CN115992265A - 一种石斑鱼全基因组液相芯片及其应用 - Google Patents
一种石斑鱼全基因组液相芯片及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种石斑鱼全基因组液相芯片，所述液相芯片的基因分型对象包括定位于鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1上背景SNP位点，其在鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1上的位置如说明书表2中所示。所述液体芯片还包括功能SNP位点，本发明还公开了上述石斑鱼全基因组液相芯片在石斑鱼育种、石斑鱼基因组选择、石斑鱼性状相关基因定位、石斑鱼遗传多样性分析、石斑鱼全基因组关联分析、石斑鱼品种鉴定或石斑鱼种质资源改良与保护中的应用。
Description
技术领域
本发明属于全基因组基因芯片技术领域，具体涉及一种石斑鱼全基因组液相芯片及其应用。
背景技术
近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，已有多种分子标记被开发出来。分子标记技术(Molecular Marker Technology)是分子育种中的重要工具。传统分子标记，例如限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、简单序列重复(Simple Sequence Repeat，SSR)、限制位点相关DNA（restriction site associatedDNA，RAD）和扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）在遗传育种领域中发挥着重要作用。但是，也存在一定局限性，例如在基因组分布数量少，以及操作过程繁琐、通量低，导致无法满足大规模商业化育种应用的需求。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)指基因组单个核苷酸的变异，包括单个碱基对的转换、颠换、插入或缺失。SNP作为基因组中分布更为广泛的遗传标记，具有密度高、遗传稳定性高和易于自动化分析等特点，已发展成为动物遗传变异研究中较为常见的分子标记。
目前，用于SNP位点分型的基因芯片技术中，传统的固相芯片基于探针与DNA序列的互补杂交，通过标记物的荧光显色信号进行分型。液相芯片基于重测序技术，对每个目标位点进行专一性捕获，并进行高深度的重测序，具有检测准确性高、通量大的优点。液相芯片一般包括根据DNA互补原理，为每个待测位点设计的一条生物素(Biotin)标记、覆盖目标SNP的探针，这些探针在液态中与基因组目标区域杂交形成双链，可以利用链霉亲和素包衣的磁珠与带有生物素的分子的吸附作用，经洗脱、扩增、建库之后进行二代测序，最终还原目标位点及其周围SNP的基因型状态。液相芯片目前在物种进化分析、种质资源评价与DNA指纹鉴定、分子遗传图谱构建、基因/QTL定位和基因克隆、分子标记辅助选择、全基因组选择等方面已经有着较为成熟的应用(徐云碧 et al., 2020)。
目前，牛90K芯片、绵羊Illumina 50K芯片、鸡600K Affymetrix高密度芯片、水产中包括大黄鱼600K液相芯片、凡纳滨对虾40K SNP基因芯片等，已经被广泛用于进行大规模商业化育种，具体应用包括种质资源遗传多样性分析、遗传与进化分析、亲缘关系鉴定、全基因组关联分析和基因组选择。
但是现有的固相基因芯片，在检测流程及应用中存在以下问题：首先，分型位点较多；其次，固相芯片只能对芯片上所包含的SNP位点进行分型，对于这些位点周围的SNP位点则无法分型，固相芯片一经设计，则所能检测到的位点就被固定下来，无法增删，灵活性较差；最后，固相芯片分型成本较高。
石斑鱼类是驰名世界的重要海水养殖鱼类，属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae )、石斑鱼亚科(Epinephelinae)，含15个属159种，广泛分布于印度洋和太平洋的热带、亚热带海域，是我国和东南亚沿海地区重要的海水养殖鱼类。目前我国养殖的石斑鱼种类主要有斜带石斑鱼、赤点石斑鱼、棕点石斑鱼、清水石斑鱼、云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼以及杂交品种等。我国石斑鱼类大规模养殖开始于上世纪90年代，本世纪初，石斑鱼类的生殖生长调控和人工苗种繁育技术取得重大突破，苗种培育和成鱼养殖进入大规模发展阶段。但石斑鱼苗种来源的稳定性、质量可靠性均存在不可控性，影响了我国石斑鱼产业的健康持续性发展，迫切需要自主研发优质石斑鱼新品系（种）育种技术，提高优质苗种繁育能力，促进科学养殖。
