CN107541551A

CN107541551A - 基于kasp技术开发的用于检测菠菜rpf1基因型的引物及应用

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Publication number: CN107541551A
Application number: CN201710801253.2A
Authority: CN
Inventors: 钱伟; 折红兵; 徐兆生; 张合龙; 刘志远; 王晓武; 武剑
Original assignee: China Vegetable Seed Technology Co ltd Beijing; Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: China Vegetable Seed Technology Co ltd Beijing; Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2017-09-07
Publication date: 2018-01-05
Anticipated expiration: 2037-09-07
Also published as: CN107541551B

Abstract

本发明公开了基于KASP技术开发的用于检测菠菜RPF1基因型的引物及应用，所述引物的序列如SEQ ID NO:1‑3所示。利用本发明提供的三条KASP引物进行菠菜RPF1基因型的检测，分析通量高，准确性高，适用于大量样本的检测。本发明提供的共显性分子标记应用于RPF1基因的转育，对于加快菠菜抗霜霉病品种的选育，提高育种效率具有重要实践意义。

Description

基于KASP技术开发的用于检测菠菜RPF1基因型的引物及应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种技术领域，具体地说，涉及一种基于 KASP技术开发的用于检测菠菜RPF1基因型的引物及应用。

背景技术

菠菜(Spinacia oleracea L.)，别名波斯草、赤根菜，系黎科菠菜属，一年生草本植物，二倍体(2n＝12)，栽培历史悠久，起源中亚，大约在唐代之前或唐代初传入我国。菠菜抗寒性强，适应性广，生育期又短，易快种连收，产量高，供应期长，深受生产者和消费者欢迎。在我国南北各地普遍栽培，是秋、冬、春三季的主要绿叶蔬菜之一，也是我国主要出口蔬菜种类之一(钱伟等，2014)。

霜霉病是菠菜生产过程中最主要的病害之一，近些年，霜霉病在我国山东、河南、河北、江苏、湖北等菠菜主产区大范围发生，不仅严重影响产量，而且在运输过程中叶片腐烂变质，严重影响菠菜品质，尤其是霜霉病的发生给种植者造成了重大的损失。菠菜霜霉病主要危害菠菜叶片，发病初期叶片产生深绿色小点，边缘不明显，而后形成褪绿色病斑，接着扩大成不规则淡黄色病斑，直径3-17mm，后期湿度大时在叶背面形成灰紫色霉层，严重时霉层连成片。夜间有露水时易发病，病斑从植株下部向上不断延伸；低温高湿条件下发病最严重，干旱时叶片枯黄，湿度大时叶片腐烂，最终导致植株变黄枯死(王慧君等，2014)。

迄今为止，共发现16个菠菜霜霉病生理小种。1824年Greville发现了第一个菠菜霜霉病生理小种(Pfs1)，经过100多年以后即1958年才发现了第二个菠菜霜霉病生理小种(Pfs2)，1977年发现了第3个生理小种(Pfs3)，1992年发现了第4个生理小种(Pfs4)，至此之后，随着菠菜育种不断发展，新的生理小种也在迅速增加，仅在过去的20 年时间里就发现了12个霜霉病生理小种。目前，荷兰园艺检测总署、美国阿肯色大学及美国加利福尼亚大学共同合作对菠菜霜霉病进行鉴定研究，建立了一套菠菜霜霉病菌生理小种鉴别寄主。目前常用 Viroflay、Resistoflay、Califlay、Polka、Celrmont、Campania、Dolphin、 Lazio、Lion、Avenger、Piheon、Whale等12个菠菜品种对各生理小种进行致病性测验。Correll等(2009)研究表明，这套菠菜霜霉病菌生理小种鉴别寄主含有不同的抗性位点，采用人工温室接种鉴定的方法，可以对世界各地不同的菠菜霜霉病菌以及新的生理小种进行鉴定分析，对田间样品的混合生理小种也可鉴定分析。Yamauchi等(2011) 从荷兰园艺检测总署引进该套鉴别寄主，利用人工温室接种鉴定方法对日本不同地区的4份霜霉病菌进行鉴定分析，结果表明一份病菌为 Pfs6，三份病菌为Pfs8。美国阿肯色大学植物病理系利用该套鉴别寄主，对来自美国和欧洲的188多份菠菜霜霉病样品进行鉴定分析，发现这些病菌样品中大多数为单个生理小种，极少数样品为混合生理小种。钱伟(2015)等首次对我国菠菜霜霉病生理小种进行鉴定分析，北京地区主要为9号生理小种，山西地区主要为5号生理小种，山东地区主要为8号生理小种。

