CN116516029A - 一种金鲳全基因组育种芯片及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金鲳全基因组育种芯片及应用，该芯片的制备方法包括以下步骤：获得金鲳高质量SNP位点；对获得的位点过滤，然后将位点上下游序列与金鲳基因组其他任何区域进行比对，过滤；将金鲳基因组划分为多个独立区域，计算区域内任意两位点的连锁不平衡值；同时根据MAF、SNP与中点的相对位置和突变类型对SNP位点进行过滤；进行全基因组关联分析获得与生长性状显著关联的位点；去除无法设计高质量液相探针的位点，设计探针获得探针池。本发明的芯片位点分布均匀，分型准确性高，重复性强，可为开展金鲳快速生长性状选择等相关遗传育种工作提供可靠的基因分型技术，缩短选育周期，推动选育技术的更新换代，促进水产种业的发展。
Description
技术领域
本发明涉及重测序、位点选择、全基因组育种、遗传效应评估、生物信息学技术领域，尤其涉及与生长性状相关SNP位点的筛选，基因组SNP芯片及制备方法，同时涉及这种金鲳SNP芯片的应用。
背景技术
遗传育种的核心是育种值的准确估计，随着现代遗传育种理论的创新和发展，选择育种、杂交育种、分子标记辅助育种、细胞工程育种、性别控制、全基因组选择育种、分子设计及分子模块设计育种、基因组编辑等育种技术驱动种业的蓬勃发展。在传统选择育种技术方面，基于BLUP的群体选育和家系选育在遗传育种领域广泛应用，该方法利用混合线性模型对育种值进行准确估计。随着分子标记的开发和应用，基于性状相关的分子遗传标记的分子标记辅助选择育种技术（MAS）在遗传改良中发挥重要作用，该技术可缩短选育周期、提高选育效率，但是MAS无法应用于复杂数量性状的选育，因为无法找到一个或数个可以完全或大不部分解释数量性状表型方差的遗传标记。
近年来随着高通量测序技术的快速发展，全基因组水平遗传标记的开发，现代选择育种技术得到发展，Meuwissen 等人提出了基于经典数量遗传学与分子标记来计算育种值的全基因组选择育种技术（GS），GS可通过参考群体建立表型和基因型的相关性模型，并利用该模型对选育群体进行基因组育种值（GEBV）估计。该技术在复杂数量性状选育中获得极大成功，成为现代育种的基本方法。开展全基因组选择育种，需要高效、低成本的全基因组SNP检测技术。然而常用的全基因组重测序技术虽然可获取全基因组SNP 标记，但对于基因组较大的物种来说大规模测序成本依然昂贵；简化基因组测序技术可大幅度降低分型成本，但仅局限于获取酶切片段附近的位点；育种芯片技术具有准确性高，重复率好等特点，是良好的分型技术之一。SNP芯片技术在畜牧业和作物育种中应用广泛，但对于非模式生物而言缺少廉价的商业化芯片，定制芯片费用非常昂贵，且固相芯片难以满足位点灵活选择。因此开发高通量、低成本的SNP分型技术是非模式生物尤其水产动物实施全基因组选择育种的关键。液相芯片通过探针池可以实现需求位点的灵活调整，与低成本、高通量等优势有效结合，为非模式生物提供了高效灵活的基因分型技术。
金鲳学名卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus），据中国金鲳鱼产业发展报告2020统计，2019年全国投苗量达到5.8亿尾，养殖产量16.8万吨，2020年养殖产量约20万吨。金鲳作为我国热带海水养殖的两大鱼类品种之一，具备适应大型网箱养殖、加工多样、出口市场成熟等优点，有望在海水养殖产业占据更大的份额。然而，金鲳养殖产业粗放式的发展，成为制约其可持续发展的瓶颈。在金鲳养殖过程中，存在种质资源匮乏，遗传背景不清晰、种群遗传多样性衰减、良种缺乏等问题，严重制约金鲳产业的健康可持续发展。为解决以上问题，需开展金鲳种质创制和良种选育，开发金鲳基因组育种液相芯片，能为金鲳生长形状全基因组选育，遗传参数评估提供技术手段，满足金鲳大规模全基因选育的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于金鲳快速生长良种选育的育种芯片，解决金鲳良种选育过程中育种芯片缺乏的问题，弥补传统选择育种技术的不足，为金鲳良种选育提供一种低成本、高通量的基因分型技术，实现精准高效的选育，推动鱼类选择育种技术的升级，促进金鲳产业的健康可持续发展。同时也可为其他水产生物的育种芯片设计和开发提供参考。
