KR102564133B1 - 수박 측지, 덩굴손 및 엽설 형질이 부재하는 개체 선발용 유전자 마커 및 이의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수박에서 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 개체를 선발하는 것에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 조성물, 프라이머 세트 및 키트와 이를 이용하여 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 선발용 유전자 마커의 제공으로, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 품종 개발시 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 빠르고 간편하게 측지, 덩굴손 및 엽설 유무를 확인할 수 있게되어 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 품종의 효율적 판별 및 육성이 가능해 지므로, 육종에 소요되는 시간, 비용, 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 예측되며, 이로 인해 수박의 생산성이 크게 향상될 것으로 기대된다.

Description

수박 측지, 덩굴손 및 엽설 형질이 부재하는 개체 선발용 유전자 마커 및 이의 이용{Genetic marker for selection of watermelon without lateral branch, tendril and ligule trait and use thereof}
본 발명은 수박에서 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 개체를 선발하는 것에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 조성물, 프라이머 세트 및 키트와 이를 이용하여 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하는 방법에 관한 것이다.
수박은 아시아(82.4%)를 비롯하여 유럽(5.8%), 오세아니아(0.1%), 아프리카(5.3%), 아메리카(6.3%) 등지에서 전세계적으로 생산되고 있으며, 아시아 중에서도 중국(약 5천만 톤)에서 가장 많은 수박을 생산하고 있다. 우리나라에서도 수박은 여름뿐만 아니라 연중내내 소비되는 과채류이다. 수박은 덩굴성 작물로 주지와 측지가 발달하는 작물로 알려져 있다. 고품질의 수박의 안정적인 생산을 위해 측지 관리는 필수적이며 수분하기 전에 측지를 제거해야 한다. 그러나 측지 제거에 노동력과 시간이 많이 소요되어 측지가 발달하지 않는 품종이 필요한 실정이다.
한편, 최근 차세대 염기서열 분석법의 발달에 따라 염기서열 분석 비용이 절감되어 식물의 염기서열 분석 또한 빠르게 진행되고 있으며, 박과 식물의 경우 오이(2009년), 멜론(2012년), 수박(2013년)의 전장 염기서열이 공개되었다. 수박의 경우 최근 게놈(genome)의 서열분석을 통한 게놈서열 기반 고밀도 유전자지도가 작성되고 있으며, 이를 기반으로 한 다량의 SNP(single nucleotide polymorphism; 단일염기다형성) 정보의 결과로 다양한 식물 계통, 품종의 구분뿐만 아니라, 유전자 마커(genetic marker)로서의 활용도가 증가되고 있다. 과거 전통육종에서는 원하는 형질의 게놈부위를 교배육종을 통해 형질도입을 하였는데, 이를 확인하기 위해서 해당 표현형을 관찰하기까지 많은 노동력과 긴 시간이 소요되는 문제점이 있었다. 이를 해결하기 위해 원하는 형질과 연관된 유전자 마커의 개발이 이루어지고 있으며, 나아가 개발된 마커로 유묘기 때 개체를 선발하여 노동력 절감, 육종효율 증진 및 육종기간 단축을 위한 연구 개발이 이루어지고 있다.
KR 10-2018-0077871
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 수박의 유전자 마커 이용 여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)에 적용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 501번째 염기를 포함하는 8 내지 100개의 연속된 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 2 및 3으로 이루어진 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 고해상도 융해(High-resolution melting; HRM) 분석용 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 판별하고자 하는 수박으로부터 유전체(genomic) DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 상기 유전체 DNA에서, 서열번호 1의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및 (c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하는 단계를 포함하는, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 (c) 단계는 고해상도 융해, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 판별용 유전자 마커의 제공으로, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 품종 개발 시 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 측지, 덩굴손 및 엽설 유무를 확인함으로써, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 품종을 효율적으로 판별하고 육성할 수 있으므로 육종에 소요되는 시간, 비용, 및 노력을 절감하는 데 매우 유용할 것으로 예측되며, 이로 인해 수박의 생산성이 크게 향상될 것으로 기대된다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명에서 사용한 모본 DrHS4105과 부본 BbrtlNwa의 표현형을 나타낸 것으로서, 도 1a는 모본 DrHS4105의 과실, 꽃, 측지, 덩굴손 및 엽설의 형태를, 도 1b는 부본 BbrtlNwa의 과실, 꽃, 측지, 덩굴손 및 엽설의 형태를 나타낸 것이다(도 1a 흰색 화살표: 엽설, 덩굴손).
도 2는 DrHS4105 × BbrtlNwa 분리세대로부터 양성한 F2 분리세대에서 0점 및 1점의 표현형 스코어의 기준이 되는 대표 개체를 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 각 개체들의 DNA 전기영동 결과로서, 도 3a는 측지, 덩굴손 및 엽설이 존재하는 DNA 풀(AA), 도 3b는 측지, 덩굴손 및 엽설이 존재하지 않는 DNA 풀(aa)에 사용된 DNA를 전기영동한 밴드를 나타낸 것이다.
도 4는 전체 염색체의 ΔSNP-인덱스 값을 나타낸 것이다(초록색 선, 신뢰수준 95%; 주황색 선, 신뢰수준 99%).
도 5는 가장 유의미한 ΔSNP-인덱스 값을 나타내는 3번 염색체의 23 내지 24Mbp 지역 및 4번 염색체의 21 내지 26Mb 지역의 ΔSNP-인덱스 값을 나타낸 것이다.
