CN109385433A

CN109385433A - 芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1及其突变基因Sicl1

Info

Publication number: CN109385433A
Application number: CN201811123445.3A
Authority: CN
Inventors: 张海洋; 苗红梅; 魏利斌; 李春; 段迎辉; 徐芳芳; 曲文文; 赵瑞红; 琚铭; 常淑娴; 秦灵灵
Original assignee: Henan Sesame Research Center Henan Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Sesame Research Center Henan Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2019-02-26

Abstract

本发明属于芝麻分子遗传育种技术领域，具体涉及一个芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1及其突变基因Sicl1。芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1长度为6835bp，包含6个外显子和5个内含子，位于芝麻第1条染色体上。突变等位基因Sicl1为隐性控制基因，长度为1829bp，对芝麻卷叶、闭蒴性状的解释率为100%。本发明通过提供芝麻卷叶闭蒴等位基因SiCL1/Sicl1，以及特定的InDel分子标记SiCLInDel1，一方面为芝麻等农作物叶片和蒴果调控发育机理研究奠定了理论基础，另一方面，为芝麻的分子辅助育种技术发展、抗裂蒴芝麻新品种筛选及新品种培育提供了材料基础，因此具有较好的科研价值和经济应用价值。

Description

芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1及其突变基因Sicl1

技术领域

本发明属于芝麻分子遗传育种技术领域，具体涉及一个芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1及其突变基因Sicl1。

背景技术

芝麻（Sesame indicum L.，2n=26）是我国特色优质油料作物，属于一种无限生长型作物。芝麻开花后结成蒴果，并在蒴果内发育形成芝麻籽粒。常规芝麻品种蒴果为开裂型，但通常因上下部位蒴果成熟度及成熟期的不一致，对芝麻籽粒收获及产量造成一定影响。因此，为提高芝麻产量潜力，高产稳产型、机械化适用度高的芝麻新品种选育是推动我国和世界芝麻生产发展的重要环节措施之一。

叶型和蒴果开裂性是芝麻品种选育中两个比较直观、也是比较重要的农艺性状，也是品种选育的重要评价指标。而随着分子育种技术的发展，对现有芝麻种质资源的农艺性状进行详细调查及对其调控基因进行详细分析研究，可为选育和培育新的芝麻品种提供新的途径，也有助于加快芝麻新品种的培育工作。而随着相关基因组测序工作的开展，相关功能性基因的分析是现阶段芝麻育种工作中的重点工作之一。

发明内容

本发明主要目的是提供一个芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1，以及该基因的突变等位基因Sicl1；同时为便于研究和分析，本发明提供了一个针对性的InDel标记，从而便于新种质、新材料的选择。

本申请的技术方案详述如下。

芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1，该基因长度为6835bp，包含6个外显子和5个内含子，位于芝麻第1条染色体上，在芝麻USA (0)-26×cl1群体SNP遗传图谱中的位置为第8连锁群C29 区间的C29_6522236 和C29_6918901标记之间，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1的cDNA，包括两个cDNA序列，序列 1（SiCL1-1）长度为1323 bp，编码440个氨基酸；具体如SEQ ID.2所示；序列2（SiCL1-2）长度为1320 bp，编码439个氨基酸，具体如SEQ ID.3 所示。

芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1的突变等位基因Sicl1，该基因长度为1829bp，对芝麻卷叶、闭蒴性状的解释率为100%（Vg/Vp）；其DNA序列如SEQ ID NO.4所示；所述基因Sicl1为隐性基因，即，当植株中基因型为Sicl1/ Sicl1时，植株表型为卷叶闭蒴表型，如果植株中基因型为SiCL1/ Sicl1或SiCL1/ SiCL1时，植株表型为正常的展叶开蒴表型。

芝麻卷叶闭蒴突变等位基因Sicl1的cDNA，序列长度为900bp，编码299个氨基酸，具体如SEQ ID.5所示。

需要解释和说明的是，卷叶闭蒴突变基因Sicl1与正常SiCL1基因序列的主要区别在于：

突变体（cl1）的卷叶闭蒴突变基因Sicl1基因序列中，正常序列的1131-1150bp位置处的20个核苷酸CAGGTAGCTATGTATATGCA 突变成了突变体中的6个核苷酸TCTTTG（具体而言，正常序列中的1138bp、1139 bp、1141 bp、1142 bp未发生突变，其他碱基发生了突变），而这种突变的发生导致了后续翻译的较早终止，因而使得等位基因序列大幅缩短；另一方面，由于正常的SiCL1基因的可变剪切和InDel突变，导致Sicl1基因的cDNA序列中，第295-299氨基酸序列由正常的Arg₂₉₅-Lys₂₉₉ 变成了Asn₂₉₅-Cys₂₉₉，植株也由正常型（展叶开蒴型）变成了卷叶闭蒴型。

针对所述芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1/等位基因Sicl1的PCR扩增用引物对，具体设计如下：

SiCL1 F：5'- TCCAACTTTTGCTGTCCGTC -3'，

SiCL1 R：5'- GGAATCCAAAATCCAAGTGAGA-3'。

利用所述PCR扩增用引物对制备获得芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1/等位基因Sicl1的PCR扩增方法，包括如下步骤：

（1）提取制备DNA模板

提取DNA时可采用改良CTAB法进行操作；

制备获得芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1时，以表型展叶开蒴正常表型的种质资源材料（具体例如豫芝11号）为材料基础来提取制备DNA模板；

制备获得芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1的等位基因Sicl1时，以表型卷叶闭蒴表型种质资源材料（具体例如突变体cl1）为材料基础来提取制备DNA模板；

（2）PCR扩增

利用步骤（1）中所制备DNA模板以及PCR扩增用引物对，进行PCR扩增；

PCR扩增时，10 µL反应体系可参考设置如下：

模板DNA，80 ng；

10×PCR Buffer (Mg²⁺)，1.0µL；

Taqase酶 (5U/µL)，1.0µL；

dNTP (10mmol/L)，0.1µL；

Forward Primer (10µM)，1.0µL；

Reverse Primer (10µM)，1.0µL；

加入超纯水至10 µL；

PCR反应程序为：94℃预变性4分钟；之后94℃变性30秒，55~58℃复性2分钟，72℃延伸1分钟，循环35次；最后72℃延伸8分钟；

PCR扩增产物即为芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1或等位基因Sicl1。

针对所述芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1/Sicl1的InDel分子标记SiCLInDel1，为一对引物序列，具体为：