发明内容
本发明的目的在于提供一种石斑鱼全基因组液相芯片。
本发明的目的还在于提供上述石斑鱼全基因组液相芯片的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种石斑鱼全基因组液相芯片，所述液相芯片的基因分型对象包括定位于鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1上的背景SNP位点，所述背景SNP位点在鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1上的位置如下表2中所示。
进一步的，本发明所述液体芯片还包括功能SNP位点，所述功能SNP位点在鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1上的位置如下表3中所示。
本发明中的所述液相芯片包含石斑鱼全基因组不低于40K的SNP位点。
优选的，所述SNP位点包括45655个背景SNP位点和91个功能SNP位点。
优选的，所述SNP功能位点与石斑鱼主要经济性状相关联，所述经济性状包括生长、抗病和抗逆中的一种或几种。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述石斑鱼全基因组液相芯片在石斑鱼育种、石斑鱼基因组选择、石斑鱼性状相关基因定位、石斑鱼遗传多样性分析、石斑鱼全基因组关联分析、石斑鱼品种鉴定或石斑鱼种质资源改良与保护中的应用。
优选的，所述石斑鱼为鞍带石斑鱼、棕点石斑鱼、斜带石斑鱼、赤点石斑鱼或清水石斑鱼。
优选的，本发明基于石斑鱼全基因组液相芯片的检测方法为基于液相芯片的SNP位点分型方法，例如，靶向捕获测序技术。
优选的，在石斑鱼品种鉴定中的应用时，采集已知品种的石斑鱼的鱼鳍样本，连同待测石斑鱼样本一起，采用上述的液相芯片进行基因分型，得到SNP位点分型结果集合；将包含所有样本的SNP分型结果集合分别进行主成分分析和系统发育树的构建，根据系统发育树的聚类结果，分析得出待测石斑鱼样本与哪些已知品种的石斑鱼样本更为接近，即可判定待测石斑鱼所属的品种。
本发明具有以下优点：
（1）本申请发明人利用三代基因组测序解析了斜带石斑鱼、鞍带石斑鱼、棕点石斑鱼、清水石斑鱼基因组，并在此基础上开发了石斑鱼40K全基因组液相芯片，以填补石斑鱼无液相芯片空白，更好服务于石斑鱼进行遗传改良，相对于传统的固相芯片，本发明与具有相同数目探针的固相芯片相比，可以检测出更多的SNP位点，并且设计灵活，后期可随时添加感兴趣的标记位点，相比于全基因组重测序，本发明有明显的价格优势，可以进行石斑鱼的大规模分型，进而促进石斑鱼的育种工作；
（2）本发明包含了大量石斑鱼功能基因相关位点，筛选了已有研究中与生长、抗病、抗逆等性状显著相关的位点，增加了芯片进行基础研究的准确性；
（3）本发明用于设计芯片的样本来源于5个品种共1,253尾石斑鱼，来源广泛、数量多有利于石斑鱼育种工作的开展以及对石斑鱼种质资源的研究与保护；
（4）本发明中的石斑鱼全基因组液相芯片可以应用在石斑鱼育种、石斑鱼基因组选择、石斑鱼性状相关基因定位、石斑鱼遗传多样性分析、石斑鱼全基因组关联分析、石斑鱼品种鉴定或石斑鱼种质资源改良与保护中等方面；
（5）本发明可以实现主要5种石斑鱼基因分型，同时可以从大规模测序数据中挖掘石斑鱼关键功能位点，效率高，在石斑鱼育种中的多个领域均具有较高的应用价值；
（6）本发明所涉及的石斑鱼液相芯片基于靶向捕获测序技术，不仅可以对目标位点进行分型，同时目标位点周围一定范围内的SNP也可以被准确分型，因此可以得到比标记位点更多的SNP分型信息；与传统固相芯片相比，灵活性较高，可以根据应用需要随时添加标记位点；同时，液相芯片依托二代测序平台，分型成本较低，为大规模分型提供技术手段；
（7）本发明液相芯片检出率高，代表性强，多样性信息丰富，该芯片测序深度高，每个个体平均测序深100X左右，包含常见5种石斑鱼的高多态性位点，位点分布均匀，该芯片除了满足40K个标记区域的检测，可以根据不同的应用场景灵活应用到5种不同的石斑鱼中。
附图说明
图1为实施例1中石斑鱼40K液相芯片区段标记染色体分布情况；
图2为实施例1中石斑鱼40K液相芯片标记染色体平均分布情况；