一种金鲳全基因组育种芯片，其制备方法包括以下步骤：
1)采集金鲳，构建参考群体，测量体尺性状，并提取高质量DNA，建库测序后，获得数据，质控，将质控后的数据比对到金鲳参考基因组序列，进行变异检测，对获得的位点进行数据过滤，获得高质量SNP位点；
2)对步骤1）获得的位点进一步过滤，然后将位点上下游序列与金鲳基因组其他任何区域进行比对，过滤位点；
3)将金鲳基因组划分为多个独立区域，计算区域内任意两位点的连锁不平衡R2值，设置R2>0.8为强连锁；同时根据最小等位基因频率、SNP与中点的相对位置和突变类型对SNP位点进行过滤，过滤掉强连锁中得分低的位点，再根据权重得分高低保留每个独立区域的位点；
4)进行全基因组关联分析，获得与生长性状显著关联的位点；
5)评估步骤4）所得位点的上下游序列，去除无法设计高质量液相探针的SNP位点，对符合标准的位点设计探针，获得探针池。
进一步的技术方案，步骤1）中，所述数据过滤的过滤标准为：删除最小等位基因频率<0.05和偏离哈迪-温伯格平衡的位点。
进一步的技术方案，步骤2）中，所述进一步过滤为：过滤掉杂合基因型频率>5%、位于重复序列区、测序深度过高和过低、以及非二碱基位点。
进一步的技术方案，步骤2）为：对步骤1）获得的位点进一步过滤，然后将位点上下游22bp的序列与金鲳基因组其他任何区域进行比对，过滤掉匹配度>85%的位点。
进一步的技术方案，步骤3）为：将金鲳基因组每100kb划分为一个区域，共划分为6550个独立区域，计算区域内任意两位点的连锁不平衡R2值，设置R2>0.8为强连锁；同时根据最小等位基因频率、SNP与中点的相对位置和突变类型对SNP位点进行过滤，权重设置标准：最小等位基因频率的权重占60，SNP的相对位置权重占30，同义突变和非同义突变权重分别占5-10；过滤掉强连锁中得分低的位点，再根据权重得分高低每个区域内保留4个SNP位点；如果该区域内SNP数目小于4，则利用临近区域过滤掉的位点进行填充，所述填充以靠近需填充区域中点为原则选择填充位点，获得SNP位点。
进一步的技术方案，步骤5）为：评估步骤4）所得位点的上下游22bp序列，去除无法设计高质量液相探针的SNP位点，对符合标准的位点设计探针，获得的探针池。
进一步的，本发明同时提供了一种金鲳育种全基因组芯片的相关应用，具体包括该芯片在金鲳快速生长良种选育中的应用，在金鲳种质资源评估和遗传多样性分析中的作用，在金鲳性状关联中的应用，在金鲳全基因组选育中育种值分析中的应用及在筛选金鲳快速生长个体中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
利用广西北海地区采集的226尾个体作为验证群体对所述芯片进行性能评估，结果显示位点捕获率能达到95%以上，分型比例在95%以上，位点测序深度一致性较好，重复性的皮尔逊系数>0.95。
本发明的芯片位点分布均匀，分型准确性高，重复性强，可为开展金鲳快速生长性状选择等相关遗传育种工作提供可靠的基因分型技术，缩短选育周期，推动选育技术的更新换代，促进水产种业的发展。
附图说明
图1 为4,886,850个SNP位点在金鲳基因组上的分布，设置窗口为100Kb。
图2为本发明所述金鲳全基因组育种芯片上的SNP位点在金鲳基因组上的分布示意图。
图3为验证群体生长性状全基因组关联分析曼哈顿散点图。其中，横坐标从左至右依序为Chr1至Chr23。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员更好的理解本发明技术内容，下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1:金鲳全基因组20K SNP育种芯片的制备
