula 6] PiBRS] iss iaa sem fu eo os aosa eososaros roses aesaeo [ros [roaloorn5= Primeira Mandíbula Primeira Mandíbula 104 RB] fitas To [5 o speed ed E) Primeira Mandíbula ; 116 Es FRs] fitas fo [ue e se see] re Primeira Mandíbula ; Primeira Mandíbula Mobilidade CONS 2 Visita inferior — |mandíbula inferior 21 |Mandíbula Mobilidade de 1 superior mandíbula superior Mandíbula [eos | use een Bor Jooolocolonolooolooolocoloooloooooolo oo lo ooloa 1h o: |] om | oo teme Jo | dezaloealzalaas soa e2a 222 222 2a a22l2es 2sslaas Mandíbula sor | Bose eeesana for] Jooclosolcoolosa co 1joa one nacloelonolone co sra

[5] os | net cenas por [ooo looolooolonolo rolo rolo o loool colono toa lnalraol | [ss] A | venswa [lago maus — JPo ssalasalaalzaalaaa aaa lz22 zaa Pan lazala2AlaasSsAL inter A inferior Mandíbula Mobilidade del inferior mandíbula inferior [TABELA 1-8] mai " Mobilidade de Primeira | 22 | Mandibuia | mandíbula 1 1a da o P superior Primeira Mandíbula | Lado BEESNEIFINANDNTNNNH on pen as oo [one 199197 [105] Bigaço Mandíbula | Lado 457 747] 524 [338737 727] 632 [228] 635 | 324 [433 |224 734 643 Visita superior — | bucal NDA Mandíbula |Lado 535/536| 443 |335]777]|766]| 665 [467] 645 | 466 [434 /334 724 544 Visita superior — |palatinal Primeira Mandíbula | Lado [96 [rm] fue | palatinal [80º Joos Iron] too [ont Iron Jon | 1a Joni] tos [104 Jocolooobronhros| Primeira Mandíbula | Lado DDS Mandíbula |Lado 657|555 |535/323/323] 323 [226] 334 | 337 |534 467 449 445 Visita inferior — | Lingual BTEDeNo Mandíbula [Lado 434 /446]| 423 |436/323|624| 622 |337| 436 | 334 [433 |336]/537 544 Visita inferior Labial Primeira Mandíbula | Lado Primeira | | |Mandíbula [Mobilidade — de o la Visita inferior ; inferior ima 1 Mobilidade — de 37 oia 23 Mandibula mandíbula P superior 37 | Primeira Mandíbula [Lado — Bop 101/1114) 101 001 000 [oo1| 101 001 101 001 101 Visita superior | bucal 37 | Primeira Mandíbula | Lado 444|557] 546 [634 /435 644 |344]| 536 | 426 [934 /436 533 Visita superior bucal s7A[Ermeira Mandíbula |Lado 467 | 445 |545/444/436] 644 [445] 545 | 444 [744 /476 544 Visita superior palatinal Primeira Mandíbula | Lado palatinal [sor [res f111] 100 ovo lovol ooo] toa [ovo] too [oe renan] Droo| Primeira Mandíbula | Lado [eres | metres fita [sor fronfri| vor fone local | oo [196] pebe| Primeira Mandíbula | Lado Primeira Mandíbula | Lado [37 [Primeira || [Mancfouia [tado |BoP |1o1[111 [001 [tor [100 [ooo] | [oor 101 [100] foor|ror]

Es Fe TE LT IT TILL mi bula | Mobilidade — de Primeira Mandíbula 1 37 | Prime À mandíbula " Mobilidade — de 37) Rr | 24 |Mandiouia | mandíbula Pp! superior Mandíbula | Lado [oe | Jem fi Jor lereleas| 200 [eco 0oo|1oo| roo [mr [20 [one |ronlneo| Jose! 37 Mandíbula |Lado 433 234] 336 |523/324]/525]| 543 |335] 425 | 334 |622/224 333 superior — | bucal 37 Mandíbula |Lado 334/325]| 334 |535/434/ 433] 333 [334] 534 | 323 [322]|365 333 superior — | palatinal Mandíbula | Lado [oe | fes pf Dor Jena leso| 200 [6co con [oro ooo [em [20 [om |ronlaes| Jose! Mandíbula | Lado 37 Mandíbula |Lado 935/655| 333 |322/522/333 222 | 223 333 344 333 inferior — |Lingual Mandíbula | Lado 663 /494| 343 |335]533]/333 323 | 336 |333 323 /223 inferior — | Labial Mandíbula | Lado 1 Mobilidade — de 37 Mandibula | mandíbula e inferior [TABELA 1-9] Primeira| ,. IMandíbula [Mobilidade de 1 1 Visita superior superior Primeira Mandíbula |Lado [an fm om enca — [sor oos|11o coloca ooo ooolonalo vale nal ao eaaloa1|ro7| Brmeia | Mandíula |Lado 963|323/323/323/323/322/233/323/333/334/435/435 Visita superior — |bucal Brimeira/ — IMandíbula (Lado 344/737/433/333/333/323/323/322/323/323/323/333/325/439 Visita superior — |palatinal Primeira Mandíbula |Lado [ao [ven] Nono filha [por ron: nel ole co ooalonelooe ooo onalooeloaa oo lonas Primeira Mandíbula |Lado [ao [ven] ear firga for nos: iltonfocofonaloneloce one onalonelaas| rolos Primeira Mandíbula Lado asa4la447/523/434/ 523/8333 334/333/323/333/347 434 Visita inferior Lingual ES Mandíbula ILado 333 334/333/323/333/433/333/323/323/323/333 433 334 Visita inferior Labial Primeira Mandíbula |Lado [an ita fo jiana fsor oosloos oolocaloo loool oolonolenelenalono Iroclooe Primeira Mandíbula |Mobilidade de) iai 7 1 1 Visita inferior mandíbula

Mandíbula Mobilidade del 26 |gunerior — Mandíbula 1 1 1 1 p superior Mandíbula |Lado BOP superior — |bucal Mandíbula |Lado 333/543/322/223/222/222/222/222/222/222/322/223/323/235 superior bucal Mandíbula (Lado 333/527/223/323/322/223/322/322/222/322|/223/323/224/836 superior palatinal Mandíbula |Lado À 101 a pro | Roe lidana [0º [oonlooo ooo calo oo looolonolonole coloca oco eae oca ron Mandíbula |Lado 1 1 pe | fere lit for noconolono oca looolone ee ooo fonolonalas Irooleoa Mandíbula (Lado 334/436/323/323/333 222/223/222/223/338 433 434 inferior Lingual Mandíbula |Lado 323 334 223/323|/322/222/223/323/222/228 333333 inferior Labial Mandíbula |Lado BOP inferior Labial 1 Mobilidade — del Mandibula mandíbula 1 1). 1 inferior Primeira Mandíbula Mobilidade de eia | 27 mandíbula 3 3 | 1 | 1/1 1 1 Visita superior ; superior Primeira Mandíbula |Lado [oo ven] no fia for rubeloe pele re pebepe ereto Ene Mandíbula ILado 746|/644|645|548/739|737/747|748/735/635/635/545 Visita superior — |bucal Ene Mandíbula |Lado 7º! |547|6847/746/747|737] 646 |545|545/546/544/545/978 Visita superior — |palatinal 10 | Primeira Mandíbula |Lado Ef EE eo on emeno Primeira Mandíbula |Lado [oo [veta] pera fungi for pelo pe pebearepebepe ereto Ene Mandíbula |Lado 858 977|745/646/645/445|/546/535/434 645/556/667 Visita inferior Lingual Primeira Mandíbula ILado 657/747/846|734] 73 [119 745|545/639/9036/535/634/465]657 Visita inferior Labial 10 | 7 Primeira Mandíbula |Lado Primeira) — |Mandíbula [Mobilidade de 1d, Visita inferior infari inferior [TABELA 1-10] Primeira Mandíbula |Mobilidade del 41) visita [20 etges fest | [ls [4] [| [Jo] Jojo]

E super A Primeira Mandíbula |Lado Jan Poe] fases [6ãos sor | Joolrosjar| lisolirolonofoce| ooo oorhror| Primeira | IMandíbula Lado = py 439/12 346 836|533/333/333 333 /334/667 Visita superior — |bucal 9 Primeira | | IMandíbula Lado = py 568/9089 466 545/734/443/334 433 435 649 Visita superior palatinal Primeira Mandíbula |Lado Jeje) Momo aaa Por) | pelos fesbelboseso loorbrooloo Primeira Mandíbula |Lado Jeje) Meo [ma porn ele eee eee bebo Prímeira Mandíbula ILado — py |ga7/549|545/666/545/445/666/444/636/434/444] 545 | 649 |743 Visita inferior Lingual Primeira | IMandíbula ILado — lp |ge6l6a7issalss6 436/3245 677/4233 633 034/0230] 535 /9810/634 Visita inferior Labial Primeira Mandíbula |Lado [on eta | ferra for ubelcelo lose moro rode eee bh! Primeira Mandíbula Mobilidade de 1 1 ol, 2 | 2 1 o 1 1 Visita inferior ; inferior Primeira | . |Mandíbula Mobilidade de Visita | 2º [superior — Mandíbula superior Primeira | — IMandíbula Lado — |B0p|1090/000/onolooolooolono on ooo ooolonolono| 000 011 /000 Visita superior bucal Primeira | — IMandíbula Lado — pn |343/423/323/323/324|322/323/323/323/323/323| 323376 333 Visita superior — |bucal Primeira | — IMandíbula Lado =p |533/423/233/335/323/323/323/323/323/323/623| 323 | 426 446 Visita superior — |palatinal Primeira | — IMandíbula Lado — |B56p|190/000|100/100/000lo00/000/000looolonolioolonol|1o1/1os Visita superior — |palatinal Primeira | — IMandíbula Lado — pop 100100 ooolooolocolooolocoolooc| 000/0001 000/1000 Visita inferior Lingual Brimneira Mandíbula ILado — lp |gg5/l635/534/323/323/212/212/212/212/324/323] 323 /323/433 Visita inferior Lingual Beira Mandíbula Lado — pp |agal734/223/323/325/523/313/323/324/423/723] 423 /333/ 424 Visita inferior Labial Primeira Mandíbula |Lado [az Poeira] enapoia liado, BOP |1 001 00/001/000l001/100/o0no/ooolonolocoloool 110 [011 Primeira Mandíbula mobilidade de Visita inferior . inferior Primeira | 5 =Mandíbuta Mobilidade de Visita superior ; superior Primeira | — IMandíbula Lado — Bop o10/001/000/oo1/101/000/000/100/100lo00lono|1o0l100/101 Visita superior bucal Primeira | — IMandíbula ILado — lp 445/453/323/327/334/544/323/433/223/323/523]| 324 654 456 Visita superior bucal

[43] Primeira | |Mandíbula [Lado — |PD |535/646/333/336/323/323/324|533/323/544/433] 323 | 525]556])

