CN111485027A

CN111485027A - 一种筛选奶牛酮病抗性分子标记的方法及其应用

Info

Publication number: CN111485027A
Application number: CN202010517904.7A
Authority: CN
Inventors: 黄金明; 白佳琛; 鞠志花; 姜强; 王金鹏; 张亚冉; 王秀革; 魏晓超; 高亚平; 杨春红; 刘文浩; 李荣岭; 高运东
Original assignee: Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science; Shandong Ox Livestock Breeding Co Ltd
Current assignee: Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science; Shandong Ox Livestock Breeding Co Ltd
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2020-06-09
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2040-06-09
Also published as: WO2021248793A1; CN111485027B

Abstract

本发明提供一种筛选奶牛酮病抗性分子标记的方法及其应用，属于分子遗传生物技术领域。本发明以健康和酮病奶牛为样本，进行芯片测序、数据填充、选择信号分析和全基因组关联分析等，筛选出影响中国荷斯坦牛酮病抗性的关键基因APOA1。在APOA1基因启动子区域筛选获得单核苷酸多态性位点g.‑572 A>G，通过关联分析、启动子活性分析等方法，得到GG基因型奶牛血液中β‑羟丁酸浓度显著低于AA基因型，GG基因型个体的启动子活性显著高于AA基因型个体。采用本发明技术方案，对APOA1基因启动子区域位点g.‑572 A>G进行基因分型，可筛选出酮病抗性强的奶牛个体，达到节省养殖成本的目的。

Description

一种筛选奶牛酮病抗性分子标记的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传生物技术领域，具体涉及一种筛选奶牛酮病抗性分子标记的方法及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

近几十年来，奶业集约化饲养程度不断加强，并一味追求高产，奶牛产后疾病日趋突出。奶牛酮病是由糖类等碳水化合物及挥发性脂肪酸供应不足引发产后奶牛功能失调的代谢性疾病，多发生于泌乳性能良好的高产奶牛(Hibbitt 1979)。酮病是奶牛场最常见和最昂贵的代谢疾病之一，患病率大约为30％-40％(Zhang and Ametaj,2017)。患有酮病的奶牛其产奶量、生殖性能和免疫能力降低，罹患其他围产期疾病的风险也更高(McArt etal.,2013)。Duffield指出一例酮病牛的综合各项损失在50到100美元之间(Duffield,2000)。酮病的特征是奶牛乳、尿、血液中的酮体含量增高，临床上乙酰乙酸、β-羟丁酸(BHBA)、丙酮这三种物质总称为酮体。β-羟丁酸是诊断奶牛酮病的最常见酮体(Oetzel,2004)。血浆β-羟丁酸浓度≥1.2mmol/L是判断奶牛是否患酮病的金标准(McArt et al.,2011)。

奶牛对酮病具有抗性，且个体间存在较大差异。发明人发现，酮病抗性的遗传力低，约为0.02-0.16，若依赖表型的常规育种方法进行选择，难度极大，而分子育种策略对于低遗传力性状更具优势，可以很好地解决这个问题(Koeck et al.,2012；Koeck et al.,2014)。国外研究者也将酮病抗性作为奶牛育种的热点性状，并开始投入关注(Kroezen etal.,2018；Parker Gaddis et al.,2018)。因此，进一步挖掘影响奶牛酮病抗性形成的功能基因和标记并阐明其分子调控机制，对于高酮病抗性牛的分子育种具有重要意义和价值。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种筛选牛酮病抗性分子标记的方法及其应用，本发明针对中国荷斯坦奶牛酮病发生过程的遗传特性，从基因组进化和选择以及疾病易感性角度考虑，采用牛150K基因芯片对患酮病和健康中国荷斯坦奶牛血液样本进行测序，同时整合Fst、XPEHH、XPCLR三种基因组选择信号分析方法以及GEMMA、PLINK全基因组关联分析方法，成功筛选出奶牛酮病抗性基因及其分子标记，并建立相应检测方法，因此具有良好的实际应用之价值。

为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种筛选奶牛酮病抗性分子标记的方法，所述方法至少包括：

基于SNP芯片检测分析健康和患酮病奶牛DNA样品；

基于Fst、XPEHH和XPCLR基因组选择信号分析方法和GEMMA、PLINK全基因组关联分析方法进行分析；筛选受到显著正选择和与酮病显著相关的单核苷酸多态SNPs及候选基因，整合基因功能注释筛选酮病抗性的SNP分子标记。