도 6은 4번 염색체의 23.97Mbp 지역(23,974,450) SNP를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 HRM 분석을 수행한 결과로 얻은 융해 곡선을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 고품질 수박의 안정적인 생산을 위해 측지, 덩굴손 및 엽설이 존재하지 않는 품종을 선발하여 수박의 생산량을 증가시킬 수 있는 측지, 덩굴손 및 엽설 형질과 관련된 유전자 마커를 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 수박의 4번 염색체 상의 24,395,156번째 염기가 수박의 측지, 덩굴손 및 엽설 형질과 연관되어 있음을 확인하였다. 이에 따라 해당 염기의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 확인할 수 있는 프라이머 세트를 개발하여 F2 분리집단에서 검정한 결과 모든 개체에서 수박의 측지, 덩굴손 및 엽설 여부를 정확하게 판별할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 수박의 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 수치화하기 위해 각 개체의 측지, 덩굴손 및 엽설 표현형을 0점, 1점으로 점수를 매겨 분류하고, F2 분리세대의 개체별 표현형 검정에서 측지, 덩굴손, 엽설 존재 : 측지, 덩굴손, 엽설 부재의 분리비가 3 : 1로 나타남을 관찰하여, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질이 멘델의 유전법칙에 따라 단일 우성유전됨을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 수박의 잎에서 DNA를 추출하고 각각의 표현형 스코어 별로 유전자 풀(pool)을 만든 후, 차세대 시퀀싱 및 BSA(Bulked Segregant Analysis) 기법을 이용하여 측지, 덩굴손 및 엽설 형질과 연관된 유전자좌의 후보를 선정하고, ΔSNP-인덱스 분석을 통해 수박의 3번 염색체의 23 내지 24Mb 및 4번 염색체의 21 내지 26Mb지역 사이에 있는 지역을 후보 유전자좌로 선택하였다(실시예 2 및 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 고해상도 융해(High-resolution melt) 분석을 통해 수박의 4번 염색체의 24,395,156 지역에 해당하는 BL-4-156 HRM 프라이머가 F2 분리집단 199 개체에서 모두 표현형과 유전자형이 100% 일치함을 확인하였다(실시예 4 참조).
따라서 상기 실시예를 통해 확인한 수박 측지, 덩굴손 및 엽설 형질에 관여하는 SNP 마커 및 이를 검출하는 프라이머는 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하는 데 이용될 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 SNP 마커 조성물을 이용하면, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 종래의 방법보다 더 빠르고 정확하게 판별할 수 있다.
본 발명에 따른 SNP 마커는, 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 염기가 (G→T)인 경우 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 것으로 판별할 수 있는 바, 상기 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 유전자 마커로 사용함으로써 품종 개발시 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 측지, 덩굴손 및 엽설 형질의 유무를 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 1의 염기서열은 수박의 4번 염색체 상에 존재하는 염기서열일 수 있으며, 예를 들면 24.3Mbp ~ 24.4Mbp 영역일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “수박(Citrullus lanatus, watermelon)”은 한반도에서 재배되거나 혹은 품종 개량을 목적으로 육종된 수박을 의미하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “다형성(polymorphism)”이란 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미 하며, '다형성부위(polymorphic site)'란 상기 대립 유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 '단일염기다형성', 즉, SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “마커”란 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립 유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 측지, 덩굴손 및 엽설 유무와 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 유전자 마커(genetic marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “유전자 마커”는 DNA 마커, 바이오마커, 분자마커 등의 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 마커는 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 형질을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 유전자 마커는 유전현상의 본질인 DNA의 염기서열 차이를 대상으로 개체간 다형성(polymorphism)을 나타내는 방법으로서, 주로 반복되는 단순 염기서열로 이루어진 마이크로새틀라이트(microsatellite)나 유전자 염기서열을 이용한 마커 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 프로브나 SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커가 이용되고 있다.
본 발명에 있어서, 상기 SNP 마커 조성물은 수박의 유전자 마커 이용 여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)에 적용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “유전자 마커 이용 여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)”은 유전자 마커를 사용하여 유묘기에 여교잡 자손의 염색체 전체 조성을 확인함으로써 여교잡 자손이 회복친의 우수형질을 가진 유전체 구성으로 회복하는데 걸리는 시간을 단축시킬 수 있는 육종기법을 의미한다. 기존의 여교잡 육종의 경우 6~7 세대 이상의 시간이 소요되지만 유전자 마커를 이용한 여교잡 선발(MABC) 육종은 빠른 경우에는 여교잡 2세대에서부터 개체를 선발할 수 있기 때문에 작물 개량에 소요되는 노력과 비용을 절감하여 육종의 규모와 효율성을 증대시킬 수 있다. MABC용 마커 제작에는 주로 SNP를 이용하는데 이는 단순반복서열(Simple sequence repeat)이나 삽입/결실(insertion /deletion; indel)과 같은 변이에 비하여 유전체 내 발생빈도가 높은 구조 변이의 하나이며 탐색에서 분석에 이르는 전 과정이 자동화될 수 있기 때문이다. 하지만 과도하게 많은 SNP는 실험에 많은 시간과 비용이 소모되기 때문에 정확도 및 활용도가 높은 SNP를 선발하는 것이 중요하다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 501번째 염기를 포함하는 8 내지 100개의 연속된 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3으로 이루어진 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 본 명세서에서 개시하고 있는 SNP 마커를 검출하기 위한 프라이머라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드” 또는 “폴리뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥의 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 특별히 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 (폴리)뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머레이즈와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정되지만, 통상적으로 15bp 내지 30bp의 길이로 사용된다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야 한다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 고해상도 융해(High-resolution melting; HRM) 분석용 프라이머 세트일 수 있으나, 본 발명에 따른 SNP를 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “고해상도 융해(High-resolution melting; HRM)”는, PCR에 의해 증폭된 영역 내에 존재하는 DNA 상의 SNP에 따라서 형광시약과 결합한 증폭산물 DNA를 약 60℃에서 95℃까지 온도를 변화시키며 단일가닥의 DNA로 변성될 때의 형광강도 변화를 측정하는 방법을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 수박의 유전자 마커 이용 여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)에 적용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 키트는 본 발명에 따른 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 및 Mg2+와 같은 보조인자(cofactor) 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 예를 들면, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계를 포함하는 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 (a) 판별하고자 하는 수박으로부터 유전체(genomic) DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 상기 유전체 DNA에서, 서열번호 1의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및 (c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 (b) 단계의 검출하는 단계는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 것일 수 있으나, 실질적으로 동일한 목적을 달성하기 위한 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 (c) 단계의 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하는 단계는 고해상도 융해, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정 및 인광 측정 등의 실험 기법을 통해 수행될 수 있으나, 본 발명에 따른 SNP 마커 또는 프라이머 세트를 이용하는 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 수박의 측지, 덩굴손, 엽설 지표 설정 및 표현형 검정
1.1. 수박의 측지, 덩굴손, 엽설 지표 개발
모본으로 사용한 'DrHS4105'은 일반 수박의 생육 형태를 지니고 있는 품종이며, 부본으로 사용한 'BbrtlNwa'은 다면발현(pleiotropism) 즉, 엽액(leaf axil) 부위에 엽설, 덩굴손, 측지가 동시에 발달하지 않는 품종으로 판단하고 있다(도 1a 및 도 1b 참조).