正向引物SiCLInDel1 F序列：5'- CTACTCCGAAGTCAGTGTTGGA-3'；

反向引物SiCLInDel1 R序列：5' –GAGTCCACACATTCCTATTACCTA-3'。

利用所述InDel分子标记对芝麻表型的PCR检测判定方法，包括如下步骤：

（1）提取待鉴定芝麻种质资源的基因组DNA；

基因组DNA提取可参照魏利斌等的改良CTAB法进行（芝麻DNA和RNA同步提取方法，2008，分子植物育种）；

（2）以步骤（1）中所提取DNA为模板，进行PCR扩增；PCR扩增时，利用InDel分子标记引物序列进行PCR扩增，所述引物序列具体为：

正向引物SiCLInDel1 F序列：5' CTACTCCGAAGTCAGTGTTGGA 3'；

反向引物SiCLInDel1 R序列：5' GAGTCCACACATTCCTATTACCTA 3'；

（3）依据PCR扩增产物片段大小或具体序列进行判定，具体而言：

如果PCR扩增产物只有一条，且长度为199bp，则待鉴定种质资源中含有卷叶闭蒴基因SiCL1，为显性纯合型，其表型为展叶开蒴的正常型；

如果PCR扩增产物只有一条，且长度为185bp，则待鉴定种质资源中含有卷叶闭蒴基因Sicl1，为隐性纯合型，其表型为卷叶闭蒴表型；

如果PCR扩增产物有两条，且长度分别为185bp和199bp，则待鉴定种质资源中同时含有卷叶闭蒴基因SiCL1和Sicl1，为杂合型，其表型为展叶开蒴的正常型；

为进一步判定PCR扩增产物序列的准确性，可对PCR扩增产物进行提取后测序，依据测序结果进行比对测定，具体而言：

PCR扩增产物中的199bp，对应卷叶闭蒴基因SiCL1中第1060至1258位碱基序列，具体序列为：

CTACTCCGAAGTCAGTGTTGGAGCTCATGGACGTCAAAGATCTCACTCTTGCTCATGTCAAGAGCCATTTACAGGTAGCTATGTATATGCATAGACAGCCTAGACTGAGAAAACATAGGAAAATTGTAGTCAAAGGAAAGAAGCCCAGAAAATTTATCTTTGTCTGTGTGTGGGTTAGGTAATAGGAATGTGTGGACTC；

PCR扩增产物中的185bp，对应卷叶闭蒴等位基因Sicl1中第1060至1244位碱基序列，具体序列为：

CTACTCCGAAGTCAGTGTTGGAGCTCATGGACGTCAAAGATCTCACTCTTGCTCATGTCAAGAGCCATTTATCTTTGTAGACAGCCTAGACTGAGAAAACATAGGAAAATTGTAGTCAAAGGAAAGAAGCCCAGAAAATTTATCTTTGTCTGTGTGTGGGTTAGGTAATAGGAATGTGTGGACTC。

所述InDel分子标记在植物育种中应用，根据对于种子资源中是否含有SiCL1、Sicl1基因的鉴定结果，可用于不同植物表型新品种的培育。

发明人对现有芝麻种质资源库进行调查研究后发现，现有芝麻种质资源中存在一种叶片卷曲且蒴果闭合的芝麻种质材料cl1。该材料最早在上世纪40年代由美国科学家Derald R. Langham发现，为自然突变体类材料。该突变体在田间表现主要包括以下方面：（1）叶片上卷，叶背部不够平滑，带有小突；（2）蒴果闭合，较难打开；（3）叶片上卷表型与蒴果闭合表型不出现分离；（4）卷叶闭蒴突变体单蒴粒数少，结实性差，产量水平较低。发明人进一步的实际种植结果统计表明，突变体cl1的单株结蒴数量在34-37个，平均单株籽粒种为4.82 g/株，与现有豫芝11对照（10.17g/株）相比，结蒴性差，单株产量低。常规而言，缺乏实际开发利用价值。但从分子育种角度分析而言，对表型性状调控基因的详细分析，可为芝麻叶片及蒴果发育规律提供良好材料基础，并可较好推动植物新品种选育进程。

前期工作中，发明人将USA (0)-26 (CL，正常) 和豫芝11 (CL，正常)分别与cl1(cl，突变)配置了杂交组合并调查了F₁、F₂代特征特性。结果显示，F₁后代均表现为正常。F₂调查研究结果显示，正常型与卷叶闭蒴型分离比例为3:1。这一结果表明，该性状受单隐性基因控制，且卷叶与闭蒴性状紧密连锁没有分离，属于“一因多效”现象。

进一步地，发明人利用已构建的USA (0)-26 (CL，正常)×cl1(cl，突变)的F₂群体，参考芝麻基因组精细图、芝麻群体关联分析和基因组重测序技术，成功克隆获得了芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1和其等位基因Sicl1的基因序列。更进一步地，为便于识别和研究该基因，发明人分析了野生型和突变体cl1(cl，突变)中的基因cDNA序列，并开发设计了InDel分子标记SiCLInDel1，从而便于相关研究工作的进一步开展。

需要强调和说明的是，针对卷叶闭蒴基因SiCL1及其等位突变基因cl1，现有技术虽有部分研究，并就部分碱基序列进行了测序，但实际应用及分析发现，基于现有成果，只能初步分析相关材料中是否含有相关基因序列，而无法确定该基因功能是否与叶型和裂蒴性有关；而且由于现有技术及成果对相关序列信息披露的不完整，人们是无法充分利用现有成果进一步进行相关基因功能分析、特定目标的转基因育种等新品种培育工作的。因此，就特定功能基因的全基因序列分析、功能基因应用及新品种培育等应用而言，本申请仍然是具有十分重要的科研和应用价值的。

总体而言，本申请的主要技术效果体现在以下几个方面：

（1）本发明通过对芝麻卷叶闭蒴突变体cl1开展的基因组重测序和基因定位，克隆获得了芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1及等位基因Sicl1，并开发了针对性的InDel分子标记SiCLInDel1，可较为便捷和快速地确定待测芝麻品种的叶片形态与蒴果开裂与否的表型，从而为新品种培育提供参考；

（2）本发明所提供的卷叶闭蒴基因SiCL1、等位基因Sicl1以及InDel分子标记SiCLInDel1序列明确，检测结果稳定可靠；且所涉及的卷叶闭蒴基因对芝麻产量、品质以及芝麻生产等均具有重要影响，对开展芝麻等农作物叶片及蒴果发育机理研究以及培育适于机械化生产的芝麻新品种具有重要意义；

（3）本发明所提供的卷叶闭蒴基因SiCL1、等位基因Sicl1以及InDel分子标记SiCLInDel1的检测方法，技术操作较为成熟，检测结果稳定性较好，对提高芝麻育种工作效率、提升我国芝麻遗传育种研究技术水平具有重要意义。

