CN109680078A

CN109680078A - 利用snp位点选择信号梯度变化指数评估经济性状候选基因的方法

Info

Publication number: CN109680078A
Application number: CN201910135038.2A
Authority: CN
Inventors: 马云龙; 谢胜松; 南九红; 张赛仙; 张凯丽; 朱猛进; 余梅; 李新云; 赵书红
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2019-04-26

Abstract

本发明属于分子标记鉴定技术领域，具体涉及一种利用SNP分子标记数据定位畜禽重要经济性状基因组关联区域，并用于评估畜禽品种经济性状候选基因的方法。所述的方法针对120个以上具有代表性样本数目的群体，围绕具有连续变异的经济性状，通过人工制造群体表型梯度变化，并利用群体间选择信号检测方法，再计算SNP位点的梯度变化指数来评估经济性状的功能候选基因。该方法缩减了样本基因分型与表型测定成本，相比于传统的选择信号分析，能够具体解释目标表型的潜在候选区域，提高了选择信号分析的针对性，解决了传统选择信号分析无法直接与具体表型关联的技术问题。

Description

利用SNP位点选择信号梯度变化指数评估经济性状候选基因的方法

技术领域

本发明属于畜禽分子标记鉴定技术领域，具体涉及一种利用SNP分子标记数据定位畜禽重要经济性状关联遗传标记，用于评估畜禽品种经济性状候选基因的方法。

背景技术

畜禽经济性状遗传改良的主要任务是对目标品种中的遗传变异进行有目的选择和重新组合，从而提升重要经济性状的生产表现的技术。长期以来，为获得最大的经济效益，育种工作者对大量的畜禽品种施加了高强度的人工选择作用，并由此改变了优势等位基因在群体中的频率分布，在基因组上留下了相关的选择信号“痕迹”。针对具体已知改良的重要经济性状，通过大规模SNP分型技术，如重测序、基因芯片，可以鉴定出育种过程中受选择的位点，这些分子标记位点能为进一步的品种改良提供指导。但是，如何针对某一具体经济性状，通过选择信号方法定位性状人工选择过程中的关键突变位点，并将这些受选择位点用于指导畜禽遗传改良，目前尚未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用SNP位点选择信号梯度变化指数评估畜禽品种经济性状候选基因的方法，该方法是在鉴定重要经济性状遗传改良过程中基因组受选择区段的基础上，结合极端群体表型信息，通过计算每个位点的选择信号梯度变化指数来鉴定目标性状功能候选基因的方法，还可根据梯度变化指数变化的幅度评估畜禽品种育种潜力，可有效提高品种遗传改良的的目的性与效率。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

利用SNP位点选择信号梯度变化指数评估畜禽经济性状候选基因的方法，包括以下步骤：

(1)选取同一品种的不少于120个个体作为样本，采集DNA，去除缺失值大于10％的位点与个体，去除最小等位基因频率小于0.05的位点，获得至少2万个多态性位点的基因型数据；

(2)对步骤(1)获得的预处理数据进行表型分析，根据表型差异划分3对梯度亚群，包括最高差异梯度对、中等差异梯度对、普通差异梯度对群体，具体为：将目标表型值进行秩排序，选取前N₁个样本与后N₁个样本组成最高差异梯度对，前N₂个样本与后N₂个样本组成中等差异梯度对，前N₃个样本与后N₃个样本组成普通差异梯度对，N₁、N₂、N₃呈等差数列递增，公差≥20，N₁≥20；

(3)对步骤(2)获得的不同梯度对群体，分别使用基于位点频率谱差异与长范围单倍型纯合的群体遗传学方法鉴定梯度对间有差异的受选择区段，并根据3组梯度对之间的全部检验统计量计算SNP位点选择信号梯度变化指数，第1指数＝最高差异梯度对计算统计量–中等差异梯度对计算统计量，第2指数＝普通差异梯度对计算统计量–中等差异梯度对计算统计量；

