CN111690755A - 提高尼罗罗非鱼选育效率的标记、方法、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提高尼罗罗非鱼选育效率的标记、方法、试剂盒及应用，所述标记的SNP标记引物为：上游引物SEQ ID NO:2，5’‑ACTGTCTGACCTCACAAATGTGCTT‑3’；下游引物SEQ ID NO:3，5’‑GAGGAGAAGGCGAGACTCTACGAAC‑3’。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述方法提供的SNP标记引物不受尼罗罗非鱼年龄、性别及养殖状态限制，可以用于尼罗罗非鱼早期种质鉴定，显著提升罗非鱼的保种、选育工作效率；(2)本发明所述方法选取尼罗罗非鱼Ghrelin基因启动子调控区域的SNP位点作为检测位点，对建立一种提高尼罗罗非鱼摄食行为频率和平均生长速率的辅助育种方法提供了科学依据。

Description

提高尼罗罗非鱼选育效率的标记、方法、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于分子育种技术领域，涉及一种分子标记辅助育种的方法，具体为提高尼罗罗非鱼选育效率的标记、方法、试剂盒及应用。

背景技术

优良的尼罗罗非鱼苗种是罗非鱼养殖成功的首要环节，也是保证成鱼品质的关键，因此罗非鱼苗种繁育以及优良性状的罗非鱼亲本选择环节至关重要。目前我国尼罗罗非鱼主要采用群体选育和家系选育两种方法，在恒产这要求尼罗罗非鱼亲本群体具有较高的遗传种质纯度和清晰的遗传背景。然而传统的生产实践中由于往往只能通过种间外形类似且种间无生殖隔离来选育亲本群体，因而常常引起品种混杂，种质纯度降低，从而导致生产的苗种经济性状退化，进而影响尼罗罗非鱼养殖效益，制约产业健康发展。

随着分子生物学技术的发展，通过分子标记提升尼罗罗非鱼纯度和进行定向辅助育种已成为一种可能，目前通过微卫星和AFLP技术来建立品种遗传鉴定和生长速率关联性标记，但由于以上两种分子技术主要集中在非编码区，对不同个体间的遗传差异的生物学解释仍不够明确。因此，从功能基因相关编码区和调控区域开发鉴别不同品种间的差异的应用技术成为未来的水产育种的一种趋势。单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphisms，SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是一种可遗传的变异。在遗传学研究中，SNPs作为一类分子标记拥有其独特的优势。其数量多且分布广，在生物体整个基因组中均有SNPs的分布，此外，SNPs的突变与生物的遗传直接相关，启动子区或编码区的多态性可能会直接引起生物体的疾病或性状的改变。由于SNPs在遗传学分析中的各项优势，使其在水生动物遗传学研究及分子标记筛选上呈现出规模较大的探索及发展。李胜杰等在大口黑鲈(Micropterus salmoides)的3个载脂蛋白(Apoprotein，Apo)基因外显子区上筛选到了4个SNPs位点，并发现位于ApoA4基因上的A633T和ApoC1基因上的2个位点A24G和A75C在用于实验分析的全部159尾大口黑鲈群体中表现为完全连锁，通过进一步相关性分析发现Apo基因的多态性与大口黑鲈的重要生长性状(体重、体长等)显著相关。李浩等采用直接测序法对缢蛏(SinonovacμLa constricta)α-淀粉酶(Alpha amylase)编码区的SNPs位点进行筛选，共获得13个有效位点并组成的7个双倍型，并发现S6双倍型个体的各项生长性状在全部双倍型中均为最高。

在罗非鱼选育方面，中国专利CN201710454403.7公开了一个与吉富罗非鱼生长速度相关的SNP标记及其应用，所述方法有助于快速、准确提升吉富罗非鱼群体生长速率，在吉富罗非鱼保种和选育中有一定的应用价值。但在研究中未讲明SNP标记突变导致生长速率变异的生物学原因，且仅仅集中在某个家系的吉富罗非鱼200尾个体，该研究结果在其他选育的尼罗罗非鱼中的适用性和推广应用稳定性有待进一步确认；同时该方法表明杂合基因型生长高于纯合基因型，显示出一定的杂种优势，这就导致罗非鱼选育的操作规程较为繁琐和困难。由于生长是由多个基因决定的，因此以单基因SNP标记进行辅助选育难以获得较好的效果。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有选育技术的不足，获得一种能够有效提高罗非鱼摄食行为频率和生长速率的分子标记技术，进而开展尼罗罗非鱼定向育种，实现短时间、低成本、高准确率的保种、选育工作，本发明提供了提高尼罗罗非鱼选育效率的标记、方法、试剂盒及应用。