尽管国外对菠菜生理小种研究取得很大进展，但是在菠菜对霜霉病抗性基因研究比较少。Correll等(2011)认为在菠菜中可能存在6 个抗霜霉病基因位点(Resistanceagainst Peronospora Farinosa，RPF)，即RPF1-RPF6，这些位点分别对不同的生理小种具有抗性。如，RPF1 基因可以对Pfs1-7，9，11，13以及15具有抗性((Irish et al.2003；Irishet al.2008；Feng et al.2014)。Irish等(2008)发现菠菜对霜霉病生理小种Pfs6的抗性由一个显性基因控制，并开发了与抗病基因RPF1连锁的SCAR标记DM-1，其距离抗病基因约1.7cM。此外，Xu等(2017) 成功进行了菠菜参考基因组的组装，并将标记DM-1锚定到3号染色体上，继而在其上下游筛选到5个NBS-LRR类的抗病基因作为RPF1的候选基因。

霜霉病抗性在其它植株中有广泛的研究，至今在拟南芥中已经鉴定了28个不同的霜霉病抗性位点(recognition of Peronospora parasitica； RPP)，其中部分抗病基因已经被克隆，如RPP1,RPP4,RPP5,RPP8, RPP13和RPP27(Slusarenko et al.2003；Wang etal.2006；Nemri A et al. 2010)。此外，抗霜霉病基因DM3,PI8和MrRPV1分别在莴苣，向日葵和葡萄中被克隆(Meyers et al.1998；Radwan et al.2005；Feechan et al. 2013)。迄今为止，所有这些被克隆的基因均属于R基因，除了RPP27 为RLP结构，其余均具有NBS-LRR结构。植物抗病基因(Plant disease resistance gene，简称R基因)，是非常重要的一类抗病基因，对细菌、病毒、真菌、卵菌甚至线虫和昆虫病原体都有抗性，目前国内外已经克隆了70多个植物R基因。R基因编码5种类型的蛋白质，大多数R基因编码的蛋白质含有核苷酸结合位点(nucletide-binding site，NBS) 和富含亮氨酸重复(leucine rich repeat，LRR)域。按N-端的结构特点可以把NBS-LRR这类蛋白细分为两类：一类是果蝇Toll蛋白和哺乳动物白细胞介素1受体同源域(TIR-NBS-LRR或TNL蛋白)；另一类是 N端卷曲螺旋域(CC-NBS-LRR或CNL蛋白)；第二类R基因编码色氨酸/丝氨酸激酶，如抗番茄细菌性叶斑病基因Pto；第三类R基因编码受体激酶(receptor-like-kinases，RLKs)，如抗水稻白叶枯病基因Xa21；第四类R基因编码受体蛋白(receptor-like-proteins，RLPs)，如抗拟南芥霜霉病基因RPP27；最后一类R基因只编码卷曲螺旋(coiled-coil， CC)，如拟南芥中的PRW8基因(Dangl etal.2001；Meyers et al.2005)。

可见，菠菜抗霜霉病分子研究薄弱，目前菠菜中还没有抗霜霉病基因定位克隆的报道，且与RPF1基因连锁的标记仅有DM-1，且距离较远，影响了菠菜抗霜霉病品种选育进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于KASP技术开发的用于检测菠菜 RPF1基因型的引物及应用。

本发明的另一目的是提供与菠菜抗霜霉病基因RPF1紧密连锁的 SNP标记KM256436。

为了实现本发明目的，本发明基于KASP技术开发的用于检测菠菜RPF1基因型的引物，所述引物用于检测与菠菜抗霜霉病基因RPF1 紧密连锁的SNP标记KM256436，该标记位于菠菜3号染色体上，物理位置697720bp，SNP位点处碱基为G或T，碱基为G的菠菜植株为霜霉病抗病型，碱基为T的菠菜植株为霜霉病感病型。