1、参考群体构建和表型数据采集
在海南沿海地区东方、陵水和文昌三地收集8月龄金鲳716尾，构建参考群体，并对体尺性状进行测量，取适量肌肉组织保存于95%乙醇中备用。
2、全基因组范围内SNP标记的获得
用酚/氯仿法抽提DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测后，获得高质量DNA，并用Qubit分析仪对DNA进行定量；将金鲳DNA进行打断处理，打断范围为350bp左右；利用标准建库流程完成重测序文库构建；Qubit定量后，将文库进行质检并用Illumina HiSeq X Ten PE150平台进行测序。
测序完成后，共得到3.1T数据，平均每个样本的测序深度为6×，经质控后（利用Fastp软件默认参数去除测序接头序列和低质量序列）的数据用于后续分析，使用BWA软件构建参考序列索引，并将测序数据比对到金鲳参考基因组序列（NCBI BioProject：PRJEB22654），利用GATK软件对参考群体进行变异检测SNP calling，对获得的位点进行数据过滤，删除最小等位基因频率<0.05和偏离Hardy-Weinberg平衡（哈迪-温伯格平衡）的位点，共得到4,886,850个高质量SNP位点。并生成vcf文件。高质量SNP位点在基因组上的分布如图1所示。
3、金鲳20K SNP标记的筛选
对获得的这些高质量SNP位点，进一步过滤，过滤掉杂合基因型频率>5%、位于重复序列区、测序深度过高（30×以上）和过低（10×以下）及非二碱基位点。为保证探针的特异性，将位点上下游22bp序列与金鲳基因组其他任何区域进行比对，过滤掉匹配度>85%的位点。
将金鲳基因组每100kb划分为一个区域，共划分为6550个独立区域，计算区域内任意两位点的连锁不平衡R2值，设置R2>0.8为强连锁。同时根据最小等位基因频率（MAF）、SNP与中点的相对位置和突变类型进行过滤，权重设置标准如下：MAF的权重占60，SNP的相对位置权重占30，同义突变和非同义突变权重分别占5。综合考虑连锁紧密程度和得分高低，过滤掉强连锁中得分低的位点，再根据权重得分高低每个区域内保留4个SNP位点。如果该区域内SNP数目小于4，则利用临近区域过滤掉的位点进行填充，所述填充以靠近需填充区域中点为原则选择填充位点，获得26,200个SNP位点。
对获得的体尺性状进行统计分析，利用plink工具进行全基因组关联分析（GWAS），获得与生长性状显著关联的位点。
4、液相芯片探针设计和制备
根据探针设计原则，评估上述位点上下游的22bp序列，综合考虑GC含量（GC含量在40％-60％）、退火温度（55～65℃）、连续碱基数目（不超过5个）和探针变异位点数目（不超过3个），去除无法设计高质量液相探针的SNP位点，对符合标准的位点设计探针（每个SNP位点对应两条正反向探针），获得的探针池即为金鲳全基因组育种芯片。
表1芯片SNP在各染色体的分布数量
5、育种芯片的性能评估
利用广西北海地区采集的226尾个体作为验证群体对所述芯片进行性能评估，用商业化基因组提取试剂盒提取高质量金鲳DNA，用1%琼脂糖凝胶和NanoDrop分光光度计分别对DNA完整性和浓度进行检测。按照建库标准流程制备226个金鲳DNA HD-Marker文库，利用Qubit检测文库的浓度，对文库进行指控，选取浓度均匀，质量符合测序要求的文库进行芯片性能评估。
对捕获率、分型效果、重复性等进行性能测试，液相芯片评估显示，位点捕获率能达到95%以上，分型比例在95%以上，位点测序深度一致性较好，重复性的皮尔逊系数>0.95。与全基因组重测序结果比较，位点分型准确率在90%-95%之间，该芯片分型效果良好。
实施例2:金鲳全基因组SNP育种在性状关联中的应用
