KR101798644B1 - 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 키트 및 후지 사과의 아조 변이 품종 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물을 이용 시, 유전적 유사도가 높아 표현형에 큰 차이를 보이지 않는 후지 사과의 아조변이 품종을 정확하게 판별할 수 있다. 특히, 후지 사과의 아조 변이 중 조숙계인 홍장군 품종을 판별해낼 수 있어, 향후 국내 후지 사과의 아조 변이 품종의 지식재산권 보호 및 브랜드화 촉진에 기여할 수 있고, 관련 산업의 경쟁력을 확보하는데 이용할 수 있다.

Description

후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물{Composition for determining somatic variants cultivar of Fuji apple}

본 발명은 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 키트 및 후지 사과의 아조 변이 품종 판별 방법에 관한 것이다.

사과(Malus x domestica Borkh.)는 주요 과일 작목 중 하나이다. 한국에서는 1988년 홍로(Hongro)("Spur Earliblaze"×"Spur Golden Delicious")품종이 육성되어 2010년 아리수(Arisoo)("Yoko"×"Senshu") 품종까지 22 품종이 육종되었다. 상기 사과 품종 중 후지(Fuji) 사과는 "랄스 제넷(Ralls Genet)"과 "딜리셔스(Delicious)"의 교배종으로 국내에서 가장 많이 재배되고 있는 품종 중 하나이다. 그러나, 상기 후지 사과의 유전적 단점들로 인해 고품질 사과생산에 어려움을 겪게 되어 국내외에서 다양한 후지 사과 아조변이 품종들이 선발되었다. 후지 사과 및 이의 아조변이 품종들의 유전적 유사성이 높아 표현형의 큰 차이를 보이기 때문에 각각을 식별하는데 큰 어려움이 있다. 품종에 대한 구별성을 확보하기 위한 수단으로는 주로 품종이 지닌 형태적 형질을 비교 평가 해왔는데, 형태적 형질은 그 수가 제한적이고, 대부분의 형질이 다수의 유전자가 관여하는 양적 또는 연속적 형질이며, 이들 형질의 발현이 외부 환경 조건에 의해 영향을 받기 때문에 외부 형태적 형질을 이용한 품종 구분은 제한적으로 활용될 수밖에 없다. 상기의 문제점을 보완하기 위하여, 일부 유럽 국가를 중심으로 주요 작물에 대한 품종 구별, 안정성 검정 및 자국 품종 보호의 목적으로 안정적이고 환경에 영향을 받지 않는 DNA에 근거한 분자표지가 이용되고 있다.

상기 분자 표지는 분자 육종 시스템에서 유용 형질 탐색, 생물의 종 인식, 품종 분류동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등의 목적으로 널리 이용되고 있다. 가장 먼저, 염색체 내 제한효소 인식부위의 변이의 의해 발생하는 염기서열 길이 차이를 이용한 RFLPs(Restriction Fragment Length Polymorphisms) 방법이 개발되었으나 이 방법은 방사선 동위원소를 사용해야 하는 번거로움이 있다. 이후 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 핵산 지문법(fingerprinting)으로서, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA) 방법 등이 개발되었다. 상기 PCR 방법은 10~20여 개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 올리고뉴클레오타이드(이하 프라이머)를 생물체의 DNA 또는 RNA와 결합(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합 효소(Taq DNA Polymerase)를 첨가하여 합성반응이 반복적으로 이루어지게 하는 방법이다. 이것은 다른 방법에 비해 소량의 DNA(1-50ng)만을 요구하며, 간편하고 빠르게 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있다. 그러나, PCR 방법으로 분석하는 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이있고, AFLP(Amplified Fragment Length polymorphism) 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism) 검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다. SSR(single sequence repeat) 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르게 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 되며 이를 동물과 식물의 유전 연구에 활발히 이용하고 있으나, SSR 마커의 수가 적으면 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 단점이 있다. 이에 반해, Indel(insertion　or deletion) 마커는 특정 위치에 있는 DNA의 염기서열 분석을 통해 품종간 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 PCR 프라이머를 제작하는 방법이다. PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하며, resolution power가 SSR 마커보다 더 높아, 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점 보완이 가능하다.