Te T Ts Tera A IT II II TI ITA Primeira | — IMandíbula Lado — pop 000101 001 onol1 01 onolocoliaaf ooo to1 101/10 Visita superior palatinal Primeira Mandíbula |Lado [as Poe] peitos feios POP pnaeja aja at je Rate? een ros tronfooo tonpranjooo Primeira | — IMandíbula ILado — lp 343/323/323/323/323/324/323/324/412 223/2423] 423325 423 Visita inferior Lingual Primeira | — IMandíbula ILado — lp 446/554/323/333/323/a3al2a44/234/523/323/313] 323/4565 365 Visita inferior Labial Primeira Mandíbula |Lado [PE fins EH or bo oe egos ra is e eps rod ese err] Primeira | | |Mandíbua Mobilidade de olilo Visita inferior ; inferior [TABELA 1-11] ima A Mobilidade de Primeira Mandíbula , Si 31 mandíbula 2 2 o 1 1 Primeira Mandíbula |Lado Bino | Mandíbuls (Lado 335 633/9045/324/1163/212/223/323/323/227] 632 /212/235/333 Visita superior — |bucal Bomexss | Mandíbuls (Lado 324|/626/967/324/1093/323/323/323/323/326/1033|323/326| 193 Visita superior — |palatinal 3 Primeira Mandíbula Lado [6 PS] st [são pad oo [osso po ve pereira o [read os [00 Primeira Mandíbula |Lado [afim] fe ro poros for ndpea ess odiado oa padece pri o EE Mandíbula Lado 723/923/ 196 323] 212 /323/322/222/212/323| 323 /323/337/723 Visita inferior Lingual 3 Ene Mandíbula Lado 1143/9033 /823/323] 323 /422/212/212/212/212/ 212 213] 32/12 Visita inferior Labial 113 Primeira Mandíbula |Lado fare] feels poesia es e isde aa padesa prt (o Primeira Mandíbula Mobilidade de 1 1 Visita inferior inferior imai 7 Mobilidade de 47 | Pela | 32 [Mandíbula mandíbula o 11o Pp superior Primeira Mandíbula Lado RES) es, [er po raro sm ora poa co posar 47 | Primeira Mandíbula |Lado 544/ 437 435/8335] 333 I735/437/424/733/323] 334 [833/335/433 Visita superior — |bucal 47 | Primeira Mandíbula |Lado 543 337/437/644|/ 433 746/336|733/434/434] 323 [8333 434/445 Visita superior — |palatinal a7I Primeira Mandíbula Lado = pop oo1/001/101/000 001/0001 000 001|/ 000 000 Visita superior — |palatinal [47 [Primera] vendia lado -— [50P [vos von oor[0o1| vor vos vor vor oooloon| von Ivon] oo

[visita [| finferior — feinguar A ND 47 | Primeira | — Mandíbula |Lado 447 636 a34/434/435 /535/|646/436/434/334] 434 434 645 Visita inferior Lingual 47 | Primeira Mandíbula |Lado 445/546|333/323] 456 8336 636/837/635/434] 434 434 435 Visita inferior Labial Primeira Mandíbula |Lado ima 1 Mobilidade de Primeira Mandíbula » inferior ima A Mobilidade de Primeira Mandíbula , ici 33 mandíbula 2 2 2 2 3 3 3 1 2 2 Primeira Mandíbula |Lado [oo Pta om S fica poe iu jedi pejelae le me eepree| Primeiraà)| — Mandibula fado 844/349] 639 1º 995 6310 a4s|s6salaga Visita superior — |bucal 9 FElineiar Mandíbula Lado 533 336/665/558| 899 /888|966 s69l666| 966 666/6835 445 Visita superior — jpalatinal Primeira | — Mandíbula Lado = lap 111 lia da arara 111/19 [111 fadada Visita superior — jpalatinal Primeira Mandíbula |Lado [9 úreta | Juno fina ori pejebepeje dose ee de Primeira Mandíbula |Lado 444 669 555/666 666 999] 666669 536 Visita inferior Lingual Elineiam | Maníbula Lado 643 663/639 666/9909 999/999/743 | 434 436 Visita inferior Labial Primeira Mandíbula Lado PN 7 Mobilidade de Primeira Mandíbula 7 inferior [TABELA 1-12] ima 1 Mobilidade — de Primeira Mandíbula . 1 Visita * superor Superior HSNNOONSSNSOONS superior Primeira| |Mandíbula| [9º Pete) furar ado muenlaor [111111 ron fas hraneo | loeelono| buns| | Primeira) |Mandíbula| [9e Pta) fuera, ado muenpo Irasleteiotelesa rasas || lesiva) Jose] | Primeira Mandíbula| Lado 710 [9o Petao) fuera: satna PO for |7o ioeslaslanelens| | | levalver res] | Primeira Mandíbula| Lado [frias pote sepade | ue E Primeira Mandíbula Lado [ee PERA) faro linea forjou freire nele brenhendies| | Primeira Mandíbula Lado 94 [| Visita || linferor — |Lingual o [Só fresfiost| foral [aa] sas [senlova| tm fesslen7] |

Prmeira| | MMandibulalLado 899/446/434 7387 849 10109 656 /434/945/436/7117 Visita inferior — |Labial Primeira) |Mandíbula Lado jo ven) Ironia for iu foedier | hoo hioihros hoo oshonhea| imai 7 Mobilidade — de Primeira Mandíbula 1 1 Visita inferior inferior ENSNNNSSNNHSHON inferior mas 7 Mobilidade — de Primeira 35 a mandíbula 2 superior Primeira Mandíbula [seven] busto Ledo mealor 1oo| — Jonolooolocal1oolono] con lonelocolnoolocoloas [xo Primeira) | Mandíbula| 245 pucal 633 323 323/3823 323/8323] 223 [823/3823 423/3823] 336|765 Visita superior Brimeira| | Mandibulallado 523 323 /323/323/323/323| 223 [823/323/323/323|324]|387 Visita superior |palatinal Primeira] | |Mandíbula|Lado BOP |100 000/0000 001 111 Visita superior |palatinal Primeira| |Mandíbula Lado seven) Imera for] | jonolooolocalnonlonol con lonelocalrenhzao | Droo| Primeira) | |Mandíbula|Lado 323 /323/323/323/312] 323 |312/223/323/436 323 Visita inferior Lingual Primeira| |Mandíbula Lado [5 Visita inferior — |Labial e | ses] 222) [eslo2s] sas lanslazalazalaas) Dsas Primeira| |Mandíbula|Lado [so Visita inferior — |Labial [o | | loco conjaoo [11l100] 000 onoloce lana res [oo Primeira) |Mandíbula| Mobilidade de Visita inferior | inferior imai 1 Mobilidade — de Primeira Mandíbula . É Visita * superor Superior ESSGBNASISHOSSA superior Primeira| |Mandíbula| Primeira Mandíbula 106/77 55 87 [| Visita || |superior |2ºo bucal! [po [19677 [nen] 52 Jess|nan/o40| o50 losalosa|saa| 97 1165 400 | Primeira Mandíbula| Lado 107/78 |1010|75 1110 [| Visita | |superior |palatinal [po 19748 [1/9] 78 Jesalrrolava| 000 I7as ta ssa ona| 10 [446 Primeira Mandíbula| Lado [| Visita | |superior |palatinal [soe [1a e fu oo la la | fere desde | Primeira Mandíbula Lado [| Visita | inferior — |Lingual [son [101111 111 foot roslron [101] voo loooloon a tilron 114 [105 | ima 7 10 Brímeira| Mandibula/Lado 777|757 947 479 645 445] 444 744] 11 [NS 749/765|747 Visita inferior — |Lingual 44 1 a 7 "a Primeira) | |Mandíbula|Lado 17 787/5546 445] 43 |734 544 |864/437| 11 [538434 | 747 Visita inferior — |Labial 4 nn 10 Primeira Mandíbula Lado El Visita inferior — |Labial [son [101 11l 115 101 [ron foos100] 100 Irooloe lr tifo ros [ros | [51 [Primeira] |Mandíbula| Mobilidade —de[ 1 [2 [o [1/1 /2/2|/ 2 [2/17 /2/2[/17]1])

Visita inferior mandíbula inferior [TABELA 1-13] 7 Mobilidade de superior superior Mandíbula (Lado — 396 101 oo1/101/100/001|111/101 101/1017 superior — |bucal Mandíbula Lado — pp |435/423/324/423/323/446/523/212/223/323 324/239/953 superior — |bucal Mandíbula Lado — pp |gg4/524/324/323/346/457/744/333/423/346/334/323/346/939 superior — lpalatinal Mandíbula (Lado = Bop 101 111/101/101/101/ 111/14 1 (41 superior — |palatinal Mandíbula Lado — pop 101 001/101/101/101/100/011/011/110 inferior Lingual Mandíbula Lado — pn 234/344/323/327/823/323/323/212/324/422/323|324/366|633 inferior Lingual Mandíbula Lado — pn 436/633/323/325/433/324/433/323/324/323/323|323/224|733 inferior Labial Mandíbula Lado = Bop 101 101/101/101/101 110/101/010 inferior Labial Mandíbula [Mobilidade de inferior inferior ima " Mobilidade de Primeira Mandíbula » 56 | vis 38 ; mandíbula 1 1 1 Primeira Mandíbula Lado se Ra) upetor fuer POr oo! ro nlonolona ooo loool nele ooo real nele ce ooalo ro 56 [Primeira — Mandíbula ILado — lpy |336/226/312/323/323/323|612/223/333/323/423/223/334/433 Visita superior — |bucal 56 [Primeira — Mandíbula ILado — lp |325/525/324/323/323/323|543/323/323/324/523/323 424/3340 Visita superior palatinal Primeira Mandíbula Lado se Pta | fuunetor - palainal 120º 901109 ooo one oca ooolone ooclone oca realce oooloo Primeira Mandíbula Lado se Eta feto Inga POroociios Jonelocalooolone ooolone oco loe nos ooolo oa Primeira Mandíbula |Lado Primeira Mandíbula |Lado sf fit a, fo faia papo teedade: Primeira Mandíbula |Lado se teta) fmaror faia for jenelooo| Jonalooolooalooolonolonolonaloa os roalroo mai 1 Mobilidade de Primeira Mandíbula , inferior Mandíbula |Mobilidade del o | o | o o | o | o/1| 1/0 jo o o o jo)

Visita superior mandíbula superior Primeira Mandíbula |Lado [se meta o) fusetor forca — orla j iron ros ooo ro ooolooo ron colo nal: ooleo lo 00 Primeira) — Mandíbula Lado — pn |335/433/323/323/322/222/222/222/322/322/223/223/323/333 Visita superior — |bucal Primeira) — Mandíbula Lado — pn |366/545/323/333/323/322/323/323/323/323/333/333/333/433 Visita superior — |palatinal Primeira Mandíbula Lado [5 Pete") fuisotor = fostatna POPL!O 1111/11 11 oo ro rela alt roolos ali anhi ando neloos Primeira Mandíbula Lado [Se Pee") fran finge [OP]! 1111) tono ao ae 11 ron froolosalioa han) | Primeira — IMandíbula Lado — pn |g65/333/333/323/323/323/233/323/323/333/323/454 Visita inferior Lingual Primeira Mandíbula Lado [ici] este o po popa |) Primeira Mandíbula Lado [seven fer iai forloro|t onoloos ar fnnolonolonoloaIrooloo irao Primeira| — Mandíbula Mobilidade de i Visita inferior Andoua inferior [TABELA 1-14] imai Mobilidade de Primeira Mandíbula| 7 superior Primeira Mandíbula|Lado 59 “Mista | fuuneror Jouei POP 000 |1noon1 one o ace one one onaeo o oolecoleoaloo 59 [Primeira Mandíbula|Lado 333 925|/526/212/312/212/212/212/312/212/212/213/222/239 Visita superior |bucal 59 | Primeira Mandíbula|Lado 324/19 323/3823 /322/322/212/213/213/212/323/323/324/339 Visita superior |palatinal 3 Primeira Mandíbula|Lado se Ra | fuuneror lpdlainai 20º 99? [1 19]00 1 onolooe noolona ooo one colo olo ce ooaloo Primeira Mandíbula|Lado se Ra | fimarar lina 10º 00? Jon |1oclonolooe noolona ooo one oolosolonelooalr oo 69] [Primeira Mandíbula|Lado 526 /623|/323/322|323/312/212/212/212/312/312/313/333/436 Visita inferior Lingual Primeira Mandíbula|Lado se Ra | fmaror caia PO [996 fasalataferalanalo ra aralanaferaloaalana aaloaa ao Primeira Mandíbula/Lado se Ra fimaror Cao f90r 001 font) tolooolona ooo onolo co ooolo colono oooloo oo 1 59 | Primeira | - [Mandíbula Mobilidade de Visita inferior inferior 7 Mobilidade de 59 41 |Mandibulâ mandíbula p superior 59 Mandíbula|Lado BOP 010 000 000 superior |bucal

