CN112877446B - 一种与罗非鱼耐碱性相关的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于水产生物技术领域，公开了一种与罗非鱼耐碱性相关的SNP标记及其应用。所述SNP标记的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示，所述SEQ ID NO：1序列7981bp处或SEQ ID NO：4序列108bp处的SNP位点碱基为T或C。本发明创造性地提供了一种与罗非鱼耐碱性状相关的SNP标记，在此基础上，利用该SNP标记，可以进行耐碱罗非鱼或其亲本的筛选或检测，在罗非鱼的养殖或选育领域，都具有积极的效果，为罗非鱼耐碱分子标记辅助选择育种提供基础，及在此基础上，开发了相应的引物对、方法及相应试剂盒，具有很大的科学价值和商业价值。

Description

一种与罗非鱼耐碱性相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种与罗非鱼耐碱性相关的SNP标记及其应用。

背景技术

罗非鱼原产非洲，属热带性鱼类，罗非鱼属包括亚种共有100多种。罗非鱼具有生成快、产量高、食性杂、疾病少、繁殖力强等特点。罗非鱼是我国主要养殖水产品。其肉质鲜美，少刺，蛋白质含量高，富含人体所需的8种必需氨基酸，其中谷氨酸和甘氨酸含量特别高。近年已成为养殖、加工、出口的热点之一。

目前，罗非鱼的养殖主要集中在广东、广西、海南等温度较高的地区，以池塘精养为主。随着全球水资源的匮乏及气候变暖使得可利用的淡水资源锐减，淡水养殖业面临着严重的水资源短缺。罗非鱼的淡水养殖业将受到很大程度的制约。而我国盐碱水资源十分丰富，约占全国湖泊总面积的55％，但是盐碱水具有高碳酸盐碱度(HCO₃ ^-和CO₃ ^2-)、高pH、离子组成复杂等理化特点，不利于常规鱼类品种的生长，盐碱水域的开发利用存在较大的局限性，绝大部分地区盐碱水资源的利用率依然很低，开发和利用盐碱水资源十分迫切及必要。目前，耐碱种质资源的利用是解决这一问题的重要手段。因此，培育一种适合在盐碱水或海水中养殖的耐碱罗非鱼品种对于这些水域的开发利用和渔业持续发展具有重要意义。

专利CN 108207712 A公开了一种耐盐碱罗非鱼的优良品系选育方法。包括以下步骤：先收集至少三个不同品系尼罗罗非鱼作为选育基础群体，并进行耐盐碱性评估；再对上述不同品系尼罗罗非鱼每年进行一代耐盐碱选育，且连续选育至少两代，其中耐盐碱选育过程包括：繁殖池准备、亲鱼选择与培育、孵苗和捞苗、筛选和强化培养与越冬；再将经耐盐碱选育后的耐盐碱且生长优势明显的不同品系尼罗罗非鱼混合，再进行耐盐碱选育且连续选育至少四代，即为优良品系的耐盐碱罗非鱼。

专利CN 111165401 A公开了一种罗非鱼快速高效选育方法：(1)选择奥利亚罗非鱼作为选育基础群体，选出耐寒性状良好的奥利亚罗非鱼群体；(2)选择YY型超雄尼罗罗非鱼作为选育基础群体，选出耐盐碱性状良好的YY型超雄尼罗罗非鱼群体；(3)利用步骤(1)的鱼群通过自交繁殖建立耐寒奥利亚罗非鱼家系；(4)选择步骤(3)的奥利亚罗非鱼作为母本，步骤(2)的尼罗罗非鱼作为父本，进行杂交，孵化鱼苗，得到耐寒性和耐盐碱性能优良的尼奥鱼。

然而上述传统的选育方法存在选择率低、周期长等问题。因此开发一种选择强度大、不受环境影响、结果可靠、可实现早期选种和提高育种的准确性，以取得更大的遗传进展和更快的育种进程的方法尤为重要。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种与罗非鱼耐碱性相关的SNP标记。