현재 국내육성 사과품종에 대해서는 SSR 분자표지를 이용한 식별이 가능하지만(Ban et al. 2014), 아조변이 품종의 식별은 어려운 실정이다. 또한, S-SAP (retrotransposon based) 분자표지를 이용하여 후지의 아조변이 품종 판별을 시도하였으나(Zhao et al. 2010), 재현성이 낮은 단점이 있어, 후지의 아조변이 품종 판별에 대하여 정확도 및 민감도가 높은 선발 방법이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 사과 품종 중 후지 사과의 아조변이 품종을 효과적으로 판별할 수 있는 방법을 연구한 결과, 후지 사과 및 이의 아조변이 4품종의 염색체 중 특이적 삽입 및 결실 부위를 확인하고, 이에 따른 신규한 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 프라이머 세트를 디자인하였다. 상기 프라이머 세트를 이용 시, 유전적 유사도가 높은 후지 사과의 아조변이 품종을 정확하게 판별할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 후지 사과의 아조 변이 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4 로 표시되는 프라이머 세트;를 포함하는 후지(Fuji) 사과의 아조 변이(somatic variants) 품종 판별용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 후지 사과의 DNA를 추출하는 단계; (2) 상기 (1)의 DNA를 주형으로 하고 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계; (3) 상기 (2)의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하고 후지 사과의 아조 변이 품종을 판별하는 단계; 를 포함하는 후지 사과의 아조 변이 품종 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물을 이용 시, 유전적 유사도가 높아 표현형에 큰 차이를 보이지 않는 후지 사과의 아조변이 품종을 정확하게 판별할 수 있다. 특히, 후지 사과의 아조 변이 중 조숙계인 홍장군 품종을 판별해낼 수 있어, 향후 국내 후지 사과의 아조 변이 품종의 지식재산권 보호 및 브랜드화 촉진에 기여할 수 있고, 관련 산업의 경쟁력을 확보하는데 이용할 수 있다.

도 1은 Hind marker의 위치에 따른 DNA 크기를 나타내고(좌), Hind Ⅲ 마커(marker)를 이용하여 후지 및 후지 아조변이 4품종의 DNA를 추출한 결과(우)를 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 후지 사과 및 이의 아조 변이 4품종의 InDel 영역 분석 과정을 모식화한 도이다.
도 3은 선발된 각 후지 사과 및 이의 아조 변이 4품종의 이형 접합형(Heterozygous) InDel 리드(read)의 피크 패턴을 Fragment Analyzer를 이용하여 후지 사과(A) 및 홍장군(B)의 피크 패턴을 분석한 결과를 나타낸 도이다(1은 후지 사과, 2는 단홍, 3은 한가위, 4는 홍장군, 5는 야타카, 6은 음성 대조군임).

본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4 로 표시되는 프라이머 세트;를 포함하는 후지(Fuji) 사과의 아조 변이(somatic variants) 품종 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 수 있다. 상기 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1은 TGGAGACGGCCTTTATGTATTT로, 서열번호 2는 ATCAGAAATGTGCATGAGAGCC, 서열번호 3은 TGTGTGTCTCCATGTCCAATGATA로, 서열번호 4는 ACCCACCGATCGTTTTGGAC로 나타낼 수 있으며, 상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트는 후지 사과 품종을 판별할 수 있고, 서열번호 3 및 4 로 표시되는 프라이머 세트는 홍장군 품종을 판별할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 "판별"은 분석 대상 생물학적 시료에 있는 후지 사과의 아조변이 품종을 판별하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, "후지(Fuji) 사과"는 롤스 제넷(Ralls Genet)과 딜리셔스(Delicious)의 교배종이다. 1958년 일본에서 육성된 이래 국내에서 많이 재배되는 품종 중 하나이다. 상기 후지 사과는 유전적 특성상 고품질 과실생산이 어려운 단점이 있어, 상기 유전적 단점을 극복하기 위하여, 국내외에 많은 아조변이 품종들이 선발되었다. 그러나, 상기 아조 변이 품종들은 유전적 유사성이 높아 표현형에 큰 차이를 보이지 않아, 식별이 어려운 상태이다.

