CN110106250A

CN110106250A - 与奶牛围产期代谢疾病抗性相关的分子标记及应用

Info

Publication number: CN110106250A
Application number: CN201910452167.4A
Authority: CN
Inventors: 张毅; 黄河天; 张胜利
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2039-05-28
Also published as: CN110106250B

Abstract

本发明提供了与奶牛围产期代谢疾病抗性相关的分子标记及应用，本发明的分子标记是基于奶牛全基因组关联分析开发得到，共有10个SNP分子标记，其SNP位点的上、下游侧翼序列分别如SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3‑4、以此类推至SEQ ID NO.19‑20所示。这些分子标记可用于遗传学上鉴定奶牛代谢疾病抗性，淘汰代谢疾病抗性差的奶牛，培育代谢疾病抗病力强的奶牛，为奶牛围产期能量代谢疾病遗传抗性的标记辅助选择提供了有效方法。

Description

与奶牛围产期代谢疾病抗性相关的分子标记及应用

技术领域

本发明属于动物育种、遗传学与分子生物学技术领域，具体地说，涉及用于与奶牛围产期代谢疾病抗性相关的分子标记及应用。

背景技术

围产期是奶牛生产中关键阶段，能量负平衡是这一时期的主要代谢特征，导致代谢疾病高发。酮病和真胃变位就是两种围产期奶牛常见的代谢疾病，尤其是在高产奶牛中更易发生，严重影响了奶牛的健康性能和生产寿命。酮病是由能量代谢障碍引发的一种以肝脏脂肪酸氧化代谢紊乱和酮体(BHBA、乙酰乙酸、丙酮等)升高为主要病理特征的围产期能量代谢障碍性疾病，具有高血酮、高血脂等特征，发病率为5％～15％(Pryce etal.2016)。奶牛真胃变位是指真胃正常解剖位置发生改变，引起消化道梗阻，导致消化代谢机能障碍的临床疾病，发病率为5％左右(Pryce et al.2016)。围产期的能量负平衡是酮病和真胃变位共同的病理学基础，在实际中酮病和真胃变位常相伴发生，任一疾病的发病都会增加另一疾病的发病风险(LeBlanc et al.2005)。

据报道，在我国临床型酮病的治疗费用为500元/例，亚临床型酮病的治疗费用为200元/例，弃奶经济损失平均为350元/例。综合其他影响因素，每头酮病牛造成的总经济损失超过3200元(徐硕烁,2014)。美国的研究结果也显示在头胎牛中酮病造成的总经济损失为77美元，真胃变位为432美元；在经产牛中，酮病的经济损失为180.91美元，真胃变位为639.51美元(Liang et al.2017)。此外，由于代谢疾病造成的奶牛过早淘汰的问题也不容忽视。在分娩后30天内淘汰的奶牛中，因代谢疾病淘汰的比例约占60％，大大降低了奶牛的有效生产年限。

提高奶牛对代谢疾病的抗性，有助于降低疾病的发病率，减少兽医成本，培育健康抗病力优良的个体。但代谢疾病遗传力低，利用常规的育种方法选育难度大，遗传进展缓慢。

随着牛基因组学及生物信息学的迅速发展，奶牛分子育种研究已取得较大的进展，全基因组关联分析(Genome wide association study,GWAS)也成为鉴定奶牛复杂性状主效基因和分子标记的常用方法。并进一步通过标记辅助选择(Marker-assistedselection,MAS)，实现对不同个体进行直接早期选择，以提高选择的准确性。研究证实，在围产期代谢疾病的易感性上奶牛个体间存在着遗传差异，但目前报道的与代谢疾病相关的分子标记和候选基因还十分有限。

发明内容

本发明的目的是提供与奶牛围产期代谢疾病相关的分子标记及应用。

为了实现本发明目的，本发明通过收集21个奶牛场的真胃变位和酮病的发病表型数据。从中挑选在群发病(真胃变位和酮病)奶牛608头及对照健康奶牛2902头的血液样本(3,510头个体)对3,150头个体的Illumina BovineSNP50(54,609SNP)芯片数据进行缺失基因型的填充，所用参考群来自85头中国荷斯坦和510头北欧荷斯坦牛的高密度770K基因型数据。利用Plink软件对基因型数据进行质控，剔除基因型检出率小于90％的个体；剔除SNP位点检出率小于90％的个体；剔除最小等位基因小于0.05％；剔除哈代温伯格平衡检验中P值小于10^-6的SNP位点。质控后共有3,139头个体的631,981个SNP标记用于分析。进行全基因组关联分析，位于牛14号染色体上26302589-26374498bp(牛参考基因组UMD3.1.1版本)范围内的10个SNP标记与奶牛酮病抗性高度相关，这些标记呈连锁不平衡状态，共同构成一个单倍型。其中SNP位点rs133077958位于CYP7A1基因内，故CYP7A1基因是酮病的候选基因。