本发明的另一目的在于提供一种检测上述与罗非鱼耐碱性相关的SNP标记的引物对或试剂盒。

本发明的再一目的在于提供上述试剂盒在耐碱罗非鱼亲本筛选或检测中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种与罗非鱼耐碱性相关的SNP标记，所述SNP标记的序列如SEQ ID NO：1或SEQID NO：4所示，所述SEQ ID NO：1序列7981bp处或SEQ ID NO：4序列108bp处的SNP位点碱基为T或C。

该SNP标记为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第7981位碱基或标记为SEQ ID NO：4所示核苷酸序列第108位碱基以Y表示，Y代表T或C。

进一步地，所述罗非鱼为荷那龙罗非鱼。

进一步地，所述SNP标记在SEQ ID NO.1序列的7981bp处或SEQ ID NO.4序列的108bp处为T碱基的是优势等位基因，当罗非鱼个体只含有该SNP位点为T的纯合基因型(即TT基因型)时为耐碱目标选择个体。

更进一步地，所述SNP标记可以包括上述基因序列，例如包括上述7981bp处为T的SEQ ID NO.1序列；或者例如还可以包括通过SEQ ID NO.2序列和SEQ ID NO.3序列扩增得到的序列(SEQ ID NO.4序列)，这样的序列可以为SEQ ID NO.4本身，也可以为包括SEQ IDNO.4序列的SEQ ID NO.1序列。

申请人研究发现，在罗非鱼mTOR基因序列SEQ ID NO.1的7981bp处有一个T(胸腺嘧啶)-C(胞嘧啶)型SNP，该SNP位于基因编码区的3’端，命名为mTOR-T7981C SNP位点。

申请人进一步研究发现，对罗非鱼碱胁迫的实验表明，mTOR基因中7981bp处的SNP位点与罗非鱼耐碱性状有明显的相关性，该位点对应基因型为TT基因型的个体耐碱性能上显著强于TC基因型或CC基因型的个体。

一种检测上述与罗非鱼耐碱性相关的SNP标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列如下所示：

引物1：5’-TTGTTGTATAATTTTACGGT-3’(SEQ ID NO：2)；

引物2：5’-GTATGTGGAGTAATAGATGT-3’(SEQ ID NO：3)。

本发明的引物对，可以用于扩增SNP标记或含有该标记的序列，或用于检测是否具有上述SNP标记的罗非鱼，从而进一步地筛选和/或检测耐碱罗非鱼，或进一步地用于鉴定和/或筛选耐碱罗非鱼亲本。

一种检测上述与罗非鱼耐碱性相关的SNP标记的试剂盒，包括上述引物对。

所述试剂盒包括检测具有上述的SNP标记的试剂，这样的试剂可以包括例如包括引物对在内的PCR扩增试剂、样本DNA提取试剂等，这样的试剂还可以考虑为实现上述筛选和/或检测耐碱罗非鱼或亲本的方法的任何试剂及其组合。

上述试剂盒在耐碱罗非鱼亲本筛选或检测中的应用。

通过检测罗非鱼上述SNP标记对应的基因型，可有效筛选和/或检测得到耐碱的罗非鱼，检测得到上述SEQ ID NO.1的序列的7981bp处对应基因型为TT基因型的罗非鱼为耐碱的罗非鱼或罗非鱼亲本。

另外，SNP是可以从亲代遗传给子代的分子标记，可以通过选择含有目的性状相关的SNP标记的亲本，进行繁殖，以期获得含有这一性状的子代，加快选育的进程。

本发明中优选的TT基因型为纯合体，在后代个体遗传中不会发生分离。因此，通过筛选/检测本发明的SNP标记，能够用于选育耐碱罗非鱼新品种的育种之中，可根据候选亲本在该SNP标记位点上的基因型对罗非鱼亲本进行选择，挑选含有TT基因型的罗非鱼亲本进行配对繁殖，可以获得耐碱能力较强的后代鱼苗，加快培育适合咸水或海水养殖的罗非鱼新品种，既能降低养殖成本，又能节约育种时间。