图3为实施例3中基于石斑鱼40K液相芯片及基因型数据的种群聚类分析；
图4为实施例4中石斑鱼全基因组液相芯片及在棕点石斑鱼全基因组关联分析；
图5为石斑鱼全基因组液相芯片在科研和产业应用领域图示。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明的保护范围的限制。
实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1
石斑鱼40K液相芯片的设计和制备
本实施例利用5个品种共1,253尾石斑鱼(表1)，首先进行了SNP分析，对位点进行过滤后共获得45,655个背景SNP位点用于后续的芯片。
表1.所用石斑鱼品种列表
| 序号 | 品种 | 数量 |
| 1 | Epinephelusfuscoguttatus棕点石斑鱼 | 266 |
| 2 | Epinepheluscoioides斜带石斑鱼 | 638 |
| 3 | Epinepheluslanceolatus鞍带石斑鱼 | 226 |
| 4 | Epinephelusakaara赤点石斑鱼 | 113 |
| 5 | Epinepheluspolyphekadion清水石斑鱼 | 10 |
45,655个背景SNP位点的筛选：
（1）对现有石斑鱼的基因组基本调查（基因组大小，组装情况，倍性，重测序数据等信息），选择最优参考基因组；
（2）整合石斑鱼的背景位点信息和石斑鱼不同群体重测序数据；
（3）补充石斑鱼样本；
（4）位点挑选：结合石斑鱼参考基因组和群体重测序数据共有位点，筛选缺失率低、多态性高、分布均匀的背景标记，对这些候选标记及所处位置进行打分，优先选取位于基因外显子区、基因启动子区的标记作为后续检测的主要背景标记。
首先，变异位点检测：对5种石斑鱼进行重测序，将下机数据raw reads进行质控得到clean reads，利用BWA软件将clean reads与鞍带石斑鱼参考基因组进行比对，通过比对可以定位clean reads在参考基因组上的位置。根据Clean Reads在参考基因组的比对结果，使用软件GATK软件进行变异检测，得到每个样本在鞍带石斑鱼基因组上的变异位点信息。
其次，功能位点物理位置转换：调取目标位点在原参考基因组的侧翼各200bp的序列，使用blast软件比对到鞍带石斑鱼基因组上，确定该目标位点在鞍带石斑鱼基因组的物理位置。
最后筛选出在石斑鱼染色体上均匀分布的足够数量的背景标记和功能位点共同组成石斑鱼40K液相芯片的标记；背景标记和功能位点共进行了4次位点挑选：
第一次位点挑选：先筛选maf ≥0.05的位点，并且满足缺失率<20%，杂合率低于30% 的鞍带石斑鱼（龙胆）和棕点石斑鱼（老虎斑）交集位点25，114个，进行位点评估，按照GC含量在30-70，hom<10的条件进行评估，评估能用于设计探针后的位点数为10，742个，均匀分布后10，448个。
第二次位点挑选：棕点石斑鱼（老虎斑），清水石斑鱼（杉斑），斜带石斑鱼（青斑），鞍带石斑鱼（龙胆），赤点石斑鱼（红斑）五种石斑鱼中至少其中三种满足（maf>0.05，na<0.2，het<0.3）的位点共40，457个，进行位点评估，按照GC含量在30-70，hom<10 的条件进行评估，评估后的位点数为23，296个，均匀分布后13，323。
第三次位点挑选：鞍带石斑鱼（龙胆）按照（maf>0.1，NA<02，Het<0.2）挑选出157，398个位点进行评估，评估后的位点数为81，450个，均匀分布后13，099个；棕点石斑鱼（老虎斑）按照（maf>0.1，NA>0.05，Het>0.1）挑选出277，377个位点进行评估，评估后的位点数为149，133，均匀分布后8，785。
第四次位点挑选：根据对已有功能位点进行评估，转参考基因组前，功能位点总共108个，转参考基因组后，功能位点数为91个。
最终根据上述步骤的前三步得到的评估位点，进行均匀分布挑选，再加上第四步的功能位点，总共得到45，714个目标位点，进入DNA合成步骤。
将上述所有候选位点去除重复位点，提交给石家庄博瑞迪生物技术有限公司进行评估，去除在基因组上无法唯一比对的位点、去除侧翼序列中包含重复序列的位点后，再次对位点相邻间距进行评估，去除相邻位点间距小于100bp的位点，通过5种石斑鱼基因组比对，把除鞍带石斑鱼其他石斑鱼物理位置转化到鞍带石斑鱼基因组上，最后共获得了在石斑鱼基因组上均匀分布的45，714个SNP位点(图1-图2)，这些SNP位点在基因组上的坐标如下表2-3所示。根据这45,714个SNP位点的位置及其两侧序列，通过石家庄博瑞迪生物技术有限公司采用靶向捕获测序技术设计引物并进行探针合成，从而得到石斑鱼40k液相芯片。