본 발명에 있어서, "아조 변이(somatic variants)"는 생장중의 가지 및 줄기의 생장점에 유전자 돌연변이가 일어나 둘 또는 셋의 형질이 다른 가지나 줄기가 생기는 것으로, 가지변이라고도 한다. 상기 변이한 부분만을 접붙이기나 꺾꽂이 등으로 번식시키면 모주(母株)와는 형질이 다른 개체를 수득할 수 있는데, 이때 수득한 개체를 품종 또는 계(系)라고 한다.

상기 아조 변이 품종은 착색계, 조숙계, 단과지계 및 대과계 계통으로 분류될 수 있다.

본 발명에 있어서, "착색계"는 착색이 개선된 것으로, 일반 후지에 비하여 착색이 개선된 후지 아조변이 계통을 통틀어 지칭한다. "조숙계"는 일반 후지에 비하여 숙기가 빠른 특징이 있다. "단과지계"는 일반 후지와 비교하여, 가지의 절간장이 짧고 화아분화가 용이한 장점이 있다. "대과계"는 일반 후지보다 과실의 크기가 큰 특징이 있다.

상기 착색계는 단홍(Danhong), 한가위(Hangawi), 아키후-1(Akifu-1), 아오후-5(Aofu-5), 이와후-10(Iwafu-10), 모리호후 3A(Morihofu 3A), 키쿠 8(Kiku 8), 나가후 2(Nagafu 2), 나가후 6(Nagafu 6), 나가후 12(Nagafu 12), 썬 후지(Sun Fuji), 사이라이 후지(Sairai Fuji). 미야마 후지(Miyama Fuji), 챔피온 후지(Champion Fuji), 아키후-47(Akifu-47), 료까(Ryoka no kisetsu), 미시마 후지(Misima Fuji), 로얄 후지(Royal Fuji), 봉촌계 후지(Minemuragei Fuji) 및 마이라 레드(Myra Red)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 품종이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조숙계는 홍장군(Benishogun), 야타카(Yataka), 히로사키(Hirosaki), 료까(Ryoka no kisetsu), 미나키 스퍼 후지(Mimaki Spur Fuji) 및 고을로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 품종이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단과지계는 단홍(Danhong), 스퍼 후지(Spur Fuji), 주빌리 후지(Jubilee Fuji) 및 화랑으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 품종이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 대과계는 천성 품종이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 후지 사과의 아조변이 품종 중 조숙계인 홍장군을 신속 정확하게 판별해낼 수 있는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명은 후지 사과 및 이의 아조 품종인 홍장군을 판별하기 위한 용도인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은 (1) 후지 사과의 DNA를 추출하는 단계; (2) 상기 (1)의 DNA를 주형으로 하고 제 1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계; (3) 상기 (2)의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하고 후지 사과의 아조 변이 품종을 판별하는 단계; 를 포함하는 후지 사과의 아조 변이 품종 판별 방법을 제공한다.

상기 (2) 단계의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), Nested-중합효소연쇄반응(Nested-Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip) 및 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법이고, 바람직하게는 중합효소연쇄반응이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)"은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 후지 사고 및 이의 아조변이체에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH₂O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl₂, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl₂ 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg^{2 +}가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg^{2 +}가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 Triton X-100이 추가로 포함될 수도 있다.

상기 (3) 단계의 분석은 차세대 염기서열 시퀀싱(Next-generation sequencing), 생어 시퀀싱(Sanger sequencing), 단일-분자 실시간 분석법(Single-molecule real-time sequencing), 이온 반도체 분석(Ion semiconductor), 파이로 시퀀싱(Pyrosequencing), SBS(Sequencing by synthesis), SBL(Sequencing by ligation) 및 연쇄 정지반응(Chain termination)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하고, 바람직하게는 차세대 염기서열 시퀀싱 방법을 이용하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "차세대 염기서열 시퀀싱(Next-generation sequencing)"은 Massive parallel sequencing, 대용량 염기서열 분석법, 또는 대규모 병렬형 염기서열 분석법이라고 한다. 하나의 유전체를 무수히 많은 조각으로 분해하여 각 조각을 동시에 읽어낸 뒤, 이렇게 얻은 데이터를 생물 정보학적 기법을 이용하여 조합함으로써 방대한 유전체 정보를 빠르게 해독하는 분석법을 의미한다. 기존의 Sanger 방식과 달리 대량의 병렬 데이터 생산이 가능하고, DNA 서열에 대한 증폭을 하고 그 후 형광 표식 등을 카메라로 찍어 이미지 처리를 하는 과정을 거쳐 염기를 읽어내는 분석법이다.

