KR101770966B1 - 넙치 성 판별용 유전자 마커 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 형태학적으로 구분하기 어려운 넙치의 유전적 성(sex)을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 단일염기다형성(SNP) 마커를 제공한다.

Description

넙치 성 판별용 유전자 마커 및 방법{Genetic marker and method for identifying the sex in the olive flounder}
본 발명은 유전자 마커 및 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 넙치 성판별용 유전자 마커 및 방법에 관한 것이다.
1980년대 이후, 잡는 어업에 의한 생산량 감소, 원양어업의 침체로 인해 기르는 어업, 즉'양식'이 대안으로 떠오르면서 양식 산업의 기틀을 마련해준 양식대상종이 넙치(Paralichthys olivaceus)이다. 1984년 넙치 인공종묘생산이 개발된 이후로 넙치는 국내 어류양식 생산량의 50% 이상(양식시장규모 약 5,000억원)을 차지하고 있다. 현재 세계 1위 양식생산량과 양식기술을 보유한 국가가 되어 넙치 양식생산성 향상과 양식생산단가를 절감하는 기술을 개발하고 있다. 넙치 암컷은 수컷보다 성장이 빠르고 경제적 가치가 높기 때문에 양식 현장에서는 수컷보다 암컷 종묘를 매우 선호한다. 일반적으로 양식 넙치 종묘의 암수 비율은 거의 1:1이므로 수컷을 성장이 빠른 암컷으로 대체한다면 양식생산단가를 절감할 수 있어, 양식생산성을 크게 향상시킬 수 있을 것이다. 양식현장에서는 넙치의 암컷, 수컷, 및 가짜수컷이 존재하나 외관상으로는 유전적인 암수 구분이 불가능하므로 성 연관 마커를 개발해야 성판별이 가능하다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제1499689호는 넙치 암수 유전체를 비교 분석하여 넙치 종묘의 암수를 유전적으로 판별할 수 있는 단일염기다형성(SNP) 마커를 제공한다.
그러나, 상기 선행기술의 경우 개별적으로 SNP 마커의 유전자형을 분석해서 조합해야 하므로 비용이 많이 소요될 뿐만 아니라 분석시간(총3-5일)도 아주 길다는 단점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 넙치의 유전적 성을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 유전자 마커 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 일 관점에 따르면, ⅰ) 서열번호 3 또는 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 정방향 프라이머, 서열번호 7로 기재되는 핵산서열로 구성되는 역방향 프라이머 및 서열번호 9로 기재되는 핵산서열로 구성되는 프로브; ii) 서열번호 15로 기재되는 핵산서열로 구성되는 정방향 프라이머, 서열번호 17 또는 18로 기재되는 핵산서열로 구성되는 역방향 프라이머 및 서열번호 23으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 프로브; 및 iii) 서열번호 29로 기재되는 핵산서열로 구성되는 정방향 프라이머, 서열번호 31 또는 32로 기재되는 핵산서열로 구성되는 역방향 프라이머 및 서열번호 37로 기재되는 핵산서열로 구성되는 프로브를 포함하는, 넙치 암수 판별용 멀티플렉스 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 넙치 암수 판별용 멀티플렉스 키트로 판별 대상 샘플의 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 단편을 전기영동하는 전기영동 단계; 및 상기 전기영동된 DNA 단편의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 넙치 암수 판별방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, SNP 마커의 유전자형을 분석하여 신속하고 정확하게 넙치의 유전적 성을 판별할 수 있는 성 판별효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 넙치 암수개체들을 이용한 넙치 성연관 SNP 마커들의 association mapping을 분석한 그래프이다. 11115227이 SNP #9, 11148483이 SNP #10, 11185512가 #SNP 11을 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 3개 SNP 마커(5227, 8483, 5512) 영역이 들어있는 넙치의 유전자 합성을 위한 염기서열이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 넙치 성판별 분석을 위한 3개 SNP 마커 증폭을 위한 프라이머 설계의 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 3개 SNP 마커의 민감도를 실시간(real-time) PCR을 통하여 분석한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 3개 SNP 마커의 넙치 특이도를 분석한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 넙치 게놈 DNA를 이용한 3개 SNP 마커의 증폭실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 한번의 반응(one-tube)으로 3개 마커 유전자형을 동시에 증폭하는 넙치 성판별 검사키트의 안정성 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 넙치의 암수 판정을 위해서 3개 SNP 마커의 암수별 멀티플렉스 real-time PCR 결과를 나타내는 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "넙치(Paralichthys olivaceus)"는 가자미목 넙치과에 속하는 바닷물고기로 몸이 넙적하고 눈이 왼쪽으로 몰려 있고 광어(廣魚)라고도 한다. 연안의 조수가 고여 있는 곳으로부터 수심 1,000 m의 심해에까지 서식하며 몸길이는 5 ㎝ 정도인 소형종에서 80 ㎝에 달하는 종류까지 있다. 꼬리지느러미는 등지느러미와 뒷지느러미에서 명확하게 분리되어 있고 몸색깔은 눈 있는 쪽은 갈색 또는 어두운 색이고, 반대쪽은 흰색이다. 산란기는 2-7월이고 남쪽지방이 약간 빠르다. 이 시기에는 수심 20 ~ 70 m의 조수가 잘 통하는 모래진흙ㅇ모래자갈 또는 암초지대로 이동해 산란한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"은 집단 내에서 또는 개체 내의 대립유전자 사이에 특정 좌위의 한 개 염기의 변화가 나타는 것을 의미한다.
