KR20230076908A

KR20230076908A - 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체 선발용 마커 및 이의 이용

Info

Publication number: KR20230076908A
Application number: KR1020210161597A
Authority: KR
Inventors: 이긍표; 노형준; 허진혁; 장윤정; 이주희; 유은애; 이수경
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2021-11-22
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2023-06-01

Abstract

본 발명은 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체 선발용 분자 마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물, 프라이머 세트 및 키트와 이를 이용하여 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 분자마커의 제공으로 CAU7975유래 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 계통 및 품종 개발시 직접 병을 접종하지 않아도 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 저항성 유무를 확인할 수 있다.

Description

수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체 선발용 마커 및 이의 이용 {Molecular marker for selecting watermelon line or cultivar resistant to Fusarium oxysporum f. sp. niveum Race 1 and use thereof}

본 발명은 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 선발하기 위한 마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 선발하기 위한 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 조성물, 프라이머 세트, 및 키트와 이를 이용하여 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하는 방법에 관한 것이다.

현재 염기서열 분석법의 발달과 비용의 절감으로 식물의 염기서열 분석이 빠르게 진행되고 있다. 박과 식물의 경우 최근 오이(2009년), 멜론(2012년), 수박(2013년)의 전장 염기서열이 공개되었으며, 최근 게놈의 서열분석을 통한 게놈서열기반 고밀도 유전자지도가 작성되고 있으며, 특히 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 정보의 확보로 다양한 식물 계통, 품종의 구분뿐만 아니라, 분자마커로서의 활용도가 증가되고 있다. 특히, 작물은 다양한 병에 감염되어 수확량 및 품질의 저하가 지속되고 있으며, 이의 방제를 위한 농약의 과다 사용으로 인한 피해가 지속적으로 증가하고 있는 실정이다. 이의 해결을 위한 가장 바람직한 방법은 기존 재배종에는 존재하지 않는 병 저항성 유전자를 포함하는 야생종의 저항성 게놈영역을 교배를 통하여 재배종에 도입하는 병 저항성 계통 육성법이라 할 수 있다. 일반적으로 여교잡 (backcross)을 통하여 병 저항성 게놈영역 도입이 이루어지는데, 이때 지속적인 병 접종을 통한 병 저항성 계통육성이 일반적이라 할 수 있다. 최근의 식물 전체 염기서열 해독에 따라서, 기존의 유전자지도는 고밀도화 되었으며, 이에 따라 특정 형질에 연관된 QTL (quantitative trait loci) 분석에 의해 얻어지는 형질관련 마커도 기존과 달리 매우 연관성이 높은 분자마커 (tightly linked marker)로 개발할 수 있게 되었다. 또한 병 저항성을 부여하는 특정 게놈영역에 대한 후보 유전자들도 찾아볼 수 있게 되었다.

한편, Fusarium oxysporum f. sp. niveum에 의한 덩굴쪼김병(Fusarium wilt)은 전 세계적으로 수박 재배지에서 발생하여 큰 피해를 입히고 있는 식물병으로, Fusarium oxysporum f. sp. niveum은 기주 특이성과 품종에 대한 반응에 따라 총 4개의 race로의 분화가 보고되고 있으며, 이 중 race 1이 가장 세계적으로 광범위하게 수박 덩굴쪼김병을 발생시키는 균으로 알려져 있다. 이 병원균은 토양에서 서식하며 분생포자와 후막포자를 형성하고, 기주가 존재하면 포자에서 발아하여 나온 균사가 뿌리 내 물관으로 침입하여 그 속에서 이동 및 증식하여 기주에 시들음 증상을 초래하여 수박의 재배와 생산의 감소에 막대한 영향을 주고 있다.

현재까지 이러한 수박 덩굴쪼김병을 방제하기 위하여 저항성 대목을 이용한 접목재배, 토양 훈증제 등을 이용하여 토양을 소독하는 화학적 방제, 연작을 피하고 윤작을 하는 등 다양한 방법을 적용하고 있으나, 상기 방법들은 경제적인 비용과 많은 노동력을 요구하므로, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 수박의 육종이 시급한 상황이며, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-1010762호

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 수박 개체를 판별하는 방법을 제공하는데 있다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 3의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 서열번호 4의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 5의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 서열번호 3의 501번째 염기, 서열번호 4의 501번째 염기, 또는 서열번호 5의 501번째 염기를 포함하는 8 내지 100개의 연속된 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 8 및 9로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 12 및 13으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 14 및 15로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 프라이머 세트는 고해상도 융해(High-resolution melting; HRM) 분석용 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 판별하고자 하는 수박으로부터 유전체(genomic) DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 상기 유전체 DNA에서, 서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 또는 서열번호 3의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및 (c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 단계를 포함하는, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 수박 개체를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 단계 (b)는 단계 (a)에서 얻은 유전체 DNA에서 서열번호 4의 501번째 염기 및 서열번호 5의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 (b) 단계는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계는 고해상도 융해, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 수박 덩굴쪼김병균 race 1은 Calhoun Gray 및 PI296341-FR 품종에서 저항성을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 분자마커의 제공으로, 수박 덩굴쪼김병 저항성 계통 및 품종 개발시 직접 병을 접종하지 않아도 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 저항성 유무를 확인하여, 수박 덩굴쪼김병 저항성을 나타내는 수박 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있으므로, 육종에 소요되는 시간, 비용, 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.

또한, 본 발명의 방법으로 선별한 덩굴쪼김병 저항성 수박 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 수박 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에서 사용한 수박 덩굴쪼김병균 race 1의 특성을 검증한 결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 수박 덩굴쪼김병균 race 1이 배양된 모습을, 도 1b는 배양한 수박 덩굴쪼김병균 race 1을 광학현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 수박 덩굴쪼김병균 race 1을 접종하는 방법을 나타낸 것이다 (좌측 상단 → 우측 하단).
도 3은 본 발명에서 사용한 수박 덩굴쪼김병균의 race를 판별하기 위하여 판별기주에 수박 덩굴쪼김병균을 접종한 결과를 나타낸 것이다 (상단 좌측: Sugar Baby, 상단 우측: Charleston Gray, 하단 좌측: Calhoun Gray, 하단 우측: PI296341-FR).
도 4는 본 발명에서 사용한 모본(좌측, PMTd108)과 부본(우측, CAU7975)의 과실 특성을 나타낸 것이다.
도 5는 F2:3 분리집단에서 수박 덩굴쪼김병균 race 1 표현형 지표의 기준이 되는 대표 개체를 나타낸 것이다 (R:저항성, MR:중도저항성, S:감수성).
도 6은 염색체별 ΔSNP-index 값을 나타낸 것이다 (빨간색 선: 신뢰수준 95%, 파란색 선: 신뢰수준 99%).
도 7은 염색체별 G'값의 유의도에 따른 QTL 분포를 나타낸 것이다.
도 8은 SNP를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 HRM 분석을 수행한 결과 얻은 융해 곡선을 나타낸 것이다 (상단:3번 염색체의 7,517,018 지역 SNP, 중간:4번 염색체의 18,095,705 지역 SNP, 하단:10번 염색체의 16,776,298 지역 SNP).

