KR102683934B1 - 대서양연어 품종 판별용 snp마커 및 이의 용도 - Google Patents
대서양연어 품종 판별용 snp마커 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대서양연어 품종 구분을 위한 SNP 마커 및 이의 용도는 대서양연어 품종 간의 유전적 차이를 반영하여 각 품종을 판별하는 데 있어 최적화된 7개 SNP 마커의 조합으로, 대서양연어 품종 육성 및 품종 보호에 효과적인 도구로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 대서양연어 품종 구분을 위한 SNP(Single nucleotide polymorphism) 마커 및 상기 마커를 이용하여 대서양연어의 품종을 구분하는 방법에 관한 것이다. 상세하게는 대서양연어를 대상으로 전장유전체 서열재분석(Whole genome re-sequencing)을 수행하여 단일염기서열변이(SNP)를 탐색하고, 품종 구분 마커를 개발하여 대서양연어의 유전자형 분석으로 정확하게 품종을 판별할 수 있는 방법에 관한 것이다.
대서양연어(Salmo salar, Atrantic salmon)는 연어과 어류 중 성장이 빠르고 맛과 영야이 우수하여 수산물 시장에서 중요한 자원으로 인정받고 있으며, 수많은 소비자들에게 인기 있는 수산물 중 하나이다. 대서양연어의 세계시장 규모는 `17년 기준으로 330만 톤(양식 236, 어획94), 약 40조 원(FAO통계)에 이르고, 국내 수입량은 `97년 0.2만 톤에서 `21년 4.3만 톤으로 약 20배 이상 성장하였다. 또한, 최근 5년간 한국, 중국, 일본 등 동아시아지역에서 대서양연어 수입량은 90.3%가 증가하여 아시아 시장에서도 연어의 수요는 엄청난 증가 추세에 있다.
국내에서 판매되고 소비되는 연어 대부분은 노르웨이, 아이슬란드 등에서 수입되고 있다. 대서양연어는 다양한 품종과 변이가 존재하고, 이는 어종의 육질, 영양성분, 생태학적 특성 등에서 차이를 가지고 있다. 따라서, 대서양연어의 품종을 신속하고 정확하게 구분하는 것은 소비자들에게 신뢰성 있는 제품을 제공하는데 중요한 역할을 하며, 원산지 추적, 유전자원 보존, 연어 자원의 지속 가능한 관리 등에도 기여할 수 있다.
한편, 많은 생물체에서 염기서열 전체를 해독하고 유전체 전 영역에서 발생하는 유전변이를 조사하기 위한 전장유전체재분석(Whole genome resequencing, WGRS)이 이루어지고 있다. NGS에 기반한 WGRS은 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 삽입/결실(Insertion/Deletion, Indel)을 포함한 염기서열변이 정보를 탐색하고 확보할 수 있다.
분자 마커는 DNA의 염기서열의 차이를 기반으로 하여 개체간 다형성을 나타내기 때문에 환경 영향을 배제하고, 품종을 정확하게 판별할 수 있는 유전적 도구이다. 그중 단일염기변이(single nucleotide polymorphism, SNP)는 개체간의 DNA에 나타나는 하나의 염기 차이를 나타낸다. SNP는 비교적 높은 빈도와 안정성을 가지고 있으며, 유전체 전체에 분포되어 있어 개체의 유전적 다양성을 보여준다. 이러한 특성으로 인해 SNP 마커는 개체 간의 유전적 차이를 정확하게 식별하여 품종 간의 관련성을 파악하는 데 도움을 준다.