技术方案：提高尼罗罗非鱼选育效率的标记，所述标记的SNP标记引物为：

上游引物SEQ ID NO:2，5’-ACTGTCTGACCTCACAAATGTGCTT-3’；

下游引物SEQ ID NO:3，5’-GAGGAGAAGGCGAGACTCTACGAAC-3’。

提高尼罗罗非鱼选育效率的方法，包括以下步骤：

(1)给家系或群体待选育的尼罗罗非鱼亲本群体注射RFID电子标签，做到每一条鱼能够追溯；

(2)采集待鉴定的尼罗罗非鱼个体部分尾鳍，提取基因组DNA；

(3)采用SNP标记引物扩增步骤(2)提取的基因组DNA；

(4)将步骤(3)所得PCR扩增片段采用直行Sanger测序，获得扩增片段基因序列，使用Contig Express软件对测序结果进行拼接，使用Bio Edit软件进行批量序列对比，通过筛选获得一个尼罗罗非鱼群体摄食基因表达和抢食行为差异有显著影响的SNP标记；

(5)采用步骤(3)-(4)筛选获得的SNP标记引物对家系或群体待选育的尼罗罗非鱼亲本群体的基因组DNA进行扩增，并对扩增产物第91位碱基进行基因型分析，选取TT基因型突变的个体作为亲本群体。

优选的，步骤(1)中注射的RFID电子标签为采用生物玻璃封装的圆柱形动物晶片，规格为长15-25mm、直径为1-3mm。RFID(Radio Frequency Identification，射频识别电子标签)。其原理为阅读器与标签之间进行非接触式的数据通信，达到识别目标的目的。

优选的，步骤(4)拼接后片段为SEQ ID NO:1，该片段的第91位碱基(在以下序列中采用Y表示)为CC、CT或TT基因型。其中TT基因型的突变相比CC基因型会导致ghrelin基因启动子区域增加1个具有促进基因转录功能的八聚体转录因子1(Octamertranscriptionfactor 1，Oct-1)的结合位点，提高了Oct-1的结合效率，使ghrelin启动子活性大大增强并增加了ghrelin的表达，从而刺激了鱼类进食的频率并提升选育群体中TT单倍型个体的生长速率，而CT基因型介于两者之间。具体序列为：

ACTGTCTGACCTCACAAATGTGCTTCTGAAAGAATGGTCAAAAATTCCCATAAACTCACTCCTAAACCTGTGGAAAGCTAAAAGAAATGAYGCTAAGCATGGGCCAGTATTATCTTAAACCCTATGGATTAAGAAAGGAATGTCACTCAAGACAGACCAGTGAATATTTTTGGCAATATAATGTATTAGCAAATACTGGAAAACATATAAGCCTAATATTGATATATTTATATGGTGCCAGCAGAAGTTGAATATTGATGAATGCAATCAATGTGAAGTTACCATTCTTCATCCGGATTCTCAGGAGGAGGGACGGGTGACGAGCTGAGTCGTTCCTCATCCTCTTTCTCCTTCTGGGCAAGTGTTTCTCTCTTTTTGTCAATAATCTTCTGGGTGAAGTCAACAAGGAACAGCCCTTCTGTCTCTTCATCTGATGAGTTACACAACAAGGTAAATACAAAGTAAGCACACTTTGACGCTGTTGTAGCAGACATAAGGCACAAACCGTTCACCAACCTGGAAAGTCTCCTTTAGTCATCTGTTCGTAGAGTCTCGCCTTCTCCTC。