본 발명자들은 수박 덩굴쪼김병에 대한 저항성 및 감수성과 연관된 유의미한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 발굴하고, 상기 단일염기다형성을 이용한 분자마커를 사용하여 덩굴쪼김병에 대한 저항성을 갖는 수박 품종을 선별하기 위한 판별방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 구체적으로, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 계통인 CAU7975와 수박 덩굴쪼김병균 race 1 감수성 계통인 PMTd108을 양친으로 하는 F2 분리집단 및 각 F2 개체를 자가수분하여 얻은 F2:3 분리집단에서 표현형의 차이가 확실히 구분되는 양극단의 개체들을 선발하고 상기 F2 분리집단 및 F2:3 분리집단의 DNA를 추출한(pooling) 후 동량으로 DNA를 혼합하였으며, 양극성의 표현형으로 나타난 개체들 중 저항성으로 판단되는 개체들의 혼합 DNA를 Fon-R1-R(Resistant)-bulk, 감수성으로 판단되는 혼합 DNA를 Fon-R1-S(Susceptible)-bulk라고 명명하였다. 각 추출된 DNA를 Illumina 사의 Novaseq 플랫폼을 사용하여 염기서열 데이터를 생산하였으며, Bowtie 2 v.2.3.5.1프로그램을 사용하여 상기 생산된 염기서열들을 참조서열(reference sequence)와 비교하여 BAM파일을 생산하고, 상기 BAM파일을 토대로 참조서열과 다른 SNP를 발굴하기 위해 VCF(Variant Call Format)을 생산하여 SNP의 차이값(ΔSNP-index)을 계산하여 비교분석하는 방법(SNP-index)을 적용하였다. 그 결과, 수박 덩굴쪼김병균 race 1에 대한 저항성 및 감수성과 연관된 SNP를 확인하였고, 이에 따라 해당 SNP를 확인할 수 있는 프라이머 세트를 개발하여 F2 분리집단에서 검정한 결과 모든 개체에서 수박 덩굴쪼김병에 대한 저항성 및 감수성 여부를 정확하게 판별할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 유전자좌에 특이적으로 차별화되어 나타나는 단일염기다형성 마커 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 SNP 마커 조성물은 수박에 적용되나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “수박(Citrullus lanatus, watermelon)”은 한반도에서 재배되거나 혹은 품종 개량을 목적으로 육종된 수박을 의미하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “다형성(polymorphism)”이란 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미하며, “다형성부위(polymorphic site)”란 상기 대립 유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 “단일염기다형성”, 즉 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “마커”란 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일염기다형성 대립 유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일염기다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성과 같은 개체의 차이를 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 유전자 마커(genetic marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “유전자 마커”는 DNA 마커, 바이오마커, 분자마커 등의 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 마커는 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 형질을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 유전자 마커는 유전현상의 본질인 DNA의 염기서열 차이를 대상으로 개체간 다형성(polymorphism)을 나타내는 방법으로서, 주로 반복되는 단순 염기서열로 이루어진 마이크로새틀라이트(microsatellite)나 유전자 염기서열을 이용한 마커 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 프로브나 SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커가 이용되고 있다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 3의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 SNP 마커 조성물은 서열번호 4의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 5의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 SNP 마커 조성물은 바람직하게는, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위하여, 후술하는 바와 같이, 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 4의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호 5의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합;

서열번호 2의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 4의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호 5의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합; 및/또는

서열번호 3의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 4의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호 5의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 3의 염기서열은 수박의 3번 염색체에 존재하는 염기서열일 수 있으며, 바람직하게는 7.5Mb-9.1Mb 영역일 수 있다. 나아가, 서열번호 4의 염기서열은 수박의 4번 염색체에 존재하는 염기서열일 수 있으며, 바람직하게는 16Mb ~ 18.1Mb 영역; 서열번호 5의 염기서열은 수박의 10번 염색체에 존재하는 염기서열일 수 있으며, 바람직하게는 16Mb~17Mb 영역일 수 있다.

본 발명에 따른 SNP 마커는,

1) 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 염기가 G->T이고, 서열번호 4의 염기서열 내에서 501번째 염기가 T->G이며, 서열번호 5의 염기서열 내에서 501번째 염기가 A->G인 경우;

2) 서열번호 2의 염기서열 내에서 501번째 염기가 G->C이고, 서열번호 4의 염기서열 내에서 501번째 염기가 T->G이며, 서열번호 5의 염기서열 내에서 501번째 염기가 A->G인 경우; 및/또는

3) 서열번호 3의 염기서열 내에서 501번째 염기가 T->G이고, 서열번호 4의 염기서열 내에서 501번째 염기가 T->G이며, 서열번호 5의 염기서열 내에서 501번째 염기가 A->G인 경우, 수박 덩굴쪼김병균 race 1에 대한 저항성이 있는 개체인 것으로 판별할 수 있는바, 상기 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 분자마커로 사용함으로써 품종 개발시 직접 병을 접종하지 않아도 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 저항성 유무를 확인할 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공하며, 바람직하게는, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 8 및 9로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 12 및 13으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 14 및 15로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드” 또는 “폴리뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥의 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 특별히 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 (폴리)뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도, 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15bp 내지 30bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야 한다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 고해상도 융해(High-resolution melting; HRM) 분석용 프라이머 세트일 수 있으나, 본 발명에 따른 SNP를 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “고해상도 융해(High-resolution melting; HRM)”는, PCR에 의해 증폭된 영역 내에 존재하는 DNA 상의 SNP에 따라서, 형광시약과 결합한 증폭산물 DNA를 약 60℃에서 95℃까지 온도를 변화시키며 단일가닥의 DNA로 변성될 때의 형광강도 변화를 측정하는 방법을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 수박 덩굴쪼김병균 race1 저항성 개체를 판별하기 위한 키트를 제공한다.

상기 키트는 본 발명에 따른 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 및 Mg²⁺와 같은 보조인자(cofactor) 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 또는 서열번호 3의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계를 포함하는 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 수박 개체를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 (a) 판별하고자 하는 수박으로부터 유전체(genomic) DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 상기 유전체 DNA에서, 서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 또는 서열번호 3의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및 (c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 단계 (a)에서 얻은 유전체 DNA에서 서열번호 4의 501번째 염기 및 서열번호 5의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에 있어서, (b) 단계의 검출하는 단계는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 것일 수 있으나, 실질적으로 동일한 목적을 달성하기 위한 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 단계는 고해상도 융해, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 본 발명에 따른 SNP 마커 또는 프라이머 세트를 이용하는 것이라면 이제 제한되는 것은 아니다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 수박 덩굴쪼김병균 race 1 확인

1-1. 수박 덩굴쪼김병균 race 1 ( Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 1)의 특성 검정

수박 덩굴쪼김병균 race 1의 특성을 검정하기 위하여, 농촌진흥청에서 분양 받은 수박 덩굴쪼김병균 Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon) Race 1(KACC40901) 균주를 이용하였다. 균주는 PDA(potato dextrose agar, Bacto)배지에 절편체로 치상된 상태로 분양 받았고, 균주를 28℃ incubator에서 7일간 암배양한 뒤, 증식한 균사체에서 0.5~1cm² 크기의 절편체로 잘라 새로운 PDA배지로 계대증식하였다. PDA배지에서 7일간 배양한 균주를 21호 scalpel을 이용하여 균사체를 긁어 100ml PD(Potato Dextrose, Bacto)배지로 계대배양하고 1일 동안 28℃ 150rpm Shaking incubator에서 배양하였다. 이후 배양된 균주 현탁액 10ml을 serological을 이용해 CaCO₃(Calcium carbonate, Bioshop) 3g·L^-1가 첨가된 V8-juice(Campbell Soup co.)배지에 계대배양하여 28℃ 150rpm shaking incubator에서 4일동안 암배양한 뒤 배양액을 멸균된 거즈를 이용해 거르고 hemocytometer를 이용해 광학현미경에서 포자를 관찰하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 식물체를 이용한 균주 재분리를 통해 기 보고된 Fon race 1의 하얀색 원형 균사가 생성된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 균주의 포자를 확인하기 위해 PDA배지와 V8 juice-CaCO₃배지에서 배양한 것을 hemocytometer를 이용하여 확인한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 정상적인 콩팥 모양의 소생분자(microconidia)와 낫 형태인 대생분자(macroconidia)를 확인할 수 있었다.