수박의 측지, 덩굴손, 엽설 형질을 수치화하기 위해 0점, 1점으로 나누어 측지, 덩굴손, 엽설이 있는 경우(0점), 측지, 덩굴손, 엽설이 없는 경우(1점)로 분류하였다(도 2 참조). 상세 기준은 하기 표 1에 기재하였다.
표현형
스코어		 분류 기준
0 측지, 덩굴손, 엽설이 각 개체에 존재.
1 측지, 덩굴손, 엽설이 각 개체에 존재하지 않음.
1.2. DrHS4105 × BbrtlNwa : F 2 분리집단 표현형 검정
상기 표 1에 따른 기준에 의해 DrHS4105 × BbrtlNwa의 F2 분리세대에서의 측지, 덩굴손, 엽설의 유무 정도를 평가하여 0점 또는 1점으로 분류하였다. 총 DrHS4105 5개체, BbrtlNwa 5개체, F1 7개체, F2 173개체의 표현형 검정을 수행하였으며, 0점의 경우 측지, 덩굴손, 엽설이 있다고 판단하였고, 1점의 경우 측지, 덩굴손, 엽설이 없다고 판단하였다.
그 결과 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, DrHS4105에서는 모두 0점의 형질을, BbrtlNwa 에서는 모두 1점의 형질을, F1에서는 모두 우성형질인 0점의 표현형을 나타내는 것을 확인하였으며, F2 분리세대에서는 멘델의 단일유전 법칙이 성립하여, 측지, 덩굴손, 엽설 존재: 측지, 덩굴손, 엽설 부재의 분리비가 3 : 1로 나타났고, 이를 카이제곱검정(Chi-square test)을 통해 검증하였다. F2 분리세대의 개체별 표현형 검정 결과의 카이제곱검정(Chi-square test)은 표 2에 나타내었다. 또한, F2 분리세대의 개체별 표현형 검정 결과는 표 3에 나타내었다.
세대 표현형 전체 개체수 기대비 자유도 X2 값 P-값
측지, 덩굴손, 엽설 있음 측지, 덩굴손, 엽설 없음
DrHS4105 5 0 5 - - - -
BbrtlNwa 0 5 5 - - - -
F1(DrHS4105 x BbrtlNwa) 7 0 7 - - - -
F2(DrHS4105 x BbrtlNwa) 120 53 173 3:01 1 2.9306 0.08691
No. Name Phenotype score
1 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-1 0
2 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-2 0
3 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-3 0
4 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-4 0
5 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-5 1
6 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-6 1
7 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-7 1
8 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-8 0
9 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-9 0
10 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-10 1
11 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-11 0
12 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-12 0
13 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-13 0
14 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-14 0
15 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-15 0
16 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-16 0
17 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-17 0
18 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-18 0
19 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-19 0
20 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-20 0
21 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-21 0
22 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-22 0
23 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-23 1
25 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-25 0
27 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-27 0
28 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-28 0
29 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-29 0
30 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-30 0
31 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-31 1
32 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-32 0
33 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-33 0
34 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-34 0
35 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-35 1
36 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-36 1
37 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-37 0
38 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-38 1
39 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-39 1
40 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-40 0
41 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-41 1
42 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-42 1
43 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-43 0
44 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-44 0
45 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-45 1
46 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-46 1
47 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-47 0
48 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-48 1
49 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-49 1
50 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-50 1
51 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-51 0
52 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-52 1
53 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-53 0
54 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-54 0
55 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-55 0
56 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-56 1
57 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-57 0
58 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-58 1
59 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-59 0
60 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-60 0
61 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-61 0
63 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-63 0
64 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-64 0
65 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-65 1
66 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-66 0
67 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-67 1
68 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-68 0
69 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-69 1
70 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-70 0
71 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-71 1
72 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-72 0
73 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-73 1
74 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-74 0
75 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-75 1
76 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-76 1
77 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-77 0
78 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-78 0
79 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-79 0
81 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-81 1
82 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-82 0
84 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-84 0
85 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-85 0
86 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-86 0
87 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-87 1
88 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-88 1
89 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-89 0
90 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-90 0
92 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-92 0
93 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-93 0
94 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-94 0
95 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-95 0
96 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-96 0
97 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-97 0
98 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-98 1
99 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-99 0
100 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-100 0
101 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-101 0
102 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-102 0
103 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-103 1
105 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-105 0
106 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-106 1
107 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-107 0
109 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-109 0
110 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-110 1
111 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-111 0
112 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-112 1
113 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-113 0
115 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-115 0
116 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-116 0
118 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-118 0
120 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-120 0
121 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-121 1
122 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-122 0
123 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-123 0
124 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-124 0
125 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-125 1
126 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-126 0
129 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-129 0
132 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-132 0
133 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-133 0
135 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-135 0
137 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-137 0
139 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-139 0
140 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-140 0
141 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-141 1
142 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-142 0
143 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-143 0
144 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-144 0
146 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-146 0
147 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-147 0
148 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-148 0
149 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-149 0
150 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-150 1
152 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-152 0
154 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-154 0
155 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-155 0
156 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-156 1
158 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-158 1
159 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-159 1
160 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-160 0
162 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-162 0
164 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-164 0
165 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-165 0
166 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-166 0
167 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-167 0
168 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-168 0
169 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-169 0
170 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-170 1
171 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-171 0
172 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-172 0
173 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-173 1
174 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-174 0
175 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-175 0
176 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-176 1
177 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-177 0
178 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-178 1
179 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-179 1
180 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-180 1
181 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-181 0
183 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-183 1
184 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-184 0
185 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-185 0
186 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-186 1
187 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-187 1
189 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-189 0
190 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-190 0
192 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-192 1
193 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-193 1
194 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-194 0
195 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-195 0
196 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-196 0
197 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-197 0
199 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2-199 0
실시예 2: 수박 잎의 샘플링 및 DNA 추출
상기 실시예 1의 표현형 검정 결과에서 양극의 스코어인 0점과 1점으로 평가된 DrHS4105, BbrtlNwa, DrHS4105 × BbrtlNwa :F1 및 F2 개체를 각각 35개 씩 임의로 선정하여 80-85 mg의 무게로 샘플링을 진행하였다.