具体地，本发明的提供10个SNP标记的信息见表1。

表1

本发明提供的10个SNP分子标记，其SNP位点的上、下游侧翼序列分别如SEQ IDNO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20所示。

由于本发明提供的上述10个SNP位点均为二态标记，所以该分子标记或其任意多个的分子标记组合可以基于现有公知的基因分型方法实现对其检测，例如采用KASP平台实现基因分型数据的获得。具体方案为，根据KASP技术要求针对于本发明提供的位点设计引物，引物为普通引物不含荧光集团；购置KASP技术配套的PCR扩增体系MasterMix；配置反应体系加入DNA、引物和MasterMix；运行反应程序；原位扫描荧光信号；数据分析获得基因型数据。

虽然本发明实施例未提供上述10个SNP位点的扩增引物，但本领域技术人员可以针对具体的位点信息设计合适的特异性引物，能够实现对所述SNP分子标记的检测，因此用于检测本发明所述的10个SNP分子标记任一个或多个的引物组合属于本发明保护的范围。

基于此，引物组合在制备用于鉴定奶牛代谢疾病抗性的试剂盒中的应用属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述分子标记或用于检测分子标记的引物组合在奶牛育种、遗传改良或标记辅助选择中的应用。

本发明提供了上述分子标记或用于检测分子标记的引物组合在奶牛育种中用于筛选对代谢疾病具有抗性的奶牛、或淘汰对代谢疾病抗性低的奶牛中的应用。

本发明提供了上述分子标记或用于检测分子标记的引物组合在培育代谢疾病抗病力强的奶牛中的应用。

本发明发现的10个与代谢疾病相关的SNP分子标记中，其中1个SNP位点rs133077958位于CYP7A1基因内，因此CYP7A1基因是奶牛代谢疾病(酮病)的候选基因。本发明提供了CYP7A1基因在奶牛育种中用于筛选对代谢疾病具有抗性的奶牛、或淘汰对代谢疾病抗性低的奶牛中的应用。

具体而言，针对CYP7A1基因内的SNP分子标记进行检测，若位于该基因中rs133077958位点的等位基因是A，则说明待选奶牛为对代谢疾病有抗性的奶牛；所述CYP7A1基因的DNA序列如SEQ ID NO.21所示。

本发明提供了的上述应用中，所述的代谢疾病为酮病。

优选地，本发明所述的奶牛为荷斯坦奶牛。

本发明具有以下优点：本发明提供的10个与奶牛围产期代谢疾病相关的SNP分子标记可以单独或多个组合用于遗传学上鉴定奶牛代谢疾病抗性，淘汰代谢疾病抗性差的奶牛，培育代谢疾病抗病力强的奶牛，为奶牛围产期能量代谢疾病遗传抗性的标记辅助选择提供了有效方法。

附图说明

图1为与酮病相关联的20-SNP滑动窗口解释的遗传方差百分比的曼哈顿图。

图2为本发明分析得到的10个SNP位点构成的单倍型示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

实施例1与奶牛围产期代谢疾病相关的分子标记的获得

1、数据收集及样本采集

收集北京地区三元绿荷奶牛养殖中心21个牛场的真胃变位和酮病的发病表型数据。从中挑选在群发病奶牛608头及对照健康奶牛2902头的血液样本(3,510头个体)。

2、DNA提取及牛54K SNP芯片基因型检测

牛血样采集采用尾根静脉采血法，使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒(DP318)，提取牛血DNA。DNA样品质量要求为浓度要求大于50ng/ul，样品纯度要求OD260/OD280介于1.6～2.0之间，OD260/OD230介于1.8～2.1之间。质检合格的DNA样品利用Illumina平台的BovineSNP50DNA Analysis BeadChip(54,609个SNP)进行基因型分型，共获得3,150头个体基因型数据。

