CN108998543A - 一种与猪红细胞数目性状相关的snp分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及一种与猪红细胞数目性状相关的SNP分子标记。该分子标记克隆自登陆号为ASGA0068286的基因，通过基因芯片技术对该基因进行分型筛选得到一种与猪红细胞数目性状相关的分子标记，该标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第101位的碱基处存在一个T/C的等位基因突变，且当SEQ ID NO：1上的第101位核苷酸为C时，则猪具有更高的红细胞数目。公开了筛选与猪红细胞数目性状相关分子标记的方法及其关联分析方法的应用。本发明为猪免疫性状尤其是红细胞数目性状的标记辅助选择提供了一个新的SNP分子标记资源。

Description

一种与猪红细胞数目性状相关的SNP分子标记

技术领域

本发明属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及一种与猪红细胞数目性状相关的SNP分子标记。本发明的分子标记可用于猪红细胞数目(RBC)性状的预测。

背景技术

随着我国经济发展步伐不断加快，农业越来越受国家重视，因此养殖业成为了很多人发家致富的重要途径。我国养猪业发展迅速，我国养殖模式逐渐转变为高效低成本的规模化养殖，散养模式逐渐被淘汰(邓奇风等，2017)。与此同时，猪病的发生率不断上升，对环境的污染日益严重，猪肉产品的质量也存在一些问题，越来越严重(章红兵等，2007)。据相关网站资料信息记载，在我国猪猪疫病死因调查统计中，传染病的概率大约占其中60％～70％，因此在养殖过程防疫措施应引起高度重视(郑志洁等，2015)。从新世纪以来，猪疫病的发病频率和种类不断增加。例如猪口蹄疫疾病给养殖业和人类健康造成了严重的危害。除了传统的流行性疾病，像猪瘟、猪丹毒、猪流行性肺炎、猪繁殖障碍疾病、蓝耳病、圆环病毒病等疾病的耐药性逐渐增加，一些新的疾病也陆续的传播到我国(郗爱华等，2015)。例如最近发生在辽宁省沈阳市沈北新区的一起生猪非洲猪瘟疫情引起了大家的很大关注，这是我国首次发生非洲猪瘟疫情。

随着国家监管力度的增加以及大家对食品安全越来越重视，猪的健康养殖刻不容缓，抗病育种已被公认为猪病综合防控的重要环节(王超等，2014)。猪的抗病育种研究具有非常重要的意义，20世纪80年代以来，随着分子生物学和基因工程技术的发展，多种基于DNA水平的多态性分子标记被广泛应用于绘制遗传连锁图谱、遗传多态性分析、定位经济性状基因或QTL中(李晓丽等，2006)。目前猪的抗病育种研究主要集中在抗病性状的候选基因鉴定与特定病(抗)原诱导的宿主基因表达(谱)研究两个方面(朱猛进等，2007)。

本研究中SNP是与猪的红细胞数性状相关，红细胞是血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介，同时还具有免疫功能。猪的红细胞数量与其抗病能力具有紧密的联系。其含有CR1、CR3、CD8、CD59、SOD酶等数目众多的免疫分子，在血循环中能够识别、粘附、浓缩、杀伤抗原、清除免疫复合物，对免疫发挥重要作用(郭峰，2002)。随着临床兽医学的快速发展，许多检测技术得到推广应用，血常规检测具有重复性好、方便快捷、高效等特点，可以通过红细胞数来判断猪的健康程度，所以筛选出与猪红细胞数显著相关的分子标记及基因对抗病育种具有重要意义。

本发明中发现的SNP与猪的红细胞数(RBC)的相关性达到了极显著水平，为猪免疫及生长性状的研究提供了新的遗传资源。

发明内容

本发明的目的在于完善家猪抗病育种分子标记，利用基因芯片技术对SNP进行分型，并使用GWAS筛选与猪红细胞数相关的SNP，为猪的抗病育种提供了新的分子标记资源和应用。

本发明的技术方案如下所述：

申请人通过基因分型技术并参阅Ensembl，得到登录号为ASGA0068286基因上下游100bp的核苷酸序列，其核苷酸序列如表SEQ ID NO:1所示。具体序列如下所述：