(4)根据步骤(3)计算的SNP位点选择信号梯度变化指数与选择信号检验统计量，将基于各差异梯度对计算的选择信号统计量经过秩排队位于前1％统计量对应的位点，且梯度变化指数第一指数为正值、第二指数为负值的位点，定义为显著位点，即性状特异的选择信号关联位点；

(5)根据步骤(4)计算获得的显著位点，再依据基因组连锁不平衡衰减程度，确定基因组候选区域范围，利用开源数据库(比如NCBI、Ensembl数据库)抓取目标性状潜在候选基因。

进一步地，步骤(3)中鉴定受选择区段的群体遗传学方法包括但不限于F_ST(Weirand Cockerham 1984)、XPCLR(Chen,Patterson et al.2010)和XPEHH(Sabeti,Varilly etal.2007)。

本发明的实施例以猪背膘性状为例，说明了利用SNP位点选择信号梯度变化指数评估目标性状候选基因的方法，该方法适用于畜禽受微效多基因控制的数量性状，例如奶牛的产奶量性状，蛋鸡的产蛋量，猪的背膘厚等。

利用SNP位点选择信号梯度变化指数评估经济性状候选基因的方法的应用，包括但不限于以下几种用途：

1.标记辅助选择：对于现有品种目标性状的遗传改良，可通过选择经定位显著的梯度差异位点，选择优势等位基因，从而提高表型表现。

2.群体遗传改良空间的评估：群体中目标性状，显著的梯度差异位点的数目，可以直接作为衡量群体该性状遗传改良潜在的指标。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明针对畜禽重要经济性状，较目前主流的全基因组关联分析的方法能够有效地降低实验样本数目，大幅度缩减研究成本。考虑检验效力，针对复杂性状的全基因组关联分析方法通常需要1000以上的样本数目；而本发明基于选择信号方法，进行受选择位点梯度变化指数计算，继而进行目标性状关联基因的定位，仅需要几百样本规模；有效缩减了样本基因分型与表型测定成本。

(2)本发明充分利用选择信号方法中群体分化的思想，针对受选择性状人工制造表型梯度变化，通过选择信号进行目标性状功能候选基因的定位；相比于传统的选择信号分析，能够具体解释目标表型的潜在候选区域，提高了选择信号分析的针对性，解决了传统选择信号分析无法直接与具体表型关联的技术问题。

附图说明

图1：大白猪品种背膘性状极端梯度群体连锁不平衡衰减图。图注：High3/Low3代表最高差异梯度对，High2/Low2代表中等差异梯度对，High1/Low1代表普通差异梯度对。

图2：大白猪品种背膘性状梯度选择位点的分布。图注：具有颜色的标记的为本发明筛选的与背膘厚度相关的分子标记，红色点代表最高差异梯度对显著的计算统计量，绿色点代表中等差异梯度对显著的计算统计量，黑色点代表普通差异梯度对显著的计算统计量；其中XPEHH方法具有选择指示作用，L代表背膘厚度低的亚群，H代表背膘厚度高的亚群。

具体实施方式

以下实施例以大白猪背膘性状为例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：基因分型检测

(1)利用苯酚抽提法提取233头大白猪的耳朵组织DNA，全部猪只在相同条件下，饲养于华中农业大学种猪测定中心。

a)将大白猪群体的耳样组织在液氮中磨碎，加入等体积1×SET(1mL)，蛋白酶K(10ng/mL)至终浓度200ug/mL，再加入10％浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度为0.5％，摇匀。在55℃水浴中温育过夜消化。

b)将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中，在4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，标记相应记号。

c)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25：24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温(4℃)离心机中，在11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。

d)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温(4℃)冷冻离心机中，在11000rpm离心10min。

e)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状DNA。

f)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右)溶解DNA。

g)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的DNA质量。

(2)SNP基因型的判定使用Illumina公司研制PorcineSNP60BeadChip全基因组芯片，该芯片包含超过60000个SNP位点，以步长平均约每50kb有一个标记，覆盖猪的基因组。