3、基因型数据填充及质控

对3,510头个体的Illumina BovineSNP50(54,609SNP)芯片数据进行缺失基因型的填充，所用参考群来自85头中国荷斯坦和510头北欧荷斯坦牛的高密度770K基因型数据。

利用Plink软件对基因型数据进行质控，剔除基因型检出率小于90％的个体；剔除SNP位点检出率小于90％的个体；剔除最小等位基因小于0.05％；剔除哈代温伯格平衡检验中P值小于10^-6的SNP位点。质控后共有3,193头个体的631,981个SNP标记用于分析。

4、全基因组关联分析

1)统计模型

基于“一步法”全基因组关联分析(ssGWAS)策略(Wang et al.2014)构建统计模型，使用两性状动物阈模型。目标性状为酮病，但由于真胃移位与酮病具有强遗传相关性，因此将真胃变位加入统计模型中，通过两性状全基因组关联分析，提高基因定位的准确性。

模型为：

λ＝Xβ+Z_hh+Z_aa+Z_pp+e

模型中，λ表示个体酮病或真胃变位的表型(0：未发病，1：发病)的潜在连续变量；β表示固定效应向量，包括胎次效应、年季效应；h表示场年随机效应；a为个体随机加性遗传效应，H阵为系谱分子血缘关系矩阵和基因组关系矩阵合并而成。采用BLUPF90软件(Misztal et al.2002)进行计算。

采用Wang et al.(2014)文献提出的方法，由估计出的基因组育种值(GEBV)来推导SNP的估计效应，进而计算染色体上20个连续SNP所组成的窗口所解释的遗传方差。最终结果以第i个窗口解释的遗传方差百分比来表示：

其中，a_i表示第i个滑动窗口内连续20个SNP的遗传效应，表示模型中总的遗传方差组分，Z_j表示所有基因型个体第j个SNP标记向量，表示第i个滑动窗口内第j个SNP标记的估计效应。

2)SNP与性状关联性

在整个基因组上解释遗传方差最大的连续SNP窗口，被认为与表型有关联。

3)单倍型分析

选定与表型相关的滑动窗口内的，并利用Haploview(Version4.2)进行连锁不平衡分析和单倍型分析。

4)SNP注释候选基因

根据芯片SNP信息，在Ensembl网站上牛参考基因组UMD3.1.1版本上查找SNP所在或者最接近的基因。

5、结果

两性状ssGWAS结果显示，影响酮病的基因组区域集中在10、14、26号染色体，其中位于14号染色体的信号区域(26.1-26.7Mbp)，此前未有公开报道与奶牛酮病相关。在该区域内，以SNP位点rs43083541为首的20个SNP组成的基因组区域(14号染色体26302589-26440324bp)关联信号最强(图1)，所解释的遗传方差为0.52％。单倍型分析显示，其中的10个SNP位点共同构成一个单倍型(图2)，其中一个SNP位点rs133077958，位于CYP7A1基因内，且与其余显著SNP处于极强连锁不平衡状态(r²>0.9)。10个SNP位点的信息见表1。这10个SNP位点及其构成的单倍型可以应用到奶牛代谢疾病的标记辅助选择中，进而可以提高奶牛的抗病力。

实施例2本发明10个SNP位点的关联度验证

本实施例采用卡方检验方法对实施例1筛选得到的10个SNP分子标记基因型的显著性进行了检验，从表2中可以看出，10个SNP位点均存在一定的效应值，说明SNP位点与酮病关联。根据效应值的正负，结合表型数据(0表示未发病，1表示发病)基因型编码数据(0,1,2，纯合最小等位基因编码为0)，可以判断出每个SNP标记相对的抗病优势等位基因。例如SNP效应值为正，标记的最小等位基因即为抗性等位基因，SNP效应值为负，则标记最大等位基因为抗性等位基因。进一步统计发病个体和健康个体中基因型分布发现，SNP位点rs133077958中AA基因型在健康个体中显著高于发病个体(P<0.01)，A等位基因是奶牛酮病抗性的优势等位基因。在实际辅助标记育种工作中，上述10个SNP分子标记的基因型是考虑的重要因素之一，同时影响围产期代谢疾病的因素例如季节、奶牛胎次、牛场生产管理等都应纳入考量范围中，可全面客观评价奶牛围产期代谢疾病抗性。