발명의 상세한 설명:
본 발명은 일 관점에 따르면, ⅰ) 서열번호 3 또는 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 정방향 프라이머, 서열번호 7로 기재되는 핵산서열로 구성되는 역방향 프라이머 및 서열번호 9로 기재되는 핵산서열로 구성되는 프로브; ii) 서열번호 15로 기재되는 핵산서열로 구성되는 정방향 프라이머, 서열번호 17 또는 18로 기재되는 핵산서열로 구성되는 역방향 프라이머 및 서열번호 23으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 프로브; 및 iii) 서열번호 29로 기재되는 핵산서열로 구성되는 정방향 프라이머, 서열번호 31 또는 32로 기재되는 핵산서열로 구성되는 역방향 프라이머 및 서열번호 37로 기재되는 핵산서열로 구성되는 프로브를 포함하는, 넙치 암수 판별용 멀티플렉스 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 넙치 암수 판별용 멀티플렉스 키트로 판별 대상 샘플의 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 단편을 전기영동하는 전기영동 단계; 및 상기 전기영동된 DNA 단편의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 넙치 암수 판별방법이 제공된다.
본 발명자들은 넙치 암수 구분 단일염기다형성 마커(한국 등록특허 제10-1499689호)를 개발하여, 현장 양식장에서 자연적으로 유도된 가짜수컷을 마커를 이용하여 선별하고, 이것을 암컷과 교배하여 유전적으로 모두 암컷인 종묘를 생산하였다. 이때 사용한 마커의 유전자형 분석법은 직접순서결정법(direct sequencing)으로 하였으며, 이 방법은 개별적으로 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism) 마커의 유전자형을 분석해서 조합해야 하므로 비용이 많이 소요될 뿐만 아니라 분석시간(총3-5일)도 아주 길다는 단점을 보완하기 위하여 한번 반응으로 여러개 SNP 마커를 동시에 조합하여 많은 시료를 분석할 수 있는 편리하고 간편하면서도 정확도가 높은 분석 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 넙치 암수개체들을 이용한 넙치 성 연관 SNP 마커들의 association mapping 분석을 통해 성 연관성이 매우 높은 3개 SNP 마커(5227, 8483, 5512)를 선정하였다(표 1, 표 2, 표 3 및 도 1). 5227의 경우, 정방향 프라이머를 early specific 프라이머로 사용하였고 역방향 프라이머를 공통으로 사용하여 높은 판별효율을 나타내었다(표 1 참조). 또한, 8483 및 5512의 경우, 정방향 프라이머를 공통으로 사용하였고 역방향 프라이머를 early specific 프라이머로 사용하여 높은 판별효율을 나타내었다(표 2 및 3 참조). 따라서 상기 선정된 프라이머를 사용하여 one-tube에서 3개 마커 유전자형을 동시에 분석할 수 있고, 분석시간도 50-60분으로 소요되어 신속하고 정확하게 넙치의 유전적 성을 판별할 수 있는 다중 실시간 중합효소 연쇄반응(multiplex real-time PCR)법을 개발하게 되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: SNP 마커들의 연관 맵핑 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 넙치 암수개체들을 이용한 넙치 성연관 SNP 마커들 중 성 판별 효율이 높은 성연관 SNP 마커를 선별하기 위한 연관 맵핑(association mapping) 분석을 수행하였다. 통계분석 결과 p-value 값의 ??log값을 측정한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 3개 SNP 마커(5227, 8483, 5512)의 값이 14를 나타내어 성판별과 매우 높은 성 연관성을 나타냈다. 따라서, 상기 3개의 마커를 핵심마커로 선별하여 이들 마커들의 염기서열 정보를 양성 대조물질 제조에 사용하였다.