59 Mandíbula|Lado 633 534/212/212/212/212/212/212/212/212/222/223/323/336 superior |bucal 59 Mandibula|Lado 633 322|/212/212/212/212/212/212/212/212/323/322/325/3827 superior lpalatinal 59 Mandíbula|Lado BOP 100 001/001 superior lpalatinal 59 Mandíbula Lado BOP 011 011/0000 inferior Lingual 59 Mandíbula|Lado 334 /534/433 323/3823 212/222/212/213/812/323/333/333/336 inferior Lingual 59 Mandíbula Lado 334 /642/312/212/212/212/312/212/212/212/323/234/433/336 inferior Labial Mandíbula|Lado sem | Mto cia foros oro looolonolono oco ooolonolo colono o nolonolroa 1oo 1 Mobilidade de inferior inferior imai Mobilidade de Primeira Mandíbula 7 superior Primeira Mandíbula|Lado 6 Mista | uperor Joice POr tu tp jo meinen) fe | Primeira Mandíbula|Lado 86 94 so Ra | fumar bucal PO [So foton 45 oroaniase| 3 fostlooslase| Jor] | 60 | Primeira Mandíbula Lado 756 656/6562 656 656/ 756] 657/758/854/655 636 Visita superior |palatinal 7 Primeira Mandíbula|Lado a PRE] bs pele eL Primeira Mandíbula|Lado PR saia pos esmo 60 | Primeira Mandíbula Lado 879| 65 I756/868/989/544/356/635|535/756/877/755/655/447 Visita inferior Lingual 10 Primeira Mandíbula/Lado 1011 106 96 [103 so Ra fmror caia PO [6 fosorss oselres nas sseloce ser 'Sº loco [55 [nao ra7| Primeira Mandíbula|Lado PR] fes reco imai Mobilidade de Primeira Mandíbula , inferior [TABELA 1-15] " Mobilidade de 72 43 [Mandibula mandíbula Pp! superior 72 Mandíbulalhado — goplootltoo oo1 000000 100 superior |bucal 72 Mandíbula|Lado 324/522/213/313/313/312/213/ 222 /212/212/313/312/222/212 superior |bucal 72 Mandíbula Lado. 323 423/212/213/223/322/222/ 212 /212/212/313/212/323/213 superior lpalatinal

72 Mandíbulaltado — gop 100 000 000 superior |palatinal 72 Mandíbula Lado BOP 000/0900 inferior Lingual 72 Mandíbula Lado 223/332/212/313/312/212/312) 212/212/212/212/312/333/323 inferior Lingual 72 Mandíbula|Lado 323/312/212/212/212/212/212) 213 /213/212/213/212/223/222 inferior Labial Mandíbula| Lado [er | presisa lorena ooo eco oca oca ooo 000 [ovolooolo ole ooleoaloo- 7 Mobilidade de 72 Mandibul mandíbula inferior 7 Mobilidade de isuperior : superior 73 Mandíbulalhado — lgop 100/001 o0o0lo0o superior |bucal 73 Mandibula|Lado 233 222 423/227/222/222/223/223/222/222/322/222/223/323 superior |bucal 73 Mandíbula|Lado 333 323 622/226/322/222/222/222/222/222/223/322/323/333 superior |palatinal 73 MandíbulalLado BOP 101/100/001 000 000 001 superior |palatinal 73 Mandíbula Lado — lgop 000/000 inferior Lingual 73 Mandíbula Lado 433/333/323/323/323/222/ 222) 322 323/323/223/323/323|334 inferior Lingual 73 Mandíbula Lado 833/333/323/323/323/223/ 222) 222 /223/323/322/223/333|334 inferior — |Labial Mandíbula|Lado eb | reemeiaa for rooloca ooclone oco lonoloe voo lona oco lonolo ca o rolo oa 7 Mobilidade de Mandíbula| 1 BE inferior inferior Lele de e e do o e e ole o elo! inferior mai " Mobilidade de Primeira Mandíbula » 74) vici 45 ; mandíbula 1 1 Primeira Mandíbula|Lado [ivan foca beca [sor perene oooloo son onoloas ooo lonelocaloer| Iroolena 74 |Primeira) — Mandíbula|Lado 633/333|/323/326|/324/323/323] 323 /323/323/223 336/633 Visita superior |bucal 74 |Primeira) — Mandíbula|Lado 333/435/333/333|/533/333/323] 323 /323/323/323 324|555 Visita superior |palatinal Primeira Mandíbula|Lado fee ai par) iso ro des] osa cao [ros] rseess or] rodo] Primeira Mandíbula|Lado imerar eng [907171190 te jpenona ooo [ron 00 fotolone oo onols ronco 74 [Primeira] — Mandíbula Lado 468 333 325/323|/323/323/323| 323 323 323/323/323/333/334 Visita inferior Lingual al ermelta| | IMandíbula Lado 369/333|335/333/324/424/323/423 323 323/323/323/333/333 Visita inferior — Labial Primeira Mandíbula|Lado ae as, poeraes vero essere ros eres ooosloostroa o] mai " Mobilidade de; «níeror inferior BNSSSSONOSSSSA isita inferior RB N inferior [TABELA 1-16] " Mobilidade de superior Superior else pede e e de de e e superior superior 74 Mandíbula Lado — Bop loos1/ono 000/001/001/000/100/000/100 001 superior bucal 74 Mandíbula Lado 333/812| 212 /213/812/212/212/212/812/212/223 424/423 superior — bucal 74 Mandíbula Lado 333/833| 323 /323/422/222/212/312/212/213/323 334/8344 superior — |palatinal 74 Mandíbula [Lado = Bop 101/000/000|110/000/010/001 101 superior palatinal 74 Mandíbula Lado — Bop lo11/000 110/010/011|111/101/000/001/01o0 inferior Lingual 74 Mandíbula Lado 357/823| 324 /323/323/212/212/212/212/212/223/323/333/533 inferior Lingual 74 Mandíbula Lado 467/443) 323 |322/312/212/212/212/212/212/222/323/3823/533 inferior Labial 74 Mandíbula Lado — Igop oooloooloo1/100/oooloooli1o|1o1 inferior Labial Mandíbula |Mobilidade del 7a . ne o 1 inferior mandíbula inferior <Cálculo de Valor de PISA>

[0287] Em seguida, a partir dos resultados de teste periodontal de doença de 6 pontos registrados, PISA (área de superfície inflamada periodontal) foi calculada conforme mostrado na Tabela 2 em referência à literatura conhecida (Nesse, W,., Abbas, F., van der Ploeg, |., Spijkervet, F. K,, Dijkstra, P.U., Vissink, A.: Periodontal inflamed surface area: quantifying inflammatory burden. Journal of Clinical Periodontology, 35: 668 a 673, 2008.). O valor de PISA indica a área de inflamação do tecido periodontal da cavidade oral inteira em milímetros quadrados (mm?).

[0288] ATabela3 mostra coletivamente os valores de PISA de 46 indivíduos.

o s Ss q a s s à à = = 3 3 S ie = e e o S = ic 3 Ss Ss —=E E q QN o 2) «E Is |e2 2/ a | Sae à É s|) ss 38 |E =| SE | SE |E E Ss) Ss 8 |S | SE | PE |S = o nao =o o oj<E | <E |O oq Ss 8 E 8 E Tt o

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E MA Trr ao LO ON od E PITFTRQRINRNAINISRENA ; Sd Zz 8 s Ss 2 & 2 2

[Tabela 3] er

E 29 445

Detecção de Bactérias orais em Amostra de Saliva <Extração de DNA da Saliva> 1-1 Interrupção de Microesfera

[0289] A um tubo de 2 ml, 400 ul da saliva acima, 400 ul de água esterilizada, e 0,4 g de microesferas de vidro de 0,1 mm (% GB-01 fabricado pela TOMY SEIKO CO,., LTD.) foram adicionados, e a tampa foi firmemente fechada. Em seguida, interrupção de microesfera foi realizada por 5 minutos a 3.200 rpm definindo-se o tube em Micro Smash (fabricado pela TOMY SEIKO CO,, LTD.). Então, o tubo foi definido em uma centrífuga para lançar microesferas e similares, e levemente centrifugados em 1.800 g por 5 minutos. O sobrenadante foi dispensado em uma quantidade de 400 ul em um novo tubo de 1,5 ml. 1-2Tratamento de Enzima

[0290] A amostra 1-1 foi misturada com 90 ul de Buffer ATL da Qiagen, 10 ul de Proteinase K, e 100 ul de Buífer AL para ajustar um volume total para 600 ul, e a mistura foi incubada a 56 ºC por 1 hora. 1-3 Purificação de Coluna

[0291] Após a incubação, 120 ul de etanol foi adicionado e colocado em vórtice. Então, com uso de um QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen), uma quantidade total de 720 ul foi colocada na coluna do kit, a mistura foi centritugada em 14.000 rpm por 1 minuto, e o eluado foi descartado. Então, de acordo com o protocolo do kit, a coluna foi lavada com 500 ul de Buffer AW1 e 500 ul de Buffer AW2. Subsequentemente, depois que a coluna em um estado vazio foi centrifugado a 14.000 rpm por 1 minuto, DNA foi eluado com 20 ul de água esterilizada. Cerca de 4 a 20 ng/ul de uma solução de DNA foi obtida a partir de cada uma das 46 amostras. <Reação de Amplificação de DNA Bacteriano>

[0292] A solução de DNA foi diluída a 20 pg/ul e usada como um modelo de PCR. De modo a amplificar a sequência da região alvo de detecção de 16S rRNA de uma bactéria oral em cada amostra, PCR foi realizado sob as condições de reação com a composição de solução de reação descrita abaixo. PCR foi realizado com uso de, como um kit de PCR, Premix Ex Taq (nome comercial) Hot Start Version (fabricado pela Takara Holdings Inc.) e o ProFlex (nome comercial) POR System (fabricado pela Thermo Fisher Scientific. Como iniciadores, iniciadores que têm as seguintes sequências foram usados. O iniciador primário usado teve a terminação 5' rotulada com Cy5.