所述引物包含3条序列，其中两条为正向引物，一条为通用的反向引物，具体信息如下(SEQ ID NO:1-3)：

正向引物F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCATTGACT GGATCAAAACTATTCACA-3’；其中GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为通用标签A；

正向引物F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATTGACT GGATCAAAACTATTCACC-3’；其中GAAGGTCGGAGTCAACGGATT为通用标签B；

反向引物R：5’-GGTACTTTGTTTTTATAGATTTGTTTTTTCCTT TTA-3’。

KM256436标记的SNP位点信息见表1：

表1 KM256436标记的SNP位点信息

标记	染色体	SNP物理位置	等位基因
				KM256436	Chr3	697720	[G/T]

表1中的SNP位置是根据Xu等(2017)发表的菠菜全基因组序列(http://www.spinachbase.org/cgi-bin/spinach/index.cgi)而确定的。

本发明还提供含有所述引物的用于鉴定菠菜RPF1基因型的检测试剂或试剂盒。

本发明还提供所述引物或所述检测试剂或试剂盒在菠菜RPF1基因分型中的应用。

本发明还提供所述引物或所述检测试剂或试剂盒在鉴定与菠菜抗霜霉病基因RPF1紧密连锁的SNP标记KM256436中的应用。

本发明还提供所述引物或所述检测试剂或试剂盒在鉴定或选育抗霜霉病菠菜品种中的应用。

本发明进一步提供标记KM256436在分子标记辅助菠菜抗霜霉病选择育种中的应用。

本发明提供的KASP基因分型通量大且操作简单，只需将特异的 KASP Primer mix和通用的KASP Master mix加入到含有DNA样本的 PCR微孔反应板中，进行PCR扩增。最终结果采用荧光检测仪进行分析即可。

所述KASP Primer mix含有3条特异引物：分别带有通用标签A和 B的正向引物F1和F2，以及一条反向引物R。

所述KASP Master mix包含通用的FRET cassette荧光引物，ROX 内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和Mgcl2等组分，已预置于优化的缓冲液中。其中荧光报告基团A为FAM，荧光报告基团B为 HEX，所述KASP Master mix是英国LGC公司产品。产品目录号为KBS-1016-002。

前述应用包括以下步骤：

(1)提取待测菠菜样品的DNA；

(2)将步骤(1)中的DNA稀释到18-25ng/μl，向其中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix，进行PCR扩增；其中， KASP Primer mix中正向引物F1和F2的终浓度均为12μM，反向引物R 的终浓度为30μM；通用的KASP Master mix包含如下组分：通用的TRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP 和MgCl₂；

(3)PCR产物荧光检测分析。

PCR反应体系如下：

组分	96孔板(μl)	384孔板(μl)
			模板DNA	5	2.5
KASP Master mix	5	2.5
			KASP Primer mix	0.14	0.07
总体积	10.14	5.07

PCR反应条件如下：

步骤(3)待荧光检测分型后，若分型结果不理想，再进行如下 PCR反应(第四步PCR反应条件)：

第二次PCR反应结束后，再次进行荧光检测分析。

在本发明的一个具体实施方式中，检测菠菜RPF1基因型的操作步骤如下：

(1)提取待测菠菜样品的全基因组DNA，将其浓度稀释到 20ng/μl。

(2)向步骤(1)提取的DNA模板中加入特异的KASP Primer mix 和通用的KSAPMaster mix，进行PCR扩增。

(3)在小于40℃条件下，采用荧光检测仪分析PCR产物。

(4)若分型结果不理想，分析后可再进行第四步PCR扩增，PCR 反应结束后再次进行荧光检测分析。

(5)荧光检测结果若为GG，则为纯合抗病型，若为TT，则为感病型，若为GT，则为杂合抗病型。

本发明基于KASP技术，根据关键突变位点[G/T]设计引物，用于鉴定菠菜中RPF1基因型。利用本发明提供的三条KASP引物进行菠菜中RPF1基因型的检测，分析通量高，准确性高，适用于大量样本的检测。本发明提供的共显性分子标记应用于RPF1基因的转育，对于加快抗霜霉病品种的选育，提高育种效率具有重要实践意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中基因RPF1进行精细定位的结果；其中，A 为SLAF-seq数据分析及关联分析结果，B为基因RPF1的精细定位。