보다 구체적으로, DNA 추출을 위해 GeneAll®Exgene™키트를 사용하였다. 식물체 잎 80-85mg의 샘플을 2ml 튜브(Eppendorf, 독일)에 넣고 액체질소를 이용하여 동결시킨 뒤 오토밀(Automill; Tokken, 일본)을 이용하여 마쇄 하였다. 식물체를 마쇄한 후 키트에 동봉된 버퍼들을 이용하여 키트 사용방법에 따라 고순도의 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 품질은 전기영동 및 분광 광도계(Spectrophotometer; DS-11, 28 DeNovix, 미국)를 이용하여 확인하였고, 정량은 형광 광도계(flourometer; Qubit®2.0, Invitrogen, 미국)를 이용하여 측정하였다.
상기 샘플에서 고순도의 DNA를 추출하여 측지, 덩굴손, 엽설이 존재하는 표현형(표현형 스코어: 0)을 보이는 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2 35 개체의 DNA 풀(pool)과 측지, 덩굴손, 엽설이 존재하지 않는 표현형(표현형 스코어: 1)을 보이는 DrHS4105 x BbrtlNwa : F2 35 개체의 DNA 풀을 동량으로 만들었다. 측지, 덩굴손, 엽설이 존재하는 DNA 풀을 'AA’, 측지, 덩굴손, 엽설이 존재하지 않는 DNA 풀을 ‘aa’이라고 명명하였다. 각 DNA 풀에 사용된 개체들의 DNA를 확인한 결과는 도 3a(AA) 및 3b(aa)에 나타내었다.
실시예 3: 수박 측지, 덩굴손, 엽설 형질의 BSA(Bulk Segregant Analysis) 및 서열정렬을 통한 유전자 변이 확인
3.1. NGS(Next-Generation Sequencing)을 통한 서열의 도출
부모집단인 DrHS4105 및 BbrtlNwa와 상기 실시예 2에서 제작한 AA 및 aa 유전자 풀의 NGS를 수행하여 염기서열을 도출하였다. NGS 등급의 DNA인 것을 확인한 후, NovaSeq-6000 시스템(Illumina, 미국)을 이용하여 101bp의 리드 길이(Read length) 기준으로 페어드-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing)을 진행하였다. 상세한 시퀀싱 조건은 하기 표 4에 기재하였다.
리드 타입(Read Type) Paired-end
리드 길이(Read Length) 101
라이브러리 키트 TruSeq DNA PCR-Free kit
라이브러리 프로토콜 ruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Guide, Part # 15036187 Rev. D
시퀀서 타입 Illumina platform
3.2. 서열정렬을 통한 서열의 변이 확인
상기 실시예 3.1의 각 'AA'와 'aa'의 bulk들의 시퀀싱을 통해 얻어진 서열을 정렬하기 위해 Bowtie2 프로그램을 이용하였다. 유전자 분석 툴킷(Genome Analysis Toolkit, GATK)을 통하여 도출된 서열과 수박의 레퍼런스 서열인 97103 Ver.2의 BAM 파일을 만들었고, Samtools variant calling package를 이용하여 VCF(Variant Call Format) 파일을 얻었다. 이를 통해 얻은 VCF 파일로 ΔSNP-인덱스(index)를 구하였다.
양적형질 유전자(QTL) 분석방법 중 하나인 QTL-seq 분석(QTL-seq package of R software 이용)을 이용하여 2Mb의 sliding window를 지정하고, 해당 지역에서 10개 미만의 SNP가 존재하는 경우는 해당 지역을 interval mapping분석에서 제외하고, 10개 이상의 SNP가 존재하는 슬라이딩 윈도우(sliding window)의 genomic regions 지역을 분석에 포함시켰다. 각 슬라이딩 윈도우(sliding window)지역들 간의 유의성 검정 및 ΔSNP-인덱스 값을 계산한 후, 유의수준 95%, 99%의 높은 통계적 옵션을 주어 수박 측지, 덩굴손, 엽설 형질에 관여하는 유전자좌를 확인하였다. 표 5는 각 bulk 별 read depth 정보 및 유의성, SNP index 그리고 ΔSNP-인덱스(index)결과를 나타내었다.
그 결과 도 4에는 전체 염색체의 ΔSNP-인덱스(index) 값에 따른 plot를 보여주는데, 3번, 4번 염색체에서 유의수준 95~99%에 높은 유의성이 있을 것으로 예상하는 형질연관 유전지역을 확인할 수 있었다. 또한, 도 5에는 가장 유의미한 ΔSNP-인덱스(index) 값을 나타내는 3번 염색체의 23 내지 24Mb, 4번 염색체의 21 내지 26Mb지역을 나타내었다. 본 지역을 기반으로 DrHS4105와, BbrtlNwa 계통들 genome서열사이에서 차이가 보이는 SNP 후보들을 이용하여 genotyping을 실시하고, 완전연관 유전지역을 발굴하였다.
상기에서 얻은 GATK 파일과 VCF 파일을 추합하여 SNPs의 후보 지역을 선정하였고, Tablet v.1.19 프로그램을 이용하여 지역별 1kb 이상의 거리를 두는 SNPs를 선별하여, 이를 대상으로 HRM(High Resolution Melting)분석용 프라이머를 제작하였다.
실시예 4: HRM(High-resolution melting) 분석을 통한 측지, 덩굴손, 엽설 형질 연관 유전자 마커 개발
본 발명자들은 상기 실시예 3를 통하여 후보 유전자좌를 선정하였으며, 수박의 측지, 덩굴손, 엽설 연관 단일 염기서열 변이 기반 연관 마커의 제작을 위해 모부본 서열에서 차이가 나는 지역을 대상으로 HRM(High-resolution melting) 프라이머를 제작하여 실험을 진행하였다.
HRM 분석은 LightCycler96®소프트웨어 1.1(Roche, 스위스)을 통해 분석하여 F2 분리세대의 표현형과 예상 유전자형의 비교를 통해 일치율이 높은 지역을 탐색하였다. HRM 분석의 레퍼런스로는 부모개체인 DrHS4105 및 BbrtlNwa 과 이들의 교배후대인 F1 집단을 사용하였다. 실험은 로슈 사의 LightCycler®480 키트를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 레퍼런스로 사용한 부모개체인 DrHS4105 및 BbrtlNwa과 이들의 교배후대인 F1 집단이 각각 고유의 곡선을 보여 그룹핑(grouping)이 가능한 것을 확인한 후, DrHS4105 × BbrtlNwa 교배에서 유래한 F2 집단을 분석하였다.