따라서, 본 발명에서는 대서양연어의 NGS 분석을 통해 확보한 유전형 정보를 바탕으로 SNP 마커를 탐색하고, 분석된 SNP 마커에서 대서양연어 품종 구분용 SNP 마커를 발굴하여 이를 이용한 대서양연어 품종 판별방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 외형이 매우 유사하여 형태적 방법으로는 종판별이 어려운 대서양연어의 품종 구분을 정확하게 하는 SNP 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 대서양연어의 품종 구분용 SNP(Single nucleotide polymorphism) 마커 조성물은 서열번호1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 C 또는 G이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 C 또는 G이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 A 또는 C이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 대서양연어는 노르웨이산 또는 아이슬란드산 품종인 것일 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 상기 SNP(Single nucleotide polymorphism)염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 대서양연어의 품종 판별용 마이크로어레이를 제공하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 상기 SNP(Single nucleotide polymorphism)염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 대서양연어의 품종 판별용 프라이머세트 및 프라이머 세트와 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 대서양연어 품종 판별용 키트를 제공하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 대서양연어 품종을 판별하는 방법으로 상기 대서양연어 품종은 노르웨이산 또는 아이슬란드산인 것인 대서양연어 품종을 판별하는 방법은ⅰ) 대서양연어의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; ⅱ) 상기 분리된 게놈 DNA들을 주형으로 하고, 대서양연어의 품종 판별용 프라이머세트 조성물을 이용하여 Real time PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; ⅲ) 상기 ⅱ)단계 PCR결과를 바탕으로 각 조성물에 대한 대서양연어 품종별로 유전자형을 분석하는 단계, ⅳ) 상기 ⅲ)단계에서 분석된 각 유전자형에 코드를 부여하여 대서양연어 품종별 고유 유전자 코드를 설정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 대서양연어 집단에서 품종을 판별하기 위한 SNP 마커에 관한 것으로, 구체적으로 200마리의 대서양연어 집단에 대한 70K SNP chip 자료를 기반으로 두 집단의 유전체 정보를 이용하여 대서양연어 품종을 구분할 수 있는 SNP 마커 7개를 선발하였으며, 이는 대서양연어의 품종 구분을 가능하게 하고, 보다 정확한 대서양연어 품종 관리를 할 수 있다.
도 1은 선발된 SNP 마커를 사용하여 유전체 정보를 이용한 개체별 및 집단간 유전적 유사성 및 군집을 분석하기 위하여 주성분 분석 (Principal Coordinates Analysis, PcoA)결과를 나타낸다.
본 발명에서는 대서양연어의 NGS 분석을 통해 확보한 유전형 정보를 바탕으로 SNP 마커를 탐색하고, 분석된 SNP 마커에서 대서양연어 품종 구분용 SNP 마커를 발굴하였다.
본 발명은 대서양연어 품종 판별용 SNP마커 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 서열번호1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 C 또는 G이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 C 또는 G이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 A 또는 C이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 대서양연어의 품종 구분용 SNP(Single nucleotide polymorphism) 마커 및 마커조성물을 제공한다.
서열번호 1 내지 서열번호 7의 51번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 그에 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대서양연어 품종 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다. 상세하게는, 서열번호 1 내지 서열번호 7의 51번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 표 1에 기재하였고, 다형성 염기 정보는 [ / ]로 표시하였으며, 본 발명의 서열번호 1 내지 7의 염기서열 사선(/) 앞에 위치한 염기를 포함하는 서열을 의미한다
본 발명은 또한, 대서양연어 시료로부터 DNA를 확보하는 단계; 유전체 비교를 위한 전장유전체 서열재분석 단계; 대서양연어 품종 구분을 위한 SNP 선별 단계; SNP 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는, 대서양연어 품종을 구분하는 마커 및 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위한 실시형태로는 상기한 대서양 연어 품종 판별용 SNP 마커를 포함하는 DNA 칩이나 이를 포함하는 키트일 수 있다.
본 발명에서 "대서양연어"의 학명은 Salmo salar로 연어과에 속하며 Atlantic salmon으로 흔히 불리는 어류를 지칭한다.
본 발명에서 "뉴클레오티드"는 단일 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드를 의미하며, 특별한 언급을 제외하고 자연 상태의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
본 발명에서 "프로브"는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 리뷰니클레오티드와 디옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미하며, 바람직하게는 혼성화에서 최대 효율을 위하는 단일가닥일 수 있다. 본 발명에 이용되는 프로브는 상기 SNP을 포함하는 서열에 완전히 상보적인 서열이 사용될 수 있으나. 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열이 사용될 수 있다.
본 발명에서 "SNP"은 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism)이며, 다형성(polymorphism) 부위 중에서 개체에 따라 단일 염기(A, T, G 또는 C)만 다른 것을 의미한다.