1-2. 수박 덩굴쪼김병균 race 1의 접종방법

수박 덩굴쪼김병균 race 1 접종에 사용할 균주 현탁액을 제작하였다. 구체적으로, Fon race 1(KACC40901)을 PDA배지에 치상한 후 7일간 28℃ incubator에서 암배양하고 균주의 균사체를 21호 scalpel을 이용해 PDA배지에서 긁어 분리한 뒤, PD배지에 계대배양하였다. 28℃ shaking incubator에서 150rpm으로 1일간 암배양한 후, 균주 현탁액 10ml을 10ml serological pipette을 이용해 V8-juice배지에 계대배양하고 28℃ shaking incubator에서 150rpm으로 4일간 암배양하였다. 배양한 균주를 3겹의 멸균 거즈를 이용해 균사를 제거하고, hemocytometer를 이용해 광학현미경에서 포자의 농도를 확인하였으며, 제작한 균주 현탁액은 수박 덩굴쪼김병을 제외한 병의 발생을 예방하기 위해 멸균수를 이용해 희석하여 사용하였다

도 2에 나타낸 바와 같이, 본엽 1매까지 키운 식물체를 tray에서 뿌리가 다치지 않게 뽑아 뿌리에 있는 상토를 씻어준 뒤, 뿌리에 묻은 물기를 제거하기 위해 휴지로 감싸 시약접시에 올리고 멸균된 가위를 이용해 주근과 측근의 끝을 약 1~2cm 정도 잘라준 후, 균주 현탁액에 15분간 뿌리를 침지 시켰다. 침지하는 동안 5분 간격으로 균주 현탁액을 흔들어 균이 바닥으로 가라앉지 않게 잘 섞었다. 15분 뒤 균주 현탁액에서 식물체를 꺼내 50구 tray에 다시 심는 방법으로 수박 덩굴쪼김병균을 접종하였다.

1-3. 수박 덩굴쪼김병균의 생리적 race 판별

수박 덩굴쪼김병균의 race를 판별하기 위한 판별기주는 Zhou 등 (2010)이 사용한 ‘Sugar Baby’, ‘Charleston Gray’, ‘Calhoun Gray’, 및 ‘PI296341-FR’를 사용하였다. 각 판별기주당 20개체씩 상기 실시예 1-2의 방법으로 1×10⁵ conidia/mL 농도로 균주 현탁액을 접종하였다.

접종 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 접종한 수박 덩굴쪼김병균에 대하여 ‘Sugar Baby’ 및 ‘Charleston Gray’ 에서는 감수성을 나타내고, ‘Calhoun Gray’ 및 ‘PI296341-FR’ 에서는 저항성을 나타내었다. 상기 결과로부터, 사용한 수박 덩굴쪼김병균 균주는 race 1임을 확인할 수 있었다. 수박 품종별 병반응(저항성/감수성)을 이용한 수박 덩굴쪼김병균 race 판별 기준은 표 1에 기재하였다.

실시예 2. 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 표현형 검정 및 지표 설정

기존에 보고된 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성은 1980년에 실시한 Netzer와 weintall의 연구에 의하면 감수성 개체 Mallai와 저항성 개체 Calhoun Gray 및 Summit를 이용해 분리집단을 양성하여 표현형 검정을 실시한 결과, F1개체는 모두 저항성, F2개체는 모두 3:1(저항성:감수성)의 표현형을 보였고, BC1P1개체는 모두 1:1(저항성:감수성)의 표현형을 보여, 단일 우성으로 유전된다고 알려져 있었다 (Netzer and Weintall 1980). 하지만, 2014년에 실시한 Lambel 등의 연구에 의하면 저항성 개체인 HMw017과 감수성 개체인 HMw013을 이용해 분리집단을 양성하고 표현형 검정을 실시한 결과, F1 개체는 모두 저항성, F2개체에서 유래된 F3개체들은 정규 분포의 표현형 결과를 보여, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성은 단일 유전자에 의한 것이 아닌 QTL에 의한 것으로 밝혀졌다 (Lambel et al. 2014).

2-1. 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 표현형 검정

수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 선발계통 CAU7975(부본, P2)의 저항성 유전양상을 밝히기 위하여, 수박 덩굴쪼김병균 race 1에 대해 감수성인 상업계통 PMTd108(모본, P1)과 교배하여 후대분리세대를 확보하였다 (도 4). 구체적으로, 모본과 부본을 교배하여 얻은 F1 집단, F1을 자가수분하여 얻은 F2 집단, 각 F2 개체를 자가수분하여 얻은 F2:3 집단, F1을 모본 또는 부본과 여교잡하여 얻은 BC1P1 집단(P1×F1), 및 BC1P2 집단(P2×F1)을 확보하여 분석대상으로 하였다.

PMTd108(P1)과 CAU7975(P2) 각각 50개체, F1 18개체, BC1P1 85개체, BC1P2 50개체, F2 119개체에 상기 실시예 1-2 방법에 따라 수박 덩굴쪼김병균 race 1을 접종한 후 개체별 표현형 검정을 실시하였다.

표현형 검정을 30dpi(day post inoculation)까지 실시한 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, F1에서 17개체가 감수성, 1개체가 저항성을 나타내었다. 1개체의 저항성은 실험과정의 오류인 것으로 판단되었으며, 17개체가 감수성의 표현형을 나타내었으므로 저항성은 열성 유전인 것을 확인할 수 있었다. 또한, BC1P1에서 13개체가 저항성, 72개체가 감수성의 표현형을 나타내었으므로, 저항성은 단일 유전에 의해 결정되는 것이 아닌 여러 개의 유전자가 관여하는 양적형질유전자좌(QTL)에 의해 결정되는 것으로 추측할 수 있었다.

집단	개체수	표현형
집단	개체수	저항성	중도 저항성	감수성
P1(PMTd108)	50	0	-	50
P2(CAU7975)	50	50	-	0
F1	18	1	-	17
BC1P1	85	13	-	72
BC1P2	50	27	-	23
F2	119	37	-	82

2-2. 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 표현형 지표 설정

상기 실시예 2-1의 후대집단(F1, BC1P1, BC1P2, F2) 개체들에 대한 표현형 검정을 통해 도 5 및 표 3과 같이 표현형 지표를 0점에서 5점까지의 6개 지표로 분류하고 평가하여 저항성, 중도저항성, 감수성으로 구분하였다. 구체적으로, 표현형 지표를 무증상의 정상적인 식물의 경우(0점), 자엽이나 본엽 한 개의 잎에서 위조를 보이는 경우(1점), 자엽이나 본엽 두 개 이상의 잎에서 지속적인 위조를 보이는 경우(2점), 자엽과 본엽 거의 모든 잎의 위조를 보이는 경우(3점), 자엽과 본엽 모든 잎의 위조 및 줄기의 무너짐을 보이는 경우(4점), 식물체가 고사된 경우(5점)로 분류하고 평가하여 0-1점은 저항성(R), 2점은 중도저항성(MR), 3-5점은 감수성(S)으로 설정하였다.