그 결과 도 6 및 표 6에 나타난 바와 같이, 4번 염색체 상의 24,395,156bp(표 7의 초록색 음영)에서 표현형과의 100% 일치율을 보이는 결과를 얻었다. 도 6에서는 파란색 곡선이 그룹 1(표현형 스코어: 0)로 측지, 덩굴손, 엽설이 있는 AA(DrHS4105)이고, 빨간색 곡선이 그룹 2(표현형 스코어: 1)로 측지, 덩굴손, 엽설이 없는 aa(BbrtlNwa)이며, 주황색 곡선이 그룹 3(표현형 스코어: 0)으로 F1(DrHS4105 × BbrtlNwa)을 나타낸다. 또한, 하기 표 6의 표현형 데이터를 기반으로 그룹 1은 우성 Homotype AA이며, 그룹 2는 열성 Homotype aa이고, 그룹 3은 Heterotype Aa임이 확인되었다. 표현형과 불일치를 보이는 F2 개체는 볼드체와 밑줄로 표시하였다.
상기 HRM 분석에 사용한 각각의 프라이머 서열 및 SNPs 지역은 하기 표 7에 나타내었다.
No. Chromosome Location SNP(ref/alt) Primer name Sequence Mer TM Product size (bp)
1 3 22,753,878
(서열번호 4)		 T/C BL-3-862-F
(서열번호 16)		 CCAACCGGGGTTAAGCTAAG 20 60.83 118
2 3 T/C BL-3-862-R
(서열번호 17)		 GTGTTGGGATGGGTCAAATC 20 60.03 118
3 4 21,886,302
(서열번호 5)		 A/G BL-4-302-F
(서열번호 18)		 TTGACATTACCCCAAATTCCA 21 60.04 103
4 4 A/G BL-4-302-R
(서열번호 19)		 AGAGAACTGCCGGATTTGAA 20 59.81 103
5 4 23,012,965
(서열번호 6)		 G/T BL-4-965-F
(서열번호 20)		 TGGTGGGACCTCACAAATCT 20 60.36 113
6 4 G/T BL-4-965-R
(서열번호 21)		 CATTGTTAATAAAAAGTGACCAACA 25 57.38 113
7 4 23,398,716
(서열번호 7)		 C/T BL-4-716-F
(서열번호 22)		 TGATCAAATGAGTTGAAGTACCA 23 57.29 113
8 4 C/T BL-4-716-R
(서열번호 23)		 TCCCCAAAGTTTCATTTTAGTG 22 58.16 113
9 4 23,828,388
(서열번호 8)		 T/C BL-4-388-F
(서열번호 24)		 TTCCACGGAACAGCTTCTCT 20 59.99 106
10 4 T/C BL-4-388-R
(서열번호 25)		 CCCATTTTAGGCATAAGACCA 21 58.95 106
11 4 23,974,450
(서열번호 9)		 A/C BL-4-450-F
(서열번호 26)		 TGGAGATGAGATTTACGTTTCG 22 59.22 90
12 4 A/C BL-4-450-R
(서열번호 27)		 ACAGGGAACAATCCCCAAA 19 60.16 90
13 4 23,986,087
(서열번호 10)		 T/C BL-4-087-F
(서열번호 28)		 GAAAAATGCAGCTTCCACTCA 21 60.38 100
14 4 T/C BL-4-087-R
(서열번호 29)		 GAGTGCAGGCACAAGAGGAT 20 60.42 100
15 4 24,395,156
(서열번호 1) 		G/T BL-4-156-F
(서열번호 2) 		CCTCCTTGCAGCAGTTTCTC 20 60.13 104
16 4 G/T BL-4-156-R
(서열번호 3) 		AGGGATCGTTTCAACACTCG 20 60.11 104
17 4 24,444,557
(서열번호 11)		 A/G BL-4-557-F
(서열번호 30)		 TGGTTACGTTTCCTTTAGATCG 22 58.32 121
18 4 A/G BL-4-557-R
(서열번호 31)		 CGCTAAAGTTGATAAAAGAAACCA 24 58.96 121
19 4 24,546,365
(서열번호 12)		 T/C BL-4-365-F
(서열번호 32)		 GGGTTTACCGAGACAGTGGA 20 59.97 130
20 4 T/C BL-4-365-R
(서열번호 33)		 CTTGCTTTCTCGATGGGAAT 20 59.27 130
21 4 24,550,134
(서열번호 13)		 T/C BL-4-134-F
(서열번호 34)		 CCCCAACCGCTTACAAATTA 20 59.83 99
22 4 T/C BL-4-134-R
(서열번호 35)		 ATGCCAAAGGTTGATTCAGG 20 59.93 99
23 4 24,579,758
(서열번호 14)		 G/A BL-4-758-F
(서열번호 36)		 TTGTTAGGAAGAGGAACCAAAGTT 24 59.6 93
24 4 G/A BL-4-758-R
(서열번호 37)		 ATTCAAGTGGGAGAGCCAAG 20 59.28 93
25 4 25,361,809
(서열번호 15)		 A/C BL-4-809-F
(서열번호 38)		 TCCCACCCATCTTCTTTCAC 20 59.9 112
26 4 A/C BL-4-809-R
(서열번호 39)		 GGGGCGTCAACTAAAGTAGC 20 58.86 112
상기 13 세트의 프라이머(BL-3-862, BL-4-302, BL-4-965, BL-4-716, BL-4-388, BL-4-450, BL-4-087, BL-4-156, BL-4-557, BL-4-365, BL-4-134, BL-4-758, BL-4-809)를 이용한 HRM 분석 결과, 24,395,156 지역에 해당하는 BL-4-156 HRM 프라이머가 F2 분리집단 199개체 모두 표현형과 100% 일치하는 결과를 보였다(표 6). 따라서, 상기 SNP 마커를 이용하는 경우, 완벽한 정확도로 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별할 수 있다는 점에 기술적 의의가 있다고 사료된다.