进一步的，基于上述方法，本发明筛选鉴定出APOA1基因为奶牛酮病抗性的关键基因，因此可作为奶牛酮病抗性分子标记；更进一步的，奶牛酮病抗性分子标记还包括位于该基因上1个单核苷酸多态位点：g.-572A>G。经试验证明，APOA1基因GG型奶牛血液中β-羟丁酸浓度显著低于AA基因型。并且荧光素酶活性检测，APOA1基因GG型的启动子活性显著高于AA型个体的启动子活性。因此APAO1基因核心启动子多态性位点g.-572A>G可实现对牛的酮病抗性进行评估。

其中，所述奶牛为中国荷斯坦奶牛。

本发明的第二个方面，提供上述方法在如下1)-9)中任一种中的应用：

1)鉴定或辅助鉴定待测奶牛的酮病抗性；

2)制备鉴定或辅助鉴定待测奶牛的酮病抗性的产品；

3)鉴定或辅助鉴定待测奶牛为酮病抗性奶牛；

4)制备鉴定或辅助鉴定待测奶牛为酮病抗性奶牛的产品；

5)奶牛选育；

6)选育奶牛酮病抗性品种；

7)制备选育奶牛酮病抗性品种的产品；

8)鉴定或辅助鉴定待测奶牛的酮病抗性性状；

9)制备鉴定或辅助鉴定奶牛的酮病抗性性状的产品。

其中，所述奶牛为中国荷斯坦奶牛。

本发明的又一具体实施方式中，所述应用方式包括：

提取不同奶牛个体的血液DNA；

鉴定带有酮病抗性分子标记的个体。

所述分子标记为g.-572A>G。

与现有技术相比，上述技术方案的有益效果是：

1)上述技术方案的检测方法具有独创性，针对牛酮病发生过程的遗传特性，从基因组进化和选择以及疾病易感性角度，以患酮病牛群组作为参考组，健康牛群组作为实验组，整合多种基因组正向选择信号分析技术，分别以奶牛患酮病或健康二元性状为表型以及以奶牛血液中β-羟丁酸含量作为表型，采用全基因组关联分析方法和策略，高效准确筛选与牛酮病发生相关的关键基因和分子标记，方法设计合理，依据关键基因和标记设计的检测方法，具有准确性高、应用操作简便的特点；

2)上述技术方案提供了APOA1基因中与酮病抗性相关的一个单核苷酸多态位点，通过检测所述位点的基因型，可以方便的对酮病抗性进行评价，为奶牛的酮病抗性提供有效的评价依据，为家畜养殖企业节省经济成本。

3)基于上述基因及位点表达差异的确认，用于检测APOA1基因的试剂、用于检测APOA1基因单核苷酸多态位点的试剂及引物可用于制备奶牛酮病抗性检测的试剂盒，为奶牛酮病抗性提供使用便利的产品，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为本发明实施例1中筛选奶牛酮病抗性分子标记的方法流程图；

图2为本发明实施例1中采用XPCLR正向选择信号分析和PLINK全基因组关联分析筛选到奶牛酮病抗性分子标记APOA1基因；其中，A为XPCLR正向选择信号分析；B为PLINK全基因组关联分析；

图3为本发明实施例2中APOA1基因及其基因组结构示意图，以及SNP g.-572A>G在基因组中位置信息。

图4为本发明实施例3中APOA1基因中不同基因型的启动子的活性。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，发明人在研究中发现牛虽然具有相似的遗传背景，其血液中β-羟基丁酸含量的表型以及患酮病与否却存在显著的差异，推测其性状差异可能与基因的单核苷酸多态性相关。

本发明的设计思路为：首先，通过基因芯片测序以及全基因关联分析等方法，筛选出奶牛酮病抗性候选基因。其次，对酮病抗性候选基因APOA1进行定量分析，在核心启动子区鉴定出g.-572A>G位点。再次，该位点GG基因型奶牛血液中β-羟丁酸浓度显著低于AA基因型，并且GG型的启动子荧光素酶活性显著高于AA型个体的启动子活性，启示了APOA1基因多态位点g.-572A>G可作为评价奶牛酮病抗性的标志物。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种筛选奶牛酮病抗性基因的方法，所述方法至少包括：