(3)质量控制：去除缺失值大于10％的位点与个体，去除最小等位基因频率小于0.05的位点。

实施例2：计算大白猪背膘性状SNP位点选择信号梯度变化指数

根据实施例1所述方法共获得了37,061个高质量的SNP位点。此外，全部大白猪记录肩部最厚处背膘厚度等6个背膘性状，获得背膘性状表型数据。

本实施例以大白猪肩部最厚处背膘厚性状SNP位点选择信号梯度变化指数为例，对本发明所述方法进行说明：

(1)基于大白猪基因芯片数据，根据不同背膘表型划分成最大差异梯度对、中等差异梯度对、普通差异梯度对群体。根据目标表型值从大到小排队后，最高差异梯度对被定义为前N₁个样本与后N₁个样本组成的一对(2个)亚群，中等差异梯度对为前N₂个样本与后N₂个样本组成的群体对，普通差异梯度对为前N₃个样本与后N₃个样本组成的群体对，且N₁、N₂、N₃呈等差数列递增，公差≥20，N₁≥20。

以本实施例中实验数据为例，按照背膘厚度表型值对上述233个个体进行秩排序，选取背膘最厚的116个个体个与背膘最薄的116个个体形成普通差梯度对；在普通梯度对的基础上，在背膘厚的116个个体中选取背膘更厚的76个个体，在背膘薄的116个个体中选取背膘更薄的76个个体，形成中等差异梯度对；再在中等差异梯度对的基础上，在背膘更厚的76个个体中选取背膘更厚的36个个体，在背膘更薄的76个个体中选取背膘更薄的36个个体，形成最大差异梯度对。在本实施例中根据表型变化划分梯度对，相邻梯度对的样本数目差值是40，即公差为40。同时，各亚群连锁不平衡分析表明，人工制造表型梯度差异群体对各群体基因组结构特征并无显著影响(图1)。

(2)在步骤(1)的基础上，对3组梯度对群体分别使用F_ST与XPEHH方法计算统计量评估群体位点分化程度。

对于F_ST方法，其基本思想为，由于选择作用，不同群体基因组上同一等位基因频率存在的差异程度将会大于两个群体处于中性条件下的期望值，这种群体的分化程度可以通过F_ST统计量进行量化计算。目前典型的代表有：Cockerham et al.’s F_ST(Weir andCockerham 1984),Akey et al.’s F_ST(Akey,Zhang et al.2002)和Gianola et al.’s F_ST(Gianola,Simianer et al.2010)等。本实施例使用经典的Cockerham et al.’s F_ST方法进行计算，基本公式如下：

其中s是群体数目，p_Ai是第i个群体等位基因A的频率，n_i是第i个群体的样本数目。F_ST统计量在0-1之间，0代表两个群体不存在分化情况，1代表群体处于完全分化的状态。

对于XPEHH方法，该方法基于EHH方法扩展单倍型纯合的思想，并引入了群体比较的策略，基本计算公式如下：

其中I_A是A群体EHH关于遗传距离的积分，I_B是B群体EHH关于遗传距离的积分，通常A为实验群体，B为参考群体。c_t代表群体核心单倍型t的总数，e_ti代表以核心单倍型t为基础向两端扩展形成的第i个扩展单倍型在群体中的总数，s是基于核心单倍型t构成的所有扩展的所有单倍型的总数。XPEHH统计量的正负表示了选择发生的群体，正值表明选择发生在实验群体中，负值表明选择发生在参考群体中。

(3)在步骤(2)的基础上，计算获得的F_ST统计量首先进行秩排序，其中统计量位于每个梯度对前1％的值定义为选择信号显著位点。计算上述显著选择信号位点在3组梯度对中的SNP位点选择信号梯度变化指数。其中指数定义为在一个群体内某一具体受选择位点的群体分化离差对，表示为第1指数、第2指数。第1指数＝最高差异梯度对计算统计量–中等差异梯度对计算统计量，第2指数＝普通差异梯度对计算统计量–中等差异梯度对计算统计量，呈现统计量大小梯度递增，即计算选择位点梯度变化指数第1指数为正值、第2指数为负值的位点被定义为目标性状关联位点，具备选择潜力。基于F_ST方法共检测到94个符合上述条件的SNP分子标记位点(表1，图2)，占全部使用分子标记的0.25％。