상기와 같은 결과를 바탕으로 본 발명자들은 수박의 4번 염색체 상의 24,395,156 지역(서열번호 1)의 SNP를 수박의 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 개체를 선발하기 위한 유전자 마커로 최종 선정하여, 수박의 측지, 덩굴손 및 엽설 형질이 없는 개체를 선발하는 유전자 마커의 개발을 완성하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Genetic marker for selection of watermelon without lateral branch, tendril and ligule trait and use thereof <130> MP21-118 <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1002 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 1 gcttatctat aagaaaaaga gtaatattta tctctttcaa aacattcaat aaaattggaa 60 tgaaaacaca caaataaagt ttagataata tcgttataat tacatcaata ataatccata 120 caagctaaaa cacttgaaaa tcaaaggtac aacatttctt gcaacattta acacaacaac 180 cacaaataca attggaatat atatatatat atatatttgg ttttttggtt tttatgtaat 240 aataatattt atccgttgaa tgttttataa gagacccaaa agaagaaaga agaaaaaaag 300 aaaaaccacc catttctaaa atcaactaag taattagaaa gatgaaagtc tggaaatatg 360 aatgttcttt aatttaaatt ggagaagaaa ttgagagaat gaaaaagcaa attaattaag 420 agaaaatgtg tcattaatta atttaattaa tcaattaatg attgtgattc tatcgcctcc 480 ttgcagcagt ttctctttgt gtcattgaaa tagacagcag caacaggaag acccaaatca 540 ttctcacccg aaaatcttcg agtgttgaaa cgatcccttg atgaaggagg gttcactgaa 600 cgacgccgtt tttgtttgaa cagaacaaac acaaacctgt gaattcctat tgttggcttt 660 ggaatttcat agctcatttc ttcttttcct gtctcatcac ccaaatttta aaattaaaaa 720 acaatttatc attgttatta ttattattat ttttcaaaaa aaggaataac ctataccaaa 780 agtagcatca gtagttcctg gaatgtctgt caccaacctg aaaaagagat ccaaataaag 840 gccaaaaatt aggtaaacat ctcgaatttg ttgatagaaa ttcctttttt aacaaattct 900 tttctttttc ctaaacctaa ataaatttaa cactagataa acaaattatt gttttggtca 960 tgggttttca tcgagaaaat tataccagat aggctttaaa tt 1002 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-156-F Primer <400> 2 cctccttgca gcagtttctc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-156-R Primer <400> 3 agggatcgtt tcaacactcg 20 <210> 4 <211> 1002 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 4 agggcttcac caaatctggt taacattttg taaaattctt ctggccaccc cccaactaga 60 actaacactt cttcccttgc ccttcatgct ttgtcatagc ttaaactaac attatactcc 120 tgtttgatgt ctttcacaat gtcttttggt ctataagtat gactaacttt ttccaacttt 180 gactttatta aatggctgag aacccaacta gaaacttgta tatgatcatt agtacgtcaa 240 ggtttcattt ttacatgtat ggatattatc atacttagaa atcataaatg tttcatagtc 300 tttcaattta acatctctca ttctccatct gtattcttca acgatgcatc taactttgta 360 taactttgtg cttgacttct tcaccctaaa ttgaaaaaaa acatgactaa aggatgagta 420 caaatacata gtaagtagcc cccaaccggg gttaagctaa gcacccatat ccaaaagatg 480 aaacatacta gtgggacata tcataagtaa tttaactctt gatggctatc tagtgaacga 540 tttgacccat cccaacacaa ttttggtggc ccgaaggctc acaaacgtag tacggcaccc 600 gtcggcaccc gggacatagt agggaacccg tgggtccctg atagcatagt agaaaacccg 660 tagggttcca ataacatatc aggaaacccg tcgacttcca atagcataga aggaaactcg 720 tcgatttttc ggtaacatag tagtgttagg agggcaatcg tcagtactag ttaatttata 780 acatgtttca aaaagactta aatataaatc atgcaacata ctctatggtc ccacacataa 840 tcacatcaac aagaacagtg tagcatgctc atacatcaca tagcacaagg acgaccgcag 900 taatgagtct acttaccttg gaattaaatt tcaatagcta accacgcaac caacttttac 960 aaaaaaaaaa ccctcgagtt gcaacctagg cataaacccc aa 1002 <210> 5 <211> 1002 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 5 tttgggtgtc aagaaatctt ttaggatatt aaatcctagg taagtggcca ttgtgataat 60 cactaggcca attcatgttg ttaacttacg tattttaaaa acattattta gaaagtagat 120 aagaaaacaa ataaatagga aaaattaatt ttaaacttaa atttaaaaca aaaaataaaa 180 atgagggaaa aaggaaaaaa aaaaaaaaaa aagacacaaa ttggaatatg tagggttatt 240 acatggctca ttgttatgtt tctctcaata gcaagtggtg gccatgtgag gttttctttg 300 atattagacc cttttttgct ttgaatggaa gccttagcct taaggtcttg tttggatttg 360 cccttttttt tttaggaaga aaaaaaaaaa aaaaaaaact ctccctccaa tatttgctat 420 ttcatcctta atttctccat ctaacttgtt aattttgaca ttaccccaaa ttccatcttt 480 gtttattaca aaactccccc agtcattatt ttattttcaa tccctttctc ttgtatttca 540 aatccggcag ttctctctct ctagaacgtc ctttttggta tcaaaatgaa acaaaattaa 600 attagggcgg tgttttgttt ttctttttgg ttatatcaat tttttttagc ttcatgtatt 660 tgtatcagtt ttagttttaa cttttttatt ttttttgtca ctaataaaac cataaagatc 720 aatatgccga cattgatatg gtcaataatt tttaatacta ttaatgacaa aaaccacgag 780 ataattgaaa caaaatatga aagtatgggt atatgatatg gtatattttt acaatgatct 840 ttccttcaaa atatcattga aaattgacag tttcagatat tcaaatagaa taatgtattt 900 catattaatt caaaagaaat acaagaatgt gtcttctttt caaacattcc ttgtaaaaaa 960 gttactatgt aatgaatata tatatatata tatatatata ta 1002 <210> 6 <211> 1002 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 6 tcttttgaga agtttctata tgttatttca cccattatat ggctggtttg atttgaagct 60 gttctttata ttgcagcttg aaaaccattc ttctgtggct gtgagagcac atccttcttt 120 tatgagttgt cccaatttct ttcctaccta ccaggtattt aagtctaaga ctgttttcca 180 taatttctat gctatttata catggctata caactttttt ttagtcgatt ttcgttagag 240 tgttgatata atactaaact catccgaact cattaattta aacttttagg ttgattgatc 300 atttaacatg gtattaaagt tcataaagtg taagtacatg ctcaatcaaa aaaaaaaaag 360 tctttaactt aagaatagtg aattaaaaaa tacgagtttg agagaatgtt gaggatccta 420 