含有权利要求1所述标记的试剂盒。

以上所述标记在尼罗罗非鱼早期种质鉴定、保种、选育中的应用。

以上所述标记在建立提高尼罗罗非鱼摄食行为频率和平均生长速率的辅助育种模型中的应用。

以上所述试剂盒在尼罗罗非鱼早期种质鉴定、保种、选育中的应用。

以上所述试剂盒在建立提高尼罗罗非鱼摄食行为频率和平均生长速率的辅助育种模型中的应用。

本发明所述方法的设计思路在于：在以往尼罗罗非鱼选育实践中发现，选育群体中有一部分个体存在无饱食感，抢食较其他个体凶猛的情况，因此在生产中往往摄入比其他个体更多的饵料，平均生长速率也在群体中居于优势地位。针对于此，本发明从摄食促进因子研究入手，分别分析了胃饥饿素(ghrelin)、食欲肽(0rexin)、甘丙肽(galanin)及神经肽Y(Neuropeptide Y)等摄食相关基因序列，从中找到了一个可以显著促进尼罗罗非鱼摄食的SNP基因型，在此基础上结合传统选育技术建立了一项可以明确提高罗非鱼选育效率的分子辅助标记方法，操作简便、稳定性高，具有比较范围广的适用性范围。

本发明所述方法的原理在于：罗非鱼ghrelin启动子区域包含多种重要的启动子元件，同时也包括一些如激活蛋白2(Activator protein-2，AP2)、肌源性分化(Myogenicdifferentiation，MyoD)、八聚体转录因子1(Octamer transcription factor 1，Oct-1)和锌指蛋白217(Zinc finger protein 217，ZNF 217)等转录因子的结合位点。通过研究我们发现，在基因转录起始位点前226bp处存在C和T两种基因型(C-226T)中T基因型突变会导致ghrelin基因启动子区域增加1个具有促进基因转录功能的Oct-1转录因子结合位点。研究发现C-226T位点TT基因型个体的ghrelin基因相对表达量是CC基因型1.6-1.8倍，CT基因型个体相对表达量是CC基因型个体的1.2-1.3倍。基于上述结果，我们得出当ghrelin基因C-226T位点表现为TT基因型时，相比CC基因型启动子区增加了Oct-1的转录因子结合位点，提高了Oct-1的结合效率，使ghrelin启动子活性大大增强并增加了ghrelin基因的表达，从而刺激了鱼类进食的频率并导致体重等各生长性状的显著升高。因此，ghrelin基因中C-226T的TT基因型具有极大的分子标记发展潜力，通过对该序列进行分析，可用于定向筛选TT基因型个体或淘汰CC基因型个体，对尼罗罗非鱼的选育工作做出明确指导。

有益效果：(1)本发明所述方法提供的SNP标记引物不受尼罗罗非鱼年龄、性别及养殖状态限制，可以用于尼罗罗非鱼早期种质鉴定，显著提升罗非鱼的保种、选育工作效率；(2)本发明所述方法选取尼罗罗非鱼Ghrelin基因启动子调控区域的SNP位点作为检测位点，对建立一种提高尼罗罗非鱼摄食行为频率和平均生长速率的辅助育种方法提供了科学依据。

附图说明

图1是ghrelin基因启动子调控区的序列结构和关键结合位点；

图2是C-226T位点不同基因型个体ghrelin mRNA的相对表达；

图3是C-226T位点不同基因型与生长性状的关联分析；其中，A为体重对比，B为体长对比，C为体高对比，D为体厚对比。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1.1尼罗罗非鱼群体的标记和养殖跟踪

所采用群体为国家尼罗罗非鱼遗传育种中心(中国水产科学研究院淡水渔业研究中心位于江苏无锡的国家罗非鱼遗传保种基地)，2017年随机采集保存于遗传育种中心的来自埃及、美国和肯尼亚等多个地区的尼罗罗非鱼品(家)系，每个品(家)系100尾(初始体重在15±1g)，在每条个体中注射RFID电子标签，放于同一池塘喂养，做到每一条鱼可以追溯。

1.2尼罗罗非鱼尾鳍的全基因组DNA提取

采集每条尼罗罗非鱼0.3-0.5g鳍条剪碎置于1.5mL离心管中，加入500μL DNA抽提液(0.001mol/L Tris-Cl、0.1mol/L EDTA、5％的十二烷基肌氨酸钠，pH8.0)，加入25μL蛋白酶K溶液，震荡混匀30s，在56℃放置90min，每隔15min取出样品，震荡10s后放回56℃；加入自配蛋白分离溶液(酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1)600μL，轻轻来回颠倒离心管10min，13000×g离心10min。重复一次，直至水相与有机相之间没有白色沉淀；取出上清液，加入2倍体积已预冷的无水乙醇沉淀DNA；颠倒混匀，4℃静置30min，13000×g离心10min，沉淀再用70％乙醇洗涤，离心晾干沉淀后加50μL无菌水溶解。4℃保存备用或-20℃长期保存；