总之，本发明通过提供芝麻卷叶闭蒴等位基因SiCL1/Sicl1，以及特定的InDel分子标记SiCLInDel1，一方面为芝麻等农作物叶片和蒴果调控发育机理研究奠定了理论基础，另一方面，为芝麻的分子辅助育种技术发展、抗裂蒴芝麻新品种筛选及新品种培育提供了材料基础，因此具有较好的科研价值和经济应用价值。

附图说明

图1为豫芝11（叶片蒴果正常，WT）和卷叶闭蒴突变体cl1（cl1型，卷叶、闭蒴）叶片及蒴果形态对照；

图2为本发明利用F₂群体重测序进行的SNP和InDel变体图谱关联分析；其中彩色图像下的绿点为6个候选变体位点；彩色图像下的红色横线指-log 10 (P)值为8；

图3为本发明的芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1、等位基因Sicl1结构与cDNA序列比对结果；其中a图为芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1、等位基因Sicl1结构；b图为芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1、等位基因Sicl1 的cDNA序列比对结果。

图4为本发明的卷叶闭蒴性状InDel分子标记SiCLInDel1的引物对在部分芝麻种质及群体材料中的PCR扩增结果，其中：泳道M为DL 2000 marker，显示的条带从上到下分别为750bp、500bp、250bp和100bp；泳道1-10为含有突变Sicl1等位位点（即cl型）的F₂材料（卷叶闭蒴）；泳道11-20为含有SiCL1基因位点及杂合型的F₂群体材料（表型正常）；泳道21-40为芝麻种质资源材料（表型正常）。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

种质材料：

本申请中所涉及的卷叶闭蒴突变体cl1芝麻材料为一种卷叶闭蒴表型的自然突变体后代，该材料最早在上世纪40年代由美国科学家Derald R. Langham发现。上世纪80年代左右美国芝麻育种家Ray D. Langham将该材料赠送河南省农业科学院芝麻研究中心，并被保藏于河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库中，属于一种可公开获得材料；

下述实施例中所涉及的USA (0)-26、豫芝11、以及其他芝麻种质资源材料，均为叶片正常展叶、蒴果正常开裂表型材料，均在河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库中有所保藏，也可由其他种子资源库或公开渠道获得。

实验试剂及仪器

PCR反应中相关酶类、缓冲液等试剂产品均采购于上海生工试剂公司或中国大连Takara公司；

相关引物由上海生工或华大基因公司合成提供；

相关基因测序由天津基因芯片生物公司完成；

下述实施例中标记验证用PCR反应采用PTC-100 (MJ research公司产品)热循环仪进行；

基因序列 PCR反应采用德国Eppendorf Mastercycler PCR仪器(Eppendorf公司，德国)进行。

实施例1

本实施例主要介绍一下芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1/Sicl1的筛选及其InDel分子标记SiCLInDel1的开发过程，相关实验过程简要介绍如下。

一、卷叶闭蒴性状遗传背景介绍

为研究分析芝麻卷叶闭蒴性状，前期工作中，发明人选用USA (0)-26 (CL，正常) 和豫芝11 (CL，正常)分别与cl1(cl，突变)进行了正反交组合配置（具体组合配置如下表所示），并对F₁后代进行了叶片形态与蒴果开裂类型调查。

USA (0)-26 (CL，正常) 和豫芝11 (CL，正常)分别与cl1(cl，突变)的正反交组合配置类型为：

。

栽培筛选过程中，豫芝11（叶片、蒴果正常）和卷叶闭蒴突变体cl1材料的典型表型性状对比如图1所示。

对F₁调查结果显示，F₁代叶片、蒴果均为正常，说明该突变性状（卷叶闭蒴）受隐性基因控制。

随后，对USA (0)-26 (CL，正常) 和豫芝11 (CL，正常)与cl1(cl，突变)的2个正交F₂后代群体进行了加代种植，每个群体均大于1000株。苗期、花期及成熟期开展了田间性状调查，结果如下表所示。

F₂及测交后代群体中性状分离结果：

。

从上述数据可以看出，野生型与卷叶闭蒴型性状的分离比分别为830: 261和906:325，适合性检验结果显示其符合3:1分离比，表明该突变性状受1对隐性基因控制。进一步进行USA (0)-26 (CL，正常) 和豫芝11 (CL，正常)与cl1(cl，突变)的2个测交后代群体检测。结果显示，突变性状后代分离比例分别为221: 213和174: 165。适合性检验结果显示，卷叶闭蒴性状在测交后代中符合1:1分离比，进一步证明该突变性状受1对隐性基因控制。

二、芝麻卷叶闭蒴突变体与野生型亲本的F₂遗传群体构建

为详细分析控制卷叶闭蒴表型的这1对隐性调控基因，发明人以USA (0)-26 (CL，正常) 和cl1(cl，突变)组合进行了F₂群体构建和性状调查。构建过程中，为确保株系数量，发明人将上述组合的F₁种子采用营养钵点播种植，2对真叶后，适时移栽各植株，确保测序及性状调查应用。

三、卷叶闭蒴基因F₂群体图谱关联定位

（1）F₂群体亲本及130个F₂单株基因组重测序，具体而言：利用步骤二中所构建的F₂群体，随机挑选130个株系，采集130个株系单株和2个亲本单株的幼嫩叶片，提取各植株DNA，采用Illumina测序方法对132份材料进行基因组重测序，测序覆盖度≥30×。

（2）参考现有豫芝11基因组数据（PRJNA315784），选用BWA（Burrows-WheelerAligner）0.7.15软件将各株系的测序数据进行拼接；使用GATK3.7软件对132份测序材料基因组中的SNP和InDel变体位点进行筛选。

（3）在苗期-成熟期，对F₂群体130个株系及2个亲本进行表型鉴定，共鉴定3次，确保鉴定准确。进一步地，利用TASSELE5.0和GLM模型进行F₂群体变体的卷叶闭蒴性状关联分析，确定候选关联变体所在的区域，最终确定具有最低P值的变体为C29_6721563（2.38×E^-91）。

随后对该位点上下游各200Kb进行定位，确定与卷叶闭蒴性状显著关联的变体区域位于第8连锁群（即第1染色体）的C29区域，在C29_6522236 和 C29_6918901标记之间。

进一步分析发现，该区域共包含90变体（SNP和InDel），P值范围在3.97×E^-19~3.00×E^-94。

（4）随后，采用已有的822份芝麻种质（正常型）基因组数据对上述90个变体进一步进行过滤分析（过滤结果如图2所示），最终确定6个变体为候选位点（图2中彩色图像下的绿点）。