[0293] Iniciador dianteiro (para amplificação bacteriana):

[0294] 5-Cy5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3' (SEQ ID NO: 32)

[0295] Iniciador reverso (para amplificação bacteriana):

[0296] — 5-CAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACC-3' (SEQ ID NO: 33)

[0297] Iniciador dianteiro (para amplificação de índice de carga absoluta):

[0298] — 5-Cy5-GAGAAGCCTACACAAACGTAACGTOC-3' (SEQ ID NO: 34)

[0299] Iniciador Reverso (para amplificação de índice de carga absoluta):

[0300] — 5-CTCTAMAGACCGCTCTATCTCOGG-3' (SEQ ID NO: 35)

<Composição de Solução de Relação> 2x Premix Ex Taq (nome comercial registrado) Hot Start Version 10 ul 4 UM de iniciador dianteiro (para amplificação bacteriana) 1u 4 UM de iniciador reverso (para amplificação bacteriana) 1u 4 UM de Iniciador dianteiro (para amplificação de índice de carga absoluta) 1 4ul 4 uM de Iniciador Reverso (para amplificação de índice de carga absoluta») 14 DNA de modelo 5ul Índice de carga absoluta 1ul Total 20 ul <Condições de Reação>

[0301] Após aquecimento a 95 ºC por 1 minuto, um total de 40 ciclos de "dissociação: 98 ºC (10 seg) — anelamento: 55 ºC (30 seg) — síntese: 72 ºC (20 seg)" foram realizados, e a mistura foi coletada em 4 ºC, obtendo assim um produto de amplificação.

<Chip de DNA: Produção de Chip de DNA para Detectar Bactérias Orais>

[0302] Um chip de DNA do tipo furo atravessante foi produzido por um método similar ao método descrito no Exemplo 1 da Publicação de Patente nº JP (Kokai) nº 2007-74950A (method for detecting methylated DNA and/or unmethylated DNA).

[0303] Observe que, como sondas de oligonucleotídeo montadas no presente documento, sondas que têm as informações de sequência mostradas na Tabela 4 foram usadas.

[Tabela 4] ; 2 : 4 6 bh TAGTTATACAGTTTCCAACG [tera nucleatum — subsp.

! " n 7 ss ns . ão nv ss 1º 2o 2 2 2 26 2s 26 7 28 2º ao si <Hibridização com Chip de DNA>

[0304] Uma solução de hibridização foi preparada misturando-se as respectivas soluções conforme descrito abaixo.

[0305] Produto de amplificação de DNA obtido após PCR 20 ul 1M Tris-HCI 48 ul 1M NaCl! 48 ul

Tween20 a 0,5% 20 ul Água 65 ul Total 200 ul

[0306] Um aparelho de lavagem híbrido automático (tipo: AHF-200, fabricado pela Mitsubishi Chemical Corporation) foi usado para hibridização e lavagem do chip de DNA.

[0307] A solução de hibridização em uma quantidade de 200 ul foi colocada em contato com o chip de DNA, seguido por hibridização a 50 ºC por 16 horas.

[0308] Após a hibridização, o chip de DNA foi lavado sob as condições a seguir. Lavagem com 1.000 ul de solução de 0,24 M de Tris:HCI/0,24 M de NaCl/0,05% de Tween-20 por 220 segundos foi repetida 12 vezes. Então, lavar com 1.000 ul de 0,24 M Tris:-de HCI/0,24 M de NaCl por 220 segundos foi repetido 4 vezes.

[0309] Após a conclusão da lavagem, cada chip foi transferido a uma solução misturada de 0,24 M de Tris:HCI/0,24M de NaCl em temperatura ambiente. <Detecção>

[0310] Após a lavagem, a intensidade de fluorescência de cada ponto do chip de DNA foi medida sob as condições a seguir com uso de Genopal Reader (tipo: GR-S1, fabricado pela Mitsubishi Chemical Corporation). <Condições de Detecção>

[0311] Comprimento de onda de excitação central: 633 nm

[0312] Tempo de exposição: 0,1, 1, 4, e 40 segundos <Resultados>

[0313] A intensidade de fluorescência de um ponto com uma sonda montada no mesmo para uma bactéria a ser detectada foi dividida pelo valor de base (o mediano das intensidade de fluorescência de pontos sem uma sonda), calculando assim a razão de SN da intensidade de fluorescência derivada de hibridização (doravante denominada como “intensidade de sinal”).

[0314] Previsão de Valor de PISA com Base na Carga Bacteriana <Análise de Correlação de Valor de PISA e Carga Bacteriana>

[0315] Primeiro, o valor de PISA e os dados de razão de SN que indicam a carga bacteriana de cada bactéria foram associados a cada amostra. Os resultados são mostrados na Tabela 5 [Tabela 5-1] Amostra Controle | Bactéria Porphyro Tannerella | Treponema | Campylobac Nº PISA DNA s totais meonas forsythia denticola ter gracilis gingivalis

EFE EEE ET EEE EI E EEr TE EO Co Eee TT

1.120 941,6 |2.295,5 | 1,3 6,8 23 1,6

Er EEE ET OA

EE EE E OA E EEE E EA

[Tabela 5-2] Fusobact Fusobact Fusobact Fusobact . erium Fusobact Campylob erium erium erium Campyloba nucleatu m erium Prevotella acter nucleatu m nucleatu m | nucleatu m . NNE cter rectus subsp. periodonti | intermedia showae subsp. subsp. subsp. . polymorp . cum vincentii animalis | nucleatu m hum 6,8 1,2 61 34 | 16,1 39,3 2,9 | 11 se E EA FLoç E TE TE GOA

LE EE EO

LT E ETR EO a e e e e a TE E e e [Tabela 5-3] Streptoc | Aggregati Prevotella occus bacter Campylob | Capnoeyt | Capnoeyt | Gapnocyt Eikenella nigrescens | constellat | actinomy acter ephaga ephaga ephaga corroden s us cetemco concisus | gingivalis | ochracea | sputigena

ELOA GE EE E Ee e sr FE e e a de e e e e e so

1,0 | 2,6 5,7 2,8 | 1,3 1,5 21 11 rs e es e e

FT TE E ET ESA To E E TETO GR e e e [Tabela 5-4] Streptoc Streptoc Streptoc | Streptoc Aetinomy Veillonell Aetinomy Selenom | Streptoc occus OPUS occus occus os um os onas occus gordonii memos mitis mitis bv 2 ao parvula nessa noxia mutans se a ss e ss e se

EEEF ETF TES

ET EE TETE SS Goes e E e 6 1 6 ee de e e e e a so so e e es e e e Fr FF FE FTF EE) EE TETE Ts 33,5 5,4 19,5 36,4 9,5 | 14 41,2 | 2,0 13,5

FE F Fi FE E E =]

GT TE TETE GF TT E ve) ss es a 7 as ss as

[0316] Depois disso, o coeficiente de correlação entre PISA e a razão de SN de cada bactéria foi obtida depois de usar “análise de dados” de Excel, e resumido na Tabela 6. [Tabela 6] |Streptococcus mutans -0,41

Prevotetaimemeda [908 | (camprioacieramamee [aos Fusobacterium nucleatum subsp palymarprum. — Jooa |

[0317] Na comparação da razão de SN que mostra a carga bacteriana de cada bactéria e o valor de PISA para a cavidade oral inteira, a correlação foi a seguinte em ordem decrescente de correlação: Treponema denticola, Tannerella forsythia, Fusobacterium — nucleatum subsp. animalis, Porphyromonas gingivalis e Campylobacter rectus. Esses continham “Complexo Vermelho” e foram considerados como índices do grau de inflamação da cavidade oral inteira. Entretanto, aqueles que mostram a correlação inversa foram Streptococcus mutans, Actinomyces odontolyticus, Streptococcus mitis bv 2, Streptococcus mitis e Campylobacter concisus. Esses foram considerados como índices do grau de saúde da cavidade oral geral.

[0318] Subsequentemente, um modelo para prever o valor de PISA com uma árvore modelo foi criado com uso de uma técnica de aprendizado em máquina com base na razão de SN da carga bacteriana de cada bactéria com uso dos dados mostrados na Tabela 5. A otimização pelo método “M5” com uso do pacote de "cursor" do software estatístico “R” (R Development Core Team) foi realizado para análise.

[0319] Depois que os dados na Tabela 5 foram lidos como “bactérias” o comando a seguir foi executado.

m <- train(PISA-,,data=bacteria ,method="M5")

[0320] Esse é um comando para gerar uma árvore modelo com PISA como um objetivo variável e variáveis explicativas como todos os tipos de bactérias na Tabela

5. Todos os 46 dados de amostra foram usados.

[0321] Quando o modelo ideal que foi executado foi emitido inserindo-se o comando de saída de resultado “m$finalModel”, o modelo de previsão a seguir foi obtido. Os resultados são mostrados na Figura 1

[0322] Árvore modelo não podada M5:

[0323] (Com uso de modelos lineares suavizados) Actinomyces.odontolyticus <= 20,1: | Campylobacter.concisus <= 2,2: | | Capnocytophaga.sputigena <= 2,15: | | | Tannerella.forsythia <= 6,9:

| | | | Streptococcus.mutans <= 5,3: LM1 (2/12,282%) | | | | Streptococcus.mutans > 5,3: LM2 (2/32,179%) | | | Tannerella.forsythia > 6,9: | | | | Streptococcus.mutans <= 2,95: LM3 (3/16,447%) | | | | Streptococcus.mutans > 2,95: LM4 (3/2,075%) | | Capnocytophaga.sputigena > 2,15: | | | Streptococcus .gordonii <= 35,45: LM5 (2/1,965%) | | | Streptococcus .gordonii > 35,45: LMG6 (3/26,323%) | Campylobacter.concisus > 2,2: | | Treponema.denticola <= 15,35: | | | Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum <= 38,35: LM7 (3/2,882%) | | | Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum > 38,35: | | | | ACtinomyces.odontolyticus <= 10,9: LM8 (3/4,64%) | | || ACtinomyces.odontolyticus > 10,9: LM9 (2/2,948%) | | Tteponema.denticola > 15,35: LM10 (3/39,648%) Actinomyces.odontolyticus > 20,1: | Tannerella.forsythia <= 2,85: | | Streptococcus.gordonii <= 19,6: | | | AcCtinomyces.naeslundii.ll <= 4,05: LM11 (5/2,414%) | | | Actinomyces.naeslundii.ll > 4,05: LM12 (3/3,304%) | | Streptococcus.gordonii > 19,6: | | | Control.DNA <= 837,15: LM13 (3/4,132%) | | | Control.DNA > 837,15: LM14 (2/0,098%) | Tannerella.forsythia > 2,85: | | Streptococcus.constellatus <= 1,75: LM15 (3/14,832%) | | Streptococcus.constellatus > 1,75: | | | Porphyromonas.gingivalis <= 1,385: LM16 (2/9,58%) | | | Porphyromonas.gingivalis > 1,35: LM17 (2/2,751%)

[0324] num. de LM: 1

[0325] resultado =

5,9609 * Treponema.denticola + 2,719 * Streptococcus .gordonii - 2,4637 * Actinomyces.odontolyticus - 43,3698 * Streptococcus.mutans + 161,5714 * Capnocytophaga.sputigena - 0,4833 * Control. DNA + 3,734 * Tannerella.forsythia - 1510,5973

[0326] num. de LM: 2

[0327] resultado = 5,9609 * Treponema.denticola + 2,719 * Streptococcus .gordonii - 2,4637 * Actinomyces.odontolyticus - 43,3698 * Streptococcus.mutans + 161,5714 * Capnocytophaga.sputigena - 0,4833 * Control.DNA + 3,734 * Tannerella.forsythia - 1507,5864

[0328] num. de LM: 3

[0329] resultado = 5,9609 * Treponema.denticola + 2,719 * Streptococcus .gordonii - 2,4637 * Actinomyces.odontolyticus - 26,3717 * Streptococcus.mutans + 161,5714 * Capnocytophaga.sputigena - 0,4833 * Control. DNA + 3,9077 * Tannerella.forsythia - 1392,5945