표현형 스코어	분류기준
0	병징이 전혀 없음
1	1개 잎에 위조증상 시작됨
2	1개 이상의 잎에서 연속적인 위조증상이 나타남
3	모든 잎에서 위조증상이 나타나며, 생장이 억제됨
4	모든 잎, 하배축 및 줄기가 위조됨
5	식물체가 고사됨

2-3. F2 집단에서의 병저항성 결과 보완을 위한 F2:3 집단의 병저항성 검정

F2 집단의 각 개체는 하나의 개체를 한 번만 검정하게 되므로 환경에 따른 병반응이 부정확할 수 있어, 최대한 재현성을 확보하고 BSA-seq에 사용할 극저항성을 구분하고자, 상기 실시예 2-1에서 각 F2 개체를 자가수분하여 얻은 F2:3 집단에서 계통별로 15개체씩 임의로 선정하여 표현형 검정을 실시하였다. 표현형 검정은 30dpi까지 실시하였으며, 각 계통별 점수를 이용해 score mean, disease index, survival ratio, 및 score median 4개의 범주로 나누어 데이터화 하였다. “Score mean”은 각 계통 내 개체들의 점수의 합/전체 개체 수×100으로 계산하였고, “disease index”는 100×∑ [(Number of plants with disease rating×Disease rating)/(Total number of plants Highest disease rating possible)]으로 계산하였다. “survival ratio”는 계통 내 저항성의 개체 수/계통 내 전체 개수×100(%)로 계산하였고, “score median”은 계통 내의 반복개체 내의 점수를 오름차순으로 정렬했을 때 가운데에 위치한 값으로 도출하였다. 도출된 계통별 병반응 검정결과는 표 4에 나타내었다.

F2:3 집단의 계통별 병반응 지표 분석 시 저항성과 감수성을 세분화하는데 유리한 지표를 적용하고자 표 4에 나타낸 계통별 병반응 검정결과를 활용하였다. 구체적으로, “score median(스코어 중앙값)”을 저항성과 감수성의 세분화 기준으로 설정할 경우, 극저항성(0), 저항성(0.1이상 2 미만), 감수성(2이상 4미만), 극감수성(5)으로 구분하기 가장 적합하였으며, 표 4에 나타낸 바와 같이, 1계통이 극 저항성(Fon R1-273), 15계통이 저항성, 5계통이 감수성, 97계통이 극감수성(5점)의 표현형을 나타내었다. 상기 결과로부터, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 형질은 비멘델식 유전을 하며, 2개 이상의 비대립 유전자 간의 상호작용에 의한 양적형질의 유전 결과인 것을 추측할 수 있었으며, 극 저항성을 나타낸 Fon R1-273 계통에 대한 저항성 분자마커를 확보하고자 하였다.

No.	F2:3집단의 계통	Score mean (스코어 평균)	Survival ratio (생존률)	Disease index (발병도)	Score median (스코어 중앙값)
1	Fon R1-7	4.8	5.60%	95.6	5
2	Fon R1-10	3	45.00%	60	5
3	Fon R1-11	3.3	40.00%	66	5
4	Fon R1-12	4	25.00%	79	5
5	Fon R1-17	4.8	5.00%	96	5
6	Fon R1-20	1.7	75.00%	33.8	1.5
7	Fon R1-24	2.6	55.00%	52	1.5
8	Fon R1-25	3.6	33.30%	71.7	5
9	Fon R1-29	2.9	43.80%	58.8	5
10	Fon R1-42	2.3	60.00%	46	1.5
11	Fon R1-44	2.9	50.00%	57	3
12	Fon R1-45	5	0.00%	100	5
13	Fon R1-48	3.9	25.00%	78	5
14	Fon R1-50	4.2	20.00%	83	5
15	Fon R1-54	4.2	20.00%	84	5
16	Fon R1-55	3.3	36.80%	66.3	5
17	Fon R1-56	5	0.00%	100	5
18	Fon R1-57	2.6	60.00%	51	1.5
19	Fon R1-58	4	23.50%	80	5
20	Fon R1-59	3.9	25.00%	78	5
21	Fon R1-60	4	25.00%	79	5
22	Fon R1-62	3.4	40.00%	68	5
23	Fon R1-63	4.4	14.30%	88.6	5
24	Fon R1-72	4.5	12.50%	90	5
25	Fon R1-73	5	0.00%	100	5
26	Fon R1-75	3.5	35.00%	69	5
27	Fon R1-87	4.1	20.00%	81.3	5
28	Fon R1-88	3.3	42.90%	65.7	5
29	Fon R1-95	4.1	20.00%	82	5
30	Fon R1-99	3.6	35.00%	71	5
31	Fon R1-100	4.1	21.40%	81.4	5
32	Fon R1-101	3.3	37.50%	66.3	5
33	Fon R1-105	4.9	0.00%	98.7	5
34	Fon R1-106	4.5	13.30%	90.7	5
35	Fon R1-114	3.1	42.90%	61.4	5
36	Fon R1-116	4.5	13.30%	90.7	5
37	Fon R1-117	4.8	5.90%	95.3	5
38	Fon R1-122	4.7	6.30%	93.8	5
39	Fon R1-123	4.8	5.60%	95.6	5
40	Fon R1-136	1.6	76.50%	32.9	1.5
41	Fon R1-137	3.4	40.00%	68	5
42	Fon R1-142	2.8	50.00%	56.7	2
43	Fon R1-144	2.6	58.80%	48.9	1.5
44	Fon R1-146	3.6	30.00%	72	5
45	Fon R1-147	3.1	46.70%	62.7	5
46	Fon R1-151	5	0.00%	100	5
47	Fon R1-152	5	0.00%	100	5
48	Fon R1-161	5	0.00%	100	5
49	Fon R1-167	4.7	6.70%	94.7	5
50	Fon R1-168	2.1	71.40%	42.9	1.5
51	Fon R1-176	2.2	66.70%	44.4	1.5
52	Fon R1-231	5	0.00%	100	5
53	Fon R1-232	5	0.00%	100	5
54	Fon R1-233	3.5	36.80%	70.5	5
55	Fon R1-235	4.4	15.00%	87	5
56	Fon R1-237	5	0.00%	100	5
57	Fon R1-238	5	0.00%	100	5
58	Fon R1-239	5	0.00%	100	5
59	Fon R1-242	4.5	12.50%	90	5
60	Fon R1-243	5	0.00%	100	5
61	Fon R1-245	4.3	16.70%	85.6	5
62	Fon R1-246	3.9	26.70%	78.7	5
63	Fon R1-247	5	0.00%	100	5
64	Fon R1-249	4.2	20.00%	84	5
65	Fon R1-250	4.6	10.00%	92	5
66	Fon R1-251	4.7	6.70%	93.3	5
67	Fon R1-252	3.8	27.80%	76.7	5
68	Fon R1-253	4	25.00%	80	5
69	Fon R1-254	4.3	17.60%	85.9	5
70	Fon R1-256	3.4	38.90%	67.8	5
71	Fon R1-258	3.5	37.50%	70	5
72	Fon R1-260	3.2	41.20%	63.5	5
73	Fon R1-261	5	0.00%	100	5
74	Fon R1-262	5	0.00%	100	5
75	Fon R1-263	2.2	70.60%	43.5	1.5
76	Fon R1-266	4.6	10.00%	92	5
77	Fon R1-270	4.2	20.00%	84	5
78	Fon R1-271	3.5	35.70%	70	5
79	Fon R1-273	0.9	98.40%	7.8	0
80	Fon R1-274	2.5	53.30%	49.3	1.5
81	Fon R1-275	2.3	55.60%	46.7	1.5
82	Fon R1-276	1.7	75.00%	33.8	1.5
83	Fon R1-277	4.8	5.60%	95.6	5
84	Fon R1-279	5	0.00%	100	5
85	Fon R1-280	3.8	31.30%	75	5
86	Fon R1-281	3.5	36.40%	69.1	5
87	Fon R1-283	4.6	9.10%	92.7	5
88	Fon R1-284	2.5	50.00%	50	2.5
89	Fon R1-285	4.5	15.40%	89.2	5
90	Fon R1-286	2.1	68.80%	42.5	1.5
91	Fon R1-287	5	0.00%	100	5
92	Fon R1-288	4.9	0.00%	97.5	5
93	Fon R1-289	1.8	90.40%	22.2	1.5
94	Fon R1-290	3.1	42.90%	62.9	5
95	Fon R1-291	4	22.20%	80	5
96	Fon R1-292	4.4	11.10%	88.9	5
97	Fon R1-294	4.1	22.20%	82.2	5
98	Fon R1-295	3.8	25.00%	75	5
99	Fon R1-296	4.9	0.00%	97.8	5
100	Fon R1-297	4.8	6.30%	95	5
101	Fon R1-299	4.6	8.30%	91.7	5
102	Fon R1-301	5	0.00%	100	5
103	Fon R1-302	2.8	45.50%	56.4	4
104	Fon R1-306	4.4	12.50%	88.8	5
105	Fon R1-310	4	25.00%	80	5
106	Fon R1-311	4.2	20.00%	84	5
107	Fon R1-313	5	0.00%	100	5
108	Fon R1-314	4.6	10.00%	92	5
109	Fon R1-316	4.8	7.10%	95.7	5
110	Fon R1-317	4.8	0.00%	96.9	5
111	Fon R1-319	1.9	73.30%	38.7	1.5
112	Fon R1-321	3.2	41.20%	63.5	5
113	Fon R1-322	5	0.00%	100	5
114	Fon R1-323	5	0.00%	100	5
115	Fon R1-324	3.4	37.50%	67.5	5
116	Fon R1-326	3.6	29.40%	72.9	5
117	Fon R1-327	2.5	50.00%	50	2.5
118	Fon R1-329	2.6	61.10%	52.2	1.5
119	Fon R1-330	4.8	5.00%	96	5