进一步地，所述应用方法为：

提取罗非鱼DNA，采用SEQ ID NO：2序列和SEQ ID NO：3序列的引物对进行PCR扩增，选择具有SEQ ID NO：1序列的7981bp处碱基多态位点对应基因型为TT基因型或SEQ IDNO.4序列的108bp处碱基多态位点对应基因型为TT基因型的罗非鱼作为耐碱罗非鱼或亲本。

具体地，例如检测出罗非鱼个体的SNP位点碱基多态位点只有T时，即标记位点对应基因型为TT基因型，则判定该检测样本为耐碱罗非鱼，可选做为耐碱罗非鱼繁殖亲本。

进一步地，所述PCR扩增反应体系为25μL的反应体系，具体如下：

进一步地，所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30秒，54℃退火20秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明创造性地提供了一种与罗非鱼耐碱性状相关的SNP标记，不同的基因型与罗非鱼耐碱性状的相关性已经得到证实，在此基础上，利用该SNP标记，可以进行罗非鱼的筛选或检测，或耐碱罗非鱼或其亲本的筛选或检测，在罗非鱼的养殖或选育领域，都具有积极的效果，为罗非鱼耐碱分子标记辅助选择育种提供基础，及在此基础上，开发了相应的引物对、方法及相应试剂盒，具有很大的科学价值和商业价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例SNP标记的作用研究：

所用的荷那龙罗非鱼(Oreochromis hornorum)(500尾)均来自于中国水产科学研究院珠江水产研究所高要水产种质基地。碱度胁迫实验在320cm×200cm×150cm的鱼池中进行。实验前暂养7天，期间溶解氧为8.7±0.6mg/L，水温为28.5±1℃。挑选健康无伤、活泼的罗非鱼进行实验，实验开始后，每20分钟加入预配好的碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液增加池水的碳酸盐碱度，每次提高碱度1g/L，以酸碱滴定法测定水体实际碳酸盐碱度，用1mol/L盐酸溶液(HCl)滴定，并以甲基橙为指示剂检测池水的实际碳酸盐碱度。期间持续充气，不投喂饲料。3小时后开始有罗非鱼死亡，记录每尾罗非鱼的死亡时间、水体碱度、体质量等指标，并取鱼鳍保存于无水乙醇中。碱胁迫条件下，先死亡的100个个体认为是碱敏感组，耐碱性能低，最后死亡的100个个体认为是碱耐受组，耐碱能力强。提取基因组DNA，检测SEQ IDNO.1的7981bp处的SNP位点的等位基因和基因型频率见表1。

表1罗非鱼mTOR-T7981C SNP位点的基因型频率

由以上结果可以看出，mTOR-T7981C SNP位点基因型TT在碱耐受组的基因型频率占89％，而早期死亡的个体中CC基因型占84％，因此可认为该SNP位点与罗非鱼碱耐性状关系密切，该位点对应的基因型TT为碱耐受基因型。

因此，本发明获得的mTOR-T7981C SNP(SEQ ID NO.1的7981bp)分子标记可用来辅助选育罗非鱼耐碱品种，当罗非鱼待测试个体在该位点上的仅检测出T时，也就是其对应的基因型为TT基因型时，则测试个体为耐碱个体，可选择作为罗非鱼耐碱品种的亲本，而mTOR-T7981C SNP(SEQ ID NO.1的7981bp)位点不止为T，还包括C，或者只有C时，也就是说其对应基因型为TC或者是CC基因型时，为碱敏感罗非鱼个体。

实施例2

本实施例对罗非鱼的SNP标记进行筛选/检测：

(一)样品DNA的提取

(1)取待检测样本罗非鱼的鳍条组织3mg，剪碎后，加入0.5mL的裂解液(10mmol/LTris-HCl；0.1mol/L EDTA；0.5％SDS；30mg/L RNase；100mg/L蛋白酶K，pH8.0)，55℃消化1小时；