cgccctaata agatggtggg acctcacaaa tctttttaaa catatgtagg ttacttgttt 480 gttaattagt tttgaaatga gtactaatgt tatttttaat tgttggtcac tttttattaa 540 caatgatctt tttaaaaaaa aaaaaaaatg gaaaagtgtt taaactaaaa tgcatgctaa 600 cctcaccttt ttgagtctct cagcaacgtg aaaaaaataa taataaaatt tattttttta 660 atttataaat ttggtccttg taatttaaaa aaagttagaa tttaattcat atgatttata 720 attaaaattt agtctttatg gtttgttaaa actttcttaa atattcccta tagtgaagac 780 tattttttag gattttatca aaccatatag gctatttgtg aaactttatt agatataaga 840 ctaactttta aaactataga aactaaattc taactttttc gaaatcatat ggaccaaatt 900 tgtaatttaa tttttgttgt tagttcaata ttattcaatg gtgtgatata tatatatata 960 tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata ta 1002 <210> 7 <211> 1002 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 7 tccagttaaa aacctaaaac aaaaaatttt aaattttaaa ttaaattaaa tttatttggg 60 gctgaagttc ataatttaca ttacagagat ttggcaaata cactaaaagc tagtgaggaa 120 aggtgaaaga gaatgaggtg aagggagcaa aatacaaaag ctagttatgt ttggttggca 180 aatacacgaa gtgtttttcg atgaaattaa gatgaaaaat taactccatt tgcaaaagcg 240 tactaatgga acaacagggc cttgctggaa acgtgaaaga gaaagtagaa ggagaatgag 300 agggagggag ggaggagata agaataacca tcatcaaata aataaataaa aatatataat 360 taatttagat tgacatgtca ggtaaatcct agcatagtcc catagttccc ttttggttta 420 gtcaactaat gatcaaatga gttgaagtac catttagaac tatttttaaa 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gttcttagga agtcacacct cctacttcca 300 tgctaagtgg gaaattccaa tccaaattga aaattgattt tcataaaatc aataaataaa 360 tcccatttta gattaattct aatcattaat atttaaaatt aaattaataa attttccatt 420 ccacggaaca gcttctctac taacctagaa ttaggtagga gtgaattcta tcttgcagga 480 ctatgtcccc agctatctac tctggtctta tgcctaaaat gggaggctta ttgagtcggc 540 gaactcaggt cactttcacc catgcaaatt aaaagataat ctaaaacaga caggagttca 600 tagttagctc aagattaaga ttgagttacc taggtcatta ggttgaaata atcaatttca 660 acagtaaatg gtgttataaa gtaagagtaa ttatttcatg gtccaatctt atgcaaactc 720 attgcatatg atgcccccac tcacatacat agtgagctgc atccatatta tccccaggat 780 aaggtaccca accttatctc tatactatag attgttttag ctattattta aacttgatcc 840 acttttatgt ctacacataa agtctaagta ttcaacatat aaccaagggt tcttagttta 900 ttggatttaa taaatgcaat tcacatatcc aataacaatt ttactaaact tattctcaat 960 aaagttgtta tcgagaataa gttccaaaat ttacaaacta ca 1002 <210> 9 <211> 1002 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 9 catacctaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagaaactg ttaccaaaca cttgtttctc 60 tagattcata 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720 tttcatcctt tccaaccagt atgtttttgt ttatatatac acagctgaat tccttggatt 780 ttcttcatat cctcctgcat atttgagcca agatgccact ggaaacaagc ttttaacagg 840 agccaacttt gcttctgctg cttctggctt ttatgatggc acagctcagc tctatgtaaa 900 taatcttctc tacctctcca tttagtagtt tatgaattgt gtaccaatat ctaagctaac 960 acatcagaga aggtgtttag atctaataac tgattgagat cg 1002 <210> 11 <211> 1002 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 11 caaatcttta ttaaatgtgg tcttatttaa ttctcatatg atgatgctac cggtaatgtt 60 ttaggccaaa tccatgcaag ttcatccctt aggaggaaag attatctcta tcaaatacta 120 gtttttatat aaagggcaaa ttgcaaaaaa ccactctaaa aattatataa atgttgaaat 180 tgagtcaaat tgatccttca aatttatata atggttaaat tgtaatattt gtataagttt 240 acgaactcaa tttttatcgt ttgtgggtcc aatttctata attattgtaa gttcgatggt 300 ccaatttcta taatttcgaa aaaagaaaaa ttattattct taattagctt cacttccaaa 360 attcctaatg aagtcatttt caagcaaaaa tgtgtaaacc attggacgta aaagtttata 420 cgattggtgt tatatcttaa tttgattaat taattaatat ggtagggtta atggttacgt 480 ttcctttaga tcgaataaat agtaatggat 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aatttgaagc taccaatttt cttagctaac gatgaagaaa acaggtctaa ctgtaaagaa 360 tcgggctaga agcactaatg gcagtcctat aggttgatgg actagttaag taggacgttg 420 cgatcctttc tttttcttgc aataaagaaa aacccctttt taaaagaact agaaatgggt 480 ttaccgagac agtggaatat tcctaactat atcctaatct ccacccattc tttgccctgc 540 caccacttcc tcatcaaaga ccaaaactaa gaccaagtat taccaattcc catcgagaaa 600 gcaagcaatc tccatgggag cgggaataac tagaaaagta actgtcaact ggttatccaa 660 ctcgttcgta ccttttgtaa cttttttggc ttggattcat ctccgtctca actctcttcc 720 cttcgcgtac tcgtatgtcc cctccacttt actaattggt atgatgaccc gtaagaggaa 780 gcaacatagt catattagcc agagcaccct aaaccggcaa cagcaagacc aaccaaccaa 840 atttaagaaa gaggaataga aaacgggact cgattgtctt ttcagagttg taatgatata 900 tttataagaa atattaatta ggattttcct attcgaattt gatctatact tatttgagcc 960 caaatcttct cttatgttag acctattttc tctagtcttt tc 1002 <210> 13 <211> 1002 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 13 atactgagag tattaaaaga atcctcctga tggagaaccg tggcagtggc agcaataaca 60 aatttattaa gagcgggaca aatgacttct aaagctcaag cattgacacc ctgcattctt 120 tggatgatgg aagctcttta ctgggatcct ctcaagaaaa tagtctttaa ttagtgcctg 180 gtgcctatca gaatgggtta gttctttatt tgtgaggtca actgttgagc ctttaatatg 240 gttcttggtt tcgataagta ttagacggtt ctccaatttt aacaggtctc tcacttataa 300 gactaaagtc cctgaaattt actacgaatt tgagtaggtg tacgtgtgta tcctattttg 360 aatgattgaa tgaaactaca agatcctcca acaacttctt tgaattgtgc tatgcagtaa 420 