表2背景SNP位点
作为本发明的一种改进：所述液体芯片还包括功能SNP位点，所述功能SNP位点在鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1上的位置如下表3所示：
表3功能SNP位点
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所述鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1的全基因组序列参阅https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/?taxon=310571。
本发明中的石斑鱼全基因组液相芯片，该液相芯片的基因分型对象包含了45,714个SNP位点，具体包括：
1）所述液相芯片的基因分型对象包括定位于鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/?taxon=310571）上的45,655个背景SNP位点，所述45,655个背景SNP位点在鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1上的位置如上表2中所示，石斑鱼40K液相芯片区段标记染色体分布情况如图1所示，石斑鱼40K液相芯片标记染色体平均分布情况如图2所示，在24个染色体上均匀分布。
2）所述液体芯片还包括91个功能SNP位点，所述功能SNP位点在鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1上的位置如说明书表3中所示。
可提供进行国内外5种主养石斑鱼（鞍带石斑鱼、棕点石斑鱼、斜带石斑鱼、赤点石斑鱼、清水石斑鱼）石斑鱼品种性状相关基因的定位、遗传多样性分析、全基因组关联分析、基因组选择，种质资源改良与保护的SNP分子标记组合。
实施例2
利用石斑鱼40K液相芯片对石斑鱼DNA样品进行检测的流程
（1）石斑鱼基因组DNA的提取：剪取石斑鱼尾鳍，使用酚氯仿法或血液基因组提取试剂盒(天根生物科技有限公司，北京)进行DNA的提取。
（2）DNA样品质量检测：用质量分数为1％～1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统(GelDocXRSystem，美国Bio-Rad公司)判断电泳结果，保证基因组完整性；用微量紫外分光光度计(Q5000，美国Quawell公司)或类似的核酸蛋白测定仪测量基因组DNA的浓度，将DNA浓度调整到工作浓度10～50ng/μL。
（3）石斑鱼全基因组液相芯片检测：按照液相探针杂交的靶向基因捕获技术(http://www .molbreeding .com/index .php/Technology/GenoBaits .html)标准流程构建液相芯片 DNA杂交捕获文库，文库测序依赖于华大MGISEQ2000测序平台。
（4）数据分析：获得的原始数据采用fastQC软件(Chen, Zhou, Chen,&Gu, 2018)进行质控，得到Clean data；之后用bwa软件(Li, 2013)将Clean数据mapping到鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1上，采用GATK软件(Van der Auwera et al., 2013)的标准流程检测SNP，进行基因分型。
实施例3
石斑鱼40K液相芯片在种群多样性分析中的应用
在对未知品种的石斑鱼6个样本进行品种鉴定时，首先采集已知品种的石斑鱼的鱼鳍样本，连同待测石斑鱼6个样本一起，采用石斑鱼40K液相芯片进行基因分型(具体的分型方法参考实施例2)，得到SNP位点分型结果集合。之后，将包含所有样本的SNP分型结果集合分别进行主成分分析(PCA)和系统发育树的构建，根据系统发育树的聚类结果，分析得出待测石斑鱼样本与哪些已知品种的石斑鱼样本更为接近，即可判定待测石斑鱼所属的品种。
基于石斑鱼40K液相芯片及基因型数据的种群聚类分析如图3所示，其中样品1-2属于鞍带石斑鱼，样品3-4属于斜带石斑鱼，样品5-6属于棕点石斑鱼。
从图3中可以看出，本套液相芯片可很好实现5种石斑鱼在基因组的多样性分析。