(2)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)混合物，混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

(3)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟，得到沉淀；

(4)将沉淀用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE(10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解，得到DNA液，可4℃贮存备用。

(二)引物的设计与合成

根据罗非鱼mTOR基因序列(SEQ ID NO.1)设计并合成一对引物，用于扩增SEQ IDNO.1的7981bp或SEQ ID NO.4的108bp位置的SNP位点，引物序列如下：

引物1：5’-TTGTTGTATAATTTTACGGT-3’(SEQ ID NO.2)

引物2：5’-GTATGTGGAGTAATAGATGT-3’(SEQ ID NO.3)

(三)PCR反应：

反应体系(25μL体系)

PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30秒，54℃退火20秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7min。

(四)罗非鱼的基因型分析(筛选/检测)

测序步骤(三)得到的PCR扩增产物(即SEQ ID NO.4序列)，查看测序峰图，分析每尾罗非鱼个体的基因型，根据SEQ ID NO.1序列或SEQ ID NO.4与测得序列的比较结果，在SEQ ID NO.1序列的7981pb为T单峰的个体是TT基因型个体，TC双峰的个体是TC基因型个体，C单峰的个体是CC基因型个体。其中TT基因型个体筛选/检测为耐碱的罗非鱼或罗非鱼亲本，TC或CC基因型个体筛选/检测为碱敏感罗非鱼个体。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种与罗非鱼耐碱性相关的SNP标记及其应用

<130> 2021-3-19

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8193

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gtgaagttcc gtgtgtgtat cgctaactcg agctaattca tcagctagcc aaccttgcgc 60