1.3尼罗罗非鱼个体不同ghrelin基因启动子调控区分型鉴定

对DNA模板进行PCR扩增，PCR扩增体系以50μL：80-120ng/μL的模板DNA2μL，10μmol/μL的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的上下游引物各1μL，2.5μmol/μL的dNTP Mixture4μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR反应缓冲液5μL，余量为灭菌水；该PCR扩增的反应条件为：95℃分钟；94℃30秒，56℃30秒。72℃45秒，35个循环；72℃10分钟。由此能够高效、准确地扩增本发明的SNP标记所在片段并获得目标扩增产物，便于后续步骤的进行；所得PCR扩增片段采用直行Sanger测序，获得扩增片段基因序列，使用ContigExpress软件对测序结果进行拼接，使用Bioedit进行批量序列对比，找到了一个在两种罗非鱼中产生群体差异的位点。该位点位于SEQ ID NO:1所示序列的91bp位点处，在SEQ IDNO:1序列中用Y表示该处为点，此位点存在CC\CT\TT三种基因型。

1.4不同基因型个体ghrelin基因表达量差异分析

养殖60d后，禁食12h，根据基因型鉴定结果随机采集三种基因型尼罗罗非鱼各12尾鱼，将鱼迅速投入质量浓度为50mg/L的MS-222中麻醉，解剖鱼体并采集胃组织0.1～0.2g，采用Trizol试剂(Invitrogen)提取尼罗罗非鱼幼鱼胃组织总RNA，通过1％的琼脂糖凝胶电泳与紫外分光光度计NanoDrop-Lite(Thermo Scientific)分别测定纯度和浓度。取1μg RNA使用PrimeScriptTM逆转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA，保存于-20℃冰箱。以肌动蛋白β-actin为参照基因，设计选取ghrelin基因引物，使用生物软件Primer premier 5.0软件设计特异性引物，引物序列信息见表1，将引物序列委托生工生物(上海)有限公司进行合成。

表1 ghrelin及管家基因β-actin实时荧光定量引物序列

以罗非鱼胃组织cDNA为模板，在ABI 7900HT PCR仪上进行荧光定量PCR。反应体系为20μL：

Realtime PCR Master Mix(Toyobo)10μL，目标基因上下游引物各1.6μL，cDNA模板1μL，RNase Free Water 5.8μL，单样品重复3次。反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，59～61℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。实验结束后进行熔解曲线分析，验证每个反应的特异性。荧光定量PCR的相对表达数据分析采用2^-ΔΔct法(ΔΔCt＝ΔCt_目的基因–ΔCt_参照基因)进行分析。在基因型与mRNA相对表达量间的关联性分析中，因变量为mRNA相对表达水平，自变量为C-226T位点的各基因型，并对3个基因型进行LSD分析。C-226T位点不同基因型与基因相对表达的关联分析结果见图2。结果表明，禁食12h后，C-226T位点TT基因型个体的ghrelin基因相对表达量是CC基因型1.65倍(P<0.05)；CT基因型个体相对表达量是CC基因型个体的1.28倍(P<0.05)。

1.5生长速率对比分析

利用SPSS软件的一般线性模型(GLM)中的多元方差分析法进行不同基因型与生长性状关联性分析。在基因型与生长性状的关联性分析中，因变量为各生长性状测量值，自变量为C-226T位点的各基因型；在基因型与mRNA相对表达量间的关联性分析中，因变量为mRNA相对表达水平，自变量为C-226T位点的各基因型，并对3个基因型进行LSD分析。C-226T位点不同基因型与生长性状的相关分析结果见图3。结果表明，C-226T位点3种基因型CC、CT和TT在体重、体长、体高、体厚等生长性状上均表现出TT>CT>CC的趋势，且3种基因型个体间在全部性状上均存在两两显着差异(P<0.05)。