[0330] num. de LM: 4

[0331] resultado =

5,9609 * Treponema.denticola + 2,719 * Streptococcus .gordonii - 2,4637 * Actinomyces.odontolyticus - 26,3717 * Streptococcus.mutans + 161,5714 * Capnocytophaga.sputigena - 0,4833 * Control. DNA + 3,9077 * Tannerella.forsythia - 1394,1708

[0332] num. de LM: 5

[0333] resultado = 5,9609 * Treponema.denticola + 1,2546 * Streptococcus .gordonii - 2,4637 * Actinomyces.odontolyticus - 26,3717 * Streptococcus.mutans + 201,9643 * Capnocytophaga.sputigena - 0,4833 * Control.DNA + 5,5586 * Tannerella.forsythia - 1565,177

[0334] num. de LM: 6

[0335] resultado = 5,9609 * Treponema.denticola + 1,336 * Streptococcus .gordonii - 2,4637 * Actinomyces.odontolyticus - 26,3717 * Streptococcus.mutans + 201,9643 * Capnocytophaga.sputigena - 0,4833 * Control. DNA + 5,5586 * Tannerella.forsythia - 1555,611

[0336] num. de LM: 7

[0337] resultado =

13,3672 * Treponema.denticola + 2,719 * Streptococcus .gordonii - 2,4637 * Actinomyces.odontolyticus - 30,4289 * Streptococcus.mutans - 0,4833 * Control. DNA + 5,5586 * Tannerella.forsythia - 0,3524 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum - 1314,4003

[0338] num. de LM: 8

[0339] .resultado = 13,3672 * Treponema.denticola + 2,719 * Streptococcus .gordonii - 1,8817 * Actinomyces.odontolyticus - 30,4289 * Streptococcus.mutans - 0,4833 * Control. DNA + 5,5586 * Tannerella.forsythia - 0,3171 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum - 1293,9573

[0340] num. de LM: 9

[0341] .resultado = 13,3672 * Treponema.denticola + 2,719 * Streptococcus .gordonii - 1,38181 * Actinomyces.odontolyticus - 30,4289 * Streptococcus.mutans - 0,4833 * Control. DNA + 5,5586 * Tannerella.forsythia - 0,3171 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum - 1294,0756

[0342] num. de LM: 10

[0343] resultado =

15,293 * Treponema.denticola + 2,719 * Streptococcus .gordonii - 2,4637 * Actinomyces.odontolyticus - 30,4289 * Streptococcus.mutans - 0,4833 * Control. DNA + 5,5586 * Tannerella.forsythia - 1320,5275

[0344] — num.deLM:11

[0345] .resultado = 3,3786 * Treponema.denticola + 5,1956 * Streptococcus .gordonii - 2,8861 * Actinomyces.odontolyticus - 0,5662 * Control. DNA + 29,9183 * Tannerella.forsythia - 2,6289 * Actinomyces.naeslundii.|| - 826,1665

[0346] —num.deLM:12

[0347] .resultado = 3,3786 * Treponema.denticola + 5,1956 * Streptococcus .gordonii - 2,8861 * Actinomyces.odontolyticus - 0,5662 * Control. DNA + 29,9183 * Tannerella.forsythia - 2,9643 * Actinomyces.naeslundii.ll - 825,1613

[0348] num. de LM: 13

[0349] .resultado = 3,3786 * Treponema.denticola + 5,4972 * Streptococcus .gordonii - 2,8861 * Actinomyces.odontolyticus

- 0,6637 * Control. DNA + 29,9183 * Tannerella.forsythia + 0,4481 * Actinomyces.naeslundii.ll - 906,7614

[0350] num. de LM: 14

[0351] .resultado = 3,3786 * Treponema.denticola + 5,4972 * Streptococcus .gordonii - 2,8861 * Actinomyces.odontolyticus - 0,6694 * Control.DNA + 29,9183 * Tannerella.forsythia + 0,4481 * Actinomyces.naeslundii.ll - 910,6162

[0352] num. de LM: 15

[0353] .resultado = -215,5803 * Porphyromonas.gingivalis + 3,3786 * Treponema.denticola + 3,1851 * Streptococcus .gordonii - 2,8861 * Actinomyces.odontolyticus - 56,1926 * Streptococcus.constellatus - 0,5662 * Control. DNA + 36,302 * Tannerella.forsythia - 1327,7476

[0354] num. de LM: 16

[0355] .resultado = -221,29 * Porphyromonas.gingivalis + 3,3786 * Treponema.denticola + 3,1851 * Streptococcus .gordonii - 2,8861 * Actinomyces.odontolyticus - 53,2351 * Streptococcus.constellatus

- 0,5662 * Control. DNA + 36,302 * Tannerella.forsythia - 1307,8776

[0356] num. de LM: 17

[0357] .resultado = -221,29 * Porphyromonas.gingivalis + 3,3786 * Treponema.denticola + 3,1851 * Streptococcus.gordonii - 2,8861 * Actinomyces.odontolyticus - 53,2351 * Streptococcus.constellatus - 0,5662 * Control. DNA + 36,302 * Tannerella.forsythia - 1307,1008

[0358] O comando “p <- predict(m, newdata=bacteria)" foi inserido, e os dados de razão de SN medidos da carga bacteriana de cada bactéria for 46 amostras foram substituídos no modelo de previsão criado “m,” obtendo assim os valores de PISA previstos “p” correspondentes a 46 amostras.

[0359] Subsequentemente, o comando cor(p,bacteria$PISA) foi inserido para calcular o coeficiente de correlação entre os valores de PISA previstos “p" e os valores de PISA medidos. Como resultado, O coeficiente de correlação foi 0,8759666.

[0360] A Figura 2 mostra um diagrama de dispersão dos valores de PISA previstos “p” e dos valores de PISA medidos.

[0361] Conforme mostrado nesse modelo, foi constatado que o valor de PISA pode ser previsto a partir da razão de SN do chip de DNA.

[0362] Em particular, ao comparar a razão de SN que mostra a carga bacteriana de cada bactéria mostrada na Tabela 6 com o valor de PISA da cavidade oral inteira, foi mostrado que o valor de PISA pode ser previsto a partir da razão de SN do grupo bacteriano de Streptococcus mutans, Actinomyces odontolyticus, Campylobacter concisus, Actinomyces. naeslundii. 1|l e Streptococcus.constellatus que tem um coeficiente de correlação negativa e o grupo bacteriano de Capnocytophaga sputigena, Tannerella forsythia, Streptococcus gordonii, Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum e Porphyromonas gingivalis que tem um coeficiente de correlação positiva. Exemplo 2

[0363] Os mesmos resultados de detecção do Exemplo 1 foram usados para prever os valores de PISA com base nas cargas bacterianas. <Análise de Correlação de Valor de PISA e Carga Bacteriana>

[0364] Primeiro, o valor de PISA e os dados de razão de SN que indicam a carga bacteriana de cada bactéria foram associados a cada amostra. Então, o mediano das razões de SN do índice de carga absoluta sondas de todas as amostras foi calculado, e a razão de SN da sonda de índice de carga absoluta de cada amostra foi dividido por esse mediano. Isso é especificado como a correção entre valores de correção. Os dados de razão de SN entre chips foram então padronizados dividindo-se os dados de razão de SN de todas as bactérias para cada amostra pelo valor de correção entre chips para cada amostra. Os resultados são mostrados na Tabela 7 [Tabela 7-1] Porphyro Campy| Campyl Campylo PISA Bactérias monas Tannerella| Treponema obacter obacter bacter totais gingivalis forsyíhia denticola gracilis rectus showae

FE E EE EA

1.050) 1.7264 14 11,6 84 1,3 | 5,2 | 0,9 |

EEE RE E O

FE E E ETA E o e e Fes TE E EE

FE O O O FERE E E E

EFE E E EE Fr E E RO sr e e ss ss 3420 1.728,1 2,7 32,7 39,3 1,2 24,2 0,8

FF E ET TE ETA [Tabela 7-2] Fusobact Fusobact Fusobact . Fusobact . erium . erium Fusobact Streptoc erium erium Prevotella nucleatu nucleatu | erium Prevotella occus nucleatu nucleatu . . Ú nigrescen m subsp. m subsp.| periodont| intermedia constell m subsp. m subsp. . s , . polymorp . nucleatu | icum atus vincentii animalis hum m 10,6 1,6 36,6 26 3 0,9 [1 15,4

EE FE EFE EE Fr E Eee : For EE EEE 3 1,3 49,3 115,5 1,5 0,8 | 0,9 1,2

FE TE E TF EE E E EE e E EA) [Tabela 7-3] Aggregat ibactor Campylo | Capnocy | Capnocy Capnocy Eikenella | Streptoc Streptoc actinomy | bacter tophag a| tophag a tophag à corroden | occus OPeus . cetem concisus | gingivalis| ochracea sputigen Ss gordonii intermedi comitans ? “S 2 | 1,5 1,8 1,5 2 1,5 25,8 4,5 |

For E E FE TEA

EEE E E EEE

E E E EE EA For E E E EEE 1,5 | 5 0,9 1,2 2,2 11 | 17,6 | 3,9 o po djs a as o ss eo | [Tabela 7-4] Actinomyc Actinomyc e.

Z cus cus cus mitis mitis bv 2 odontolytic parvula naeslundii nas noxia mutans us " ss e e eo so E o E e ss O a e e e e so 2,2 4,6 5,6 1 9,5 2 | 11,9 | o e as

EEE E es e e ss ss)

EL E

E E A E E LE E Es

E E EO

NM E E E E O so FE ss E E Es 30,3 61,4 15,4 1,3 8,7 23 | 2,1

Cs E E O a se e e e e Cs Te is E Er TE TEIA

[0365] Depois disso, o coeficiente de correlação entre PISA e a razão de SN de cada bactéria foi obtida depois de usar “análise de dados" de Excel, e resumido na Tabela 8. [Tabela 8] Streptococcus mutans Actinomyces odontolyticus Streptococcus mitis bv 2 Streptococcus mitis Campylobacter concisus -0,12 Capnocytophaga gingivalis -0,01 Actinomyces naeslundii Il | ooo | Fusobacterium periodonticum | oo | Streptococcus constellatus 0,11 Prevotella intermedia Aggregatibacter actinomycetemcomitans Eikenella corrodens Campylobacter showae 0,20 Bactérias totais | Campylobacter gracilis 0,24

Prevotella nigrescens 0,24 Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum Streptococcus intermedius Capnocytophaga sputigena Capnocytophaga ochracea Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum Campylobacter rectus Veillonella parvula 0,39 Streptococcus gordonii Selenomonas noxia Fusobacterium nucleatum subsp. animalis | o60o | Porphyromonas gingivalis 0,65 Treponema denticola Tannerella forsythia

[0366] Na comparação da razão de SN que mostra a carga bacteriana de cada bactéria e o valor de PISA para a cavidade oral inteira, a correlação foi a seguinte em ordem decrescente de correlação: Tannerella forsythia, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum subsp. animalis, Selenomonas noxia, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula, Campylobacter rectus e Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum. Esses continham “Complexo Vermelho” e foram considerados como índices do grau de inflamação da cavidade oral inteira. Entretanto, aqueles que mostram a correlação inversa foram Streptococcus mutans, Actinomyces odontolyticus, Streptococcus mitis bv 2, Streptococcus mitis e Campylobacter concisus. Esses foram considerados como índices do grau de saúde da cavidade oral geral.

[0367] Subsequentemente, um modelo para prever o valor de PISA com um árvore modelo foi criado com uso de uma técnica de aprendizado em máquina com base na razão de SN da carga bacteriana de cada bactéria com uso dos dados mostrados na

Tabela 7. Em seguida, a otimização pelo método “M5” com uso do pacote de "cursor" do software estatístico “R” (R Development Core Team) foi realizada.