실시예 2: 양성 대조물질의 제조
본 발명의 일 실시예에 따라 바이오니아(bioneer) 유전자 합성 서비스를 이용하여 3개 SNP 영역이 들어있는 넙치 특정염기서열 정보를 토대로 양성대조물질(positive genomic DNA)을 합성하였다. 상기 각각의 합성 유전자는 재생산이 가능하도록 클로닝 벡터에 삽입된 형태로 제조하였으며, 라이프테크놀로지사의 웹 기반(https://www.lifetechnologies.com/kr/ko/home/brands/thermo-scientific/ molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/dna-copy-number-calculator.html)DNA copy number calculator 프로그램을 이용하여 정량 대조물질을 준비하였다(도 2).
본 발명에서 합성된 양성대조물질(5227, 8483, 5512)은 종래 특허(넙치 암수구분 단일염기다형성 마커, 한국 등록특허 제10-1499689호)에서 넙치 성과 연관이 있는 11개 SNP 마커 중에서 암수 성판별의 정확도가 높은 SNP #9, SNP #10, SNP #11이 들어있는 특정 염기서열 정보를 토대로 합성된 것이다(표 5 내지 7 참조).
상기 SNP #9가 들어있는 염기서열은 ornithine decarboxylase antizyme 유전자이고, SNP #10이 들어있는 염기서열은 histone-lysine N-methyltransferase 유전자이며, SNP #11이 들어있는 염기서열은 유전자는 아니고 intergeneic 영역이다. 합성된 양성대조물질의 염기서열에서 특이적 프라이머 및 프로브는 적정 증폭온도에서 3개의 SNP가 동시에 증폭될 수 있도록 다양한 프라이머를 설계하여 선정하였다. 상기 선정된 마커 SNP #9, SNP #10, SNP #11을 이용한 넙치 친어의 유전적 및 생리적 성판별을 비교한 데이터를 하기 표 1 내지 4에 표시하였다.
친어
개체
 생리적 성
 SNP 유전자형 유전적 성
 비고
SNP #9 SNP #10 SNP #11
친어1 암컷 TT AA AA 암컷
친어2 수컷 AT AG AG 수컷
친어3 수컷 AT AG AG 수컷
친어4 수컷 AT AG AG 수컷
친어5 암컷 TT AA AA 암컷
친어6 수컷 AT AG AG 수컷
친어7 수컷 AT AG AG 수컷
친어8 수컷 AT AG AG 수컷
친어9 수컷 AT AG AG 수컷
친어10 수컷 AT AG AG 수컷
친어11 수컷 AT AG AG 수컷
친어12 수컷 AT AG AG 수컷
친어13 수컷 AT AG AG 수컷
친어14 암컷 TT AA AA 암컷
친어15 암컷 TT AA AA 암컷
친어16 암컷 TT AA AA 암컷
친어17 수컷 AT AG AG 수컷
친어18 수컷 AT AG AG 수컷
친어19 수컷 AT AG AG 수컷
친어20 수컷 TT AA AA 암컷 가짜수컷
친어21 수컷 AT AG AG 수컷
친어22 수컷 AT AG AG 수컷
친어23 암컷 TT AA AA 암컷
친어24 암컷 TT AA AA 암컷
친어25 수컷 AT AG AG 수컷
친어
개체
 생리적
성
 SNP 유전자형 유전적
성
 비고
SNP #9 SNP #10 SNP #11
친어26 암컷 TT AA AA 암컷
친어27 수컷 AT AG AG 수컷
친어28 암컷 TT AA AA 암컷
친어29 수컷 AT AG AG 수컷
친어30 수컷 AT AG AG 수컷
친어31 수컷 AT AG AG 수컷
친어32 암컷 TT AA AA 암컷
친어33 수컷 TT AA AA 암컷 가짜수컷
친어34 암컷 TT AA AA 암컷
친어35 수컷 AT AG AG 수컷
친어36 수컷 AT AG AG 수컷
친어37 암컷 TT AA AA 암컷
친어38 수컷 AT AG AG 수컷
친어39 암컷 TT AA AA 암컷