实施例2

采用传统群体选育法，以生长速度、尾鳍的清晰整齐度为主选性状，对国家尼罗罗非鱼遗传育种中心保种的埃及品系尼罗罗非鱼进行了3个世代选育，传统手法选育过程中分别于每年6月捞取苗种3000尾，放入1亩大池混养，每年11月拉网测量，保留生长较快、尾鳍清晰的鱼种300尾(雄：雌＝1:2)，以作下一代的罗非鱼选育亲本群体；同时以同样的选育手法在另一个大池放养同一期的苗种3000尾，采用同样的养殖方式和保种方式，并在此基础上通过RFID标记跟踪和ghrelin基因启动子调控区分型并淘汰基因型为CC的个体，从2017年6月～2019年10月，共选育两个世代，同期两种选育模式下以500尾苗种的生长速率进行养殖对比，后者较前者提高9.2％，显著提升了罗非鱼养殖效率。

序列表

<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120> 提高尼罗罗非鱼选育效率的标记、方法、试剂盒及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 565

<212> DNA

<213> 罗非鱼(nile tilapia)

<400> 1

actgtctgac ctcacaaatg tgcttctgaa agaatggtca aaaattccca taaactcact 60

cctaaacctg tggaaagcta aaagaaatga ygctaagcat gggccagtat tatcttaaac 120

cctatggatt aagaaaggaa tgtcactcaa gacagaccag tgaatatttt tggcaatata 180

atgtattagc aaatactgga aaacatataa gcctaatatt gatatattta tatggtgcca 240

gcagaagttg aatattgatg aatgcaatca atgtgaagtt accattcttc atccggattc 300

tcaggaggag ggacgggtga cgagctgagt cgttcctcat cctctttctc cttctgggca 360

agtgtttctc tctttttgtc aataatcttc tgggtgaagt caacaaggaa cagcccttct 420

gtctcttcat ctgatgagtt acacaacaag gtaaatacaa agtaagcaca ctttgacgct 480

gttgtagcag acataaggca caaaccgttc accaacctgg aaagtctcct ttagtcatct 540

gttcgtagag tctcgccttc tcctc 565

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acctgcctgt tggcttttct c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cattggcttg atttggctcc t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttgccatcc aggctgtgct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctcggctgt ggtggtgaag 20

Claims (9)

1.提高尼罗罗非鱼选育效率的标记，其特征在于，所述标记的SNP标记引物为：

上游引物SEQ ID NO:2，5’-ACTGTCTGACCTCACAAATGTGCTT-3’；

下游引物SEQ ID NO:3，5’-GAGGAGAAGGCGAGACTCTACGAAC-3’。

2.提高尼罗罗非鱼选育效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)给家系或群体待选育的尼罗罗非鱼亲本群体注射RFID电子标签，做到每一条鱼能够追溯；

(2)采集待鉴定的尼罗罗非鱼个体部分尾鳍，提取基因组DNA；

(3)采用SNP标记引物扩增步骤(2)提取的基因组DNA；

(4)将步骤(3)所得PCR扩增片段采用直行Sanger测序，获得扩增片段基因序列，使用Contig Express软件对测序结果进行拼接，使用Bio Edit软件进行批量序列对比，通过筛选获得一个尼罗罗非鱼群体摄食基因表达和抢食行为差异有显著影响的SNP标记；

(5)采用步骤(3)-(4)筛选获得的SNP标记引物对家系或群体待选育的尼罗罗非鱼亲本群体的基因组DNA进行扩增，并对扩增产物第91位碱基进行基因型分析，选取TT基因型突变的个体作为亲本群体。

3.根据权利要求2所述的提高尼罗罗非鱼选育效率的方法，其特征在于，步骤(1)中注射的RFID电子标签为采用生物玻璃封装的圆柱形动物晶片，规格为长15-25mm、直径为1-3mm。

4.根据权利要求2所述的提高尼罗罗非鱼选育效率的方法，其特征在于，步骤(4)拼接后片段为SEQ ID NO:1，该片段的第91位碱基为CC、CT或TT基因型。

5.含有权利要求1所述标记的试剂盒。

6.权利要求1所述标记在尼罗罗非鱼早期种质鉴定、保种、选育中的应用。

7.权利要求1所述标记在建立提高尼罗罗非鱼摄食行为频率和平均生长速率的辅助育种模型中的应用。

8.权利要求5所述试剂盒在尼罗罗非鱼早期种质鉴定、保种、选育中的应用。

9.权利要求5所述试剂盒在建立提高尼罗罗非鱼摄食行为频率和平均生长速率的辅助育种模型中的应用。

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