[0368] Depois que os dados na Tabela 7 foram lidos como “bactérias” o comando a seguir foi executado.

m <- train(PISA-. data=bacteria ,method="M5")

[0369] Esse é um comando para gerar uma árvore modelo com PISA como um objetivo variável e variáveis explicativas como todos os tipos de bactérias na Tabela

7. Todos os 46 dados de amostra foram usados.

[0370] Quando o modelo ideal que foi executado foi emitido inserindo-se o comando de saída de resultado “m$finalModel” o modelo de previsão a seguir foi obtido.

[0371] Árvore modelo não podada M5:

[0372] (Com uso de modelos lineares suavizados) Treponema.denticola <= 6,1: | Campylobacter.concisus <= 1,45: | | Actinomyces.odontolyticus <= 53,95: | | | Streptococcus.mutans <= 15: || | | Tannerella.forsythia <= 4,9: | | | | | Porphyromonas.gingivalis <= 1,45: LM1 (2/25,547%) | | | | | Porphyromonas.gingivalis > 1,45: LM2 (2/24,859%) | | | | Tannerella.forsythia > 4,9: LM3 (3/3,438%) | | | Streptococcus.mutans > 15: LM4 (2/7,664%) | | Actinomyces.odontolyticus > 53,95: | | | Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis <= 2,2: LM5 (2/3,144%) | | | Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis > 2,2: LM6 (2/2,358%) | Campylobacter.concisus > 1,45: | | Capnocytophaga.ochracea <= 1,15: | | | Fusobacterium.periodonticum <= 2,35: LM7 (2/4,372%) | | | Fusobacterium.periodonticum > 2,35: LM8 (2/1,326%) | | Capnocytophaga.ochracea > 1,15:

| | | Total.Bacteria <= 2252,6: LM9 (4/4,488%) | | | Total.Bacteria > 2252,6: | | | | Capnocytophaga.ochracea <= 1,55: LM10 (4/2,777%) | | | | Capnocytophaga.ochracea > 1,55: || | | | Tannerella.forsythia <= 2,9: ||| ||| Tannerella.forsythia <= 2,35: LM11 (2/11,398%) | | | | | | Tannerella.forsythia > 2,35: LM12 (2/1,572%) || | | | Tannerella.forsythia > 2,9: LM13 (3/17,057%) Treponema.denticola > 6,1: | Campylobacter.rectus <= 6,4: | | Veillonella.parvula <= 1,25: | | | Streptococcus.gordonii <= 36,15: LM14 (3/12,485%) | | | Streptococcus.gordonii > 36,15: | | | | Tannerella.forsythia <= 11,5: LM15 (2/8,205%) | | | | Tannerella.forsythia > 11,5: LM16 (2/1,572%) | | Veillonella.parvula > 1,25: LM17 (3/55,578%) | Campylobacter.rectus > 6,4: | | Bactérias Totais <= 1916,55: LM18 (2/4,176%) | | Bactérias Totais > 1916,55: LM19 (2/1,965%)

[0373] num. de LM: 1

[0374] resultado = 0,1154 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 32,2177 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 4,5488 * Streptococcus .gordonii - 2,8479 * Actinomyces.odontolyticus - 4,1907 * Streptococcus.mutans - 353,0028

[0375] num. de LM: 2

[0376] resultado = 0,1154 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 32,2177 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 4,5488 * Streptococcus .gordonii - 2,8479 * Actinomyces.odontolyticus - 4,1907 * Streptococcus.mutans - 354,0939

[0377] num. de LM: 3

[0378] resultado = 0,1154 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 32,2177 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 4,5488 * Streptococcus .gordonii - 2,8479 * Actinomyces.odontolyticus - 4,1907 * Streptococcus.mutans - 353,0353

[0379] num .deLlM:4

[0380] resultado = 0,1154 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 32,2177 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 4,5488 * Streptococcus .gordonii

- 2,8479 * Actinomyces.odontolyticus - 5,4232 * Streptococcus.mutans - 347,5507

[0381] num. de LM: 5

[0382] resultado = 0,1154 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 32,2177 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 4,5488 * Streptococcus .gordonii - 3,3806 * Actinomyces.odontolyticus - 263,7849

[0383] num. de LM: 6

[0384] resultado = 0,1154 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 32,2177 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 4,5488 * Streptococcus .gordonii - 3,3806 * Actinomyces.odontolyticus - 262,54

[0385] num. de LM: 7

[0386] resultado = 0,1154 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 27,5903 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis

+ 4,5488 * Streptococcus .gordonii - 0,6784 * Actinomyces.odontolyticus - 33,5894

[0387] num. de LM: 8

[0388] resultado = 0,1154 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 27,5903 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 4,5488 * Streptococcus .gordonii - 0,6784 * Actinomyces.odontolyticus - 32,468

[0389] num. de LM: 9

[0390] resultado = 0,0649 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 43,8294 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 4,5488 * Streptococcus .gordonii - 0,6784 * Actinomyces.odontolyticus - 146,6484

[0391] num. de LM: 10

[0392] resultado = 0,0785 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 44,0191 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis

+ 4,5488 * Streptococcus .gordonii - 0,6784 * Actinomyces.odontolyticus - 93,2371

[0393] num. de LM: 11

[0394] resultado = 0,0785 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 45,0694 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 4,5488 * Streptococcus .gordonii - 0,6784 * Actinomyces.odontolyticus - 91,1073

[0395] num. de LM: 12

[0396] resultado = 0,0785 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 45,0694 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 4,5488 * Streptococcus .gordonii - 0,6784 * Actinomyces.odontolyticus - 91,0077

[0397] num. de LM: 13

[0398] resultado = 0,0785 * Bactérias totais - 87,6234 * Porphyromonas.gingivalis + 45,1623 * Tannerella.forsythia + 3,4246 * Treponema.denticola + 10,3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis

+ 4,5488 * Streptococcus .gordonii - 0,6784 * Actinomyces.odontolyticus - 93,4098

[0399] num. de LM: 14

[0400] resultado = -0,0279 * Bactérias totais - 142,0103 * Porphyromonas.gingivalis + 9,7177 * Tannerella.forsythia + 5,5503 * Treponema.denticola + 24,5588 * Campylobacter.rectus + 16,8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 10,5169 * Streptococcus.gordonii + 793,003 * Veillonella.parvula - 497.9287

[0401] num. de LM: 15

[0402] resultado = -0,0279 * Bactérias totais - 142,0103 * Porphyromonas.gingivalis + 9,7177 * Tannerella.forsythia + 5,5503 * Treponema.denticola + 24,5588 * Campylobacter.rectus + 16,8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 10,4819 * Streptococcus.gordonii + 793,003 * Veillonella.parvula - 489.1573

[0403] num. de LM: 16

[0404] resultado = -0,0279 * Bactérias totais - 142,0103 * Porphyromonas.gingivalis + 9,7177 * Tannerella.forsythia

+ 5,5503 * Treponema.denticola + 24,5588 * Campylobacter.rectus + 16,8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 10,4819 * Streptococcus.gordonii + 793,003 * Veillonella.parvula - 489.4669

[0405] — num.deLM:17

[0406] resultado = -0,0279 * Bactérias totais - 142,0103 * Porphyromonas.gingivalis + 9,7177 * Tannerella.forsythia + 5,5503 * Treponema.denticola + 24,5588 * Campylobacter.rectus + 16,8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 10,4024 * Streptococcus.gordonii + 853,2173 * Veillonella.parvula - 506.1734

[0407] —num.deLM:18

[0408] resultado = -0,0958 * Bactérias totais - 142,0103 * Porphyromonas.gingivalis + 9,7177 * Tannerella.forsythia + 5,5503 * Treponema.denticola + 32,3143 * Campylobacter.rectus + 16,8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 7,3721 * Streptococcus .gordonii + 686,8925 * Veillonella.parvula - 139,0553

[0409] num. de LM: 19

[0410] resultado =

-0,0958 * Bactérias totais - 142,0103 * Porphyromonas.gingivalis + 9,7177 * Tannerella.forsythia + 5,5503 * Treponema.denticola + 32,3143 * Campylobacter.rectus + 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis + 7,3721 * Streptococcus.gordonii + 686,8925 * Veillonella.parvula - 143,569

[0411] Número de Regras: 19

[0412] Subsequentemente, o comando “p <- predictím, newdata=bacteria)” foi inserido, e os dados de razão de SN medidos da carga bacteriana de cada bactéria for 46 amostras foram substituídos no modelo de previsão criado “m,” obtendo assim os valores de PISA previstos “p” correspondentes a 46 amostras.

[0413] De modo a calcular o coeficiente de correlação entre os valores de PISA reais e os valores de PISA previstos, o comando cor(p,bacteria$PISA) foi executado para calcular o coeficiente de correlação entre os valores de PISA previstos “p” e os valores de PISA medidos. Como resultado, O coeficiente de correlação foi 0,9291664. A Figura 3 mostra um diagrama de dispersão dos valores de PISA previstos “p” e dos valores de PISA medidos. Conforme mostrado nesse modelo, foi constatado que o valor de PISA pode ser previsto a partir da razão de SN do chip de DNA.

[0414] Em particular, ao comparar a razão de SN que mostra a carga bacteriana de cada bactéria mostrada na Tabela 8 com o valor de PISA da cavidade oral inteira, foi mostrado que o valor de PISA pode ser previsto a partir da razão de SN do grupo bacteriano de Streptococcus mutans, Actinomyces odontolyticus e Campylobacter concisus que tem um coeficiente de correlação negativa e o grupo bacteriano de Tannerella forsythia, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum “subsp. animalis, Streptococcus gordonii, Veillonela parvula, Campylobacter rectus, Capnocytophaga ochracea e Fusobacterium periodonticum que tem um coeficiente de correlação positiva.

Exemplo 3

[0415] Um modelo para prever o valor de PISA com uma árvore modelo foi criado com uso de uma técnica de aprendizado em máquina com base na razão de SN da carga bacteriana de cada bactéria com uso dos mesmos dados que na Tabela 7 descritos no Exemplo 2. O método “M5” do pacote de "cursor" do software estatístico “R” (R Development Core Team) foi usado para análise.

[0416] Ao construir modelo de previsão, 34 amostras foram aleatoriamente extraídas de 46 amostras e usadas para o método de validação cruzada. A razão de dados de treinamento de construção de modelo e dados de verificação no método de validação cruzada foi 75:25, e a frequência de aprendizado foi de 10 vezes.

[0417] Após a construção de modelo, as 12 amostras restantes de dados que não foram usadas para construção de modelo foram usadas como dados desconhecidos futuros e usados para verificação.

[0418] Mais especificamente, depois de definir a tabela da Tabela 7 ao nome de quadro de dados “bactérias” os comandos a seguir foram executados.

[0419] fitControl <- trainControl(method="CV",p=0,75, number=10)

[0420] train.index <- sample(nrow(bacteria),nrow(bacteria)*0.75)

[0421] tModeling dados definidos

[0422] data.train <- bacteria[train.index,]

[0423] tTest dados definidos

[0424] data.test <- bacteria[-train.index,]

[0425] data.m5 <- train(data.train[,- 1]),data.train$PISA,method="M5",trControl=fitControl)

[0426] (A razão de dados de treinamento de construção de modelo e dados de verificação no método de validação cruzada foi 75:25, e a frequência de aprendizado foi de 10 vezes).