具体6个变体位点及所在基因信息如下：

注：方向*列的F 指正向；“-”表示在变体上下游10Kb区域内不存在基因。

基于上述筛选和已知的C29.460基因序列信息，设计SiCLInDel1分子标记引物对（正向引物SiCLInDel1 F序列：5' –CTACTCCGAAGTCAGTGTTGGA-3'；反向引物SiCLInDel1 R序列：5'-GAGTCCACACATTCCTATTACCTA-3'），随机从上述亲本、F₂群体以及500份种质资源（正常型）中选出1000个植株，提取DNA，利用上述分子标记引物对进行筛查。

结果显示：C29.460基因为控制芝麻卷叶闭蒴性状的目的基因，SiCLInDel1位点与卷叶闭蒴性状紧密连锁。

实施例2

本实施例主要介绍一下对芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1及等位基因Sicl1克隆及基因序列分析过程。

在实施例1基础上，为获知芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1及等位基因Sicl1的具体序列，发明人进一步采用PCR扩增方法扩增获得了相关序列并进行了进一步测序，相关过程简介如下。

（1）设计引物，利用PCR技术扩增获得SiCL1及等位基因Sicl1

根据实施例1中确定的变体位点，利用已知的豫芝11号基因组数据，确定了SiCLInDel1位点所在的基因，将该基因序列命名为SiCL1。对SiCL1序列分析发现，该基因在芝麻基因组（豫芝11号）被注释为KAN1基因（SiCL1)；随后，根据基因组数据，利用Primer premier 5.0软件设计了扩增芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1及等位基因Sicl1的引物对，具体设计如下：

SiCL1 F：5'- TCCAACTTTTGCTGTCCGTC -3'，

SiCL1R：5'- GGAATCCAAAATCCAAGTGAGA-3'。

（2）PCR扩增

分别以豫芝11和突变体 cl1材料的DNA为模板（植株DNA提取参照魏利斌等的改良CTAB法进行（芝麻DNA和RNA同步提取方法，2008，分子植物育种），利用步骤（1）中所设计引物进行PCR扩增；

PCR扩增时，10 µL反应体系设置如下：

模板DNA，80 ng；

10×PCR Buffer (Mg²⁺)，1.0µL；

Taqase酶 (5U/µL)，1.0µL；

dNTP (10mmol/L)，0.1µL；

Forward Primer (10µM)，1.0µL；

Reverse Primer (10µM)，1.0µL；

加入超纯水至10 µL；

PCR反应程序为：94℃预变性4分钟；之后94℃变性30秒，56℃复性2分钟，72℃延伸1分钟，循环35次；最后72℃延伸8分钟。

（3）序列分析

将步骤（2）中的PCR扩增产物4℃保存备用，或者直接回收扩增条带后进行测序。

结果显示，SiCL1基因的全长gDNA序列为6835bp，共包含6个外显子和5个内含子，序列如SEQ ID NO.1所示；

Sicl1基因全长gDNA序列为1829bp，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

（4）cDNA分析

为便于进一步对比分析，参考上述操作，分别提取豫芝11和cl1突变体幼嫩植株的RNA，反转录获得总cDNA（利用TaKaRa RNA反转录试剂盒），以此为模板，利用步骤（1）中所设计引物进行扩增，获得SiCL1 和Sicl1基因的cDNA编码区序列。

进一步测序分析后，结果表明：SiCL1基因存在可变剪切，其cDNA序列为2条，其中SiCL1-1有1323bp，编码440氨基酸；SiCL1-2有1320bp，编码399氨基酸；序列如SEQ ID NO.3所示；

Sicl1基因cDNA序列为900bp，共编码299个氨基酸，序列如SEQ ID NO. 4所示。

进一步将卷叶闭蒴突变Sicl1基因与正常株（即豫芝11号）的等位基因SiCL1进行结构和cDNA序列比对，结果如图3所示。分析可以看出：

卷叶闭蒴型突变体（cl1）的Sicl1基因序列中，在第1131- 1150bp中的20个核苷酸CAGGTAGCTATGTATATGCA 突变成了6个核苷酸TCTTTG；

另一方面，因SiCL1基因的可变剪切和InDel突变，导致Sicl1基因的cDNA序列中，第295-299氨基酸序列由Arg₂₉₅-Lys₂₉₉ 变成了Asn₂₉₅-Cys₂₉，并由此导致植株由正常型变成了卷叶闭蒴型。

实施例3

基于实施例1、2结论，发明人以Mutant cl1×USA (0)-26 F₂群体和自然群体材料为基础，对所设计的SiCLInDel1分子标记引物对及InDel 位点进行了进一步验证，以进一步验证和确定Sicl1基因即是调控芝麻卷叶闭蒴类型的基因，相关过程简要介绍如下。

（1）随机从Mutant cl1×USA (0)-26构建的F₂群体中挑选1000个单株和500份种质资源的单株，同时田间调查各株系单株的叶片及蒴果表型。

采集上述单株和2个亲本单株的幼嫩叶片，提取各植株DNA，并以此作为模板，利用SiCLInDel1分子标记引物对进行PCR扩增；

所述引物对具体设计为：

正向引物SiCLInDel1 F序列：5' CTACTCCGAAGTCAGTGTTGGA 3'；

反向引物SiCLInDel1 R序列：5' GAGTCCACACATTCCTATTACCTA 3'；

PCR反应过程中，10 µL反应体系设置如下：

模板DNA 80 ng；

10×PCR Buffer (Mg²⁺)，1.0µL；

Taqase酶 (5U/µL)，1.0µL；

dNTP (10mmol/L)，0.1µL；

Forward Primer (10µM)，1.0µL；

Reverse Primer (10µM)，1.0µL；

加入超纯水至10 µL。

PCR反应程序为：94℃预变性3分钟，之后94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环30次，最后72℃延伸6分钟，扩增产物4℃保存备用。

对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，凝胶浓度为8%，凝胶大小180mm×120mm×2mm，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒压交流电电泳2小时。电泳结束后，在凝胶加入浓度为0.1%的硝酸银水溶液，置于水平摇床上渗透银染10min；再加入2%氢氧化钠和0.4%甲醛混合溶液，置于水平摇床中适度显色；最后清水漂洗凝胶并记录读取数据。

部分电泳图谱如图4所示。

对扩增条带结果进行分析及测序，结果表明：

表型为卷叶闭蒴的植株，其扩增结果仅有一条185bp条带；对应卷叶闭蒴等位基因Sicl1中第1060至1244位碱基序列，具体序列为：

CTACTCCGAAGTCAGTGTTGGAGCTCATGGACGTCAAAGATCTCACTCTTGCTCATGTCAAGAGCCATTTATCTTTGTAGACAGCCTAGACTGAGAAAACATAGGAAAATTGTAGTCAAAGGAAAGAAGCCCAGAAAATTTATCTTTGTCTGTGTGTGGGTTAGGTAATAGGAATGTGTGGACTC；