图2为本发明实施例2中标记KM256436扩增BC₁群体以及两个亲本的结果。

图3为本发明实施例3中标记KM256436扩增抗病自交系和感病自交系的结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1精细定位RPF1基因且确定与RPF1基因紧密连锁的标记

1、菠菜遗传群体的构建

利用菠菜抗病自交系12S3作为母本和轮回亲本，感病自交系12S4 作为父本，杂交得到148株BC₁群体和200株F₂群体。F₂群体长至两片子叶期进行霜霉病菌接种试验，经调查，153株为抗病株，47株为感病株，经卡方检测符合3:1，菠菜霜霉病受一个显性基因RPF1控制。

2、基因组DNA的提取以及SLAF文库的构建

采用CTAB法提取亲本和BC₁群体的基因组DNA。

SLAF文库的构建流程如下：

(1)参考基因组的确定

选用菠菜基因组，实际基因组大小为989Mb，组装出的基因组大小为493.771Mb，GC含量为38.00％，下载地址：

ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA_000510995.2_Spinach- 1.0.3

(2)酶切方案的确定

利用软件对参考基因组进行酶切预测，选择最适酶切方案，最终选用的酶为RsaI+HaeIII酶。

(3)建库测序

经酶切后，对得到的酶切片段进行3’端加A处理，连接Dual-index 测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiseq^TM 2500进行测序。

3、SLAF-seq数据分析、构建混池及关联分析

测序数据的处理采用Sun等(2013)开发的流程。

利用DM-1标记对BC₁群体进行RPF1基因型的鉴定，最终选取50 株纯合抗病单株(RR)和50株杂合抗病单株(Rr)的测序数据分别作为RR池和Rr池的测序结果。

利用欧氏距离(Euclidean distance,ED)算法进行关联分析，ED 的的公式如下：

其中A_aa，G_aa，C_aa，T_aa分别代表RR池中碱基A，G，C，T的深度，A_ab，G_ab，C_ab，T_ab分别代表Rr池中碱基A，G，C，T的深度。因此，ED值越大，表明离目标区域越近。本实验中共筛选到21个SLAF标记与RPF1相关联，将这些标记以及前人开发的标记DM-1 比对到菠菜基因组上(http://www.spinachbase.org/cgi-bin/spinach/ tool/download.cgi)，其位于菠菜3号染色体0.05-1.7Mb区域内(图 1A)。

4、RPF1的精细定位

利用上述22个标记从F₂群体中筛选重组交换单株，以期缩小候选区域。最终筛选到12个重组交换单株，将RPF1定位于KM256645和KM1179193之间(图1B)。

5、确定候选基因

在候选区域内，共发现14个R基因。为进一步减少基因数量，选择3份感病自交系(12S1，12S4和10S2)和2份抗病自交系(12S2和 12S3)进行重测序。根据重测序数据，将上述14个基因在抗、感材料中进行比对分析，结果共筛选出3个重要的候选基因，分别命名为SPo1，Spo2和Spo3。

6、连锁标记的开发

在抗性亲本中，Spo2与KM256436标记之间的物理距离约为 7.7Kb。因此，选择该标记进行分子标记辅助选择育种。

7、KM256436标记引物的合成

依据SNP突变信息特点，设计成套的竞争性等位基因特异性PCR 引物，包括正向引物1、正向引物2和反向引物。两条正向引物末端为等位变异碱基G/T，反向引物的序列选择要保证扩增片段在60-120bp。正向引物的5’端连接有荧光标签序列，其中正向引物1的5’端连接为 FAM荧光标签序列5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'，正向引物2 的5'端连接为HEX荧光标签序列 5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。