[0427] data.m5$results HDisplay de modelo de construção

[0428] Verification resultados com dados desconhecidos

[0429] PISA.pred <- predict(data.m5,newdata=data.test[,-11)

[0430] tCalcation de coeficiente de correlação

[0431] coOr(PISA.pred,data.test$PISA)

[0432] tOutput de diagrama de dispersão

[0433] PIot(PISA.pred,data.test$PISA)

[0434] Results em dados de treinamento

[0435] PISA ..predtr <- predict(data.m5,newdata=data.train[,-11)

[0436] —%Calcationde coeficiente de correlação

[0437] cor(PISA.preditr,data.train$PISA)

[0438] tOutput de diagrama de dispersão

[0439] Plot(PISA.predtr,data.train$PISA)

[0440] Como resultado, os resultados a seguir foram obtidos para o modelo de construção (Figura 4).

[0441] Árvore modelo não podada M5:

[0442] (Com uso de modelos lineares suavizados) Tannerella.forsythia <= 3,589: | Capnocytophaga.ochracea <= 1,085: LM1 (3/3,579%) | Capnocytophaga.ochracea > 1,085: | | Prevotella.intermedia <= 1,135: | | | Total.Bacteria <= 2.072,974: LM2 (2/2,188%) | | | Total.Bacteria > 2.072,974: LM3 (3/2,889%) | | Prevotella.intermedia > 1,135: | | | Treponema.denticola <= 2,289: LM4 (3/0,856%) | | | Treponema.denticola > 2,289: LM5 (2/4,57%) Tannerella.forsythia > 3,589: | Capnocytophaga.sputigena <= 1,786: | | Eikenella.corrodens <= 1,067: | | | Fusobacterium .periodonticum <= 1,502: LM6 (3/2,054%) | | | Fusobacterium.periodonticum > 1,502: | | | | Streptococcus.mitis <= 3,972: LM7 (2/7,05%) | | | | Streptococcus.mitis > 3,972: | | | | | Aggregatibacter.actinomycetemcomitans <= 1,334: LM8 (3/5,601%)

| | | | | Aggregatibacter.actinomycetemcomitans > 1,334: LM9 (2/21,879%) | | Eilkenella.corrodens > 1,067: LM10 (3/7,804%) | Capnocytophaga.sputigena > 1,786: | | Tannerella.forsythia <= 12,803: | | | Total.Bacteria <= 2244,721: LM11 (2/6,126%) | | | Total.Bacteria > 2244,721: LM12 (2/103,221%) | | Tannerella.forsythia > 12,803: | | | Total.Bacteria <= 1907,395: LM13 (2/25,331%) | | | Total.Bacteria > 1907,395: LM14 (2/1,945%)

[0443] num. de LM: 1

[0444] .resultado = 0,1964 * Bactérias totais + 8,473 * Treponema.denticola - 3,7524 * Streptococcus.mitis - 136,0844

[0445] num. de LM: 2

[0446] .resultado = 0,1872 * Bactérias totais + 8,473 * Treponema.denticola - 102,9193 * Prevotella.intermedia - 3,7524 * Streptococcus.mitis - 297,6459

[0447] — num.deLM:3

[0448] .resultado = 0,1877 * Bactérias totais + 8,473 * Treponema.denticola - 102,9193 * Prevotella.intermedia - 3,7524 * Streptococcus.mitis - 295,2116

[0449] num. de LM: 4

[0450] .resultado = 0,1964 * Bactérias totais + 10,9568 * Treponema.denticola - 102,9193 * Prevotella.intermedia - 3,7524 * Streptococcus.mitis - 261,0986

[0451] —num.deLlM:5

[0452] .resultado = 0,1964 * Bactérias totais + 11,1029 * Treponema.denticola - 102,9193 * Prevotella.intermedia - 3,7524 * Streptococcus.mitis - 261,4416

[0453] num. de LM: 6

[0454] .resultado = 0,1528 * Bactérias totais + 6,7947 * Tannerella.forsythia + 6,5901 * Treponema.denticola + 29,1856 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans + 74,536 * Capnocytophaga.sputigena - 197.1112* Eikenella.corrodens - 5,6233 * Streptococcus.mitis - 637,0725

[0455] num. de LM: 7

[0456] .resultado = 0,1528 * Bactérias totais + 6,7947 * Tannerella.forsythia + 6,5901 * Treponema.denticola + 32,1268 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans + 74,536 * Capnocytophaga.sputigena

- 197.1112 * Eikenella.corrodens - 5,6233 * Streptococcus.mitis - 625,658

[0457] num. de LM: 8

[0458] .resultado = 0,1528 * Bactérias totais + 6,7947 * Tannerella.forsythia + 6,5901 * Treponema.denticola + 32,301 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans + 74,536 * Capnocytophaga.sputigena - 197.1112 * Eikenella.corrodens - 5,6233 * Streptococcus.mitis - 627,695

[0459] num. de LM: 9

[0460] .resultado = 0,1528 * Bactérias totais + 6,7947 * Tannerella.forsythia + 6,5901 * Treponema.denticola + 32,3574 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans + 74,536 * Capnocytophaga.sputigena - 197.1112* Eikenella.corrodens - 5,6233 * Streptococcus.mitis - 627,9978

[0461] num. de LM: 10

[0462] .resultado = 0,1528 * Bactérias totais + 6,7947 * Tannerella.forsythia + 6,5901 * Treponema.denticola + 22,9812 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans + 74,536 * Capnocytophaga.sputigena

- 273.7656 * Eikenella.corrodens - 5,6233 * Streptococcus.mitis - 673,9955

[0463] num. de LM: 11

[0464] .resultado = 0,1989 * Bactérias totais + 14,1331 * Tannerella.forsythia + 6,5901 * Treponema.denticola + 90,7394 * Capnocytophaga.sputigena - 6,2112 * Streptococcus.mitis - 410,322

[0465] num. de LM: 12

[0466] .resultado = 0,1989 * Bactérias totais + 14,1331 * Tannerella.forsythia + 6,5901 * Treponema.denticola + 90,7394 * Capnocytophaga.sputigena - 6,2112 * Streptococcus.mitis - 409,7214

[0467] num. de LM: 13

[0468] .resultado = 0,1989 * Bactérias totais + 14,1331 * Tannerella.forsythia + 6,5901 * Treponema.denticola + 90,7394 * Capnocytophaga.sputigena - 6,2112 * Streptococcus.mitis - 497,6085

[0469] num. de LM: 14

[0470] .resultado = 0,1989 * Bactérias totais

+ 14,1331 * Tannerella.forsythia + 6,5901 * Treponema.denticola + 90,7394 * Capnocytophaga.sputigena - 6,2112 * Streptococcus.mitis - 501,0283

[0471] Número de Regras: 14

[0472] Como resultado de inserção dos dados de treinamento ao modelo construído, o coeficiente de correlação entre o valor de PISA real e o valor previsto foi 0,9318094. Os resultados são mostrados no diagrama de dispersão da Figura 5.

[0473] Entretanto, nos resultados de verificação nos quais dados desconhecidos foram inseridos no modelo construído, o coeficiente de correlação entre o valor de PISA real e o valor previsto foi 0,5986115. Os resultados são mostrados no diagrama de dispersão da Figura 6.

[0474] Os resultados mostraram que o valor de PISA pode ser previsto mesmo para dados desconhecidos.

[0475] Em particular, ao comparar a razão de SN que mostra a carga bacteriana de cada bactéria mostrada na Tabela 8 com o valor de PISA da cavidade oral inteira, foi mostrado que o valor de PISA pode ser previsto a partir da razão de SN do grupo bacteriano de Streptococcus mitis que tem um coeficiente de correlação negativa e o grupo bacteriano de Tannerella forsythia, Treponema denticola, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Eikenella corrodens, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia e Fusobacterium periodonticum que tem um coeficiente de correlação positiva. [Exemplo 4] <Comparação com Métodos de Determinação Existentes>

[0476] Em relação à determinação do estado de doença periodontal com uso de saliva como uma amostra, de acordo com o “Clinical Guidelines for Antibacterial Therapy for Patients com Periodontal Disease (em Japonês) (editado pela Sociedade Japonesa de Periodontologia), o estado pode ser determinado com o “brando” quando a contagem bacteriana total de três tipos de bactérias é menos do que 0,05% em relação à contagem bacteriana total, “moderada” quando a mesma é 0,05% ou mais e menos do que 0,5% em relação à contagem bacteriana total, e “severa” quando a mesma é 0,5% ou mais em relação à contagem bacteriana total.

[0477] Portanto, dentre as razões de SN mostradas na Tabela 7, o valor total de razões de SN de três tipos de bactérias de complexo vermelho, a saber Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, e Treponema denticola, e a razão de SN de bactérias totais que indicam a carga bacteriana total foram calculadas e designadas como índices existentes. Com base nesses índices, “brando,” “moderado,” e “severo” foram determinados.

[0478] A Tabela 9 resume os resultados determinados, os valores de PISA medidos, os valores de PISA previstos com base nos resultados do Exemplo 3, a razão de SN de três bactérias, e a razão de SN de bactérias totais. [Tabela 9] PISA so Porphyr | Tamnere| DP) PTSSNcoo Valor (Valor Baciêrias gingival torsythi ma bactérias/razão | Determinação previsto de medido) s a denti SN bacteriana PISA cola total 477 21481 | 18 | 17 | 15 0,2% Moderado 564

[0479] Um gráfico no qual o eixo geométrico X representa os valores de PISA medidos mostrados na Tabela 9 e o eixo geométrico Y representa a “razão de três bactérias” existente é mostrada como o gráfico esquerdo da Figura 7. De modo similar, um gráfico no qual o eixo geométrico X representa os valores de PISA medidos e o eixo geométrico Y representa os valores de PISA previstos é mostrado como o gráfico direito da Figura 7. O coeficiente de determinação com o valor de PISA medido foi cerca de 0,41 para o método existente e cerca de 0,66 para o método da presente invenção, que mostra que o estado de doença periodontal pode ser previsto mais precisamente do que o método existente. Adicionalmente, a média de valores de “PISA previsto” das amostras determinadas como “severas” pelo método existente foi

1.424, e a média de valores de PISA previstos das amostras determinadas como “moderadas” foi 736, mostrando que os índices da presente invenção podem ser comparados com os Índices convencionais. Exemplo 5

[0480] Com base nos dados nas Tabelas 7 e 8, as três espécies bacterianas de topo (Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola e Tannerella forsythia) que mostram uma “correlação positiva” da carga bacteriana e PISA e as três espécies bacterianas de topo (Streptococcus mutans, Actinomyces odontolyticus e Streptococcus mitis bv 2) que mostram uma “correlação negativa” da carga bacteriana e PISA foram selecionadas. A razão total das razões de S/N dos grupos de três bactérias (a razão das bactérias que mostram uma correlação positiva e as bactérias que mostram uma correlação negativa: “índice de equilíbrio”) foi calculada.

[0481] A diagrama de dispersão dos valores calculados (eixo geométrico X) e os valores de PISA (eixo geométrico Y) é mostrado na Figura 8. Como resultado, foi constatado que há uma relação entre X e Y com um coeficiente de determinação de cerca de 0,41. Ou seja, foi constatado que PISA pode ser estimado mesmo quando o Índice de equilíbrio é usado. Exemplo 6

[0482] De modo a investigar a espécie bacteriana recém discutida nos últimos anos, um chip de DNA que é recém equipado com as sondas bacterianas mostradas na Tabela 10 foi preparada da mesma maneira que no Exemplo 1.