表1：肩部最厚处背膘厚极端差异群体F_ST统计量

(4)在步骤(2)的基础上，在3组极端表型差异梯度对中分别计算XPEHH统计量，为检验3组表型差异梯度群体在统计量大小上的差异，各组统计量的计算无需正态化。鉴于XPEHH统计量正负值能够反映选择发生的方向，本研究中，XPEHH正值代表选择发生在背膘薄的群体中，XPEHH负值代表选择发生在背膘厚的群体中。因此，分别对3组极端表型差异对中计算获得的正负统计量进行秩排序，统计量位于前1％的值定义为选择信号显著位点。在上述显著选择信号位点的基础上，在3组梯度对中呈现统计量正值大小梯度递增(或负值递减)，即计算选择位点梯度变化指数第1指数与第2指数为正负值相反的位点被定义为目标性状关联位点，具备选择潜力。基于XPEHH方法共检测到126个符合上述条件的SNP分子标记位点(表2，图2)，占所有使用分子标记的0.34％。

表2：肩部最厚处背膘厚XPEHH统计量

(5)重复步骤(1)、(2)、(3)、(4)，完成全部6个背膘性状的相关统计量的计算，性状包括：肩部最厚处背膘厚，第6-7胸椎间背膘厚，第十肋骨处背膘厚，胸腰椎结合处背膘厚，腰荐椎结合处背膘厚，肩部最厚处、胸腰椎结合处与腰荐椎结合处三点平均背膘厚。基于显著的SNP位点选择信号梯度变化指数，确定全部背膘性状相关SNP分子位点。其中，同时被F_ST与XPEHH检测到的呈现梯度变化的选择信号显著位点，被认定为极其可靠的目标性状关联位点。同时，使用plink软件(Purcell,Neale et al.2007)计算各种梯度表型差异群体中连锁不平衡衰减程度(图1)，确定背膘性状相关SNP分子标记位点左右两侧200kb的有效连锁不平衡辐射区间，在大白猪中具备选择潜力的基因组功能区域有13个，大约占全基因组总长度的0.61％(表3)。

表3：基于梯度指数鉴定的选择信号作用区域

(6)通过生物信息学手段，利用Ensemble开源数据库信息，提取全部的潜在功能基因；通过基因直系同源的思想，利用MGI数据库(Dickinson,Flenniken et al.2016)，在小鼠表型数据库中进一步筛选背膘性状功能候选基因，部分具有功能报道的基因如表4所示，这些性状特异选择信号区域发现的具有明确功能报道的基因，充分反应了利用受选择基因位点的梯度变化指数评估经济性状候选基因方法的可靠性。

表4：大白猪背膘性状功能候选基因

例如，根据梯度选择指数，1号染色体270659255-271411666bp的基因组区域被判定为肩部最厚处背膘厚的潜在关联区域，且根据XPEHH统计量的指向性发现该区域在背膘薄的群体中受到选择作用。在该区域富集了QRFP与ABL1两个重要的功能候选基因，基于鼠表型数据库生物信息挖掘发现，QRFP基因涉及脂肪表型，并和焦虑性反应相关联(Primeaux,Barnes et al.2013)；ABL1基因和肝脏(细胞)形态学异常相关。同样，2号染色体119980473-120922605bp的基因组区域也被判定为肩部最厚处背膘厚的潜在关联区域，且该区域也在背膘薄的群体中受到选择作用。基于小鼠数据库信息发现，该区域富集的SEMA6A基因与鼠的前脑形态学异常密切相关。有全基因组关联分析研究表明：大白猪的背膘厚性状关联基因显著富集到神经系统发育的生物学过程上(Fontanesi,Schiavo etal.2012)。此外，14号染色体98219317-98841746bp的基因组区域，被判定与第6-7胸椎间背膘厚相关，且该区域也在背膘薄的群体中受到选择作用。在猪上，该区域附近发现一个名为ENSSSCG00000010432的基因，通过直系同源分析，该基因在鼠上的同源基因为ASAH2，该基因的功能与脂质水平异常相关(Kono,Dreier et al.2006)。