采集226尾金鲳的生长性状数据，并利用本技术方案中的20K SNP芯片进行基因分型。对获得的分型结果进行质量控制，并得到高质量的分型信息。去除最小等位基因频率<0.05、基因型缺失率>0.05、样本缺失率>10%的个体。经筛选后，将获得的SNP位点与体重性状数据利用plink软件中混合线性模型进行全基因组关联分析，并利用Bonferroni检验去除假阳性SNP位点，最终定位到24个与金鲳体重性状关联的SNP位点，这些位点分布在4号、6号、8号和16号染色体上（图3）。通过基因注释，有19个位点能注释到基因座上，这些位点所在的基因跟生长代谢、抑制细胞凋亡、离子转运和蛋白质乙酰化、泛素化修饰等密切相关。因此，通过该芯片可以对金鲳进行基因分型和得到比较准确的关联分析结果。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种金鲳全基因组育种芯片，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
1)采集金鲳，构建参考群体，测量体尺性状，并提取高质量DNA，建库测序后，获得数据，质控，将质控后的数据比对到金鲳参考基因组序列，进行变异检测，对获得的位点进行数据过滤，获得高质量SNP位点；
2)对步骤1）获得的位点进一步过滤，然后将位点上下游序列与金鲳基因组其他任何区域进行比对，过滤位点；
3)将金鲳基因组划分为多个独立区域，计算区域内任意两位点的连锁不平衡R2值，设置R2>0.8为强连锁；同时根据最小等位基因频率、SNP与中点的相对位置和突变类型对SNP位点进行过滤，过滤掉强连锁中得分低的位点，再根据权重得分高低保留每个独立区域的位点；
4)进行全基因组关联分析，获得与生长性状显著关联的位点；
5)评估步骤4）所得位点的上下游序列，去除无法设计高质量液相探针的SNP位点，对符合标准的位点设计探针，获得探针池。
2.根据权利要求1所述的金鲳全基因组育种芯片，其特征在于，步骤1）中，所述数据过滤的过滤标准为：删除最小等位基因频率<0.05和偏离哈迪-温伯格平衡的位点。
3.根据权利要求1所述的金鲳全基因组育种芯片，其特征在于，步骤2）中，所述进一步过滤为：过滤掉杂合基因型频率>5%、位于重复序列区、测序深度在30×以上和10×以下、以及非二碱基位点。
4.根据权利要求1所述的金鲳全基因组育种芯片，其特征在于，步骤2）为：对步骤1）获得的位点进一步过滤，然后将位点上下游22bp的序列与金鲳基因组其他任何区域进行比对，过滤掉匹配度>85%的位点。
5.根据权利要求1所述的金鲳全基因组育种芯片，其特征在于，步骤3）为：将金鲳基因组每100kb划分为一个区域，共划分为6550个独立区域，计算区域内任意两位点的连锁不平衡R2值，设置R2>0.8为强连锁；同时根据最小等位基因频率、SNP与中点的相对位置和突变类型对SNP位点进行过滤，权重设置标准：最小等位基因频率的权重占60，SNP的相对位置权重占30，同义突变和非同义突变权重分别占5；过滤掉强连锁中得分低的位点，再根据权重得分高低每个区域内保留4个SNP位点；如果该区域内SNP数目小于4，则利用临近区域过滤掉的位点进行填充，所述填充以靠近需填充区域中点为原则选择填充位点，获得SNP位点。
6.根据权利要求1所述的金鲳全基因组育种芯片，其特征在于，步骤5）为：评估步骤4）所得位点的上下游22bp序列，去除无法设计高质量液相探针的SNP位点，对符合标准的位点设计探针，获得的探针池。
7.权利要求1所述的金鲳全基因组育种芯片在金鲳快速生长良种选育中的应用。
8.权利要求1所述的金鲳全基因组育种芯片在金鲳种质资源评估和遗传多样性分析中的应用。
9.权利要求1所述的金鲳全基因组育种芯片在金鲳性状关联分析中的应用。
10.权利要求1所述的金鲳全基因组育种芯片在金鲳全基因组选育的育种值分析中的应用。
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