基于SNP芯片检测分析健康奶牛和患酮病奶牛DNA样品；

基于Fst、XPCLR和XPEHH基因组选择信号分析方法和GEMMA、PLINK全基因组关联分析方法进行分析；筛选受到显著正选择和与酮病显著相关的单核苷酸多态SNPs以及候选基因，整合基因功能注释筛选酮病抗性的SNP分子标记。

其中，所述奶牛为中国荷斯坦奶牛。

本发明的又一具体实施方式中，所述筛选奶牛酮病抗性基因方法包括：

S1.健康奶牛和患酮病奶牛样品的采集及DNA提取；

S2.SNP芯片检测分析；

S3.基因型填充；

S4.Fst、XPCLR、XPEHH基因组选择信号分析；

S5.GEMMA、PLINK全基因组关联分析；

S6.基于候选基因的筛选策略筛选候选基因；

S7.鉴定位于候选基因内受选择的SNPs；

其中，步骤S4与S5没有先后顺序之分。

本发明的又一具体实施方式中，步骤S1具体方法包括：

S1.1对奶牛血液中β-羟丁酸浓度进行测定；

S1.2采集健康奶牛和患酮病奶牛的血液，提取血液组织中的DNA。

本发明的又一具体实施方式中，步骤S2具体方法包括：

S2.1使用SNP芯片对DNA样品进行分析，并进行基因分型；

S2.2对SNP数据进行过滤，对剩余符合要求的SNP做进一步分析；

S2.3为每条染色体构建单倍型；

S2.4获取数据库中50K基因芯片数据；

S2.5以150K基因芯片为参考，对50K基因芯片数据进行基因型填充。

本发明的又一具体实施方式中，步骤S3具体方法包括：

S3.1选择信号Fst和hapFLK基因组扫描和局部进化树的构建：对奶牛品种获得的所有数据进行Fst分析；

S3.2估算患酮病奶牛和健康奶牛品种之间的XPCLR值；

S3.3估算患酮病奶牛和健康奶牛品种之间的XPEHH值。

本发明的又一具体实施方式中，步骤S4具体方法包括：

S4.1采用GEMMA单变量线性混合模型，以奶牛患酮病或健康二元性状为表型进行全基因组关联分析；

S4.2以奶牛血液中β-羟丁酸含量作为表型，利用多元回归模型，以奶牛的胎次、年龄为协变量进行全基因组关联分析；

S4.3基于Benjamini和Hochberg校正方法计算显著性的P值；

S4.4生成GWAS分析的曼哈顿图；

S4.5 SNP注释通过Bedtools在UCSC数据库中检索。

本发明的又一具体实施方式中，步骤S5具体方法包括：

S5.1选择具有Fst、XPCLR或XPEHH中有强选择信号和最显著P值的SNPs；

S5.2使用UCSC基因组浏览器检索由SNP定义的每个选定区域内的带注释的Refseq基因；

S5.3选用每种分析方法所得出的信号值排名前1％的SNP标记定位受选择的SNPs，将基因限定在每个显著SNP上下游500K bp以内，定位受正选择的基因；筛选出同时在至少有2种分析方法同时鉴定到的基因，并且至少在一种分析方法中，其选择信号值或者显著性检验的P值排名前10，作为重要候选基因；

S5.4应用DVAID对筛选到的候选基因进行功能分析，并应用Benjamini-Hochberg进行多重校正，分析基因富集在哪些特定的分子功能以及细胞成分或者生物学通路中。

本发明的又一具体实施方式中，步骤S6具体方法包括：

S6.1确定候选基因，鉴定出位于候选基因受选择的SNPs；

S6.2对鉴定出的SNPs与奶牛酮病做相关性分析。

本发明的又一具体实施方式中，所述奶牛酮病抗性候选基因包括APOA1；SNP位点为g.-572A>G。

其中，所述位点命名规则如下：将APOA1基因(NCBI:AC_000172.1)第一个ATG(翻译起始密码子)的A碱基命名为+1，下游方向依次为+2、+3……，上游方向依次为-1、-2……，所述位点分别位于APOA1基因上游方向-572处。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法在如下1)-9)中任一种中的应用：