[Tabela 10]

CTATTCGACCAGCGATATCACTACGT

TACACACGTTCTTCCCCTAC | 40 —— | SondadePorphyromonas paste — | ACACGTGACTCTTGTTATTC

GTACCGTCACCCAAACTCAATA ACCCACTGCAAAACCAGGGT

TCTCTTCTTCCCTGCTAACA | 6 | SondadeTreponemamedum — — | GTCGATTACCGTCATCAGATG 65 Sonda de Eubacterium saphenum CCCTAGGACAGAGGCTTACA |

[6 | SondadeNeisseraflavesceens — — | AGCTGTCGATATTAGCAACAG

GTCAAGGCGCTAACAGTTAC [65 | sonda de Eubacterimsulá — — | ARACCCTACACTTAAGETEC | | 6º —— | Sondade Megasphaera micronuciformis| TAACCACAAGATTATTCGTC

[0483] Dados de PISA foram também coletados para 56 amostras que foram parcialmente coletadas adicionalmente às mesmas amostras que do Exemplo 1, e dados de intensidade de fluorescência foram adquiridos para essas amostras com uso do novo chip de DNA mostrado na Tabela 10. As condições experimentais ao tempo de aquisição foram as mesmas que no Exemplo 1, mas os dois pontos a seguir foram mudados.

[0484] Os iniciadores usados para PCR foram mudados conforme a seguir.

[0485] R e Y representam bases misturadas, R representa A e G, e Y representa CeT.

[0486] Iniciador dianteiro (para amplificação bacteriana):

[0487] 5-Cy5-TACGGGAGGCAGCAG-3' (SEQ ID NO: 72)

[0488] Iniciador Reverso (para amplificação bacteriana):

[0489] — 5-CRGGGTATCTAATCCYGTT-3' (SEQ ID NO: 73)

[0490] Iniciador dianteiro (para amplificação de índice de carga absoluta):

[0491] — 5-Cy5-GAGAAGCCTACACAAACGTAACGTOC-3' (SEQ ID NO: 34)

[0492] Iniciador Reverso (para amplificação de índice de carga absoluta):

[0493] — 5S-CTCTAAAGACCGCTCTATCTCGG-3' (SEQ ID NO: 35)

[0494] A temperatura e tempo de hibridização foram definidos para 50 ºC por 16 horas.

[0495] Subsequentemente, a intensidade de fluorescência obtida foi processada conforme a seguir.

[0496] A intensidade de fluorescência de um ponto com uma sonda montada no mesmo para uma bactéria a ser detectada foi subtraída pelo valor de base (o mediano das intensidades de fluorescência de pontos sem uma sonda), calculando assim a intensidade de sinal derivada de hibridização. Nesse tempo, quando a intensidade de sinal foi abaixo de um determinado limiar, a mesma foi determinada como ruído e foi definida para "0". Aqui, como o valor limítrofe, um valor três vezes o desvio padrão de valores excluindo os 5 valores superior e inferior fora das intensidades de fluorescência de 30 pontos sem uma sonda foi usado.

[0497] Além disso, a razão relativa de cada bactéria às bactérias totais foi calculada dividindo-se a intensidade de sinal da sonda para uma bactéria alvo de detecção pela intensidade de sinal da sonda para o índice de carga microbiana total. Para a análise subsequente, o valor obtido convertendo-se a razão relativa à carga bacteriana total por log10 foi usado. No entanto, visto que o valor "0" não pode ser calculado, o valor após a conversão de log10 foi substituído por -4. Desse modo, dados foram obtidos para todos os 56 espécimes. A tabela 11 resume os resultados e PISA para cada espécime.

[Tabela 11-1] totais nodatum sobrinus S28-D-2 182,7 -0,3839 | 0,0000 | -2,9588 -1,8171 -1,5686 -3,2036

[soDa [o — [ssa] 00000 | a1585 | 27600 | 20000 | 2706 | S59-D-2 228,1 -0,9631 0,0000 | -3,2568 -2,2626 -3,1281 | -3,3909

[Tabela 11-2] pasteri atypica parainíluen rava,OT parasangui israeli pallens zae 308) nis -2,2095 -2,8109 -2,5090 | -3,1961 | -1,6167 -3,2010 -2,6926

[Tabela 11-3] Prevotelia | Prevotella Solobacte | Prevotella | Selenom Rothia | Rothia loescheii histicola riu m| melaninoge | ona s| dentocarios | mucilaginos

FFEEE ST -3,2647 | -2,7550 -3,2690 | -3,0064 | -3,1081 -3,1031 | -0,5240 |

-3,3694 | -3,8452 -3,4136 | -2,5794 | -2,9350 -3,1162 | -1,0660

[Tabela 11-4] ' Peptostre Porphyro Actinomyce Veillonella | pto Prevotella mo nas| Streptococc s Treponem rogosae Cocos denticola endodont us salivarius graevenitzii a medium -1,8660 30126 | -32507 | -25145 | -1,63890 21482 — | -3,0047

[Tabela 11-5] socranskii sanguinis mo nas matruchoti| UM flavescens| aadiacens catoniae i saphenum -3,1420 | -1,7323 -3,2392 -2,5434 | -1,5850 -1,0559 | -0,7195 |

[Tabela 11-6] -2,2329 -3,0472 -3,8305 -3,8266

-1,9523 -2,1290 -3,2527 -2,0127

[0498] O coeficiente de correlação de PISA e o valor de log10 (razão de relativa à carga bacteriana total) de cada bactéria foi calculado para todos os 36 tipos de bactérias, e além disso, as espécies bacterianas que tem um valor absoluto do coeficiente de correlação maior do que 0,2 foram selecionados.

As bactérias que tem um coeficiente de correlação positivo e bactérias que têm um coeficiente de correlação negativo são mostrados abaixo (Tabela 12). [Tabela 12]

Prevotella pallens

Streptococcus salivarius -0,2738

Eubacterium sulci

Rothia mucilaginosa

Prevotella denticola

Veillonella atypica -0,2261

Prevotella histicola

| Megasphaera micronuciformis -0,2176

Streptococcus parasanguinis -0,2106 Sonda Correlação SR1 sp. OT 345 0,2053 Porphyromonas catoniae 0,2278 Selenomonas sputigena 0,2281 Neisseria flavescens 0,2301 Streptococcus sobrinus 0,2500 Parvimonas micra 0,2560 Peptostreptococcus stomatis 0,2860 Treponema socranskii 0,3357 Eubacterium saphenum 0,3647 Eubacterium nodatum 0,4170 Treponema medium 0,4386 Filifactor alocis 0,4983 Porphyromonas endodontalis 0,5607

[0499] O grupo bacteriano que tem um coeficiente de correlação negativa foi determinado para incluir as seguintes 9 espécies bacterianas: Prevotella pallens, Streptococcus salivarius, Eubacterium sulci, Rothia mucilaginosa, Prevotella denticola, Veillonella atypica, Prevotella histicola, Megasphaera micronuciformis e Streptococcus parasanguinis.

[0500] O grupo bacteriano que mostra um coeficiente de correlação positiva foi determinado para incluir as seguintes 13 espécies bacterianas: SR1 sp. OT 345, Porphyromonas — catoniae, Selenomonas sputigena,y Neisseria flavescens, Streptococcus sobrinus, Parvimonas micra, Peptostreptococcus stomatis, Tteponema socranskii, Eubacterium saphenum, Eubacterium nodatum, Treponema medium, Filifactor alocis e Porphyromonas endodontalis.

[0501] Subsequentemente, um modelo para previsão por análise de regressão múltipla com os valores numéricos após a conversão de logiO0 das 22 espécies bacterianas acima como variáveis explicativas e os valores de PISA como variáveis objetivas foi criado. Para análise, software estatístico “R” (R Development Core Team) foi usado, e a análise foi realizada com uso da função “Im”.

[0502] O comando a seguir foi executado depois de ler PISA na Tabela 11 e os dados das bactérias (22 tipos, dados de 56 amostras) como “data01.”

[0503] res1 <- IM(PISA-.,data=data01)

[0504] (Comando para realizar análise de regressão múltipla em dados de 56 amostras com valores de PISA como variáveis objetivas e 22 tipos de bactérias como variáveis explicativas)

[0505] O coeficiente de correlação entre o valor de PISA previsto obtido substituindo-se os dados de cada carga bacteriana na fórmula de modelo de previsão executada res1 e a PISA real foi 0,8618542. Esse diagrama de dispersão é mostrado na Figura 9.

[0506] Texto Livre de Listagem de Sequências

[0507] SEQIDNOs: 1 a 74: DNAs sintéticos

[0508] Listagem de Sequências

Claims (6)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para estimar uma área de inflamação de bolsa periodontal caracterizado pelo fato de que consiste na detecção de cargas bacterianas de dois ou mais tipos de bactérias na saliva e no uso dos resultados de detecção obtidos como Índices, em que as bactérias a serem detectadas incluem: uma bactéria que tem uma correlação positiva entre uma carga bacteriana da bactéria e a área de inflamação de bolsa periodontal; e uma bactéria que tem uma correlação negativa entre uma carga bacteriana da bactéria e a área de inflamação de bolsa periodontal.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a área de inflamação de bolsa periodontal é representada por um valor de PISA ou CAPRS.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria que tem a correlação negativa é pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em Treponema denticola, Tannerella forsythia, Fusobacterium nucleatum subsp animalis, Porphyromonas gingivalis, Campylobacter rectus, Fusobacterium nucleatum subsp nucleatum, Selenomonas noxia, Veillonella parvula, Streptococcus gordonii, Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, Streptococcus intermedius, Capnocytophaga —ochraceay Capnocytophaga sputigenay Aggregatibacter actinomycetemcomitans, — Fusobacterium — nucleatum — subsp. polymorphum, Fusobacterium periodonticum, SR1 sp OT 345, Porphyromonas catoniae, Selenomonas sputigena, Neisseria flavescens, Streptococcus sobrinus, Parvimonas micra, Peptostreptococcus stomatis, Treponema socranskii, Eubacterium saphenum, Eubacterium nodatum, Treponema medium, Filifactor alocis e Porphyromonas endodontalis.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria que tem a correlação negativa é pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em Streptococcus mutans, Actinomyces odontolyticus, Streptococcus mitis bv 2, Streptococcus mitis, Campylobacter concisus, Capnocytophaga gingivalis, Prevotella pallens, Streptococcus salivarius, Eubacterium sulci, Rothia mucilaginosa,

Prevotella denticola, Veillonella atypica, Prevotella histicola, Megasphaera micronuciformis e Streptococcus parasanguinis.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas (1) a (4): (1) uma etapa para detectar a carga bacteriana de cada bactéria na saliva a partir de uma amostra de saliva de um sujeito com uma área de inflamação de bolsa periodontal conhecida; (2) uma etapa para obter um coeficiente de correlação da carga bacteriana de cada bactéria com uma área de inflamação de bolsa periodontal exclusiva para cada bactéria e construir uma expressão relacional entre a carga bacteriana de cada bactéria e a área de inflamação de bolsa periodontal, criando, assim, um modelo de predição; (3) uma etapa para detectar a carga bacteriana de cada bactéria na saliva a partir de uma amostra de saliva de um sujeito com uma área de inflamação de bolsa periodontal conhecida; e (4) uma etapa para inserir a carga bacteriana de cada bactéria obtida em (3) na expressão relacional obtida em (2), estimando, assim, a área de inflamação de bolsa periodontal.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que um método para criar o modelo de predição é um método que usa um selecionado dentre algoritmos de aprendizado de máquina de regressão linear, árvore de regressão, árvore de modelo, rede neural, máquina de vetor de suporte, ensacamento, reforço e floresta aleatória.