agtgttggcc aggtagacgt acaatgagag atattccgga taaatcgaat agcagttaag 120

tgttcggcat tgtaatacaa acacattagg ccgtccaaat ggtggtcata tcaggcacag 180

ccactgtgct gcagcagttt gtcagtggac tgaagagtcg aaatgaagac actcgagcaa 240

aatctgccaa agacctgcag cactatgtga ctacagaact cagagagtta agccaagatg 300

aagctactac gttctacgat gagttgaacc accacatatt tgaactggtg tccagctctg 360

atgtggatga aaagaaagga gggattcttg ccatagtgag tctaattgga gttgaaggag 420

gcaatgccac caggatcagt cgattcgcca actacctccg caacctgctc ccttccagcg 480

accccgtggt gatggagatg gcttctaaag ctatgggcca cctttctatg gcgggggaca 540

cctttacagc tgagtatgtg gagtttgaag tgaagagagc tctggaatgg ttgggagccg 600

acagaaatga agggagacgc catgctgcag ttttggtgtt gagggagctg gctgtgagtg 660

cacccacctt cttcttccag caagtccagc cgttctttga caacgtcttt tacgcagtat 720

gggatcctaa gcaggccatc cgagaaggcg ctgtgtctgc cctgcgagcc tgtctcatcc 780

tcaccactca gagagagaca aaggaaatgc agaaaccaca gtggtacaaa caaacctttg 840

aagaggcaga aaaaggcttt gatgagactt tggccaaaga gaaagggatg aatcgtgacg 900

acagggtcca cggcgctctt ctgatcctga atgagctggt tcgcatcagc agcatggagg 960

gagagcgtat gcgcgaggag atggaggaga tcacacagca gcagctggtc cacgataagt 1020

actgcaagga actgatgggg tttggaacaa agccccgcca catcacgccc ttcaccagct 1080

tccagtcggt gcagccgcag cagtccaacg ccctcctggg cttgttgggt tacagcacac 1140

ctcaaggctt ccccagcttt ggggccacac cggcacctgc caagagctct ctggtggaga 1200

gtcgctactg ccgtgagttg atggaggagc gatttgacca ggtgtgtcgg tgggtgctga 1260

aatacaggac cagcaaaaat cctctgatcc agatgaccat cctcaacctg cttccacgct 1320

tggctgcttt ccagccgcat acctttacag accagtattt gtcagacact atgggctacc 1380

tgctgggctg cctgaagaag gagaaggaga ggacggcagc tttccaggct ttggggctgc 1440

tggttgtggc tgtgaggaca gaaatccagc catacctctc caagatcctt gagatcatca 1500

aggctgccct gccacccaag gactttgcac acaagagaca gaagaccatg caggtggatg 1560

ctacagtgtt tacgtgcatt agcatgcttt ctagagccat gggtcccagc atccagccag 1620

acatcaaaga actgcttgag cctatgcttg ctgtgggcct cagtcctgca cttactgcag 1680

tgctgtacga tctgagccgt caaatccccc agctgaagaa agatatacag gatggtttgc 1740

tgaagatgct ctctttggta ttaatgcaca agccgttgcg tcaccctggc atgcccaaag 1800

gcctggctca ccagctagcc tcaccaagcc tcactaacat tccagaggct agtgacgttg 1860

gcagcatcac cctggccctg cgaaccctgg gaagctttga atttgaagga cattccctca 1920

cccagtttgt gcgccactgt gctgatcact tcttgaacag cgaacacaaa gaaatccgaa 1980

tggaggcagc tcggacttgc tcacgcctgc ttactccctc catccacctg atcagcggcc 2040

atgttgtcag ccagaccgct gtgcaggttg ttgcagatgt tctcagcaag ctgctagttg 2100

ttggcatcac tgatccagat ccagatatcc gatattgcgt gctggcatct cttgatgaac 2160

gctttgatgc tcacctcgcc caggctgaaa acttgcaggc gttgtttgtt gctctgaatg 2220

atgaggtgtt tgagatcaga gagctggcaa tctgcacgat cggacgcctg agcagcatga 2280

accctgcctt tgttatgccc ttcctacgca agatgctcat ccagatctta acagaattgg 2340

agcacagcgg tgttggcagg aataaagagc agagtgcgcg tatgcttggt cacctggtct 2400

ccgatgcgcc ccgccttata cgcccttata tggaacccat ccccaaggct ctcatcctca 2460