실시예 3. BSA-seq를 통한 후보 유전자좌 탐색

3-1. DNA 추출

DNA 추출을 위해 식물체 잎 85mg의 샘플을 2ml 튜브(Eppendorf, 독일)에 넣고 액체질소를 이용하여 동결시킨 뒤 오토밀(Automill; Tokken, 일본)을 이용하여 마쇄 하였다. 식물체를 마쇄한 후 65℃ DNA 추출 버퍼(1.5M NaCl, 200mM Tris-HCl, 50mM EDTA, 2% SDS, 2% β-mercaptoethanol, 300mM potassium acetate) 850㎕를 상기 샘플과 65℃에서 20분간 반응시켰다. 반응 완료 후 PCI(Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol = 25 : 24 : 1, v/v/v) 900㎕를 첨가하여 섞어준 뒤, 4℃, 13,000rpm에서 원심분리 하였다. 그 후 상등액을 새로운 1.5ml 튜브(Sarstedt, 독일)에 옮겨준 뒤, 상등액과 동량의 아이소프로판올(Isopropanol)을 첨가하여 섞어 주고 -20℃에서 20분간 정치하였다. 이후 4℃, 13,000rpm으로 원심분리하여 펠릿(pellet)을 수득하였다. 이를 70% 에탄올을 이용하여 4℃, 13,000rpm에서 1분간 세척하여 주고, 에탄올을 제거한 뒤 600㎕의 1xTE(Tris-EDTA) 버퍼로 펠릿을 녹여 주었다. 이후 10mg/ml의 RNase A 1㎕를 첨가하여 37℃ 항온수조에서 15분간 처리하고, 상등액과 동량의 PCI를 이용하여 위와 같은 방법으로 정제를 진행하였다. 이후 사용한 PCI와 동량의 CI(Chloroform : Isoamylalcohol = 24 : 1, v/v)를 넣어 주어 4℃, 13,000rpm에서 원심분리를 진행하고, 상등액을 새로운 1.5ml 튜브에 옮긴 다음, 상등액 1/10 만큼의 5M NaCl과 동량의 아이소프로판올을 넣고 섞어 준 뒤 -20℃에서 20분간 정치하였다. 그 후 상기와 같은 방법으로 세척을 진행하고, 50㎕의 1xTE에 펠릿을 녹여 DNA 추출을 완료하였다. DNA의 품질은 전기영동 및 분광 광도계(Spectrophotometer; DS-11, 28 DeNovix, 미국)를 이용하여 확인하였고, 정량은 형광 광도계(flourometer; Qubit^®2.0, Invitrogen, 미국)를 이용하여 측정하였다.

3-2. BSA를 위한 시퀀싱 라이브러리(Sequencing library) 제작

NGS를 이용한 BSA(Bulked Segregant Analysis)는 목적하는 표현형의 분리가 나타나는 집단에서 양극단 표현형을 보이는 개체를 선발하고, 선발한 개체의 DNA를 추출한 후 같은 표현형을 보이는 개체별로 DNA를 풀링(pooling) 한다. 이렇게 풀링된 DNA를 각각의 DNA 벌크(bulk)라 하고, 이를 시퀀싱하여 SNP의 차이를 분석하는 방법이다. 두 벌크는 서로 다른 표현형과 유전자형을 가지고 있기 때문에 분리집단에서 선발된 개체의 표현형과 유전자형을 비교·분석하여 목적형질의 유전자좌를 찾을 수 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 BSA 분석을 위하여 F2 분리집단과 F2:3 분리집단에서 감수성 표현형을 보이는 개체와 저항성 표현형을 보이는 개체를 각각 21개체씩 선발하여 그룹을 나누어 상기 실시예 3-1의 방법에 따라 DNA 추출과 QC(Quality control)를 진행하였다. 그 후 각 그룹별 DNA pooling을 진행하였으며, 저항성 표현형의 DNA를 pooling한 것을 Fon-R1-R(Resistant)-bulk, 감수성 표현형의 DNA를 pooling한 것을 Fon-R1-S(Susceptible)-bulk로 명명하였다. 구체적으로, DNA pooling은 개체별로 동량의 DNA를 사용했고, 추출한 DNA를 20 ng/ul으로 희석한 뒤, 개체별로 142 ng의 DNA를 준비하여, 이를 저항성 및 감수성 벌크별로 동량의 DNA를 pooling하였다.

각 벌크당 3 ug의 DNA를 준비하여 차세대염기서열분석(NGS; next generation sequencing)을 ㈜마크로젠에서 운용하는 Illumina사의 Novaseq 플랫폼에서 whole genome re-sequencing(전게놈 염기서열 재분석)하였다. 또한, 정확한 서열정보의 획득을 위하여 모본(PMTd108, P1) 및 부본(CAU7975, P2)에 대해서도 동일한 방법으로 NGS 분석을 진행하였다.

Fon-R1 R-bulk와 Fon-R1 S-bulk를 re-sequencing한 결과를 Bowtie 2 v.2.3.5.1 프로그램을 이용하여 정렬하고, 유전자 분석 툴킷(Genome analysis toolkit, GATK)를 통하여 도출된 서열과 수박의 reference genome 97103 ver. 2 (http://cucurbitgenomics.org/)의 서열을 이용해 BAM 파일을 만들어내어, 생산된 BAM 파일로 리드(read)들을 맵핑(mapping)한 후 VCF(Variant Calling Format) 파일을 얻었다.

3-3. ΔSNP-index 비교를 통한 후보 유전자좌 탐색

SNP-index란 벌크의 시퀀싱을 통하여 도출된 정렬(align)된 리드(read)의 개수에서 SNP가 발견된 대체 서열(alternative sequence)을 가진 리드의 비율을 말하며, SNP-index를 이용하여 두 벌크의 SNP-index 값의 차를 구함으로써 후보 유전자좌를 결정할 수 있으며, 두 벌크의 SNP-index 값의 차를 ΔSNP-index라고 한다.