본 발명에서 "SNP 마커"는 개체 혹은 종을 판별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일염기다형성 대립유전자 염기쌍을 의미한다. 다형성 확인을 위한 다형성 마커는 선택된 집단에서 최소 1%이상, 바람직하게는 5% 이상 또는 10 %이상의 발생 빈도를 보이는 두 가지 이상의 대립유전자를 가지는 것일 수 있다.
본 발명에서 "대립유전자"는 다형성을 나타내는 데 사용될 수 있으며, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다.
본 발명에서 "구분"은 본 발명의 SNP 마커 및 SNP 마커 세트에 의해 품종을 판단하고 구별하는 것을 의미하며, '구별', '식별' 등 유사한 뜻을 지닌 단어와 혼용하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 대서양연어 DNA 확보
대서양연어 품종 구분용 SNP 마커를 개발하기 위해, 강원특별자치도의 내수면 자원센터 및 한해성수산자원센터를 통해 대서양연어 240마리를 확보하였다. 대서양연어는 2개 품종으로, 노르웨이 집단(120마리), 아이슬란드 집단(120마리)으로 구성되어 있다. 각각의 대서양연어의 genomic DNA는 E.Z.N.A.® Mollusc DNA Kit(OMEGA, USA)를 이용하여 추출하였다. 추출된 gDNA의 품질과 농도는 NanoDrop 분광광도계(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 측정하였다.
<실시예2> 전장유전체 서열재분석(Whole genome re-sequencing)
대서양연어 품종의 유전체 비교를 위해, 노르웨이 대서양연어 20마리와 아이슬란드 대서양연어 20마리를 대상으로 Illumina NovaSeq6000 platform을 사용하여 resequencing을 실시하였다.
시퀀싱 작업이 완료된 후, 확보된 로우 데이터는 다양한 오류를 포함할 수 있으므로 품질 관리 과정을 수행하게 된다. 낮은 시퀀싱 품질의 데이터를 제거하기 위해 프로그램을 먼저 Trimmomatic과 같은 소프트웨어를 사용하여 어댑터 시퀀스를 제거하는 어댑터 트리밍 과정을 진행하며, FastQC를 통해 시퀀싱 리드의 품질 점수를 평가하고, 점수가 낮은 시퀀싱 리드를 제거하여 고품질 데이터만을 선별하였으며, NCBI 데이터베이스의 대서양연어 레퍼런스 게놈 정보(Representative genome: Ssal_v3.1)를 활용하여 로우 데이터를 매핑하였다.
매핑 과정은 BWA-MEM 또는 Bowtie2와 같은 정렬 소프트웨어를 사용하여 이루어지며, 이 과정에서 각 리드의 정확한 위치를 찾아내어 유전체 전체에 걸친 커버리지와 분포를 평가할 수 있다. 매핑 과정을 통해 얻어진 데이터를 기반으로 GATK(HaplotypeCaller)나 Samtools(mpileup)을 사용하여 개체별 변이를 탐색한다. 고품질의 변이 데이터를 선별하기 위해 vcftools (v0.1.16) 소프트웨어를 이용하여 품질 점수(Quality score), 매핑 품질, 대립 유전자 빈도(Allele frequency) 등을 기준으로 필터링한다.
확인된 유전자형 정보는 더욱 정확한 결과 도출을 위해 품질 관리(Quality Control) 과정을 수행하였다. SNP filtering 과정은 PLINK 프로그램을 통해 수행하였으며, 마커 정보 중에서 각 마커의 개체에 대한 유전자형 호출 비율(call rate)이 90% 이하인 마커 및 집단 내 대립유전자 빈도(minor allele frequency, MAF)가 5% 이하인 마커는 제거하였으며, 하디 웨인버그 평형(Hardy-Weingerg equilibrium)에 대한 P-value값이 10-4 이하인 마커는 제거하였다. 최종적으로 선발된 SNP 마커를 사용하여 유전체 정보를 이용한 개체별 및 집단간 유전적 유사성 및 군집을 분석하기 위하여 주성분 분석 (Principal Coordinates Analysis, PcoA)을 실시하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 빨간색으로 표시된 집단은 노르웨이 대서양연어 집단, 파란색으로 표시된 집단은 아이슬란드 대서양연어 집단에 대한 결과를 나타낸 것이다. 주성분 분석 결과 첫 번째 주성분(PC1)은 전체 집단 내 유전적 변이의 13.5%를 설명하고, 두 번째 성분은 약 6.5%를 설명하였다. 전체 대서양연어 집단 분석 결과, PCA plot에서 각각의 품종은 2개의 Cluster를 형성하며 각각의 품종은 유전적으로 구분되는 것으로 나타났다.