상기 차세대 염기서열 시퀀싱의 분석 장비는 사용하는 화학 반응 및 염기서열 검출 원리 등 세부 기술에 따라 고유의 특성 및 장단점에 따라 다양한 플랫폼이 출시되었고, 그 예로, Illumina MiSeq sequencer, Illumina의 HiSeq sequencer, Roche 454 GS FLX+ sequencer, Thermo Fisher사의 Ion Torrent PGM sequencer 또는 Illumina Genome Analyser IIx sequencer 등이 있으며, 바람직하게는, Illumina의 HiSeq sequencer 2000을 이용하나, 이에 제한되지 않는다.

(3) 단계의 분석은 재염기서열(Re-sequencing)을 분석하여 후지 사과의 종래 서열(Reference sequence)과 비교하여 삽입(Insert) 또는 결실(Deletion) 변이 위치를 찾아낼 수 있다.

본 발명에 있어서, "재염기서열(Re-sequencing)"은 이미 알려진 종래 서열(Reference sequence)을 참조하여 분석하고자하는 서열을 해석하는 방법으로, 차세대 염기서열 시퀀싱 결과로 수득한 리드(read)를 종래 서열에 맞춰 나가면서 유전체 상의 변이체 연구를 목적으로 사용된다. 본 발명의 목적 상, 후지 사과의 종래 서열과 비교하여, 본 발명의 후지사과 및 이의 아조변이 4품종(단홍, 홍장군, 한가위 및 야타카의 염기서열을 분석하여 삽입(Insert) 또는 결실(Deletion) 변이 위치를 찾아내었다. 이 후, 이를 바탕으로 후지 사과 및 아조변이인 홍장군 품종에 대한 판별용 프라이머 세트를 선발하였다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. DNA 추출

표 1에 나타낸 바와 같이, 후지(Fuji)사과 및 이의 아조변이 4품종(단홍(Danhong), 한가위(Hangawi), 홍장군(Benishogun) 및 야타카(Yataka))의 DNA를 추출하고 이의 DNA양 및 순도를 검정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 농촌진흥청 원예특작과학원에서 경정 배양(shoot tip)한 후지 및 이의 아조변이 4 품종의 어린 잎을 채취하였다. 상기 채취한 어린 잎의 DNA 추출은 Lodhi et al.의 CTAB(cetyl-tri-methyl ammonium bromide) 방법을 변형하여 이용하였다. 시료 100㎎을 액체질소를 이용하여 막자사발에 마쇄한 후 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN Inc., USA)를 이용하여 각각의 DNA를 제조사의 프로토콜을 이용하여 추출하였다. DNA의 정량 및 정성 분석은 Qubit(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) & Tecan F200-nanodrop을 이용하여 확인하였다. 또한, 분광광도계(Spectrophotometer)(SmartSpec Plus, BIO-RAD)를 이용하고, TAE buffer를 가득 채운 머피드(mupid) 장치에 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)을 넣고 genomic DNA 4㎕, 6X 로딩버퍼(loading buffer) 2㎕를 추가한 후 300mA, 125V 조건에서 30분간 전기 영동을 수행하여 후지 및 후지 아조변이 4품종의 DNA 추출을 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, Hind Ⅲ 마커(marker)를 이용하여 후지 및 후지 아조변이 4품종의 DNA를 추출함을 확인하였다.

이 후, 상기 후지사과 및 이의 아조변이 품종 4종의 genomic DNA를 이용하여, 도 2에 나타낸 바와 같이, 일련의 과정을 통하여 후지사과 및 이의 아조변이 품종 4종의 Indel 영역을 분석하고, 본 발명의 후지 사과 아조변이 판별용 프라이머 세트를 선발하였다.