CTCCAAAGCCTGCATTTTCACACCTTTATTCAAAAGGGTTTTTCTCTCTCTGGAGTTCTCCAAAACAGCTGACAGCTTGTCTGGCTCTGGAGCTCTGCCTR(T/C)ACCCTCCCATGAACAATTCTCAACCCCGGACGGACACAGAACTGCCTGAGGCCCTGGAGCTGCTGGCGCTGCAGGAACCAGGAGCTGTAATCTTCGTGGG

上述序列的第101位碱基处的R为一个T101-C101的等位基因突变,该突变使SEQID NO：1序列产生了多态性。同时该突变导致红细胞数性状发生改变，且上述序列即SEQ IDNO：1所示序列上的第101位核苷酸为C时，则猪具有更高的红细胞数目。

上述序列可以作为检测猪红细胞数目性状相关SNP分子标记。

申请人提供了一种筛选猪红细胞数目性状相关SNP分子标记的方法，所述的方法包括如下步骤：

①提取猪耳组织基因组DNA，进行DNA质量检测。

②利用基因芯片技术进基因分型。

③采用基于固定模型和随机模型的方法，利用R统计环境下的MVP软件包进行全基因组关联分析(GWAS)。具体的回归模型如下：(1)固定模型y_i＝M_i1b₁+M_i2b₂+…+M_it b_t+S_ij d_j+e_i，其中y_i是对第i个个体的观察值；M_i1，M_i2，...，M_it分别是t个假设QTN的基因型；b₁，b₂，...，b_t分别是t个遗传标记的效应值；e_i是残差误差，服从正态分布，e_i～N(u_e,σ² _e)，σ² _e表示残差方差。(2)随机模型y_i＝u_i+e_i，其中y_i是对第i个个体的观察值；e_i是残差误差，服从正态分布，e_i～N(u_e,σ² _e)，σ² _e表示残差方差；u_i是第i个体的总遗传效应，并对影响表型的因素进行了主成分分析，将前三个主成分作为协变量加入模型中。

本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的对猪相关基因或基因型与猪免疫性状中红细胞数目之间的关联分析中，为猪红细胞数目性状的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记资源。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：

本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的免疫能力，与目前的PCR-RFLP、ELISA、流式细胞仪等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的登录号为ASGA0068286基因上下游100bp核苷酸序列。该片段是本发明筛选的分子标记。序列长度为201bp，该序列的101位碱基处的R存在一个T/C等位基因突变。

图1：本发明的总体技术流程示意图。

图2：是本发明克隆的ASGA0068286上下游100bp核苷酸序列和本发明分子标记的核苷酸序列。附图标记说明：在图2显示核苷酸序列的第101位碱基处存在一个T/C等位基因突变(101bp处的英文字母“R”为突变位点)。

图3：是本发明曼哈顿图。附图标记说明：黑色圆圈及箭头指向标记的为本发明筛选的分子标记，该标记位于猪第14号染色体上。

具体实施方式

实施例1：基因分型检测

(1)利用苯酚抽提法提取杜洛克×二花脸F2代群体的耳朵组织基因组DNA

1)将杜洛克×二花脸F2代猪(为公开使用的品种)群体的耳组织样在液氮中磨碎，加入等体积1×SET(1mL)，蛋白酶K(10ng/mL)至终浓度200ug/mL，再加入10％浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度为0.5％，摇匀。在55℃水浴中温育过夜消化。

2)将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中，在4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，标记相应记号。

3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25：24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温(4℃)离心机中，在11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。

4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温(4℃)冷冻离心机中，在11000rpm离心10min。

5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状DNA。

6)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右)溶解DNA。

7)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的DNA质量。

(2)SNP基因型的判定

使用Illumina公司研制的PorcineSNP60BeadChip全基因组芯片，该芯片包含超过60000个SNP位点，以步长平均每40kb有一个标记，覆盖猪的基因组。此芯片整合了多种猪的基因差异，包括杜洛克猪，长白猪，皮特兰猪和大白猪，能提供足够的SNP密度，可应用于全基因组关联分析中。

(3)质量控制

用PLINK v1.9软件(购自Shaun Purcell公司)对获得的基因型数据进行质量控制，剔除检出率低于90％的SNP，这些SNP等位基因频率小于0.03。忽略偏离哈代温伯格(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)P<10^-6的SNP标记，最终有5473个SNP被过滤，43111个SNP用于GWAS研究。