<실시예 3> 대서양연어 대용량 SNP 칩 제작
상기 실시예2에 따라 NGS 분석 데이터를 활용하여 개체별 변이를 탐색한 결과, 총 2,750,670개의 유전자 변이 정보를 획득하였다. High quality 변이를 확보하기 위해 LD 분석 및 SNP shannon entropy based local optimization (U score) 계산을 통한 SNP filtering을 수행하였다. 집단별 MAF, LocalPosition 및 LD 분석 결과를 토대로 SNP 마커를 선발하였고, 앞서 획득한 유전자 변이 정보의 유효성과 신뢰성을 토대로 최종적으로 본 발명의 실시예 4에 따른 대서양연어의 품종 구분용 마커 7개를 포함하는 70K SNP chip을 제작하였다.
<실시예4> 대서양연어 품종 구분을 위한 SNP 선별
상기 실시예 2에 따라 분석된 대서양연어 40마리의 유전체 정보를 이용하여 품종 특이적인 SNP 분석을 수행하였다.
SNP는 2개의 대립유전자형 (bi-allele)이 서로 조합을 이루어 존재하는 유전변이형으로 특정 염기 쌍 부위에서 하나의 염기가 다른 것으로 대치된 것이다. 유전형이 결정된 SNP의 대립유전자 유전형은 AA, AB, BB로 표현할 수 있다. 동형 유전형은 같은 유전자 위치에 있는 두 대립유전자가 같은 경우로 AA, BB 유전자형이며, 이형 유전형은 같은 유전자 위치에 있는 두 대립유전자가 다른 경우로 AB로 나타나는 유전형이다.
대서양연어 품종 구분을 위한 SNP 선별 방법은 각 SNP의 대립유전자 유전형을 숫자로 변환하여 계산하며, 메이저 대립유전자 동형접합체(major allele homozygote)를 0(AA), 이형접합체(heterozygote)를 1(AB) 및 마이너 대립유전자 동형접합체(minor allele homozygote)를 2(BB)로 가정하였다. 본 발명에서 "메이저 대립유전자 동형접합체"는 해당 유전자 위치에서 주로 나타나는 유전형을 의미하며, "마이너 대립유전자 동형접합체"는 해당 위치에서 보다 드물게 나타나는 유전형을 의미한다.
본 발명의 SNP의 대립유전자형 유전형은 AA, BB인 동형접합체로 존재하는 것이 독립적으로 존재하는 SNP으로 판단하여, 변환된 데이터에서 노르웨이 대서양연어 집단과 아이슬란드 대서양연어 집단을 0, 2 또는 2, 0로 판별하는 마커를 선별하였다. 이에 따른, 대서양연어 품종 구분을 위하여 상기 SNP 대립유전자형 분석결과에 따라, 각각의 품종에 독립적으로 존재하는 7개의 SNP 마커를 선별하였다. 하기의 표 1은 대서양연어 품종 판별을 위한 SNP마커 정보를 나타낸다.