表型为展叶开蒴的正常野生型植株，其扩增结果仅有一条199bp条带，或者同时含有185bp和199bp两个条带，185bp长度条带序列同前述等位基因Sicl1中第1060至1244位碱基序列，199bp长度条带对应卷叶闭蒴基因SiCL1中第1060至1258位碱基序列，具体序列为：

CTACTCCGAAGTCAGTGTTGGAGCTCATGGACGTCAAAGATCTCACTCTTGCTCATGTCAAGAGCCATTTACAGGTAGCTATGTATATGCATAGACAGCCTAGACTGAGAAAACATAGGAAAATTGTAGTCAAAGGAAAGAAGCCCAGAAAATTTATCTTTGTCTGTGTGTGGGTTAGGTAATAGGAATGTGTGGACTC。

总之，本申请通过对卷叶闭蒴突变的详细研究和分析，以及利用本申请所提供的分子标记，可为芝麻等作物叶片及蒴果发育机理研究提供基础，同时也为利用转基因工程、或其他育种方法培育作物新品种奠定了技术基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院芝麻研究中心

<120> 芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1及其突变基因Sicl1

<130> none

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6835

<212> DNA

<213> Sesame indicum L

<400> 1

atgcccttag aagggatttt cttagagccc tcttcaaagc cagttcctga tctttctctc 60

cacattagtc tacccaactg cgattcatcc tcgtcatcaa gaagcagcaa caccaaaaac 120

gacgccgttt ccagcttcga tctcccggtg aacatcagca gcaagcccaa gggctgcact 180

tccttcaccg atctctcgtt agctcacccg gcgaacgacg aaaaagttga gctctcgaac 240

agcttcggaa gaactcatca agaacaagaa cagccacaaa acccttatca tcatcatcac 300

caccgtatct accagcccaa ccaccagtta aatcatcatc aaatcaatca tggggactca 360

ccttttgatt catcggacgg attacggccc ataaagggca tcccggttta tcctaaccct 420

ccattcccat tcttggctct ggaccattcc accagagaga aggatccaaa gatgcggttc 480

tatcaaatgt cttatccctc ttggtcatca ccatcctctt cgtcttcttc ctcttcatcg 540

cctttctttg ggggtggttt ggaccatcat atgccattgc tgaatctggg ccctaacggt 600

tcttccacgg cggcagccta ccactgcggc ggcggcggcg gcggcggagg tggaggaaga 660

tttagtgggc tgtcgtcgta tcagctgcat catcaccaca atcatcatca tcagtacggt 720

atgggggttt ctcatcatga gggttctcat catgggatta tgcggtcaag atttctccca 780

aagatgcctg caaaacgtag tatgagggct ccaagaatga gatggaccag tactctccac 840

gctcgctttg ttcatgcagt agaacttctt ggtggccatg aaagtaattt tacaattcac 900

tatttctcga ttttcttttt cttttgggtt cttgattttg tagttgtttt gcttcttaca 960

tgcttaattt cttcaaaaat gttaaaggtt tttattttgt gggtttttgg ttttttgttt 1020

ttctttttta actgattaat ttcgatattt aattaggggc tactccgaag tcagtgttgg 1080

agctcatgga cgtcaaagat ctcactcttg ctcatgtcaa gagccattta caggtagcta 1140

tgtatatgca tagacagcct agactgagaa aacataggaa aattgtagtc aaaggaaaga 1200

agcccagaaa atttatcttt gtctgtgtgt gggttaggta ataggaatgt gtggactccg 1260

tttatttctc cggcacagta gccgatgaat gcagactgaa tgaatggatt aaagaaaagg 1320

agagaagaga agtctagaga gagagagaaa gagagagaga gagagagaga gagagagttg 1380

cagtacgtta gtagaatgat atatactata aagagacaaa agcaaagtca tcatttttca 1440

ataatacagc tcattactac tttatcaaac atcaacctcg tgattaatga tcaagcccca 1500

gtccaggaca tcactcagaa tccccacgac aacttcttcc agtagtactt tccagttaat 1560

tttttttgca tccccagaat gtaagaaacc acattattat taccagttca actcatattg 1620

tgctgatcca agtcgtaata attcatagta tttgatattt tcatattcct ttttacaaaa 1680

cacttctttt tatttttata tcagcaagag tgctagacag agatcttatt aaccttgcaa 1740

ctattaatct ttttctttgt tctatataat tcttgatttt catcgactct atcgtcttaa 1800

atttgagtat gttcttccct atgcagatgt atcgaactgt taaaactact gacaagcccg 1860

cggcttcctc aggtactata tggaatagtg tgtttttggt caaaaatgaa ttatattatg 1920

taattgggaa tacatcaata aaatgcatgc attgcctata tacgtatgtt attgcaacat 1980

cagtctgtct taacgtttct gggcttattg ttcttgttga tttctcaaag ggcattcgga 2040

tggatccggt gaagacgatc tctccacaat aggcagcggg agtgccgaca ggaccggctt 2100

gcggcagttc atggaacaaa gaggcccttc cgatgtctct ccgcgacaag aatccgatgt 2160

taacaattac cctgcagcca cattgtggag caactcctca aggtaccgtt tgcttaactc 2220

aagaacacac acataccaat gtgtgtgtgt gtgtgaacac atggaaatac acacacacac 2280

acacacacac acatatatat atatatatct aaatattata tgcccacgtc caccatttcc 2340

ttttactttt cctttccctt ttgcatggta cctgaaactc tcagaaacgc aaactcacgt 2400

ccatcatttt attttatttt attcttaaaa ttaaaggatt catacacact gcagcttttg 2460

cttttgttct ctgtttcttg atagatagat cttccttttt tcttttttaa tcttttattt 2520

cttgaagatt ttcacctgag attaattaat taattgatta gattagatta tgggatgcta 2580

acaaaagttg gggaaacaca attcaaaaag ccgaattaag ataagagaat taaagcaaac 2640

cactcgtata ctttttcttt tctctttgga ataattttat ttttctttac tactatatat 2700

gtactcgtag agtatttaat tcttcaaacc cttgttctta atattctctt cacgaggact 2760

atatacatat atatgtatat atttgcacat aagaccaaaa acagaaagaa aaatgagcag 2820

tacgtatctt gacttaagtg ctctcctttt cttaaagtac tacagattga tttttgtcga 2880

tattcttgat atatatatat atgtatatat gtatttattt atttattgtt aggacactgt 2940

ttgggaccag gttctttgtg atcacttgtt tcctgcaaga tcataatctt ctttttcttt 3000