실시예 2. DNA 라이브러리 제작 및 전-유전체의 재염기서열 (whole-genome resequencing) 분석 및 리드 맵핑 (read mapping)

후지 사과 아조변이 판별용 프라이머 세트를 선발하기 위하여, 골든 딜리셔스(Golden delicious)의 기존 게놈(reference genome)을 가진 후지 사과 품종을 대상으로 특정 개체간의 변이를 분석하기 위한 전-유전체 재염기서열(whole-genome resequencing)분석을 위하여, DNA 라이브러리를 제작하고, 차세대 염기서열분석 방법을 이용하여 수행하였다.

보다 구체적으로, 후지 및 이의 아조변이 4 품종의 유전자 염기서열을 분석하기 위하여, 유전체 재염기서열(Re-sequencing) 분석을 위하여, 일루미나(Illumina) 사에서 제공하는 프로토콜에 따라 200 bp 이하의 삽입 사이즈를 갖는 후지 및 이의 아조변이 4 품종의 페어-엔드 시퀀싱 라이브러리(paired-end sequencing library)를 제작하였다.

후지 및 이의 아조변이 4 품종의 DNA을 일루미나 SGS(second-generation sequencing) 플랫폼의 두 레인에 두어 차세대 염기서열분석(Next-generation sequencing)을 수행하였다. 101 bp 의 평균 길이를 갖는 페어-엔드 리드(paired-end reads)를 제작하였다. 그 후, 비가공(raw) 시퀀싱 리드의 정성(quality)을 확인한 후, SolexaQA package(Illumina Inc., USA)를 이용하여 트리밍화(trimmed)하였다. 시퀀싱 정성(quality) 및 길이 트리밍(length trimming)을 위하여, 표준 확률 값을 0.05(0 및 1 사이)로 설정하고, Phred 정성(quality) 점수는 20(0 내지 40 사이)까지로 설정한 후, 최소 리드 길이(bp)는 25 까지로 설정하였다(Cox MP, Peterson DA and Biggs PJ (2010)). 생성된 짧은 리드는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고된 "골든 딜리셔스"를 기준 게놈으로 하여 정렬하였다. 상기 정렬은 50 까지의 갭 확장(gap extensions, -e), 30 까지의 시드 길이(-l), 1 까지의 시드(-k) 내 최대 차이, 64 까지의 스레드(threads)(-t) 수, 6 까지의 미스 매치 페널티(-M), 15 까지의갭 오픈 패널티(gap open penalty)(-O) 및 갭 연장 패널티(gap extension penalty)(-E)로 각 설정한 것을 제외하는 디폴트 파라미터(default parameters)를 이용하였고, Burrows-Wheeler transform (BWA; 0.6.1-r104)을 이용하여 정렬을 수행하였다(Li H, 2009, Bioinformatics 25:1754-1760). 후지 및 이의 아조변이 4 품종의 트리밍 시퀀스에 대한 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2의 트리밍/로우는 트리밍된 리드의 총 길이(Total length of trimmed read)를 로우(raw) 리드의 총 길이(total length of raw read))로 나눈 값을 의미한다. 또한, 게놈 커버리지는 각 샘플의 총 리드 길이(Total read length)를 기존 게놈 크기(약 526Mb)로 나눈 값을 의미한다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 후지 및 이의 아조변이 4 품종 사과에서 생성된 273,000,101 bp의 DNA 시퀀스의 68-Gb 페어-엔드 리드를 확인하였다. 후지품종이 게놈 커버리지(genome coverage)가 약 19.31X로 가장 높았음을 확인하였고, 야타카 품종에서 약 12.90X로 가장 낮은 것을 확인하였다. 평균적으로 트리밍/로우 값이 80%이고, 16.84 X의 게놈 커버리지를 나타냄을 확인하였다. 또한, 92 bp 리드의 충분한 수가 나타났으며, 후지 및 이의 아조변이 4 품종 사과의 트리밍/로우 값은 골든 딜리셔스(Golden delicious)의 기존 게놈(reference genome)에 대하여 맵핑 가치가 있음을 확인하였다.