agcttaaaga cccagaccct aaccccggag tagtcattag tgtccttgca accattggcg 2520

agttggctca ggtgagtggc ctagagatga ggaagtggat ggatgagctt ttcccaataa 2580

ttatggacat gctgcaggac tcatcatcac tggccaagcg acaggtggct ctgtggacac 2640

tgggccagca agtagctagt acaggctatg tggtggagcc ttaccgcaag tacccatccc 2700

ttctagaggt gctgcttaac ttcctcaaga ctgaacaaaa ccagggcatc aggagagagg 2760

ctatacgtgt tctggggctt cttggagccc tggatcccta caaacacaag gtgaatatcg 2820

gcatgatcga ccagtcccga gatgcctctg ctgtcagtct ctcagagtcc aagtccagtc 2880

aggactcggc tgactatagc accagtgaaa tgctagtgaa catgggtaac ctgcccctag 2940

atgagtttta ccctgctgtg gcaatcgtca ctttgatgcg catcctgaga gacccatcac 3000

tctccaacca ccacactatg gtagtccagg cggtcacctt catcttcaaa tctttgggcc 3060

taaagtgcgt ccagttcctg cctcaggtca tgcccacttt tctcaatgtg atccgggtct 3120

gtgatgctag tattcgagag ttcctctttc agcagatggg aatggtcgtg tgctttgtaa 3180

agattcacat ccgtccctat atggatgaca tcttcaccct catcagagaa tactggacac 3240

caaacaaccc catgcagaac accatcatcc tcctgattga gcagattgtg gtggcgctgg 3300

gtggagagtt caagctctat ctccctcagc tcattccaca catgctacgt gtcttcatgc 3360

acgacaacag caccgggcgc agtgttacca tcaagctact caatgccatc cagctgtttg 3420

gtgccaacct agatgactac ctccacttgt tgctgcctcc cattgtcaag ctctttgatg 3480

cccctgatgt tcccctgcag gcgcgcaagg ttgccttgga gacactggac cgactgacag 3540

agtccctgga cttcacagac tacgcttcac gcattatcca cccgatcgtt cggacacttg 3600

acaccactcc agagctgcgt tccacttcca tggacaccct gtcctcgctc gtattccagt 3660

tgggcaagaa gtaccagatc ttcatcccca tggtgaataa agtgatgcta aagcacagga 3720

tcaaccacca gcgttacgac atactcatat gtcgcattgt caagggctat actctggcag 3780

aggaggaaga agaccctcta attttccagc atcgccaggt tcgcggtaac caaggtgacg 3840

ctttggtcag cggaccagta gaggcggggc ctatgaagaa gctccacgtc agcactactg 3900

cacttcagaa ggcttgggga gctgccagga aggtgtccaa agatgactgg ctggagtggc 3960

tgaggcgctt gagtgttgtc ctgctcaaag agtcatcctc cccagctctg cgctcgtgct 4020

ggtcactggc tcagaccaac atccctcttg ccagagacct gttcaatgca gctttcctct 4080

cgtgttggtc tgagctgagt gaggaccagc aggatgagct gatccgcagc attgagttag 4140

cgctcacatc tcaagacatt gctgaggtca cacagacttt gctcaacttg gcagagttca 4200

tggagcacag cgataagggc cctctgcccc tcagagacga taatggcatt gtgctgctcg 4260

gtgagagagc tgccaaatgc cgtgcctatg ccaaggcact gcattacaaa gagctggagt 4320

ttcagaaggg accaaccccc cttatcctgg agtctcttat cagcatcaac aataaactgc 4380

agcagccaga agcagcatct ggggttctgg aatatgccat gaaacatttt ggtgagctgg 4440

aaatccaagc cacctggtat gagaagctgc atgagtggga agatgccttg gtagcatatg 4500

acaagaagat cgacatgaac aaagaggatc cagagctcat cctgggccga atgcgctgct 4560

tagaggctct aggagaatgg ggccagttgc accagcagtg ttgtgaagaa tggacacgtg 4620

tcagtgaaga aacgcaggcc aagatggcgc gcatggctgc tgctgctgcc tggggtctag 4680

gacactggga cagcatggaa gagtacacgt gtatgatccc tagagacacg cacgatgggg 4740

ctttttatag agcggtgtta gcccttcatc aggacctctt ctcattggct caacagtgca 4800