表2与酮病相关的10个SNP效应值及基因型分布

¹粗体表示酮病抗性优势等位基因

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 与奶牛围产期代谢疾病抗性相关的分子标记及应用

<130> KHP191112753.0

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggagagtcag ctgtaggtcc gagtggtgct tctactgtct gcagtgtgtc atgcgtctta 60

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgtttatat ttacgttctg attctttaat tcttctttct tagcctcaca cctgaaatag 60

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgtcagcct attgtttgta ggctttgaaa agtgtgccat atcaaagtga accaagacaa 60

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagaataaaa taatattaaa tcaatgacca caatcccaat agaaataatt ttggatcctc 60

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggttttgcc agctgatatt tatgtacagg agtgaggcac tcacctcacg agtagacacc 60

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatcatcaaa ccagcatcac cgtcctagct taattctttg tggaaggtat gttttatgga 60

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttctgagatg accttggtgt agggctctgc atctgtggcc ttggttgaag gtcttgcacc 60

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaaccctggt ctaggactcg acagttgcag ttacatgaat gctgtaggct ccaggtagtt 60

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgactgattc tgatgctaga tgcaaacagg agagcgggct gagatctggg aagtgaacct 60

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatctgctg cctcacaagt tgtttgaggc tttggaaagc aagctgtggg gggaattgtg 60

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgaatctgca gttctctttg aaacatcagt gtccctgtct tggtgtcact ttctaggttt 60

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agcctcggac ttggtgtcag cccaggcaga tggagaaggg ggctggtgac tatggtgttg 60

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggggttgc agagtcggac acgactgagc aactgaactg agctgaactt aaaaggcaaa 60

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tctagctaaa ttccatcaat aacagtatat tatgattgat tcataggtat tagagttggt 60

<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

actgctgaga accaaagttt caaagcaaaa acttgaagat agaggggaaa gtacattaca 60

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agagatctag gaccacaggc tgatcatcgt gagtgactgg caggctgacc cactgctgga 60

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cagaaaaaca gagacctcag ggtgcactct gcctcctcac aaaagtcatt ccttcccttc 60

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcactgtttt caaatgtggg tgcttctacc aagcacaagg tgccagctag atgcttccct 60

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggagaggctt aaattgcaca caaaaacgtc aaactgaaat ctacaactaa gagaggaact 60

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tggatctgct ggcagatgtc cgctattcag gaacaaaaaa tcagctattt taaactatca 60

<210> 21

<211> 2667

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atgatgagcc tctctttgat ttgggggatt gttatagcag tgtgttgttg tttataccta 60