实施例2：ASGA0068286分子标记分型方法在猪免疫性状关联分析中的应用

(1)ASGA0068286分子标记分型结果与免疫性状关联分析

用于基因型与免疫性状关联检测分析所用的实验猪群是杜洛克×二花脸杂交的F2代群体。基因分型所用的DNA采集自杜洛克×二花脸杂交的F2代(说明书正文和表中所称的“杜洛克×二花脸杂交的F2代”简称“猪”)耳样组织中提取，用于测量猪红细胞数量的血液分别采自33日龄的仔猪。采用基于固定模型和随机模型的方法，未将性别作为固定效应，在利用R统计环境下的MVP软件包进行GWAS分析。(1)固定模型y_i＝M_i1b₁+M_i2b₂+…+M_it b_t+S_ijd_j+e_i，其中y_i是对第i个个体的观察值；M_i1，M_i2，...，M_it分别是t个假设QTN的基因型；b₁，b₂，...，b_t分别是t个遗传标记的效应值；e_i是残差误差，服从正态分布，_ei～N(u_e,σ² _e)，σ² _e表示残差方差。(2)随机模型y_i＝u_i+e_i，其中y_i是对第i个个体的观察值；e_i是残差误差，服从正态分布，e_i～N(u_e,σ² _e)，σ² _e表示残差方差；u_i是第i个体的总遗传效应，并对影响表型的因素进行主成分分析，将前3个主成分作为协变量加入到模型中。关联分析结果见表1。

表1 ASGA0068286多态性不同基因型对33日龄猪红细胞数性状的影响

表1说明：P<0.05为差异显著；P<0.01为差异极显著。

由表1可知，基因型为CC的个体红细胞数显著高于TC个体，并且基因型为CC的个体红细胞数显著高于基因型为TT的个体，所以C是有利于红细胞数增加的等位基因。

主要参考文献

[1]邓奇风等，我国养猪业的发展现状与面临的挑战[J].广东畜牧兽医科技,2017,42(4):5-8；

[2]章红兵,李君荣.浅谈猪的健康养殖[J].家畜生态学报,2007(06):143-145+166；

[3]郑志洁.探究猪健康养殖的重要性及存在的问题[J].中国畜牧兽医文摘,2015,31(07):49；

[4]郗爱华.猪的健康养殖[J].当代畜牧,2015(32):30-31；

[5]王超等，猪抗病育种的相关问题及研究进展[J].中国畜牧杂志,2014,50(22):67-72；

[6]李晓丽,何万领,董淑丽,邓昌彦.主要抗病候选基因在猪抗病育种中的研究进展[J].河南科技大学学报(自然科学版),2006(05):65-68+109；

[7]朱猛进,吴珍芳,赵书红.猪抗病育种研究进展及对几个认识问题的讨论[J].中国畜牧兽医,2007(04):63-67；

[8]郭峰，红细胞免疫的研究和意义[J].自然杂志,2002,24(5):268-273。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种与猪红细胞数目性状相关的SNP分子标记

<141> 2018-08-23

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(201)

<220>

<221> mutation

<222> (101)..(101)

<400> 1

ctccaaagcc tgcattttca cacctttatt caaaagggtt tttctctctc tggagttctc 60

caaaacagct gacagcttgt ctggctctgg agctctgcct caccctccca tgaacaattc 120

tcaaccccgg acggacacag aactgcctga ggccctggag ctgctggcgc tgcaggaacc 180

aggagctgta atcttcgtgg g 201

Claims (2)

1.一种影响猪红细胞数性状的分子标记，其核苷酸序列如下所示:

CTCCAAAGCCTGCATTTTCACACCTTTATTCAAAAGGGTTTTTCTCTCTCTGGAGTTCTCCAAAACAGCTGACAGCTTGTCTGGCTCTGGAGCTCTGCCTR(T/C)ACCCTCCCATGAACAATTCTCAACCCCGGACGGACACAGAACTGCCTGAGGCCCTGGAGCTGCTGGCGCTGCAGGAACCAGGAGCTGTAATCTTCGTGGG，

上述序列101位碱基处的R是T或C，导致上述序列,多态性。

2.权利要求1所述的分子标记在猪红细胞数目性状标记辅助选择中的应用。