除了在背膘选薄的群体里发现梯度选择指数揭示的性状特异的基因组区域外，13号染色体173585408-176112123bp的基因组区域，被判定与三点平均背膘厚性状相关，且根据XPEHH统计量的指向性发现该区域在背膘厚的群体中受到选择作用。在该区域，GBE1基因和ROBO1基因在猪与鼠中是直系同源关系。其中，GBE1基因在鼠的功能研究中发现与脉管系统拥堵，肝脏/胆道系统表型紧密相关；ROBO1基因则与鼠的消化/食物表型相关联。同样，17号染色体21239488-25085047bp的基因组区域，被判定与第6-7胸椎间背膘厚性状相关，且反应背膘被选择的方向为背膘选厚的方向。在该区域有一个与小鼠Macrod2基因直系同源的基因ENSSSCG00000030112，而Macrod2基因与鼠快速循环葡萄糖水平增加的表型过程相关。上述结果都有效地反应了利用受选择基因位点的梯度变化指数评估经济性状候选基因方法的可靠性。

上述实施例以背膘性状为例说明了通过利用受选择SNP位点的梯度变化指数评估经济性状候选基因的方法。该方法的应用不限于某一猪品种，对于所有二倍体生物受微效多基因控制的数量性状均具有普遍适用性，例如奶牛的产奶量性状，蛋鸡的产蛋量，方法的实施与与上述实施例一致。

主要参考文献：

Akey,J.M.,G.Zhang,et al.(2002)."Interrogating a high-density SNP mapfor signatures of natural selection."Genome Research 12(12):1805-1814.

Chen,H.,N.Patterson,et al.(2010)."Population differentiation as atest for selective sweeps."Genome Research 20(3):393-402.

Dickinson,M.E.,A.M.Flenniken,et al.(2016)."High-throughput discoveryof novel developmental phenotypes."Nature 537(7621):508-+.

Fontanesi,L.,G.Schiavo,et al.(2012)."A genome wide association studyfor backfat thickness in Italian Large White pigs highlights new regionsaffecting fat deposition including neuronal genes."Bmc Genomics 13.

Gianola,D.,H.Simianer,et al.(2010)."A two-step method for detectingselection signatures using genetic markers."Genetics Research 92(2):141-155.

Kono,M.,J.L.Dreier,et al.(2006)."Neutral ceramidase encoded by theAsah2 gene is essential for the intestinal degradation of sphingolipids."Journal of Biological Chemistry 281(11):7324-7331.

Primeaux,S.D.,M.J.Barnes,et al.(2013)."Hypothalamic QRFP:Regulationof Food Intake and Fat Selection."Hormone and Metabolic Research 45(13):967-974.

Purcell,S.,B.Neale,et al.(2007)."PLINK:A tool set for whole-genomeassociation and population-based linkage analyses."American Journal of Human Genetics 81(3):559-575.

Sabeti,P.C.,P.Varilly,et al.(2007)."Genome-wide detection andcharacterization of positive selection in human populations."Nature 449(7164):913-U912.

Weir,B.S.and C.C.Cockerham(1984)."Estimating F-Statistics for theAnalysis of Population Structure."Evolution；internationaljournal of organic evolution 38(6):1358.

Claims

1.利用SNP位点选择信号梯度变化指数评估畜禽经济性状候选基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(4)根据步骤(3)计算的SNP位点选择信号梯度变化指数与选择信号检验统计量，将基于各差异梯度对计算的选择信号统计量经过秩排队，位于前1％统计量对应的位点且梯度变化指数第一指数为正值、第二指数为负值的位点，定义为显著位点，即性状特异的选择信号关联位点；

(5)根据步骤(4)计算获得的显著位点，再依据基因组连锁不平衡衰减程度，确定基因组候选区域范围，利用开源数据库抓取目标性状潜在候选基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中鉴定受选择区段的群体遗传学方法包括F_ST、XPCLR和XPEHH。