ttcttttttc tttttttatc tcgtaaatat tcacatagaa cattattacc gagtatcgaa 3060

ttttattctg gtagtggttt ttattctaat ctcgtacttt tttttttatt atgagaaaat 3120

aaagaacatg aattaattaa tccattaaca tacaccagct tcacacgcat ttttaaggat 3180

gtaatgttga gtatatatta tttcttttta gttttacgtt ttagttttga agtgtcaatt 3240

atgtgttttt tttttatata tatatattta ttaaattgaa atgcatgtaa ctagattaag 3300

taatgacgat gcacttgttt tatagacagt tgtgttaaat taatatattt ttatttaaat 3360

aatacttgat gatagtcgta tcttttattg attttaggct tgttagttgg atcgtcatga 3420

tttttaattt aattaatata gtttcaattt ctaagtgtaa atatgtgttt ttatttttat 3480

attaattttt taattgaaaa tgtgattgga ttaaatgatg aagttgtacc tttttttaag 3540

acccacggtg gtatcagatc aacatatttt ctttttgaac aaatactggt agttgtattt 3600

tttattgaat ttagacttgt tagttaatgt cccgcattaa tatatatatt ttttaacgga 3660

tgaaaataat aaaatgcttt aaccaaacac atacggaaac aaatgtattt gcacattttc 3720

agacaactaa aatttaagac caaaacctac attaaaatat atatggaatc gaaacaaata 3780

gtctgaaatc aaacatggaa aaacctaata catatctaat tgctgctgtt ttcctgatta 3840

tgactgatct ttcagttttg tacgtttgct gtgaatagga gagatccaga gttctctttt 3900

aacttctttc cgaagttact gtttccacat ttgggtgttt gagttttgag ggcctcttaa 3960

agtcagaatt tcagttcaaa cttttaccaa attgatatca acaaatgctt catatgatgc 4020

tgacattttt taagttactg taggaaggtt aaaataaatt attttcattg ttacttattc 4080

aaaattttaa ttcggactca atttggtcaa atttgaatca attatgtgac aagtataata 4140

tattatattt gttttgtgat tgatgcacag ttcaagaaaa gtgaccaatc aattactctt 4200

gtcaagtgat tggattagtt cgcccaaatt taatttgaaa aagaatttct cctttatctt 4260

agaccccatt gcatatgttt tgcttcgagc attctcataa ttatttcatt gtctttaact 4320

ttttcttttt tttgaaaatt agattttcta tttttatggg attgtttgaa acttggacat 4380

tatctgagta acttatgttt gagattgttt ccacccataa tttaattaat gatcatttta 4440

cttgtacgaa cattaatgta tgatcttaaa aaatatttat ttatttgaat caaatttggt 4500

ccgacgcaat tgattattat atatatgggg taaatattat tgtaatctgt tattttgtcc 4560

atcatctttt taggattgtt cgacaatcaa atgataagta tatatacata attcaattat 4620

aatagtttgg ttggtgtatg tgcatgcatt tctaatattt ccattctaat aaagcgacta 4680

acacaatata tataaagaag ttcttacaat aaacatggat gtaaaaatat aaaatattag 4740

tgtaataatc taagatataa atttaactat cgaagtgcat gatttgatgt ttttagagta 4800

gctttaacat gtttatctat caaagttttg ttgcttgttc taacaagaat tttctattgc 4860

aatctttaat tgttgatttc ctcagcagtc gagagggtag ctggttacaa acgaatgctg 4920

gcgagacttc acatagcctc atcggatcaa cgccgtttcc atcacagtcg acttctggtc 4980

atcttatgag gtaaaagctc aactcaactt atacgatttt tttagggcaa aatgttcttt 5040

tgttctcata aaataagggt acaatttatt ttggtatcac aactatggca agtgatgttt 5100

ttagttccat aaaacacaaa atcacgtctc tttagtcata aaaaatatga ttttggaatt 5160

tttttagtcc aaaaccacaa catacatgac tttttgggac taaagatatg taattatgag 5220

ttttatggga caagaaacga cacctgtcaa agtttatggt actaaaataa attctgccct 5280

tatttttatg ggacttaaaa agtattgtac ccatttttaa gtgtaaatta caacaagctc 5340

tataaggttt gtcataatta taaattaata ctctgttatt gtttcaaaaa ttttaaatac 5400

ctactagaat taacagttgt gtagcaactg cccttcatga tagtctatta tagaaggata 5460

tttgttagac gaccattaat tccaaaagaa tatttgtaat tataataaat ttctaaaaag 5520

cccgttgtaa tttactcctt tttaaaatgt caaagagtaa ttgtgcatga ttacgttgag 5580

gtgcatggtc tatgtgacta gtaaatggag taaattatat ttatgatata tagttcatat 5640

atatacagtt taagaaaagt agtcgataaa tatataaaaa ttacggtaat actatatatg 5700

ctacatactt agcattacat gttgttagaa aacattagga aaaagtatta ttttagtcag 5760

ctaagtatgc ctaattttaa ttttagtccg ataattatgt ccatttttgt ttaggtctag 5820

caacttacga aattgcttac ttttagtccg ctggctgatt ttcggacagt tttatcccta 5880

tgcaactttt gaaagacagt tttagtccat atgcactcat aggggtaaaa ttgtctgaaa 5940

atcagccaga ggactaaaag taagcaattt cgtaagttat tgaacctaaa taaaaatgga 6000

catagttatc ggactaaaat taaaattagg catacttagc ggactaaaat aatacttttt 6060

ccaaaacatt atacacaaga tttgctcaac tgcaaaaatt gagaatttaa aaaattacga 6120

ggatttcttt tttcaattca tgaaaaatga taaattaatt gactaaatta ccaaattaat 6180

tattacggga tcaaaactgc cacatctcca tatattacgg acaaggctga tagtatttga 6240

ttaatggtgg cctcagcttt ttcattttca tgaacaaata acattatact ctaaaattat 6300

ttgtaattta tatattatat atggtgagtt atataattca agatttagta gtactgtctg 6360

attctcgtta gtattatgaa tcaaacttta tcgaatatgt ccattaaagg gaaaataaca 6420

cttgtcgtct cgtaacttac ggtgatttca tttttgatcc tgtaatctct aaaattgaca 6480

cttttggtcc cattatacct tcccgttaaa tattttaata gaattgttag gacctttacc 6540

ttttggtcgg acacttttat acgaccacat gcccgttttt tattaattat ctaacagaag 6600