| 서열번호 | Chromosome | Position | sequence |
| 1 | 1 | 161064403 | TCACAACACAGTGTTCAGAGCTCCACTGCTTCTAGAAATATATTGTGAAC[C/G]CCACTAAAGCACATGCTACTTGGCAGCGTCATCCACATTCTCACTTGATA |
| 2 | 4 | 26051319 | GAAACTCTCTCACCCATGTTTACACCAGTCTAAAGCTTTTTAACATGCAA[T/G]GAAAATCAAGTTAGCTACTTAGCGTTTTTTTTCTCCCTTTTAGCTAGTGA |
| 3 | 11 | 25712443 | CCATGCCAGGGTAAAAGTACAGATGTACAGGGGCATATTCGGTTGTCCAC[G/A]CCAATTTTTACACATTTTGTGTGAATGCCTATTCCATTAAAATCACACAA |
| 4 | 11 | 26535990 | ATACGGTAGGCAGAGCATCTGAAGACACTGTAACTGATACTGTGGTAGAC[T/C]TGGTGAATGGATGAGGAGACTCACCTCATGTCCCTGATCAGGGATACCTT |
| 5 | 28 | 2191372 | CTGTCAATTAGGTTAGTATTGTGGATTAACTTGAAAGTTGTTCATTCATC[C/G]TAAGTTTTCTCCTATCACAGCCATTAAACTCTGTAACTGTTTTAAAGTCA |
| 6 | 29 | 26216543 | TGTTGTTTCCATATTGCGTGGCAGGGAAGATGGTTAAAATCTTCTACTTT[T/C]CCGTTGCTACCCAGTCACTTTTCTTAGCTAGCTAACGTTAGCTAAGTAGC |
| 7 | 29 | 37908377 | ATGTCTCTTATCGATGGCGGTTATGATGTCGTTTAGGACTTTGAGCGTCC[A/C]AACTCCACACAAGAAACTGTCATGCCCTTGAGCAAAGCACTTAATTGCTC |
<실시예 5> SNP 마커 검증을 위한 유전자형 분석 및 품종 구분용 코드 작성
대서양연어 품종 구분용 SNP마커 검증을 위해서, 대서양연어 시료 200개(노르웨이 대서양연어 100마리, 아이슬란드 대서양연어 100마리)로 상기 70K SNP chip을 활용한 유전자형 분석을 수행하였다. 유전형 분석은 DNA의 증폭(Amplification), 단편화(Fragmentation)의 일련의 과정 이후, SNP chip과 혼성화(Hybridization)되고 탐침(Probe)과 DNA 간에 연결(Ligation), 염색(Staining) 과정 및 스캔(Scan)하여 이미지 파일로 저장되어 유전형 데이터를 추출하는 과정으로 이루진다. 본 발명에서 실시한 구체적인 방법은 하기와 같다.
본 발명의 유전자형 분석은 대서양연어의 gDNA를 추출하고, 품질 기준을 확인하는 단계로 시작한다. 품질 기준을 통과한 DNA는 특정한 DNA를 대량으로 복제하는 과정인 증폭(Amplification) 과정을 거치며, 이 과정은 후속 단계에서 충분한 양의 DNA를 확보하기 위해 이루어진다. 증폭된 DNA는 단편화(Fragmentation) 및 침전(Precipitation) 과정을 거치며, DNA를 특정 크기의 조각으로 분절하여 후속 단계에서의 처리를 용이하게 하며, 침전을 통해 순수한 DNA를 분리하게 된다.
침전된 DNA는 건조(Dry), 재현탁(Resuspend) 및 품질 확인(QC) 과정을 거치며, 이후 변성(Denaturation) 및 혼성화(Hybridization) 과정을 수행하게 된다. 이는 DNA를 단일 가닥으로 변성시킨 뒤 DNA와 탐침(Probe) 간의 결합을 유도하는 과정으로, 특정 SNP 위치를 확인할 수 있게 한다.
혼성화 과정 후 연결(Ligation), 세척(Wash), 염색(Stain) 및 스캔(Scan) 과정이 진행된다. 혼성화된 DNA에 형광물질을 부착하고 불필요한 부분을 제거한 후 색소로 염색한다. 최종적으로 형광물질을 통해 SNP 위치별 DNA 시퀀스의 변이(variation)를 이미지 파일로 변환하여 추출하였다. Axiom Analysis Suite 소프트웨어를 통해 이미지데이터에서 유전형 데이터를 추출하고, 해당 데이터를 분석하여 품종 구분 마커 7개 대서양연어의 유전적 변이와 특성을 분석하였다.