cttggaatga gaagaaggca gatgggcgaa ccccctctgg agaatgggct gattccgtat 120

ctgggttgtg ctctgcaatt tggtgccaat cctctcgagt tcctcagggc aaatcaaagg 180

aaacatggtc acgttttcac ctgcagactg atgggaaact atgtccactt catcacaaat 240

cccttgtcat atcataaagt actgtgccat ggaaaatact ttgattggaa aaaatttcac 300

tttactgctt ctgcaaaggc atttggacac agaagcattg acccgagcga tggaaacacc 360

actgatacca taagcaaaac tatcatcaag accctgcagg gtgacgcctt gagctccctc 420

acggaagcca tgatgggaaa cctccagctt gtcctgagac cccaggggcc accacagccc 480

cccacaccca cctgggtgac cgaggggatg tactccttct gctaccgggt catgtttgaa 540

gctggctact tgacgctctt tggccgcgat ctcgcagggc aagatgccca aaaggcgctc 600

attctaaaca gcctggacaa cttcaagcaa tttgacaaaa tctttcccgc cctggtggct 660

ggcttcccca tccacgtgtt caagacagga cactacgccc gggagaagct gacggagggc 720

ttgagactcc agaagttcag agaaagagac cacatctcag agctggtcag atttttgaat 780

gacacattcg ccactttgga cgacacagag agagccaagt cactcctcgc agtcctttgg 840

gcatcgcaag caaacaccat tccagccact ttctggagct tgtttcagat gattagaaac 900

ccggaggcaa tgaaagcggc cactgaagaa gtaaataaaa cactagagaa tgctggtcaa 960

aaagttagct ttgaagacag tcctattcat ttgaatcaga cacagctgga caacatgccc 1020

gtgctagaca gtatcatcaa ggagtctctg agactttcca gtgcttccct caacatccgt 1080

actgctaaag aggacttcac tttgcacctc caggacggtt cctataatat ccgcaaagat 1140

gacatcatag ctctttatcc acagttaatg catttagatc cagaaatcta cccagacccg 1200

ttgactttta aatatgatcg ctatcttgat gaaaatggga agacaaagac caccttctac 1260

agtaatggac tcaagttaaa atattactac atgccctttg ggtcaggagt cactatatgt 1320

cctggaagat tattcgctgt ccaggaaatc aagcagtttt tgatcctgat gctttcctat 1380

ttcgaactgg agcttgtgga gagctgtgtc aaatgtccac ctttggacca atcccgggca 1440

ggcttgggca ttttaccacc attatatgat actgagttta gatataaatt caagcattcg 1500

tgaacatatg cttggaggcc ccctggtgct gttacaaggc tgcgggcacc atcactcacc 1560

ggtgccctgt gggcagacat gtttagtggc agtacgacgg tgcagcaggt tcccttctgc 1620

ccagcagtgc ttgcttgtga atcttaacgt tttggtgatg gtttccagat gctgtttcag 1680

actctgcaag tgaaaaaaaa aagaaactag tttctagaag cacaataatt tgttttcatt 1740

tgaataagtc tgtgagtgtt cacattgcca ggaactgaac tttattattt tcagaggaaa 1800

aagttttttt ttgcttgttt tttcccagag tatttggcaa aagttcttct ttttttgttt 1860

tcctaaggaa actgttttat ttttatataa acctcccacg gttatacaaa aggtacacat 1920

tcacgtttta gtgaaaatgc atgactttct gatcagatat ggggctcttt gggcatagat 1980

gtatattaca gaggatattt taaaggatta tatcatgcct tttaataaaa atttttttca 2040

gctttcctta tatctagtat ttatagcttt taaaatgact gtcttgatgt cttgagaaca 2100

ttaaagatgg tcttactata ttctctttat atttaattta tttttgctgg aaactctaat 2160

atctgtgtca ggtttcaatc attttaccta cacttttatt agatttcata ttaattggaa 2220

gatttttttt ccagaaaagg caggtttttt tctgatgtta ttaacatgca tccatgaaaa 2280

caatgtagct ctcatgtgat gtattttaaa attaaaattg gatgataatg accatctgaa 2340

tgttttggat atgaaactgc aaagaattca ttaaattggc attgtgtttt atttgaaaac 2400

tttttatctt taaacaagtt gtaatcaaag gaaatatagt ttaggctata ggacagtgtt 2460

cagctactgt gtacaacagt gctttagtga aatattttaa gtactggagt tatgaactgt 2520

aatactttac tgatatttct ctatgtatat attgtaaatt atatttaact ttttccttgc 2580

actacaaata ctaagatata ttgtaatatt tgctaatgtt gaaatgattc acttttcaga 2640

aataaaagtg tgaatttttg ttttaaa 2667

Claims

1.与奶牛围产期代谢疾病抗性相关的分子标记，其特征在于，其包括以下10个SNP分子标记中的任一或多个分子标记组合，它们的信息如下：

2.用于检测权利要求1所述的分子标记的引物组合。

3.权利要求2所述的引物组合在制备用于鉴定奶牛围产期代谢疾病抗性的试剂盒中的应用。

4.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合在奶牛育种、遗传改良或标记辅助选择中的应用。

5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合在奶牛育种中用于筛选对围产期代谢疾病具有抗性的奶牛、或淘汰对代谢疾病抗性低的奶牛中的应用。

6.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合在培育围产期代谢疾病抗病力强的奶牛中的应用。

7.CYP7A1基因在奶牛育种中用于筛选对围产期代谢疾病具有抗性的奶牛、或淘汰对代谢疾病抗性低的奶牛中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，针对CYP7A1基因内的SNP分子标记进行检测，若位于该基因中rs133077958位点的等位基因是A，则说明待选奶牛为对代谢疾病有抗性的奶牛；所述CYP7A1基因的DNA序列如SEQ I D NO.21所示。

9.如权利要求3-8任一所述的应用，其特征在于，所述的代谢疾病为酮病。

10.如权利要求3-8任一所述的应用，其特征在于，所述的奶牛为荷斯坦奶牛。