gtgcagtaag accaaaagtg tcgctttttg aaaattactg gagcaaaagt gagaatttct 6660

taatcaaatg ggaccaaaag tattggaaag gctctaagtt acgaaacggg aattacaatt 6720

ttcctaagta cgatcaaagt tttgtaataa attgattaat gtagtaaatc tgaacaagca 6780

attaacaaat tgcaggaaag cagcctccaa agagctatgt aatgtccagt tctga 6835

<210> 2

<211> 1323

<212> DNA

<213> Sesame indicum L

<400> 2

atgcccttag aagggatttt cttagagccc tcttcaaagc cagttcctga tctttctctc 60

cacattagtc tacccaactg cgattcatcc tcgtcatcaa gaagcagcaa caccaaaaac 120

gacgccgttt ccagcttcga tctcccggtg aacatcagca gcaagcccaa gggctgcact 180

tccttcaccg atctctcgtt agctcacccg gcgaacgacg aaaaagttga gctctcgaac 240

agcttcggaa gaactcatca agaacaagaa cagccacaaa acccttatca tcatcatcac 300

caccgtatct accagcccaa ccaccagtta aatcatcatc aaatcaatca tggggactca 360

ccttttgatt catcggacgg attacggccc ataaagggca tcccggttta tcctaaccct 420

ccattcccat tcttggctct ggaccattcc accagagaga aggatccaaa gatgcggttc 480

tatcaaatgt cttatccctc ttggtcatca ccatcctctt cgtcttcttc ctcttcatcg 540

cctttctttg ggggtggttt ggaccatcat atgccattgc tgaatctggg ccctaacggt 600

tcttccacgg cggcagccta ccactgcggc ggcggcggcg gcggcggagg tggaggaaga 660

tttagtgggc tgtcgtcgta tcagctgcat catcaccaca atcatcatca tcagtacggt 720

atgggggttt ctcatcatga gggttctcat catgggatta tgcggtcaag atttctccca 780

aagatgcctg caaaacgtag tatgagggct ccaagaatga gatggaccag tactctccac 840

gctcgctttg ttcatgcagt agaacttctt ggtggccatg aaagggctac tccgaagtca 900

gtgttggagc tcatggacgt caaagatctc actcttgctc atgtcaagag ccatttacag 960

atgtatcgaa ctgttaaaac tactgacaag cccgcggctt cctcagggca ttcggatgga 1020

tccggtgaag acgatctctc cacaataggc agcgggagtg ccgacaggac cggcttgcgg 1080

cagttcatgg aacaaagagg cccttccgat gtctctccgc gacaagaatc cgatgttaac 1140

aattaccctg cagccacatt gtggagcaac tcctcaagca gtcgagaggg tagctggtta 1200

caaacgaatg ctggcgagac ttcacatagc ctcatcggat caacgccgtt tccatcacag 1260

tcgacttctg gtcatcttat gaggaaagca gcctccaaag agctatgtaa tgtccagttc 1320

tga 1323

<210> 3

<211> 1320

<212> DNA

<213> Sesame indicum L

<400> 3

atgcccttag aagggatttt cttagagccc tcttcaaagc cagttcctga tctttctctc 60

cacattagtc tacccaactg cgattcatcc tcgtcatcaa gaagcagcaa caccaaaaac 120

gacgccgttt ccagcttcga tctcccggtg aacatcagca gcaagcccaa gggctgcact 180

tccttcaccg atctctcgtt agctcacccg gcgaacgacg aaaaagttga gctctcgaac 240

agcttcggaa gaactcatca agaacaagaa cagccacaaa acccttatca tcatcatcac 300

caccgtatct accagcccaa ccaccagtta aatcatcatc aaatcaatca tggggactca 360

ccttttgatt catcggacgg attacggccc ataaagggca tcccggttta tcctaaccct 420

ccattcccat tcttggctct ggaccattcc accagagaga aggatccaaa gatgcggttc 480

tatcaaatgt cttatccctc ttggtcatca ccatcctctt cgtcttcttc ctcttcatcg 540

cctttctttg ggggtggttt ggaccatcat atgccattgc tgaatctggg ccctaacggt 600

tcttccacgg cggcagccta ccactgcggc ggcggcggcg gcggcggagg tggaggaaga 660

tttagtgggc tgtcgtcgta tcagctgcat catcaccaca atcatcatca tcagtacggt 720

atgggggttt ctcatcatga gggttctcat catgggatta tgcggtcaag atttctccca 780

aagatgcctg caaaacgtag tatgagggct ccaagaatga gatggaccag tactctccac 840

gctcgctttg ttcatgcagt agaacttctt ggtggccatg aaagggctac tccgaagtca 900

gtgttggagc tcatggacgt caaagatctc actcttgctc atgtcaagag ccatttacag 960

atgtatcgaa ctgttaaaac tactgacaag cccgcggctt cctcagggca ttcggatgga 1020

tccggtgaag acgatctctc cacaataggc agcgggagtg ccgacaggac cggcttgcgg 1080

cagttcatgg aacaaagagg cccttccgat gtctctccgc gacaagaatc cgatgttaac 1140

aattaccctg cagccacatt gtggagcaac tcctcaagtc gagagggtag ctggttacaa 1200

acgaatgctg gcgagacttc acatagcctc atcggatcaa cgccgtttcc atcacagtcg 1260

acttctggtc atcttatgag gaaagcagcc tccaaagagc tatgtaatgt ccagttctga 1320

<210> 4

<211> 1829

<212> DNA

<213> Sesame indicum L

<400> 4

atgcccttag aagggatttt cttagagccc tcttcaaagc cagttcctga tctttctctc 60

cacattagtc tacccaactg cgattcatcc tcgtcatcaa gaagcagcaa caccaaaaac 120

gacgccgttt ccagcttcga tctcccggtg aacatcagca gcaagcccaa gggctgcact 180

tccttcaccg atctctcgtt agctcacccg gcgaacgacg aaaaagttga gctctcgaac 240

agcttcggaa gaactcatca agaacaagaa cagccacaaa acccttatca tcatcatcac 300

caccgtatct accagcccaa ccaccagtta aatcatcatc aaatcaatca tggggactca 360

ccttttgatt catcggacgg attacggccc ataaagggca tcccggttta tcctaaccct 420

ccattcccat tcttggctct ggaccattcc accagagaga aggatccaaa gatgcggttc 480

tatcaaatgt cttatccctc ttggtcatca ccatcctctt cgtcttcttc ctcttcatcg 540