하기의 표 2는 <실시예 3>에서 선별된 대서양연어 품종 구분용 7개 SNP 마커의 유전자형 데이터를 확인한 결과로, 각 품종마다 서로 다른 SNP 마커가 존재함을 확인하였으며, 각 유전자형 분석 결과를 품종 구분용 코드로 변환하였다.
| 서열번호 | Major allele(0) | Minor allele(2) | 노르웨이 | 아이슬란드 |
| 1 | C | G | GG(2) | CC(0) |
| 2 | T | G | TT(0) | GG(2) |
| 3 | G | A | AA(2) | GG(0) |
| 4 | T | C | CC(2) | TT(0) |
| 5 | C | G | GG(2) | CC(0) |
| 6 | T | C | CC(2) | TT(0) |
| 7 | A | C | CC(2) | AA(0) |
서열번호 1의 염기서열로 구성되는 SNP는 노르웨이 품종은 GG의 유전자형으로 코드 2로 변환하였고, 아이슬란드는 CC의 유전자형은 코드 0으로 유전자 코드를 부여하였다.서열번호 2의 염기서열로 구성되는 SNP는 노르웨이 품종은 TT유전자형으로 코드 0으로 변환하였고, 아이슬란드는 GG의 유전자형은 코드 2로 유전자 코드를 부여하였다. 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 SNP는 노르웨이 품종은 AA의 유전자형으로 코드 2로 변환하였고, 아이슬란드는 GG의 유전자형은 코드 0으로 유전자 코드를 부여하였다.
서열번호 4의 염기서열로 구성되는 SNP는 노르웨이 품종은 CC의 유전자형으로 코드 2로 변환하였고, 아이슬란드는 TT의 유전자형은 코드 0으로 유전자 코드를 부여하였다. 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 SNP는 노르웨이 품종은 GG의 유전자형으로 코드 2로 변환하였고, 아이슬란드는 CC의 유전자형은 코드 0으로 유전자 코드를 부여하였다.
서열번호 6의 염기서열로 구성되는 SNP는 노르웨이 품종은 CC의 유전자형으로 코드 2로 변환하였고, 아이슬란드는 TT의 유전자형은 코드 0으로 유전자 코드를 부여하였다. 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 SNP는 노르웨이 품종은 CC의 유전자형으로 코드 2로 변환하였고, 아이슬란드는 AA의 유전자형은 코드 0으로 유전자 코드를 부여하였다.
다양한 품종과 변이가 존재하는 대서양연어에 있어 상기 품종에 따라 어종의 육질, 영양성분, 생태학적 특성 등에서 차이가 있어 본 발명에 따른 마커를 이용한 품종 판별 방법은 대서양연어의 품종을 신속하고 정확하게 구분하여 소비자들에게 신뢰성 있는 제품을 제공을 하고 원산지 추적, 유전자원 보존, 연어 자원의 지속 가능한 관리 등에도 기여할 수 있어 관련 산업 종사자 또는 어업인들에 이익 제고에 보탬이 됨으로 산업상 이용가능성이 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (4)
- 서열번호1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 C 또는 G이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 C 또는 G이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 51번째 염기가 A 또는 C이고, 상기 51번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 대서양연어의 품종 판별용 SNP(Single nucleotide polymorphism) 마커 조성물
- 제1항에 기재된 SNP(Single nucleotide polymorphism)염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 대서양연어의 품종 판별용 마이크로어레이
- 제1항에 기재된 SNP(Single nucleotide polymorphism)염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 대서양연어의 품종 판별용 프라이머세트
- ⅰ) 대서양연어의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
ⅱ) 상기 분리된 게놈 DNA들을 주형으로 하고, 제1항의 마커 조성물을 이용하여 Real time PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;
ⅲ) 상기 ⅱ)단계 PCR결과를 바탕으로 각 조성물에 대한 대서양연어 품종별로 유전자형을 분석하는 단계l
ⅳ) 상기 ⅲ)단계에서 분석된 각 유전자형에 코드를 부여하여 대서양연어 품종별 고유 유전자 코드를 설정하는 단계를 포함하는 대서양연어 품종을 판별하는 방법
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| 국내 등록특허번호 제10-2384513호에는 SNP 마커 조성물은 고수온에 내성을 가진 넙치의 유전체선발(genomic selection)에 활용할 수 있으며, 고수온 내성 품종 개발 및 지속적인 생산을 유도할 수 있는 넙치의 고수온 내성 예측용 SNP마커 및 이의용도에 관하여 개시하고 있다. |
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