ttgacaaagc aagagacctc ctggatgctg agctgactgc catggcggga gagagctaca 4860

gtcgagccta tggggtcatg gtgtcttgcc agatgttgtc agaactagag gaggtaatcc 4920

agtataagct ggtgccagag agaagggaca tcataaggga aacatggtgg gagaggcttc 4980

agggctatca gcgcattgta gaggattggc agaggatcct aatggtcaga tctctggtca 5040

ttagccccca cgaagacatg aggacctggt tgaaatatgc cagtctttgt ggcaagagcg 5100

gacgcctggc actggcccat aagaccctgg tcctcctcct aggtgttgac ccctccaagc 5160

aacttgatca cccattgcct acaacccacc ctcacgttac ctatgcgtac atgaagtaca 5220

tgtggaagag cggccgcaag atcgacgctt tccagcacat gcagcatttt gtgcaaggag 5280

tacaacagca ggctcaacat gccgttgcag ctgaggacca tcagcggaag caggagctct 5340

acaagctgat ggccagatgt tccttgaagc tgggggagtg gcggctcagt ctgcagggca 5400

tcaatgagag caccatcccc aaagttctgc agtattacag caattcaact gagcatgacc 5460

gcaactggta caaggcttgg cacgcctggg ctgtgatgaa ttttgaggct gtgctgcact 5520

acaaacacca aaaccaaggg cgagatgaaa agaagaagct gcggcacgcc agtggtgcaa 5580

gtgctaatag tgaagccagc aacagcgaca gtgaggttga cagcactgat cccagccctg 5640

tgccctcacc aggtcagaag aaggtcaatg aggacctctc aaagacgttg ctcctgtaca 5700

cagttcctgc tgtgcaaggt tttttccgct ccatttccct gtccagagga aataacttgc 5760

aggacacgct tagggttttg actctgtggt ttgattatgg tcattggccc gaagtgaatg 5820

aagctctggt ggaaggcatc aagaccattc aaatagacac ctggctgcag gtcatcccgc 5880

agcttatagc tcgaatcgac acccctcgag ccctggtggg ccgcctgatc caccagctgc 5940

taactgacat tggacgatat catccccagg ctttgatcta cccactgact gtggcttcaa 6000

agtccaccac taccgcccgc cacaatgctg ccaacaagat cctgaagaac atgtgtgaac 6060

actgcaacac cttagttcag caagctatga tggtgagtga ggagctcatc cgagtggcca 6120

tcttgtggca tgagatgtgg cacgagggcc ttgaagaggc atcacgtctg tacttcggtg 6180

agcgcaacgt caagggcatg tttgctgtgc tggaacccct acatgccatg atggagaggg 6240

gaccacagac cctcaaagag acctctttca atcaggctta tgggagggac ctgatggagg 6300

cacaagactg gtgcaggaag tacatgcgct ctggaaacgt taaagacctg actcaggcct 6360

gggacctcta ctaccacgtg ttcagacgca tctccaagca gctgccacag ctgacctccc 6420

tggagctgca atatgtttct ccaaagctgc tgatgtgtcg agacctggag cttgctgtac 6480

ccggcacttg tgaccccaac cagcctatca ttcgcatcca gtccatcgcc ccctcgctgc 6540

aggtcatcac ctccaagcag cgcccacgca aactcaccat catgggtagt aatggccacg 6600

agttcatgtt cctgttgaag ggccatgagg acttgaggca ggatgagaga gtcatgcagc 6660

tgtttggtct ggttaacacg cttctggcaa acgaccctgc gtccttgcgc aagaacctca 6720

gcattcagcg ctacgcagtg atccccctgt ccaccaactc gggcctgatt ggctgggtgc 6780

cccactgtga caccctgcat gccctcatca gagactacag agagaagaaa aagattttgc 6840

tcaacattga acatcgcatc atgctcagga tggctccaga ctacgaccac ctgacgctga 6900

tggagaaggt ggaggtgttt gaacatgctg tcaataacac agctggagac gacctggcca 6960

agctcttgtg gctcaagagc cccagctctg aggtgtggtt cgacaggagg acgaactaca 7020

ctcgatccct ggctgtgatg tcgatggtgg gctacatcct cggactgggt gacaggcatc 7080

catccaattt gatgttagac cggttaagcg gcaagatcct acacatcgac tttggagact 7140