상기 실시예 3-2에서 얻은 DNA 풀인 Fon-R1 R-bulk 및 Fon-R1 S-bulk를 가지고 BSA-NGS를 수행하여 얻은 VCF 파일로 ΔSNP-index를 구하였다. QTLseqr 도구를 사용해 슬라이딩 윈도우(sliding window) 기법으로 ΔSNP-index 값을 계산한 후, R script에서 신뢰구간 및 유의수준의 통계적 처리에 의해 수박 덩굴쪼김병 저항성 형질에 관여하는 유전자좌를 분석하고자 하였다. ΔSNP-index는 신뢰수준 95%와 99%를 기준으로 하였고, G’값은 임계값(Threshold)를 설정하여 후보 유전자좌를 탐색하였다. 95%와 99% 신뢰수준에서 R-software의 ggplot2 package를 이용해 시각화 하였다. 또한, 유전체내의 variants와 표현형의 상관관계를 분석하기 위해 2011년 Magwene 등이 소개한 회귀분석을 통해 G’값을 도출하였다 (Magwene et al., 2011).

Fon-R1-R-bulk와 Fon-R1-S-bulk의 sequencing 데이터와 수박 reference genome에 정렬(align)된 리드(reads)데이터로 유전체내에서 ΔSNP-index 값(도 6)과 G’값(도 7)을 이용하여 표현형과 유전자형 간에 높은 유의성을 갖는 지역을 확인한 결과, ΔSNP-index 값에서 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성에 관여하는 유전자좌는 1에 수렴하고 높은 피크(peak)를 보였으며, 99%의 신뢰구간을 넘는 유의미한 유전자좌는 3번 염색체의 약 0.5Mb~4.4Mb지역과 약 7.5Mb~9.1Mb지역, 10번 염색체의 약 7Mb지역과 16Mb~17Mb지역에서 도출되었다. 또한, 95%의 신뢰구간 또는 G’ 검정에서 유의미하게 추가적으로 도출된 유전자좌는 4번 염색체의 약 1.6Mb~2.0Mb, 16~ 18.1Mb, 20Mb~21Mb지역, 6번 염색체의 약 5.6Mb-7.5Mb지역으로 나타났다. 이후, 후보 유전자좌의 최종 선택을 위해 HRM 기법을 이용하여 F2 분리집단에서 HRM 분석을 수행하였다.

실시예 4. HRM(High-resolution melting) 분석을 통한 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 형질 연관 유전자 마커 개발

상기 실시예 3에서 수행한 BSA-seq 결과를 통해, 3번 염색체와 10번 염색체에서 신뢰구간 99%를 넘는 유의미한 후보 유전자좌를 도출하였고, 4번 염색체와 6번 염색체에서 신뢰구간 95%를 넘는 유의미한 후보 유전자좌를 도출하였다. 3번 염색체와 10번 염색체에서 나타난 높은 ΔSNP-index 값과 유의성으로부터 해당 염색체들에서 도출된 후보 유전자 영역은 major QTLs로 판단된 반면, 4번 염색체와 6번 염색체에서 도출된 유전자 영역은 minor QTLs로 예상되었다. 3번, 4번, 6번 및 10번 염색체에서 도출한 후보 유전자좌 지역에서 가장 유의성이 높게 나타난 SNP 주변 영역을 대상으로 총 22개 세트의 SNP 판별용 HRM marker(프라이머)를 제작하였고, HRM 분석방법으로 F2 개체들에 대한 유전자형 분석을 수행하였다. 제작한 22개의 SNP 판별용 HRM marker 중 수박 덩굴쪼김병균 race1 저항성 개체를 선발하기 위한 신규 유전자 마커로 최종 선정된 SNP 판별용 HRM marker를 표 5에 나타내었다.

No.	분석 방법	염색체	지역(bp)	SNP	프라이머	서열 (5’ to 3’)	길이
1	BSA-seq	3	7,517,018 (서열번호1)	G->T	R1-3-734-F	AAACAAAACACTAACGGTTTCTATCT	26
					(서열번호 6)
2					R1-3-734-R	TTTGTCAAAAATACCTTTGAAGTTT	25
					(서열번호 7)
3	BSA-seq	3	8,554,295 (서열번호 2)	G->C	R1-3-496-F	TTCTTCAGGATGCCAAATCC	20
					(서열번호 8)
4					R1-3-496-R	TTTTGTGGACAGAAGAACTGAAA	23
					(서열번호 9)
5	BSA-seq	3	9,016,957 (서열번호 3)	T->G	R1-3-163-F	TGGGGGATGATTGTCTTTTC	20
					(서열번호 10)
6					R1-3-163-R	TCAACCACTCATCCGATCAA	20
					(서열번호 11)
7	BSA-seq	4	18,095,705 (서열번호 4)	T->G	R1-4-832-F	GCGTAACGGTAAAACGGAAC	20
					(서열번호 12)
8					R1-4-832-R	GAGGTATTTTTACCCCCGAGTT	22
					(서열번호 13)
9	BSA-seq	10	16,776,298 (서열번호 5)	A->G	R1-10-113-F	TTGCCCCAGATTACACAATG	20
					(서열번호 14)
10					R1-10-113-R	AAAATCGCTTCGGAGCATAA	20
					(서열번호 15)

상기 실시예 3의 유전형 분석과 표현형 검정 결과를 토대로 단일 유전자 저항성이 아닌 2개 이상의 열성 유전자가 관여하는 비대립 유전자의 상호작용에 의한 저항성으로 판단하여, 상기 실시예 3에서 도출한 3번 염색체, 4번 염색체, 6번 염색체 및 10번 염색체의 후보 유전자좌 중 가장 유의성 있는 3번 염색체, 4번 염색체, 및 10번 염색체의 유전자좌에서 제작한 SNP marker를 이용하여 F2 분리집단의 개체들을 대상으로 유전자형 검증을 실시하였다.

선정된 F2 개체는 저항성 유전자좌가 동형접합인 개체들로, 각 개체의 유전자형을 대변하는 F2:3 개체 중 표현형이 분리되지 않고 균일하게 감수성의 표현형을 보이는 67개체와 극 저항성의 표현형을 보이는 1개체 및 저항성의 표현형을 보이는 7개체를 대상으로 실시하였다. 총 8개의 극 저항성 및 저항성 F2 개체들은 병저항성 유전자좌가 다음 세대에서 분리되지 않는 동형접합성을 가지며, 병원균 접종 후 생존율(survival rate)이 모두 70% 이상인 개체들이다.

수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 연관 마커들의 F2 분리집단 개체들에 대한 유전자형 검정 결과를 표 6에 나타내었다. 감수성 67개체를 이용해 각 염색체에서 제작한 SNP markers의 조합을 통해 유전자형을 파악해본 결과,

1) 3번 염색체 상의 7,517,018 지역(Chr. 3: 7,517,018), 4번 염색체 상의 18,095,705 지역(Chr. 4: 18,095,705)과 10번 염색체 상의 16,776,298 지역(Chr. 10: 16,776,298)의 마커 조합;

2) 3번 염색체 상의 8,554,295 지역(Chr. 3: 8,554,295), 4번 염색체 상의 18,095,705 지역(Chr. 4: 18,095,705)과 10번 염색체 상의 16,776,298 지역(Chr. 10: 16,776,298)의 마커 조합; 및

3) 3번 염색체 상의 9,016,957 지역(Chr. 3: 9,016,957), 4번 염색체 상의 18,095,705 지역(Chr. 4: 18,095,705)과 10번 염색체 상의 16,776,298 지역(Chr. 10: 16,776,298)의 마커 조합

즉, 세 가지의 마커 조합을 이용했을 때, 세 개의 지역(location, bp)에서 모두 열성 동형접합 유전자형이 나오는 개체가 없는 것을 확인하였다.