1)鉴定或辅助鉴定待测奶牛的酮病抗性；

2)制备鉴定或辅助鉴定待测奶牛的酮病抗性的产品；

3)鉴定或辅助鉴定待测奶牛为酮病抗性奶牛；

4)制备鉴定或辅助鉴定待测奶牛为酮病抗性奶牛的产品；

5)奶牛选育；

6)选育奶牛酮病抗性品种；

7)制备选育奶牛酮病抗性品种的产品；

8)鉴定或辅助鉴定待测奶牛的酮病抗性性状；

9)制备鉴定或辅助鉴定奶牛的酮病抗性性状的产品。

其中，所述奶牛为中国荷斯坦奶牛。

本发明的又一具体实施方式中，所述应用方式包括：

提取不同奶牛个体的血液DNA；

鉴定带有酮病抗性分子标记的个体。

所述分子标记为g.-572A>G；

扩增含分子标记基因片段的引物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例1牛酮病抗性候选基因的筛选

1.中国荷斯坦奶牛血液样品的采集

对山东省DHI数据库中的牛进行前期筛选，选取了DHI信息完备，95头患酮病的牛和95头健康牛，共计190头，这190头牛的年龄、胎次分布均匀，并且在过去的泌乳期7到14天内，至少有两个泌乳期报告患有酮病或者健康。

利用牛的尾椎静脉采血的方式，利用真空负压抗凝原理将牛的血液采集到5ml的真空采血管中。在牛产奶初期7到14天内，采用血酮仪对190头牛的血液中β-羟丁酸浓度进行测定，吸取产奶初期奶牛一滴血液滴到与血酮仪配套的芯片试纸条上，插入血酮仪中，等待仪器分析计算10秒，读取血液中β-羟丁酸的浓度并做记录，测定实验重复两次。

2.采用Illumina BovineHD 150KSNP芯片进行基因分型

将190头牛血液DNA样品质量检测合格、滴定完成的血卡送到基因芯片测序公司，利用美国Illumina Bovine 150K基因芯片对190头牛的DNA进行基因分型和数据组装，以获得基因型数据。采用Plink 1.9软件对190头牛的150K基因芯片的数据进行质量控制，为保证填充参考基因芯片的基因型数据无缺失且分相，将基因型缺失率大于0的样本以及样本缺失率大于0的剔除掉。

3.基因型填充

从NAGRP数据库下载Huang等人(2019)的包含2488头牛和50K SNP的与酮病有关的基因芯片数据。采用Fimpute和Beagle软件两步基因型填充法，以190头牛的150K基因芯片为参考，对NAGRP数据库中的2488头牛的50K基因芯片进行基因型填充。

4.Fst、XPEHH、XPCLR基因组选择信号分析

将酮病组作为参考组，健康组作为实验组，即正向选择组。采用适用于疾病-对照正向选择信号分析的三种方法：Fst、XPEHH、XPCLR进行选择信号分析。采用Vcftool软件进行Fst的选择信号分析，计算Fst值；采用Selscan软件进行XPEHH正向选择信号分析；采用XPCLR软件进行XPCLR选择信号分析。

5.GEMMA、PLINK全基因组关联分析

以奶牛患酮病或健康二元性状为表型，利用GEMMA软件的一般线性模型，对基因型填充后2678头牛的115787个标记进行了全基因组关联分析；以奶牛血液中β-羟丁酸含量作为表型，采用Plink软件的多元回归模型对190头牛的140668个标记进行全基因组关联分析。

6.受正选择遗传变异和候选基因的筛选

利用Fst、XPCLR、XPEHH选择信号分析方法以及GEMMA、PLINK全基因组关联分析方法筛选和酮病相关的SNPs，以选择信号top 1％为阈值，P＜0.05为全基因组关联分析的阈值，共筛选到和酮病抗性相关的候选基因98个，其中包括APOA1基因。

实施例2牛酮病抗性基因APOA1中SNP的鉴定

1.APOA1基因在健康和酮病奶牛中的表达分析

利用荧光定量PCR，对健康和酮病奶牛血液样本进行定量检测，结果表明APOA1基因在患酮病奶牛中的表达水平显著高于在健康奶牛中的水平(P＜0.05)。

2.牛酮病抗性基因APOA1的SNP测序鉴定

(1)选择健康牛95头，酮病牛95头，提取血液DNA。

(2)对CPT1A基因5'侧翼区多态位点进行筛选。设计一对扩增引物:

F:5‘-CTCTGCTGCCTTTGTGAAG-3’(SEQ ID NO.1)；

R:5‘-GCACCCTCTACTCACTCCAT-3’(SEQ ID NO.2)。

随后进行PCR扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。对扩增产物进行直接测序，发现APOA1在-572位点检测到一个SNP(g.-572A>G)。

(3)采用SAS 9.4的最小二乘模型结合一般线性模型分析APOA1基因的SNP g.-572A>G与奶牛血液中β-羟丁酸含量的相关性，GG基因型奶牛血液中β-羟丁酸浓度显著低于AA基因型。

实施例3APOA1基因的不同基因型启动子活性的检测

为了进一步研究该启动子区域不同基因型个体的启动子活性，扩增APOA1基因长度为647bp的启动子片段，选取基因型为GG型和AA型的启动子片段，构建pGL3-basic-GG型和pGL3-basic-AA型的启动子载体并转染HepG2细胞，测定其荧光素酶活性。结果表明，APOA1基因GG型的启动子荧光素酶活性活性显著高于AA型个体的启动子活性(P＜0.05)。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院奶牛研究中心；山东奥克斯畜牧种业有限公司

<120> 一种筛选奶牛酮病抗性分子标记的方法及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctctgctgcc tttgtgaag 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaccctcta ctcactccat 20

Claims

1.一种筛选奶牛酮病抗性基因的方法，其特征在于，所述方法至少包括：

基于SNP芯片检测分析健康奶牛和患酮病奶牛DNA样品；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

S1.健康奶牛和患酮病奶牛样品的采集及DNA提取；

S2.SNP芯片检测分析；

S3.基因型填充；

S4.Fst、XPCLR、XPEHH基因组选择信号分析；

S5.GEMMA、PLINK全基因组关联分析；

S6.基于候选基因的筛选策略筛选候选基因；

S7.鉴定位于候选基因内受选择的SNPs；

其中，步骤S4与S5没有先后顺序之分。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1具体方法包括：

S1.1对奶牛血液中β-羟丁酸浓度进行测定；

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2具体方法包括：

S2.1使用SNP芯片对DNA样品进行分析，并进行基因分型；

S2.2对SNP数据进行过滤，对剩余符合要求的SNP做进一步分析；

S2.3为每条染色体构建单倍型；

S2.4获取数据库中50K基因芯片数据；

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S3具体方法包括：

S3.2估算患酮病奶牛和健康奶牛品种之间的XPCLR值；

S3.3估算患酮病奶牛和健康奶牛品种之间的XPEHH值。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S4具体方法包括：

S4.3基于Benjamini和Hochberg校正方法计算显著性的P值；

S4.4生成GWAS分析的曼哈顿图；

S4.5 SNP注释通过Bedtools在UCSC数据库中检索。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S5具体方法包括：

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S6具体方法包括：

S6.1确定候选基因，鉴定出位于候选基因受选择的SNPs；

S6.2对鉴定出的SNPs与奶牛酮病做相关性分析。

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述奶牛酮病抗性候选基因包括APOA1；SNP位点为g.-572A>G。

10.权利要求1-9任一项所述方法在如下1)-9)中任一种中的应用：

1)鉴定或辅助鉴定待测奶牛的酮病抗性；

2)制备鉴定或辅助鉴定待测奶牛的酮病抗性的产品；

3)鉴定或辅助鉴定待测奶牛为酮病抗性奶牛；

4)制备鉴定或辅助鉴定待测奶牛为酮病抗性奶牛的产品；

5)奶牛选育；

6)选育奶牛酮病抗性品种；

7)制备选育奶牛酮病抗性品种的产品；

8)鉴定或辅助鉴定待测奶牛的酮病抗性性状；

9)制备鉴定或辅助鉴定奶牛的酮病抗性性状的产品；

优选的，所述应用方式包括：

提取不同奶牛个体的血液DNA；

鉴定带有酮病抗性分子标记的个体；

进一步优选的，所述分子标记为g.-572A>G；

扩增含分子标记基因片段的引物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。