gttttgaagt ggccatgacc agagaaaagt tccctgaaaa gattcccttc cgactgacta 7200

ggatgctaac caatgctatg gaggtgacgg gcttggatgg taactacagg atcacgtgcc 7260

acacagtgat ggaggtgctg agggagcacc gggacagcgt catggctgtg ctggaggcct 7320

tcgtctacga cccgctgctc aactggaggc ttatggacac aaacaccaaa ggcaccaaac 7380

gctcccgcac caggaccgac tcgtacaccg ccgggcagtc agtggaggct cttgagggaa 7440

ttgaccttgg agagaccacg cacaagaaag cagggaccac agtgcctgag tcgattcact 7500

ccttcattgg agatggcttg gtacaacctg aggcactcaa caagaaggct attcagatta 7560

ttaacagagt gcgagacaaa cttacaggtc gtgacttctc tcatgatgag acgctggatg 7620

tgccgacaca agtagagctc ctcatcaaac aagccacctc acatgaaaat ctgtgccagt 7680

gctacatcgg atggtgcccc ttttggtgaa gaagcgtttc ctccagccag gattgaccct 7740

tgactttctc gcacactgat agatgaagta ggagctctca gctcagattg gtatccactg 7800

gaatgtgtcc actgcagtca agccacagcc taaacaaagt ttttcctctt ttttttctgt 7860

ttggatttct ttgttgttgt ataattttac ggtttgccat ttatgtttat tagaaagtac 7920

ctttagtgct ttgtttttac ctgattatca taatctacca aattttgcag tcattgctca 7980

yaatgacctt tgtaattttt accattatat ttactcgcta aaagctttct acagtggcca 8040

tattgtgatc actaatgaca tctattactc cacatactgt tttcttctcc taaagccacc 8100

agtctgtatc attgtgtatg atgtgacaaa tttcagcaac gtgatatgcc ttttactaac 8160

ttaaacattc ttaaaagggt ttctgatgag cag 8193

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ttgttgtata attttacggt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gtatgtggag taatagatgt 20

<210> 4

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ttgttgtata attttacggt ttgccattta tgtttattag aaagtacctt tagtgctttg 60

tttttacctg attatcataa tctaccaaat tttgcagtca ttgctcayaa tgacctttgt 120

aatttttacc attatattta ctcgctaaaa gctttctaca gtggccatat tgtgatcact 180

aatgacatct attactccac atac 204

Claims (5)

1.一种与荷那龙罗非鱼耐碱性相关的SNP标记，其特征在于：所述SNP标记的序列如SEQID NO：1或SEQ ID NO：4所示，所述SEQ ID NO：1序列7981bp处或SEQ ID NO：4序列108bp处的SNP位点碱基为T或C，上述SEQ ID NO.1序列7981bp或SEQ ID NO：4序列108bp处碱基多态位点对应基因型为TT基因型的荷那龙罗非鱼为耐碱的荷那龙罗非鱼。

2.一种检测权利要求1所述的与荷那龙罗非鱼耐碱性相关的SNP标记的引物对或包含该引物对的试剂盒在耐碱荷那龙罗非鱼亲本筛选或检测中的应用，其特征在于：

所述引物对的核苷酸序列如下所示：

引物1 ：5’-TTGTTGTATAATTTTACGGT-3’，SEQ ID NO：2；

引物2 ：5’-GTATGTGGAGTAATAGATGT-3’，SEQ ID NO：3；

所述应用方法为：通过检测荷那龙罗非鱼SNP标记对应的基因型，检测得到SEQ IDNO.1的序列7981bp或SEQ ID NO：4序列108bp处碱基多态位点对应基因型为TT基因型的荷那龙罗非鱼为耐碱的荷那龙罗非鱼亲本。

3.根据权利要求2所述的引物对或试剂盒在耐碱荷那龙罗非鱼亲本筛选或检测中的应用，其特征在于：所述应用方法为：

提取荷那龙罗非鱼DNA，采用SEQ ID NO：2序列和SEQ ID NO：3序列的引物对进行PCR扩增，选择具有SEQ ID NO：1序列的7981bp处碱基多态位点对应基因型为TT基因型或SEQ IDNO.4序列的108bp处碱基多态位点对应基因型为TT基因型的荷那龙罗非鱼作为耐碱荷那龙罗非鱼亲本。

4.根据权利要求3所述的引物对或试剂盒在耐碱荷那龙罗非鱼亲本筛选或检测中的应用，其特征在于：所述PCR扩增反应体系为25 µL的反应体系，具体如下：

H₂O 19.8µL；

10×PCR Buffer 2.5µL；

4×dNTP，10mmol/L 0.5µL；

Taq酶，5U/µL 0.2µL；

引物1 ，10µmol/L 0.5µL；

引物2 ，10µmol/L 0.5µL；

样本DNA 1.0µL。

5.根据权利要求3所述的引物对或试剂盒在耐碱荷那龙罗非鱼亲本筛选或检测中的应用，其特征在于所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性 2 min；94℃变性30 秒，54℃退火20秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7 min。