引物序列如下：

上述引物序列均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成获得。

实施例2 KASP分子标记检测上述BC₁群体以及两个亲本

检测方法如下：

1、提取植物基因组DNA

取待测菠菜叶片，采用CTAB法提取全基因组DNA。本实验中BC₁群体中随机选取43株进行检测。

2、稀释DNA

本实验采用的DNA浓度为20ng/μl。

3、KASP Primer mix的制备

各取正向引物12μl(100μM)，反向引物30μl(100μM)，用无菌超纯水补充至100μl。

4、PCR扩增反应体系如下：

实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

5、PCR反应条件如下：

6、PCR扩增产物的荧光扫描

利用Applied Biosystems公司生产的7900HT Fast Real-Time PCR System机器对PCR扩增产物进行扫描，两种荧光(FAM荧光和HEX荧光)的激发波长和发射波长不同，利用软件SDS2.3进行分型。

7、等位基因的分型

采用SDS2.3软件对扫描数据进行分析，按照如下确定待测菠菜样品中RPF1的基因型，聚合在X轴的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，即为GG；聚合在Y轴的样本的基因型为连接HEX 荧光标签序列的等位基因型，即为TT；聚合在中间的样本的基因型为两种等位基因，即为GT；落在圆圈外侧的样本可能DNA质量不好，扩增产物没有被明确分型，左下角显示的黑色样本为NTC(图2)，该标记能准确区分纯合抗病单株，杂合抗病单株以及感病单株。

8、若第一次分型不理想，则分析后可再进行如下热循环：

热循环结束后可再进行步骤6与步骤7。

实施例3 KASP分子标记检测抗病自交系和感病自交系

检测方法如下：

在大田里选取35份抗霜霉病自交系，58份感霜霉病自交系。按照实施例2中的方法提取DNA，使用KM256436标记进行基因分型检测。 PCR反应体系和程序均同实施例2中所描述。

结果分析：通过以上检测，获得了抗、感病自交系在KM256436 标记中的分型结果(图3)，结果表明：KM256436标记可准确区分抗、感单株，且速度快，效率高。

综上所述，本发明设计的KASP标记引物可应用于RPF1基因型筛选，且该标记准确可靠，提高了效率，大大加快了育种进程。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

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序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所中蔬种业科技（北京）有限公司

<120> 基于KASP技术开发的用于检测菠菜RPF1基因型的引物及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcattgactg gatcaaaact attcaca 27

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cattgactgg atcaaaacta ttcacc 26

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtactttgt ttttatagat ttgttttttc ctttta 36

Claims

1.基于KASP技术开发的用于检测菠菜RPF1基因型的引物，其特征在于，所述引物用于检测与菠菜抗霜霉病基因RPF1紧密连锁的SNP标记KM256436，该标记位于菠菜3号染色体上，物理位置697720bp，SNP位点处碱基为G或T，碱基为G的菠菜植株为霜霉病抗病型，碱基为T的菠菜植株为霜霉病感病型；

所述引物包括：

正向引物F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCATTGACTGGATCAAAACTATTCACA-3’；

正向引物F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATTGACTGGATCAAAACTATTCACC-3’；

反向引物R：5’-GGTACTTTGTTTTTATAGATTTGTTTTTTCCTTTTA-3’。

2.含有权利要求1所述引物的用于鉴定菠菜RPF1基因型的检测试剂或试剂盒。

3.权利要求1所述引物或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在菠菜RPF1基因分型中的应用。

4.权利要求1所述引物或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在鉴定与菠菜抗霜霉病基因RPF1紧密连锁的SNP标记KM256436中的应用。

5.权利要求1所述引物或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在鉴定或选育抗霜霉病菠菜品种中的应用。

6.根据权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测菠菜样品的DNA；

(2)将步骤(1)中的DNA稀释到18-25ng/μl，向其中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix，进行PCR扩增；其中，KASP Primer mix中正向引物F1和F2的终浓度均为12μM，反向引物R的终浓度为30μM；通用的KASP Master mix包含如下组分：通用的TRETcassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl₂；

(3)PCR产物荧光检测分析。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)的PCR反应体系如下：

组分 96孔板 384孔板模板DNA 5μl 2.5μl KASP Master mix 5μl 2.5μl KASP Primer mix 0.14μl 0.07μl 总体积 10.14μl 5.07μl。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中PCR反应条件如下：

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(3)待荧光检测分型后，若分型结果不理想，再进行如下PCR反应：

第二次PCR反应结束后，再次进行荧光检测分析。