친어40 암컷 TT AA AA 암컷
친어41 수컷 AT AG AG 수컷
친어42 수컷 AT AG AG 수컷
친어43 수컷 AT AG AG 수컷
친어44 수컷 TT AA AA 암컷 가짜수컷
친어45 수컷 AT AG AG 수컷
친어46 수컷 AT AG AG 수컷
친어47 암컷 TT AA AA 암컷
친어48 암컷 TT AA AA 암컷
친어49 암컷 TT AA AA 암컷
친어50 수컷 AT AG AG 수컷
친어
개체
 생리적
성
 SNP 유전자형 유전적
성
 비고
SNP #9 SNP #10 SNP #11
친어51 수컷 AT AG AG 수컷
친어52 수컷 AT AG AG 수컷
친어53 암컷 TT AA AA 암컷
친어54 암컷 TT AA AA 암컷
친어55 수컷 AT AG AG 수컷
친어56 수컷 AT AG AG 수컷
친어57 수컷 AT AG AG 수컷
친어58 수컷 AT AG AG 수컷
친어59 수컷 TT AA AA 암컷 가짜수컷
친어60 암컷 TT AA AA 암컷
친어61 수컷 AT AG AG 수컷
친어62 수컷 AT AG AG 수컷
친어63 수컷 AT AG AG 수컷
친어64 암컷 TT AA AA 암컷
친어65 수컷 AT AG AG 수컷
친어66 수컷 AT AG AG 수컷
친어67 수컷 AT AG AG 수컷
친어68 수컷 TT AA AA 암컷 가짜수컷
친어69 암컷 TT AA AA 암컷
친어70 수컷 AT AG AG 수컷
친어71 암컷 TT AA AA 암컷
친어72 암컷 TT AA AA 암컷
친어73 수컷 AT AG AG 수컷
친어74 수컷 AT AG AG 수컷
친어75 수컷 AT AG AG 수컷
친어
개체
 생리적
성
 SNP 유전자형 유전적
성
 비고
SNP #9 SNP #10 SNP #11
친어76 수컷 AT AG AG 수컷
친어77 수컷 AT AG AG 수컷
친어78 수컷 TT AA AA 암컷 가짜수컷
친어79 암컷 TT AA AA TT
친어80 수컷 AT AG AG AT
친어81 수컷 AT AG AG AT
친어82 암컷 TT AA AA TT
친어83 암컷 TT AA AA TT
친어84 암컷 TT AA AA TT
친어85 암컷 TT AA AA TT
친어86 수컷 TT AA AA 암컷 가짜수컷
친어87 수컷 AT AG AG 수컷
친어88 수컷 AT AG AG 수컷
친어89 수컷 AT AG AG 수컷
친어90 수컷 AT AG AG 수컷
친어91 수컷 AT AG AG 수컷
친어92 암컷 TT AA AA 암컷
친어93 암컷 TT AA AA 암컷
친어94 수컷 AT AG AG 수컷
친어95 암컷 TT AA AA 암컷
친어96 암컷 TT AA AA 암컷
친어97 수컷 TT AA AA 암컷 가짜수컷
친어98 수컷 AT AG AG 수컷
친어99 수컷 AT AG AG 수컷
친어100 암컷 TT AA AA 암컷
실시예 3: 프라이머 디자인
본 발명의 일 실시예에 따라 실시예 1의 SNP 마커를 증폭하기 위한 프라이머를 정방향 또는 역방향으로 디자인하고 양성대조물질을 이용하여 성능을 평가하였다. 먼저, 5527의 경우 정방향, 8483, 5512의 경우는 역방향의 프라이머 세트를 선정하고 증폭산물 내 프로브 합성하였다(도 3). 상기 선정된 프라이머와 프로브 서열은 IDT사의 Oligoanalyzer 3.1 프로그램(http://eu.idtdna.com/site)을 이용하여 Tm 값을 각각 55℃, 60℃ 전후로 조정하였다. 상기 합성된 양성대조물질(5227, 8483, 5512)의 SNP 검출을 위하여 적용된 프라이머 및 프로브의 염기서열 정보를 하기 표 5 내지 7에 표시하였다. 하기 표에서 밑줄로 표기된 염기는 Tm 값의 감소를 위한 임의적 돌연변이이고 볼드체로 표기된 염기서열은 다양한 프라이머를 조합하여 실험한 결과 가장 깨끗하고 정확한 판별 효율을 나타내어 최종적으로 선택한 프라이머와 프로브의 염기서열이다.