cctttctttg ggggtggttt ggaccatcat atgccattgc tgaatctggg ccctaacggt 600

tcttccacgg cggcagccta ccactgcggc ggcggcggcg gcggcggagg tggaggaaga 660

tttagtgggc tgtcgtcgta tcagctgcat catcaccaca atcatcatca tcagtacggt 720

atgggggttt ctcatcatga gggttctcat catgggatta tgcggtcaag atttctccca 780

aagatgcctg caaaacgtag tatgagggct ccaagaatga gatggaccag tactctccac 840

gctcgctttg ttcatgcagt agaacttctt ggtggccatg aaagtaattt tacaattcac 900

tatttctcga ttttcttttt cttttgggtt cttgattttg tagttgtttt gcttcttaca 960

tgcttaattt cttcaaaaat gttaaaggtt tttattttgt gggtttttgg ttttttgttt 1020

ttctttttta actgattaat ttcgatattt aattaggggc tactccgaag tcagtgttgg 1080

agctcatgga cgtcaaagat ctcactcttg ctcatgtcaa gagccattta tctttgtaga 1140

cagcctagac tgagaaaaca taggaaaatt gtagtcaaag gaaagaagcc cagaaaattt 1200

atctttgtct gtgtgtgggt taggtaatag gaatgtgtgg actccgttta tttctccggc 1260

acagtagccg atgaatgcag actgaatgaa tggattaaag aaaaggagag aagagaagtc 1320

tagagagaga gagaaagaga gagagagaga gagagagaga gagttgcagt acgttagtag 1380

aatgatatat actataaaga gacaaaagca aagtcatcat ttttcaataa tacagctcat 1440

tactacttta tcaaacatca acctcgtgat taatgatcaa gccccagtcc aggacatcac 1500

tcagaatccc cacgacaact tcttccagta gtactttcca gttaattttt tttgcatccc 1560

cagaatgtaa gaaaccacat tattattacc agttcaactc atattgtgct gatccaagtc 1620

gtaataattc atagtatttg atattttcat attccttttt acaaaacact tctttttatt 1680

tttatatcag caagagtgct agacagagat cttattaacc ttgcaactat taatcttttt 1740

ctttgttcta tataattctt gattttcatc gactctatcg tcttaaattt gagtatgttc 1800

ttccctatgc agatgtatcg aactgttaa 1829

<210> 5

<211> 900

<212> DNA

<213> Sesame indicum L

<400> 5

atgcccttag aagggatttt cttagagccc tcttcaaagc cagttcctga tctttctctc 60

cacattagtc tacccaactg cgattcatcc tcgtcatcaa gaagcagcaa caccaaaaac 120

gacgccgttt ccagcttcga tctcccggtg aacatcagca gcaagcccaa gggctgcact 180

tccttcaccg atctctcgtt agctcacccg gcgaacgacg aaaaagttga gctctcgaac 240

agcttcggaa gaactcatca agaacaagaa cagccacaaa acccttatca tcatcatcac 300

caccgtatct accagcccaa ccaccagtta aatcatcatc aaatcaatca tggggactca 360

ccttttgatt catcggacgg attacggccc ataaagggca tcccggttta tcctaaccct 420

ccattcccat tcttggctct ggaccattcc accagagaga aggatccaaa gatgcggttc 480

tatcaaatgt cttatccctc ttggtcatca ccatcctctt cgtcttcttc ctcttcatcg 540

cctttctttg ggggtggttt ggaccatcat atgccattgc tgaatctggg ccctaacggt 600

tcttccacgg cggcagccta ccactgcggc ggcggcggcg gcggcggagg tggaggaaga 660

tttagtgggc tgtcgtcgta tcagctgcat catcaccaca atcatcatca tcagtacggt 720

atgggggttt ctcatcatga gggttctcat catgggatta tgcggtcaag atttctccca 780

aagatgcctg caaaacgtag tatgagggct ccaagaatga gatggaccag tactctccac 840

gctcgctttg ttcatgcagt agaacttctt ggtggccatg aaaatgtatc gaactgttaa 900

Claims

1.芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1，其特征在于，该基因长度为6835bp，包含6个外显子和5个内含子，位于芝麻第1条染色体上，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1的cDNA，其特征在于，含有两个cDNA序列， SiCL1-1长度为1323 bp，编码440个氨基酸；具体如SEQ ID.2所示；SiCL1-2长度为1320 bp，编码439个氨基酸，具体如SEQ ID.3 所示。

3.权利要求1所述芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1的突变等位基因Sicl1，其特征在于，该基因为隐性控制基因，长度为1829bp，对芝麻卷叶、闭蒴性状的解释率为100%；其DNA序列如SEQID NO.4所示。

4.权利要求4所述芝麻卷叶闭蒴突变等位基因Sicl1的cDNA，其特征在于，序列长度为900bp，编码299个氨基酸，具体如SEQ ID.5所示。

5.针对权利要求1或权利要求3所述芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1/等位基因Sicl1的PCR扩增用引物对，其特征在于，具体设计如下：

SiCL1 F：5'- TCCAACTTTTGCTGTCCGTC -3'，

SiCL1 R：5'- GGAATCCAAAATCCAAGTGAGA-3'。

6.利用权利要求5所述PCR扩增用引物对制备获得芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1/等位基因Sicl1的PCR扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取制备DNA模板

制备获得芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1时，以表型展叶开蒴正常表型的种质资源材料为材料基础来提取制备DNA模板；

制备获得芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1的等位基因Sicl1时，以表型卷叶闭蒴表型种质资源材料为材料基础来提取制备DNA模板；

（2）PCR扩增

PCR扩增产物即为芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1或等位基因Sicl1。

7.针对权利要求1或权利要求3所述芝麻卷叶闭蒴基因SiCL1/等位基因Sicl1的InDel分子标记SiCLInDel1，其特征在于，InDel分子标记SiCLInDel1为一对引物序列，具体为：

正向引物SiCLInDel1 F序列：5'- CTACTCCGAAGTCAGTGTTGGA-3'；

反向引物SiCLInDel1 R序列：5' –GAGTCCACACATTCCTATTACCTA-3'。

8.利用权利要求7所述InDel分子标记对芝麻表型的PCR检测判定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取待鉴定芝麻种质资源的基因组DNA；

如果PCR扩增产物有两条，且长度分别为185bp和199bp，则待鉴定种质资源中同时含有卷叶闭蒴基因SiCL1和Sicl1，为杂合型，其表型为展叶开蒴的正常型。

9.权利要求7所述InDel分子标记在植物育种中应用，其特征在于，根据对于种子资源中是否含有SiCL1、Sicl1基因的鉴定结果，用于不同植物表型新品种的培育。