실시예 3. 전-염색체 정렬(whole-genome Alignment)에 의한 InDels 영역 확인

사과 아조변이 판별용 프라이머 세트 선발을 위하여, 전-염색체 정렬(whole-genome Alignment)을 수행하고 InDels 영역을 발굴하기 위하여, 상기 실시예 2에서 맵핑화되어 정렬된 데이터를 바탕으로, 콜링(calling) 분석하여 유전적으로 의미를 갖는 InDel 영역을 발굴하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2에서 BWA(Burrows-Wheeler transform)를 통하여 정렬한 후, 맵핑화된 리드를 InDel 콜링(calling)하였다. 종래 골든 딜리셔스 서열과 관련하여 각 정렬된 후지 및 이의 아조변이 4 품종의 정렬 데이터에서 InDel 영역을 SAMtools (Trust Sanger Institute, Genome Research Limited, England) pileup2fq를 이용하여 확인하였다. SAMtools version 0.1.16 (r963:234)은 비가공(raw) InDels 영역을 종래 골든 딜리셔스 서열과 관련하여 각 정렬된 후지와 이의 아조변이 4 품종 사이를 SAMtools varFilter를 이용하여 채택하였으며, 디폴트 옵션은 15까지의 갭에 대한 최소 맵핑 정성(minimum mapping quality for gaps)(-q), 1000 까지의 최대 리드 깊이(maximum read depth)(-D), 30 까지의 최소 InDel 스코어 등을 제외하고 수행하였다(Li H, 2009, Bioinformatics 25:1754-1760). 발굴한 후지 및 이의 아조변이 4 품종의 InDel 영역에 대하여 정확성 및 신뢰성을 확인하기 위해, SEEDERS in-house script (SEEDERS Inc., Korea)를 이용하여 깊이(depth), 변이(variation) 및 일치(consensus)를 정성(quality) 분석하였고, 종래 골든 딜리셔스 서열과 관련하여 각 정렬된 후지 및 이의 아조변이 4 품종의 맵핑 데이터를 이용하였다. 총 InDel 매트릭스는 SEEDERS in-house 스크립트를 이용하여 생성하였고, miscalling 값은 종래 방법(Kim JE, 2014, Mol. Cells 37: 36-42)을 이용하여 필터링을 수행하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었고, 표 3의 맵핑된 영역(Mapped region)은 기존 게놈 대비, 리드 맵핑(read mapping) 되어 커버(cover)하는 영역을 의미한다.

그 후, 해당 영역에 맵핑된 거의 모든 리드(read)에서 변이체가 일어난 동형 접합형(Homozygous) InDel 또는 리드(read)의 일부에서 변이체가 일어난 이형 접합형(Heterozygous) InDel 영역을 확인하였다. 이 중 이형 접합형(Heterozygous) InDel 영역을 특이적 InDel으로하여 최종 선발하였다. 또한, 후지 사과 및 이의 아조변이 4품종에서 선발된 최종 선발된 이형 접합형(Heterozygous) InDel 영역을 기존 서열과 비교하여, 각 염색체(chromosome)에서 구체적인 InDel 영역을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 각 품종에서 확인한 총 리드(read)의 약 70%에 해당하는 리드(read)가 실제 맵핑(read mapping)에 이용되었고, 이들은 전체 사과 유전체의 약 70%에 해당하는 영역을 맵핑(mapping)하였음을 확인하여, 후지 및 이의 아조변이 4 품종은 기존 후지 품종 서열과는 다른 변이체(variation)을 갖는 것을 확인하였다.

표 4에 나타낸 바와 같이, 야타카 품종에서 전체 맵핑(mapping)에 리드(read) 수가 가장 적었고, 게놈 커버리지(genome coverage) 영역이 가장 적었음에도 불구하고 가장 많은 InDel을 콜링(calling)한 것을 확인하였다.

실시예 4. 후지 사과와 이의 아조변이 4품종의 이형 접합형(Heterozygous) InDel 영역 비교 및 조합

후지 사과에 대조하여 이의 아조변이 4품종의 이형 접합형(Heterozygous) InDel 영역의 수를 비교하였다. 또한, 아조변이 4품종 각각에 대조하여 이형 접합형(Heterozygous) InDel 영역의 수를 비교하였다.