명칭 염기서열(5'->3') 서열정보 서열번호
5227-F-F0 GCAAATGCCACAGTTGTGCA 정방향 프라이머 1
5227-F-F1-1 GCAAATGCCACAGTTGTTCA 정방향 프라이머 2
5227-F-F1-2 GCAAATGCCACAGTTGT A CA 정방향 프라이머 3
5227-F-F1-2T GCAAATGCCACAGTTGT A CT 정방향 프라이머 4
5227-F-F2 CAAATGCCACAGTTGTTCA 정방향 프라이머 5
5227-F-F3 AAATGCCACAGTTGTTCA 정방향 프라이머 6
5227-F-R1 TGATCGGGCAATAGGTTAGGT 역방향 프라이머 7
5227-F-R2 GTGAGTGTGCAATCTCCATTAGTTAG 역방향 프라이머 8
5227-F-P1 FAM-TGTGGAGCAGATGTGTGAAACCCA-EBQ 특이 형광프로브 9
5227-F-P2 FAM-TGGCTAACCAAGTCAATTTGTGGT-EBQ 특이 형광프로브 10
명칭 염기서열(5'->3') 서열정보 서열번호
48483-F-F0 CTTCCATCACATGTTAGAAACGTTG 정방향 프라이머 11
48483-F-F1-1 CTTCCATCACATGTTAGAAACGCTG 정방향 프라이머 12
48483-F-F1-2 CTTCCATCACATGTTAGAAACGGTG 정방향 프라이머 13
48483-F-R TGTGAGGGCGTGAATATCTG 역방향 프라이머 14
48483-R-F GTAGATGCAGTATTCAGATAAGCCTG 정방향 프라이머 15
48483-R-R0 TGAGGAATTTGTCCAGAGCAC 역방향 프라이머 16
48483-R-R1-1 TGAGGAATTTGTCCAGAG T AC 역방향 프라이머 17
48483-R-R1-1-T TGAGGAATTTGTCCAGAG T AT 역방향 프라이머 18
48483-R-R1-2 TGAGGAATTTGTCCAGAGAAC 역방향 프라이머 19
48483-R-R1-3 TGAGGAATTTGTCCAGAGCGC 역방향 프라이머 20
48483-R-R1-4 TGAGGAATTTGTCCAGAACAC 역방향 프라이머 21
48483-R-R1-5 AGGAATTTGTCCAGAGTAC 역방향 프라이머 22
48483-R-P1 JOE-CCTTGTTGAGAATAGTCGGCATGGT-EBQ 특이 형광프로브 23
48483-R-P2 JOE-AGTGGCTTTATGAGGCACCTCT-EBQ 특이 형광프로브 24
명칭 염기서열(5'->3') 서열정보 서열번호
85512-F-F0 TAGAAGCAGACCACATAGGTGG 정방향 프라이머 25
85512-F-F1-1 TAGAAGCAGACCACATAGGGGG 정방향 프라이머 26
85512-F-F1-2 TAGAAGCAGACCACATAGGCGG 정방향 프라이머 27
85512-F-R CCAGATCTGTCATTTTACAGTTGCT 역방향 프라이머 28
85512-R-F CCAAAATGAAACAAGCCTGCTC 정방향 프라이머 29
85512-R-R0 TAGGGATGTCCTGTCTCCAC 역방향 프라이머 30
85512-R-R1-1 TAGGGATGTCCTGTCTC T AC 역방향 프라이머 31
85512-R-R1-1-T TAGGGATGTCCTGTCTC T AT 역방향 프라이머 32
85512-R-R1-2 TAGGGATGTCCTGTCTCAAC 역방향 프라이머 33
85512-R-R1-3 TAGGGATGTCCTGTCTCCGC 역방향 프라이머 34
85512-R-R1-4 TAGGGATGTCCTGTCTTCAC 역방향 프라이머 35
85512-R-R1-5 TAGGGATGTCCTGTCTCGAC 역방향 프라이머 36
5512-P1 CY5-TCCGACGAACTGATAACACGGCA-EBQ 특이 형광프로브 37
5512-P2 CY5-CAAGGTCAGATGTACACCCGTCT-EBQ 특이 형광프로브 38
실시예 4: 증폭조건 확립
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 실시예 2에서 제조한 프라이머와 프로브를 이용하여 동시에 증폭이 가능하도록 최적의 증폭조건을 확립하기 위한 실험을 수행하였다. 실시간 PCR을 위한 증폭조성물(20㎕)의 조성은 제이에스 바이오테크사의 HOT-Taq qPCR Master Mix를 적용하여 하기 표 8의 조건으로 수행하였고 증폭온도 조건은 하기 표 9의 조건으로 수행하였다.
조성물 1 rxn 당 첨가량
2ㅧreal-time PCR Master Mix 10 ㎕
5227A(T) (100 ㎛) 0.1 ㎕
5227 (100 ㎛) 0.1 ㎕
5227-FAM (100 ㎛) 0.05 ㎕
8483C(T) (100 ㎛) 0.1 ㎕
8483 (100 ㎛) 0.1 ㎕
8483-JOE (100 ㎛) 0.075 ㎕
5512C(T) (100 ㎛) 0.1 ㎕
5512 (100 ㎛) 0.1 ㎕
5512-CY5 (100 ㎛) 0.075 ㎕
주형 Variable
증류수(DW) Variable
총볼륨 20 ㎕
Holding Stage
95℃ 5분
Cycling Stage (32 cycles)
95℃ 15초
55℃ 1 분
실시예 5: 분석적 성능평가
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 선정된 증폭조건 및 서열정보를 적용하여 3개 SNP 마커를 동시에 확인이 가능하도록 구성한 후 양성대조물질을 이용하여 검출 민감도 및 재현성을 평가하였다. 먼저, 상기 제조한 3개 SNP 마커의 민감도를 분석하기 위해 실시간(real-time) PCR의 양성대조물질의 농도는 107, 105, 103 copy number로 준비하고 강양성, 중간양성, 약양성 조건을 적용하여 8회 반복 후 Ct 값을 확인한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 1 Ct 이내의 편차를 보였으며, 각 농도별에 따라 명확하게 증폭됨을 확인할 수 있었다. 또한, 3개 SNP 마커의 넙치 특이도를 분석하기 위해 해양생물 중 연어, 조피볼락, 새우, 조개 및 human genomic DNA를 적용하여 교차반응성을 확인한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 상기 다른 이종 해양생물 DNA와는 반응하지 않음을 확인하였고, 넙치에서만 마커에 의한 증폭을 확인하였다.