또한, 선별된 세 가지의 마커 조합을 이용해 저항성의 병반응을 나타냈던 8개체를 대상으로 유전자형을 파악해본 결과, 해당 마커 세트들에서 오직 1개체만 유전자형과 저항성 표현형이 일치하는 것을 확인하였다. 이때 일치한 1개체는 상기 표 4에서 F2:3의 survival ratio가 98.4%로 생존율이 가장 높고 강한 극 저항성의 표현형을 보이는 것을 확인하였다.

나머지 7개의 저항성 개체들은 F2 개체에서 유래한 해당 F2:3 개체들을 이용해 표현형 검정을 실시한 결과, 모든 개체가 저항성을 보이는 것이 아니라 표현형이 분리된 일부 개체들이 존재하는 것으로 미루어 봤을 때, 세 개의 저항성 유전자좌 중 어느 하나의 유전자좌가 분리되어 이러한 현상이 나오는 것으로 추측되었다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 세 가지의 SNP markers의 조합 중 4번 염색체 상의 18,095,705 지역(Chr. 4: 18,095,705)과 10번 염색체 상의 16,776,298 지역(Chr. 10: 16,776,298)에서 제작한 SNP marker가 공통적으로 도출되었으며, 3번 염색체 상의 7,517,018 지역(Chr. 3: 7,517,018), 3번 염색체 상의 8,554,295 지역(Chr. 3: 8,554,295), 3번 염색체 상의 9,016,957 지역(Chr. 3: 9,016,957)에서 제작한 SNP marker가 도출되었다. 이로부터, 3번 염색체 상의 약 7.5Mb-9.1Mb 지역은 F2 집단에서 연관된 상태로 존재하는 것으로 판단되었다.