구체적으로, 실시예 3에서 발굴한 골든 딜리셔스 표준 유전체 대비 탐색된 InDel (Insertion-Deletion) 변이 데이터를 이용하여, 후지 사과에 대조한 이의 아조변이 4품종(후지 및 단홍 대조군, 후지 및 한가위 대조군, 후지 및 홍장군 대조군, 후지 및 야가타 대조군)의 이형 접합형(Heterozygous) InDel 영역의 수를 비교하였다. 또한, 아조변이 4품종 각각에 대조하여(후지에 대한 단홍, 한가위, 홍장군, 야타카 대조군; 단홍에 대한 후지, 한가위, 홍장군, 야타카 대조군; 한가위에 대한 단홍, 후지, 홍장군, 야타카 대조군; 홍장군에 대한 단홍, 한가위, 후지, 야타카 대조군; 및 야타카에 대한 단홍, 한가위, 홍장군, 후지 대조군) 비교 조합하였다. 그 결과를 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.

대조군	이형 접합형(Heterozygous) InDel 영역의 수
후지 및 단홍	8053
후지 및 한가위	8025
후지 및 홍장군	7908
후지 및 야가타	8313

대조군	이형 접합형(Heterozygous) InDel 영역의 수
후지에 대한 단홍, 한가위, 홍장군, 야타카	155
단홍에 대한 후지, 한가위, 홍장군, 야타카	190
한가위에 대한 단홍, 후지, 홍장군, 야타카	156
홍장군에 대한 단홍, 한가위, 후지, 야타카	165
야타카에 대한 단홍, 한가위, 홍장군, 후지	261

표 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 선발된 InDel 을 기준으로 후지 사과를 포함한 아조변이 4 품종을 구분해 낼 수 있는 특이적 InDel 개수는 후지(Fuji)사과는 155개, 단홍(Danhong)은 190개, 한가위(Hangawi)는 156개, 홍장군(Benishogun)은 165개 및 야타카(Yataka)는 261개였으며, 이를 최종 선발하였다.

실시예 5. 사과 아조변이 판별용 프라이머 세트 제작 및 선발

상기 실시예 4에서 수득한 후지 사과 및 이의 아조변이 4품종의 특이적 InDel 영역이 실제로 후지 사과 및 이의 아조변이를 판별할 수 있는지 확인하기 위하여, 프라이머 세트를 제작하고 이를 선발하여 확인하였다.

5-1. 사과 아조변이 판별용 프라이머 세트 제작

상기 실시예 4에서 확인한 후지 사과 및 이의 아조변이 4품종의 특이적 InDel 영역에 대한 사과 아조변이 판별용 프라이머 세트를 제작하기 위하여, 생성물의 크기는 100-400 bp, 프라이머 사이즈는 20-24 bp(20 bp 최적), 멜팅 온도 57-63도(60도 최적)의 조건으로 Primer-BLAST (NCBI)을 이용하여 프라이머를 94개의 프라이머 세트를 디자인하였다.

5-2. 사과 아조변이 판별용 프라이머 세트를 이용한 PCR 수행 및 이의 단편 분석

상기 5-1에서 디자인한 프라이머 세트 중 최적의 프라이머 세트를 선발하기 위하여, PCR을 수행하고 이의 단편을 분석하였다. 구체적으로, 20 ng template DNA, 10 μM의 프라이머 세트 및 1X Hot Start Taq Master Mix (Philekorea Inc., Korea)를 첨가하여 최종 부피가 20 μL인 PCR 반응액을 만들었다. 그 후, PCR 기기를 이용하여 94도, 30초의 변성 조건, 60도, 30초의 어닐링 조건 및 70도, 60초의 연장 조건을 두고 30회 동안 PCR을 수행하여 PCR 산물을 수득하였다. 상기 PCR 산물에 대한 InDel 단편 분석을 수행하기 위하여, PRO Size 2.0 software(Advanced Analytical Technologies)를 이용하여 데이터 형태로 변환하였다. 또한, Fragment Analyzer(Advanced Analytical Technologies, Inc.)을 이용하여 대립 유전자 사이즈 판별은 종래 회귀분석 방법(Ban SH, 2014, Hortic. Environ. Biotechnol. 55: 531-539.)을 이용하여, PRO Size 2.0 software으로 분석하고 후지 사과 및 이의 아조변이 4품종에 대한 선발된 InDel 리드(read)의 피크 패턴을 확인하여 최종적으로 가장 효과적인 2세트를 선발하였다. 그 결과를 도 3 및 표 7에 나타내었다.