실시예 6: 실시간(real-time) PCR
본 발명의 일 실시예에 따라 양성대조물질을 이용한 실시간 PCR 조건으로 실제 넙치 게놈(genomic) DNA를 이용하였을 때 적용이 되는지를 평가하였다. 구체적으로, 실험 조건은 ABI 7500 real-time PCR 장비를 이용하여 상기 표 5와 6의 조건으로 증폭을 수행하였고 분석 시 Threshold 값은 FAM의 경우 0.3, JOE 0.2, CY5 0.12로 세팅 한 후 진행하였다. 각각의 형광 값의 Ct는 30 이내로 확인된 경우만을 양성으로 판단하였고, 30~32의 경우 샘플의 농도를 증가하여 재실험을 실시하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 넙치 게놈 DNA를 이용하였을 때 양성 또는 음성의 결과가 뚜렷하게 확인되었고 재실험의 경우는 확인되지 않았다.
실시예 7: 안정성 평가
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 개발된 넙치 성별검사 유전자 키트(3개 SNP 마커)의 안정성 평가를 위해서 가속노화 실험을 수행하였다. 실험은 의료기기의 안정성시험 기준(2011.12.29, 식품의약품안전처)에 따라 진행하였고, 가속온도조건(40℃)에서 1일∼7일간 방치 후 3회 반복한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 3개 SNP 마커는 모두 문제없이 증폭되었다. 또한 상기 조건으로 실험한 결과를 영하 20도 보존조건으로 환산하였을 때 하기 표 10에 나타난 바와 같이, 448일로 확인되어 냉동조건으로 1년 이상의 보존조건을 만족하였다.
40℃ 1 일 2 일 3 일 4 일 5 일 6 일 7 일
25℃ 2.8 5.7 8.5 11.3 14.1 17.0 19.8
4℃ 12.1 24.3 36.4 48.5 60.6 72.8 84.9
-20℃ 64.0 128.0 192.0 256.0 320.0 384.0 448.0
실시예 8: 넙치 성판별법 확립
본 발명의 일 실시예에 따라 한 번의 반응(one-tube)으로 3개 마커 유전자형을 동시에 증폭하여 조합하여 분석함으로 넙치 성판별을 더 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 넙치 성판별법을 확립하였다. 먼저, 선택된 서열 중 하기 표 11의 조합으로 동일한 온도 조건에서 실험을 수행하였고 넙치 암수의 성판정은 하기 표 12를 참조하여 판단하였다.
그 결과, 5512T만 양성 값을 나타내어 암컷으로 판정하였고(도 8A) 5227A, 및 8483C의 값이 양성을 나타내어 수컷으로 판정하였으며(도 8B) 5227A, 8483C, 및5512T의 값이 모두 양성을 나타내어 수컷으로 판정하였다(도 8C). 또한 본 발명의 일 실시예에 따라 개발된 멀티플렉스 실시간(real-time) PCR법에 의한 3개 SNP 마커를 이용하여 넙치의 성을 유전적으로 판별한 결과의 정확성을 관찰하기 위하여 직접순서결정법(direct sequencing)과 표현형(genotype)을 비교한 결과, 상기 결과가 서로 100% 일치하는 것으로 나타났다(표 13 및 14 참조). 참고로 직접순서결정법에서 5227 마커의 경우 유전자형이 TT인 경우 암컷, AT와 AA인 경우 수컷으로 판정하고, 8483 마커의 경우 유전자형이 AA인 경우 암컷, AG와 GG인 경우 수컷으로 판정하고, 5512 마커의 경우 유전자형이 AA인 경우 암컷, AG와 GG인 경우 수컷으로 판정한다.