实施例4
石斑鱼40K液相芯片在棕点石斑鱼耐受低蛋白全基因组关联分析中的应用
首先是获取同一批棕点石斑鱼个体，为筛选耐受低蛋白石斑鱼个体制作一批饲料（降低15%蛋白含量，利用碳水化合物补平总能），饲料等脂等。鱼暂养一个月，确定实验鱼健康，去除畸形个体后使用实验饲料进行饲喂。每日饱食饲喂一次，持续90天。确保实验结束后，实验鱼体重为初始的三倍或以上。
实验开始前，将pit电子标记植入实验鱼体内并记录实验鱼的生长数据（全长，体长，体高，体重）。实验结束后，记录实验鱼的生长数据与电子标记码以确定同一条鱼的生长状况。实验结束后采集586尾实验鱼的尾鳍样本，记录电子标签号。将实验鱼进行测序，以体重、体长为关联性状筛选snp位点，并采用石斑鱼40K液相芯片进行基因分型(实施例2)。对获得的基因分型结果进行质量控制，去除最小等位基因频率小于0.05、基因型缺失率大于0.2、杂合比例大于50%的位点，以及非二等位位点，最终得到11,683个SNP标记。随后，用筛选得到的SNP位点与采集的棕点石斑鱼增重率性状数据进行全基因组关联分析，采用PLINK软件的线性回归模型（GLM）进行分析，最终与棕点石斑鱼增重率性状数据显著相关的标记位点为包括130个，候选基因数为161个，石斑鱼全基因组液相芯片及在棕点石斑鱼全基因组关联分析结果如图4所示。
上述结果表明，即使采用石斑鱼40K液相芯片，结合靶向捕获测序，能够进行更准确的全基因组关联分析。相比于传统重测序分析，可以以更低的成本和时间开展石斑鱼育种工作。
本发明中石斑鱼40K液相芯片的优点包括：
随着组学时代的到来，多种石斑鱼基因组信息逐渐被解析。前期，本申请发明人利用三代基因组测序解析了斜带石斑鱼、鞍带石斑鱼、棕点石斑鱼、清水石斑鱼基因组，并在此基础上开发了石斑鱼40K全基因组液相芯片，以填补石斑鱼无液相芯片空白，更好服务于石斑鱼进行遗传改良。
相对于传统的固相芯片，本发明与具有相同数目探针的固相芯片相比，可以检测出更多的SNP位点，并且设计灵活，后期可随时添加感兴趣的标记位点。
相比于全基因组重测序，本发明有明显的价格优势，可以进行石斑鱼的大规模分型，进而促进石斑鱼的育种工作。
本发明包含了大量石斑鱼功能基因相关位点，筛选了已有研究中与生长、抗病、抗逆等性状显著相关的位点，增加了芯片进行基础研究的准确性。
本发明用于设计芯片的样本来源于5个品种共1,253尾石斑鱼，来源广泛、数量多有利于石斑鱼育种工作的开展以及对石斑鱼种质资源的研究与保护。
因此，本发明中的石斑鱼全基因组液相芯片可以应用在石斑鱼育种、石斑鱼基因组选择、石斑鱼性状相关基因定位、石斑鱼遗传多样性分析、石斑鱼全基因组关联分析、石斑鱼品种鉴定、或石斑鱼种质资源改良与保护中等方面，如图5所示。
Claims (6)
1.一种石斑鱼全基因组液相芯片，其特征是：所述液相芯片的基因分型对象包括定位于鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1上背景SNP位点，所述背景SNP位点在鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1上的位置如表2中所示。
2.根据权利要求1所述的石斑鱼全基因组液相芯片，其特征是：所述液相芯片还包括功能SNP位点，所述功能SNP位点在鞍带石斑鱼参考基因组ASM528154v1上的位置如表3中所示。
3.根据权利要求2所述的石斑鱼全基因组液相芯片，其特征是：所述功能SNP位点与石斑鱼主要经济性状相关联，所述经济性状包括生长、抗病和抗逆中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述的石斑鱼全基因组液相芯片，其特征是：所述液相芯片包含石斑鱼全基因组不低于40K的SNP位点，所述SNP位点包括45655个背景SNP位点和91个功能SNP位点。
5.权利要求1-4任一项所述石斑鱼全基因组液相芯片在石斑鱼育种、石斑鱼基因组选择、石斑鱼性状相关基因定位、石斑鱼遗传多样性分析、石斑鱼全基因组关联分析、石斑鱼品种鉴定或石斑鱼种质资源改良与保护中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是：所述石斑鱼为鞍带石斑鱼、棕点石斑鱼、斜带石斑鱼、赤点石斑鱼或清水石斑鱼。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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