	크로모솜 번호(Chromosome No)	기준 위치(Reference position)	프라이머 크기(서열번호)	InDel 변이체(InDel variation)	생성물 크기(Product size (bp))
후지	16	1855749	F: 22mer(1) R: 22mer(2)	20-bp insertion	293
홍장군	15	40542280	F: 24mer(3) R: 22mer(4)	11-bp deletion	394

표 7에 나타낸 바와 같이, 후지의 InDel 영역을 판별하거나, 홍장군의 InDel 영역을 함께 판별하는 2개의 프라이머 세트를 확인하였다. 후지의 InDel 영역을 판별하는 프라이머 세트는 20-bp 삽입(insertion) 영역을 이용하여 후지 사과를 판별할 수 있음을 확인하였다. 또한, 홍장군 품종의 InDel 영역을 함께 판별하는 프라이머 세트는 11-bp 결실(deletion) 영역을 이용하여 홍장군 품종을 판별할 수 있음을 확인하였다.

또한, 도 3의 A에 나타낸 바와 같이, 후지 사과의 피크 패턴이 다른 아조변이 4품종과 상이함을 확인하였다. 또한, B에 나타낸 바와 같이, 홍장군의 피크 패턴이 후지 및 다른 아조변이 3품종과 비교하여 다르게 나타남을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 프라이머 세트는 다른 아조 변이군과 후지사과 및 홍장군의 판별에 사용 가능함을 확인하였다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for determining somatic variants cultivar of Fuji apple <130> 1-283 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Fuji or cultivar Fuji <400> 1 tggagacggc ctttatgtat tt 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Fuji or cultivar Fuji <400> 2 atcagaaatg tgcatgagag cc 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Fuji or cultivar Fuji <400> 3 tgtgtgtctc catgtccaat gata 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Fuji or cultivar Fuji <400> 4 acccaccgat cgttttggac 20

Claims (8)

1. 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4 로 표시되는 프라이머 세트;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 후지(Fuji) 사과의 아조 변이(somatic variants) 품종 판별용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 아조 변이 품종은 조숙계인 것을 특징으로 하는, 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 조숙계는 홍장군(Benishogun)인 것을 특징으로 하는, 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 조성물.
4. 제1항의 조성물을 포함하는 후지 사과의 아조 변이 품종 판별용 키트.
5. (1) 후지 사과의 DNA를 추출하는 단계;
   (2) 상기 (1)의 DNA를 주형으로 하고 제 1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계;
   (3) 상기 (2)의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하고 후지 사과의 아조 변이 품종을 판별하는 단계; 를 포함하는 후지 사과의 아조 변이 품종 판별 방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 (2) 단계의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), Nested-중합효소연쇄반응(Nested-Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip) 및 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 후지 사과의 아조변이 품종 판별 방법.
7. 제5항에 있어서,
   상기 (3) 단계의 분석은 차세대 염기서열 시퀀싱(Next-generation sequencing), 생어 시퀀싱(Sanger sequencing), 단일-분자 실시간 분석법(Single-molecule real-time sequencing), 이온 반도체 분석(Ion semiconductor sequencing), 파이로 시퀀싱(Pyrosequencing), SBS(Sequencing by synthesis), SBL(Sequencing by ligation) 및 연쇄 정지반응(Chain termination)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 후지 사과의 아조 변이 품종 판별 방법.
8. 제5항에 있어서,
   (3) 단계의 분석은 재염기서열(Re-sequencing) 분석하여 후지 사과의 종래 서열(Reference sequence)과 비교하여 삽입(Insert) 또는 결실(Deletion) 변이 위치를 찾아내는 것을 특징으로 하는, 후지 사과의 아조 변이 품종 판별 방법.
   

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