명칭 염기서열(5'->3') 길이 GC% Tm 증폭크기
(bp) 		서열번호
5227A GCAAATGCCACAGTTGTACA 20 45 53.9 116

 3
5227 TGATCGGGCAATAGGTTAGGT 21 47.6 55.7 7
5227-FAM FAM-TGTGGAGCAGATGTGTGAAACCCA-EBQ 24 50 60.8 9
8483C TGAGGAATTTGTCCAGAGTAC 21 42.9 51.8 170

 17
8483 GTAGATGCAGTATTCAGATAAGCCTG 26 42.3 55.1 15
8483-JOE JOE-CCTTGTTGAGAATAGTCGGCATGGT-EBQ 25 48 59 23
5512T TAGGGATGTCCTGTCTCTAT 20 45 51.3 154

 32
5512 CCAAAATGAAACAAGCCTGCTC 22 45.5 55.2 29
5512-CY5 CY5-TCCGACGAACTGATAACACGGCA-EBQ 23 52.2 60.4 37
넙치 성별 5227A 8483C 5512T
암컷 X (PCR 증폭 안됨) X O
수컷 O (PCR 증폭됨) O X
수컷 O O O
넙치 개체
Direct sequencing 의한 유전자형 암수
판정
Multiplex real-time PCR에 의한 Ct값 암수
판정
5227 8483 5512 5227 8483 5512
1 TT AA AA 암컷 - - 26.21 암컷
2 TT AA AA 암컷 - - 26.13 암컷
3 TT AA AA 암컷 - - 26.09 암컷
4 TT AA AA 암컷 - - 26.07 암컷
5 TT AA AA 암컷 - - 25.71 암컷
6 TT AA AA 암컷 - - 26.22 암컷
7 TT AA AA 암컷 - - 25.26 암컷
8 TT AA AA 암컷 - - 26.13 암컷
9 TT AA AA 암컷 - - 26.16 암컷
10 TT AA AA 암컷 - - 25.53 암컷
11 TT AA AA 암컷 - - 25.72 암컷
12 TT AA AA 암컷 - - 23.18 암컷
13 TT AA AA 암컷 - - 25.63 암컷
14 TT AA AA 암컷 - - 26.22 암컷
15 TT AA AA 암컷 - - 26.31 암컷
16 TT AA AA 암컷 - - 25.31 암컷
17 TT AA AA 암컷 - - 25.46 암컷
18 TT AA AA 암컷 - - 25.81 암컷
19 TT AA AA 암컷 - - 24.87 암컷
20 TT AA AA 암컷 - - 25.85 암컷
21 TT AA AA 암컷 - - 26.04 암컷
22 TT AA AA 암컷 - - 26.1 암컷
23 TT AA AA 암컷 - - 25.43 암컷
24 TT AA AA 암컷 - - 25.22 암컷
25 TT AA AA 암컷 - - 24.91 암컷
26 TT AA AA 암컷 - - 25.57 암컷
27 TT AA AA 암컷 - - 25.82 암컷
28 TT AA AA 암컷 - - 26.14 암컷
29 TT AA AA 암컷 - - 25.85 암컷
30 TT AA AA 암컷 - - 25.32 암컷
31 AT AG AG 수컷 24.49 25.35 25.33 수컷
32 AT AG AG 수컷 25.79 26.79 27.03 수컷
33 AT AG AG 수컷 26.81 27.80 27.67 수컷
34 AT AG AG 수컷 26.00 27.00 26.93 수컷
35 AT AG AG 수컷 26.62 27.61 28.04 수컷
36 AT AG AG 수컷 25.39 26.37 26.46 수컷
37 AT AG AG 수컷 25.30 26.33 26.32 수컷
38 AT AG AG 수컷 25.02 25.99 25.93 수컷
39 AT AG AG 수컷 25.33 26.21 26.08 수컷
40 AT AG AG 수컷 25.54 26.58 26.57 수컷
넙치 개체
Direct sequencing 의한 유전자형 암수
판정
Multiplex real-time PCR에 의한 Ct값 암수
판정
5227 8483 5512 5227 8483 5512
41 AT AG AG 수컷 25.39 26.53 26.39 수컷
42 AT AG AG 수컷 25.10 26.10 26.19 수컷
43 AT AG AG 수컷 25.03 25.76 25.87 수컷
44 AT AG AG 수컷 25.24 26.26 26.01 수컷
45 AT AG AG 수컷 25.72 26.73 26.37 수컷
46 TT AA AA 암컷 - - 26.34 암컷
47 AT AG AG 수컷 25.67 26.58 26.33 수컷
48 AT AG AG 수컷 25.17 26.14 26.09 수컷
49 AT AG AG 수컷 24.78 25.71 25.91 수컷
50 AT AG AG 수컷 26.00 27.09 26.99 수컷
51 AT AG AG 수컷 25.61 26.76 26.64 수컷
52 TT AA AA 암컷 - - 25.23 암컷
53 AT AG AG 수컷 25.03 26.13 26.00 수컷
54 AT AG AG 수컷 25.30 26.35 26.20 수컷
55 AT AG AG 수컷 25.12 26.21 26.22 수컷
56 TT AA AA 암컷 - - 25.09 암컷
57 AT AG AG 수컷 25.28 26.44 26.19 수컷
58 AT AG AG 수컷 26.40 27.62 27.65 수컷
59 AT AG AG 수컷 25.18 26.26 24.68 수컷
60 AT AG GG 수컷 25.85 26.71 - 수컷
61 AT AG GG 수컷 25.03 26.19 - 수컷
62 AT AG GG 수컷 24.17 25.28 - 수컷
63 AT AG GG 수컷 24.03 25.30 - 수컷
64 AT AG GG 수컷 23.80 25.00 - 수컷
결론적으로 외부 형태학적으로 암수 구분이 불가능한 넙치의 유전적 성을 한번 반응(one-tube)으로 3개 SNP 마커를 동시에 사용하여 분석함으로써 신속하고 정확하게 판별할 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> Genetic marker and method for identifying the sex in the olive flounder <130> PD16-5396 <160> 38 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5227-F-F0 <400> 1 gcaaatgcca cagttgtgca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5227-F-F1-1 <400> 2 gcaaatgcca cagttgttca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5227-F-F1-2 <400> 3 gcaaatgcca cagttgtaca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5227-F-F1-2T <400> 4 gcaaatgcca cagttgtact 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5227-F-F2 <400> 5 caaatgccac agttgttca 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5227-F-F3 <400> 6 aaatgccaca gttgttca 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5227-F-R1 <400> 7 tgatcgggca ataggttagg t 21 