이에 따라, 3번, 4번, 및 10번 염색체에서 제작한 SNP marker의 조합을 확인하였을 때, F2 분리집단에서 병저항성을 부여하는 유전자좌들과 명확하게 연관된 마커의 조합은 3번 염색체 상의 7,517,018 지역(Chr. 3: 7,517,018), 8,554,295 지역(Chr. 3: 8,554,295), 9,016,957 지역(Chr. 3: 9,016,957), 4번 염색체 상의 18,095,705 지역(Chr. 4: 18,095,705) 및 10번 염색체 상의 16,776,298 지역(Chr. 10: 16,776,298)로 나타났으며, 3번 염색체에서 제작한 SNP marker 세 개중 어느 하나를 선택하여도, 나머지 4번 염색체와 10번 염색체의 프라이머 세트와 같이 조합하여 유전자형을 검사할 경우, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판단할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 바탕으로 본 발명자들은 수박의 3번 염색체 상의 7,517,018 지역(서열번호 1), 8,554,295 지역(서열번호 2), 9,016,957 지역(서열번호 3), 4번 염색체 상의 18,095,705 지역(서열번호 4), 및 10번 염색체 상의 16,776,298(서열번호 5)의 SNPs를 수박 덩굴쪼김병균 race1 저항성 형질을 선발하기 위한 신규 유전자 마커로 최종 선정하여, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 형질 개체를 선발하는 신규 유전자 마커의 개발을 완성하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Molecular marker for selecting watermelon line or cultivar resistant to Fusarium oxysporum f. sp. niveum Race 1 and use thereof <130> MP21-181 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 1 tgtatgtatg aagaaaaaaa aaaagagaaa ttgttttaaa tggtaaaact attgaaaata 60 tttacagata tagcaaaatt ttattttcta tctatgatgg atcatgataa acccaaatag 120 attgtctatc ggggtctatc acaaagtgat agatgtttat ctgagtgtat cacggtgtat 180 catagataga aactaaaatt tttcttttca aactcaagcg aacttcaaac gaattgatca 240 tcatacttac tgtaagagca tttttatttt tatttttatt tctaaggtta agagtatcaa 300 tgaaactctt aaaaggttag agctattttt acgaggtatt aacagttttt gttcatatac 360 aaacagtaag gggtattttt tttttatttt ctttgtaagt ttaagggtac ttttgaaggt 420 ttaaggggta ttttttaaac aaaacactaa cggtttctat ctaagactaa ctgtaaaagt 480 atttttgaac tcttttggaa ggtttaagag cattttttaa actttttaaa cttcaaaggt 540 atttttgaca aaaaatacaa aattaaagag cattttatat aatttagcat agaatcaata 600 aaggagattg gatctaatta gagtatctag cttttccaat cataaggttc taaagtatct 660 gagattgatt tcatttcaaa gaggaagaat tcctatatct cgagtgcttt ggagttgcct 720 tcatgtataa agatgttact acagcaagct caacaaattt ggtcatggat tgaaaattat 780 ctagcaccat catgaacaaa agcttcctat atggtgtcat gtcgagggga gcaaatgtta 840 agtgtcgata gattggatga gagaataaat gtcaagtgtc gattgattgg atccacaaca 900 atggatgtct ccctgcgcta aacatttatg tatattttga cagtgtcaga ttaccaacta 960 tgagagaaaa tatcgtaatc tccttttggt ttagagtatc g 1001 <210> 2 <211> 1001 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 2 tttggaactc catctctgag aagttctatg tttctttgaa atcaaccaaa taaacataga 60 ttgaattaat tgatcaattt ttcaaaaatg aatctgggaa aaagaaaaaa aaggttaaaa 120 ttagtattat ttttattcaa agaaaagaaa aaataaaaat aaagaatcgt tcattagcat 180 tgccatttct gaaacaatcc attaagccac aaaatttcag aatgggttct caaaggcttt 240 ctcttaatga tggggataac aagaacgcga agctcggccg gagagaccgt cgcatctgtt 300 caagcgtcgg cgccagcaag gtttacactt caaaaggcct ccgagcaagg aggctccgac 360 cggcattgaa ttctacgacg ttgaggatca ccttggctac gaccaaccaa ttgaagccat 420 cggttggctt cttcaggatg ccaaatccgc cattgatgcc ctttctcgac cattagaaac 480 agaggatagc aatgagcgag gggagtttca gttcttctgt ccacaaaata ttagaaattc 540 aattatctcg cattaaagat ttagaaaagt catagatttg tccttaattt agaaaagtta 600 taggctccct aagcactata taaaagtagc ttatgtattt gttgtccaat tgtccaagtt 660 agaaaagctt aaaacttata tgctgactct aattaaattc ttttgtattt tctagtttga 720 gagtagaaaa aagtgggagt agttaaaaat tttgagagag tgcttttgta attgagatcg 780 cgagagaatt attaggtgtg attctaacaa tttttccgca tagtagattt ttttttatgg 840 gttgtagttt ttctccgagg ttagagtttc cacctaaatt tctatatttc cagttttatt 900 gatttctttt aatttctata ttatttttgt gcttattctt gccggaagag taccttggtc 960 atcttcctct cagttccagt cttacccact tgaaaatttc t 1001 <210> 3 <211> 1001 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 3 gaacgtcggt gtcattgtaa ttcgatttag aacaaacaga aaaatagaga aaataaacat 60 gtcaaagaag gacaacatgc tttttaaaaa gaattacaag gagaagagaa aataaccttt 120 aaagatgatt cttcaatttt cttcaaaacc tcgttgtgat cacaatctta gcaacttttt 180 tttcgatctc aaacaaaaaa actaccatca aggcttcctc gctattctct gacaaagagt 240 gggtttgtgg gaaccaacct tttagattac aaagggaatt tttttttttc aagagaacct 300 ctttctctta ttttattttt gagagagttt cagagatgat taatgtgtgt atatatatat 360 atatatagaa agagagagaa tgtgtagaag cagaaccacc cttgatctgc caatcatgtt 420 ctgatgtgtg cttgggacta aaagttttac tgaacaacta tgggggatga ttgtcttttc 480 aatgaggatt ttattccttt tggaacaatg gttcgaacac actttttttt tctgagaaat 540 ttgatcggat gagtggttga tcaatgcatc cactgagtgc ttgaacctct ttgaagtatc 600 atgtggtgtt ggtcttgagg gagaagaaag actcacaact tgaatatctt cttgaaatca 660 tcagcttgat tgtagtcaaa tcgttcctct tccttgtgtg aaatgtgatg gattcatctc 720 accaaacttg tgtgcctcaa cttcaatcaa agtttccttc tctacctttc tatcttcttg 780 aatttcatcc ttttggatct cccttaaaaa atccccctgt tcattaaatc gaggtaaaag 840 atgagatgca ttggaccctt tgttttatca ttatcgagct gtaaattatg tcttaacgag 900 gtagaagcct cttcgttttc cttcaccaat taaaaaccat taccttctct ctcaatatta 960 ttgaattatt ggggttttgt aattgcatcc tcattaatgc t 1001 <210> 4 <211> 1001 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 4 attacaaatt tatccttatt gttagtaatc aggtgcattt tcttcaaatt ttggcatcaa 60 agaaaataac actcctaatt aacatactta taaaaattta aagaaaacat taaaacttat 120 gtcttagatt aaaaaaagct tgggataaaa aagaatgaag agcagttgag gaatttcgac 180 tttcaaaaaa caaaactgga atttgcatca taataggcaa cccactaggg ggtaaaatgg 240 taaaataaca taagattatg aaaaagagaa aaagaaagag cctctatacg atccccaaag 300 ggatcaaaat gggagacatc ttgtcttatc gtactgccac gtggaatgta agtgaccaat 360 aaaaccataa cacgtagagc tttagaaaat gatactgtgg tagcggccgt aggagatctg 420 acactcctcc caccgcgtaa cggtaaaacg gaacaaaaac aaacttttct actggaggaa 480 aaacggaagt ggaaacaaat tactggagcg tagtaaaact cgggggtaaa aatacctctc 540 tctaagtttt aaatattaga aaaaggaaaa aagatgagtc aacggagaga gagagagaac 600 gcggtacgcg gtttggacgc tacgcggtca tttggttcac tttagactgc cacgtcatac 660 gaaccggtcg ccttctgtct attctgtggt ggcccccacc ctctttagtt tttttttctt 720 ttttttcata tatatatatt tgaatattct ttttggatat tattagttca agaaaaatat 780 cgttatattc tagggatgac aataaagtga gatttttttt ttttcttttt tttttttttt 840 tttaagacaa taaccaaaac aaccagacca actactctat aagagcctct ttagcaagaa 900 taaggataaa attatcttga aaaacatctt tctccatcaa agatcaccgc aaagaggata 960 ccaaagtgac agtcatatgg gccgctttgt tatcttcacg g 1001 <210> 5 <211> 1001 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 5 aaatacgttt gtatcatata caaagtgagt cgtatccata gtgtcaccag gataagatat 60 ccatccttat ccatgtacta tagacccttt agactgtatc ttaaacattc atctccatat 120 gtccccacat atagttcaag actcataaaa caacctaggt tgttagttta ttggatttag 180 tgttattaag ataaaacaaa caaaaacaat caataacgct tattgaagta acacatcaat 240 aattctttat tagtgattta attatggtta aattattaca tttacaatct acgagtttta 300 aggcataaaa cccaacaaaa tcccacttga actaaaactc tagtggattg tacataaaga 360 gaagtgaaaa tggtaagtat gtaaatacag taaactaggg catccatata cccattacac 420 atctctcgct tgccccagat tacacaatgt aaatatcacg cagacctaga ctttctagat 480 gacccttgaa cactttagcc aagagagcct tcgtaaaggg atcaacaatg ttatgctccg 540 aagcgatttt tgtgaagatc acatctcttc gttgcacaat ctctcgtata aggtgatact 600 ttctcttaat atgctttcct cgtttgtggc cgcaaggctc tttagagttg actactgccc 660 cactgttgtc acagtatacc gtaatgggca attccatgtt tggaacggtt ttcaaatcat 720 ttaggaactt tctgagtcaa actgcttcct ttgctgcttc acaaacagct acatactcag 780 cctccatagt agagtctgca ttgcatcctt gcttgatgct acgccatact acaactcctc 840 cgtttaaggt gaacactgat cttgacgtgg atttcctaga atccttgtca gtttaaaaat 900 cagagtcggt gtatcctgta aggatcaaat ccttagttcc atacaccagc ttgtagtccc 960 tcgtttttct aagatacttg aggttgttcg taactgcagt c 1001 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1-3-734-F primer <400> 6 aaacaaaaca ctaacggttt ctatct 26 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1-3-734-R primer <400> 7 tttgtcaaaa atacctttga agttt 25 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1-3-496-F primer <400> 8 ttcttcagga tgccaaatcc 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1-3-496-R primer <400> 9 ttttgtggac agaagaactg aaa 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1-3-163-F primer <400> 10 tgggggatga ttgtcttttc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1-3-163-R primer <400> 11 tcaaccactc atccgatcaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1-4-832-F primer <400> 12 gcgtaacggt aaaacggaac 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1-4-832-R primer <400> 13 gaggtatttt tacccccgag tt 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1-10-113-F primer <400> 14 ttgccccaga ttacacaatg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1-10-113-R primer <400> 15 aaaatcgctt cggagcataa 20

Claims

서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 2의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
서열번호 3의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SNP 마커 조성물은 서열번호 4의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
서열번호 5의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, SNP 마커 조성물.
서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 서열번호 3의 501번째 염기, 서열번호 4의 501번째 염기, 또는 서열번호 5의 501번째 염기를 포함하는 8 내지 100개의 연속된 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
제3항에 있어서,
상기 프라이머 세트는, 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 8 및 9로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 12 및 13으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 14 및 15로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 프라이머 세트.
제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 고해상도 융해(High-resolution melting; HRM) 분석용 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
제3항 또는 제4항의 프라이머 세트를 포함하는, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 개체를 판별하기 위한 키트.
하기의 단계를 포함하는, 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 수박 개체를 판별하는 방법:
(a) 판별하고자 하는 수박으로부터 유전체(genomic) DNA를 분리하는 단계;
(b) 분리된 상기 유전체 DNA에서, 서열번호 1의 501번째 염기, 서열번호 2의 501번째 염기, 또는 서열번호 3의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및
(c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 수박 덩굴쪼김병균 race 1 저항성 형질을 갖는 수박 개체를 판별하는 단계.
제7항에 있어서,
상기 단계 (b)는 단계 (a)에서 얻은 유전체 DNA에서 서열번호 4의 501번째 염기 및 서열번호 5의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제7항에 있어서,
상기 (b) 단계는 제3항 또는 제 4항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제7항에 있어서,
상기 (c) 단계는 고해상도 융해, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제7항에 있어서,
상기 수박 덩굴쪼김병균 race 1은 Calhoun Gray 및 PI296341-FR 품종에서 저항성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 방법.