ccttaagtgt aatgcctgaa atctctaagg tgactcttac aattccaatc cccaaccgct 480 tacaaattag ttctacaggt tcgctatcta acaaacatat tctggatcta ctttatgtgt 540 ttcttgtcct gaatcaacct ttggcatcaa agcaacatgt caaaaggttt ggtaggatat 600 caaagagtaa tgtgtcatca ctcatcacct gagtgtctat ccatgttctt acctctcaaa 660 tccaatcata tacataaatg taattgatag ttagattata taaatatagg ttcttcaacc 720 taaactcttt agaaagacca ggaacaagat cataaaacat gcaataaagt atgaaactga 780 gatatttttt ggattaaata atattaacca catctttctt tctgccaatt taatttcttt 840 gaaattttca ttttgtcccg aaaataggaa gccttaaatg aatttcaaga caaggatata 900 tgcctttcag cttcttgtta gtagttaaat ttgaaagtga ttacaagctt 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ttgtactttg caggtagctc tgactgtgaa cacagcagca 780 gcaggtgcag cagcagcagt ggtatctcta gcacacagtg gaaactcgag cacaaattgg 840 ttgtcaatat gcaaccaatt tggggacttt tgtcaacaaa ctagtggggc tgtggttggc 900 tcttttgctg ctgtcttgct cttccttcta ctcatcttgt tctctgcttt gtccctcaaa 960 aatagacatt gatatcatta ttgtcgcaat atcgtcttct cg 1002 <210> 15 <211> 1002 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 15 tttgtctctg ccgattcttt ttttgccaac gcaacaaaaa acgttagcag agttagtttc 60 tgccgacgaa tttttaatgc gtgggcataa catcatatct gccgacgaaa atatatacgt 120 gggtaaaaag tagtgttgta ttaatgaaaa tcattaaagt tggttttttg ccgacgatga 180 atttagtttc tctcctcgca aggagtgtgg gcataaactt ttaatttttg cctacgaaag 240 gaatgtggcc aaaaagattt taaatctcac ttattttttc atcacacaca tttttaccca 300 caaaaacatt tccccccctt ttttttactt tccctcctct cactctccct cttttttttt 360 ttccatttta tttttctttt tacataaaac aaaaaaaaac atcttcaccc acattctttc 420 atctacccga cccccccccc cccccacaaa aacctcttcc cacccatctt ctttcacccg 480 ccggcgatga acgacgatca actgctgctg ctgctcgacg ctgtcgcttc ttctgccgac 540 gcctgcctgc tactttagtt gacgcccccg tcttgcttat gccgacggca tttctgcttg 600 tgcctgacgt tctgctcgtg gaagacaacg ccgttcgtgc tcgtggtttc cgccatctca 660 gtaaatgtgg gtgagttgtt tattgactat ttgtttggat ctagagttgt cttctatagt 720 gatatagact tgttaattga gtattttttt ggatctagaa ttgtcctcta caaatgaatg 780 tttgaatgaa attagttgtc gttttggaag attagttgtc gttttggaac acatagttta 840 aattagttgg actttgcatt gtgagactta ccaaatatta taactatcat gtgaaaattt 900 gaatgaaatt gtaatgagaa taatgaaatt gcaatgagaa tgattaatgt tgatatttta 960 ggttgatttt gagtttggaa gtcacactta aatatgttca ag 1002 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-3-862-F Primer <400> 16 ccaaccgggg ttaagctaag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-3-862-R Primer <400> 17 gtgttgggat gggtcaaatc 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-302-F Primer <400> 18 ttgacattac cccaaattcc a 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-302-R Primer <400> 19 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21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-087-F Primer <400> 28 gaaaaatgca gcttccactc a 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-087-R Primer <400> 29 gagtgcaggc acaagaggat 20 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-557-F Primer <400> 30 tggttacgtt tcctttagat cg 22 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-557-R Primer <400> 31 cgctaaagtt gataaaagaa acca 24 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-365-F Primer <400> 32 gggtttaccg agacagtgga 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-365-R Primer <400> 33 cttgctttct cgatgggaat 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-134-F Primer <400> 34 ccccaaccgc ttacaaatta 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-134-R Primer <400> 35 atgccaaagg ttgattcagg 20 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-758-F Primer <400> 36 ttgttaggaa gaggaaccaa agtt 24 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-758-R Primer <400> 37 attcaagtgg gagagccaag 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-809-F Primer <400> 38 tcccacccat cttctttcac 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-4-809-R Primer <400> 39 ggggcgtcaa ctaaagtagc 20

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 수박의 유전자 마커 이용 여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)에 적용하는 것을 특징으로 하는, SNP 마커 조성물.
  3. 서열번호 1의 501번째 염기를 포함하는 8 내지 100개의 연속된 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는, 서열번호 2 및 3으로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 프라이머 세트.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 고해상도 융해(High-resolution melting; HRM) 분석용 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  6. 제3항 또는 제4항의 프라이머 세트를 포함하는, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하기 위한 키트.
  7. 하기의 단계를 포함하는, 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하는 방법:
    (a) 판별하고자 하는 수박으로부터 유전체(genomic) DNA를 분리하는 단계;
    (b) 분리된 상기 유전체 DNA에서, 서열번호 1의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 측지, 덩굴손 및 엽설 형질을 갖지 않는 수박 개체를 판별하는 단계.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 제3항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 고해상도 융해, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
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