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5227-F-R2 <400> 8 gtgagtgtgc aatctccatt agttag 26 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5227-F-P1 <400> 9 tgtggagcag atgtgtgaaa ccca 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5227-F-P2 <400> 10 tggctaacca agtcaatttg tggt 24 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-F-F0 <400> 11 cttccatcac atgttagaaa cgttg 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-F-F1-1 <400> 12 cttccatcac atgttagaaa cgctg 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-F-F1-2 <400> 13 cttccatcac atgttagaaa cggtg 25 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-F-R <400> 14 tgtgagggcg tgaatatctg 20 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-R-F <400> 15 gtagatgcag tattcagata agcctg 26 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-R-R0 <400> 16 tgaggaattt gtccagagca c 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-R-R1-1 <400> 17 tgaggaattt gtccagagta c 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-R-R1-1-T <400> 18 tgaggaattt gtccagagta t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-R-R1-2 <400> 19 tgaggaattt gtccagagaa c 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-R-R1-3 <400> 20 tgaggaattt gtccagagcg c 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-R-R1-4 <400> 21 tgaggaattt gtccagaaca c 21 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-R-R1-5 <400> 22 aggaatttgt ccagagtac 19 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-R-P1 <400> 23 ccttgttgag aatagtcggc atggt 25 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48483-R-P2 <400> 24 agtggcttta tgaggcacct ct 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85512-F-F0 <400> 25 tagaagcaga ccacataggt gg 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85512-F-F1-1 <400> 26 tagaagcaga ccacataggg gg 22 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85512-F-F1-2 <400> 27 tagaagcaga ccacataggc gg 22 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85512-F-R <400> 28 ccagatctgt cattttacag ttgct 25 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85512-R-F <400> 29 ccaaaatgaa acaagcctgc tc 22 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85512-R-R0 <400> 30 tagggatgtc ctgtctccac 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85512-R-R1-1 <400> 31 tagggatgtc ctgtctctac 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85512-R-R1-T <400> 32 tagggatgtc ctgtctctat 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85512-R-R1-2 <400> 33 tagggatgtc ctgtctcaac 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85512-R-R1-3 <400> 34 tagggatgtc ctgtctccgc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85512-R-R1-4 <400> 35 tagggatgtc ctgtcttcac 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85512-R-R1-5 <400> 36 tagggatgtc ctgtctcgac 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5512-P1 <400> 37 tccgacgaac tgataacacg gca 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5512-P2 <400> 38 caaggtcaga tgtacacccg tct 23

Claims (2)

  1. ⅰ) 서열번호 3 또는 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 정방향 프라이머, 서열번호 7로 기재되는 핵산서열로 구성되는 역방향 프라이머 및 서열번호 9로 기재되는 핵산서열로 구성되는 프로브;
    ii) 서열번호 15로 기재되는 핵산서열로 구성되는 정방향 프라이머, 서열번호 17 또는 18로 기재되는 핵산서열로 구성되는 역방향 프라이머 및 서열번호 23으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 프로브; 및
    iii) 서열번호 29로 기재되는 핵산서열로 구성되는 정방향 프라이머, 서열번호 31 또는 32로 기재되는 핵산서열로 구성되는 역방향 프라이머 및 서열번호 37로 기재되는 핵산서열로 구성되는 프로브를 포함하는, 넙치 암수 판별용 멀티플렉스 키트.
  2. 제1항의 넙치 암수 판별용 멀티플렉스 키트로 판별 대상 샘플의 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계;
    상기 증폭된 DNA 단편을 전기영동하는 전기영동 단계; 및
    상기 전기영동된 DNA 단편의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 넙치 암수 판별방법.
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