CN112831575B - 一种莫桑比克罗非鱼耐碱性snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于水产生物技术领域，公开了一种莫桑比克罗非鱼耐碱性SNP标记及其应用。所述SNP标记的序列如SEQIDNO：1或SEQIDNO：4所示，所述SEQIDNO：1序列1227bp处或SEQIDNO：4序列120bp处的SNP位点碱基为G或A。本发明创造性地提供了一种与莫桑比克罗非鱼耐碱性状相关的SNP标记，并在此基础上开发了相应的引物对、方法及试剂盒，可以进行莫桑比克罗非鱼耐碱个体的筛选或检测，不受生长阶段的限制，可大幅提高罗非鱼选育的进程以及快速选出具有耐碱优良性状的罗非鱼种质，具有很大的科学价值和商业价值。

Description

一种莫桑比克罗非鱼耐碱性SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种莫桑比克罗非鱼耐碱性SNP标记及其应用。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)，原产于非洲，俗称非洲鲫鱼，属于鲈形目(Perciformes)丽鱼科(Cichlidae)的一种广盐性热带鱼类。罗非鱼作为重要的经济性鱼类，具有肉质鲜嫩、营养价值高、生长快等特点，深受广大消费者和养殖户的青睐，已被联合国粮农组织(FAO)列为六大主食品之一，已在100多个国家和地区进行养殖。目前主要有莫桑比克罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及杂交种等养殖品种，不同的养殖品种耐盐性能相差较大。

莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)五十年代称为越南鱼。原产地在非洲的莫桑比克，自1956、1957年分别由泰国和越南引人我国广东省进行试养。在云南西双版纳和海南省的一些水库因为温高水暖可以终年养殖。莫桑比克罗非鱼属暖水性的热带鱼。生存的临界温度上限40度对其分解代谢受到影响，42度时则为致死上限温度。下限l3度时生长极差，10度时则停止生长，8度时为致死的下限温度。

全球水资源的匮乏及气候变暖使得可利用的淡水资源锐减，淡水养殖业面临着严重的水资源短缺。随着我国对淡水环境的保护加强，淡水养殖可利用水域面积短缺，罗非鱼的淡水养殖业将受到很大程度的制约。而我国盐碱水资源十分丰富，约占全国湖泊总面积的55％，但是盐碱水具有高碳酸盐碱度(HCO₃ ^-和CO₃ ^2-)、高pH、离子组成复杂等理化特点，不利于常规鱼类品种的生长，盐碱水域的开发利用存在较大的局限性，绝大部分地区盐碱水资源的利用率依然很低，开发和利用盐碱水资源十分迫切及必要。目前，耐盐碱种质资源的利用是解决这一问题的重要手段。

专利CN 108207712 A公开了一种耐盐碱罗非鱼的优良品系选育方法。包括以下步骤：先收集至少三个不同品系尼罗罗非鱼作为选育基础群体，并进行耐盐碱性评估；再对上述不同品系尼罗罗非鱼每年进行一代耐盐碱选育，且连续选育至少两代，其中耐盐碱选育过程包括：繁殖池准备、亲鱼选择与培育、孵苗和捞苗、筛选和强化培养与越冬；再将经耐盐碱选育后的耐盐碱且生长优势明显的不同品系尼罗罗非鱼混合，再进行耐盐碱选育且连续选育至少四代，即为优良品系的耐盐碱罗非鱼。

上述传统育种手段进行耐碱罗非鱼选育存在选择率低、周期长等问题。分子标记辅助育种是解决这一问题的有效手段。单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphisms,SNP)是最常用的分子标记方法之一，是指由于单个碱基的变化所引起DNA序列的改变，具有数量多、分布广泛、遗传稳定性高、定位精度高、分型操作简单、检测方法简单、规模化实验及检测自动化方面要求低等特点。由于其全基因组覆盖率和基因分型效率高等优点，被广泛应用于关联分析和分子辅助育种中。分子标记辅助育种技术是通过与目标性状紧密连锁的分子标记对目标性状进行间接选择的现代育种技术，具有选择强度大、不受环境影响和结果可靠等特点，可实现早期选种和提高育种的准确性，以取得更大的遗传进展和更快的育种进程。但目前鲜有采用SNP标记技术对莫桑比克罗非鱼进行检测或筛选的报道。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种与莫桑比克罗非鱼耐碱性相关的SNP标记。

本发明的另一目的在于提供一种检测上述与莫桑比克罗非鱼耐碱性相关的SNP标记的引物对或试剂盒。

本发明的再一目的在于提供上述试剂盒在耐碱莫桑比克罗非鱼亲本筛选或检测中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种与莫桑比克罗非鱼耐碱性相关的SNP标记，所述SNP标记的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示，所述SEQ ID NO：1序列1227bp处或SEQ ID NO：4序列120bp处的SNP位点碱基为G(鸟嘌呤)或A(腺嘌呤)。

该SNP标记为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第1227位碱基或标记为SEQ ID NO：4所示核苷酸序列第120位碱基以R表示，R代表G或A。

进一步地，所述SNP标记在SEQ ID NO.1序列1227bp处或SEQ ID NO.4序列120bp处为G碱基的是优势等位基因，当莫桑比克罗非鱼个体只含有该SNP位点为G的纯合基因型(即GG基因型)时为耐碱目标选择个体。

更进一步地，所述SNP标记可以包括上述基因序列，例如包括上述1227bp处为G的SEQ ID NO.1序列；或者例如还可以包括通过SEQ ID NO.2序列和SEQ ID NO.3序列扩增得到的序列(SEQ ID NO.4序列)，这样的序列可以为SEQ ID NO.4本身，也可以为包括SEQ IDNO.4序列的SEQ ID NO.1序列。

更进一步地，所述SNP标记还可以包括为1227bp处为A的SEQ ID NO.1序列本身。

申请人研究发现，在罗非鱼Prkaca基因序列SEQ ID NO.1的1227bp处有一个G(鸟嘌呤)或A(腺嘌呤)型SNP，该SNP位于基因非编码区的5’端启动子区域，命名为Prkaca-G1227A SNP位点。

申请人进一步研究发现，对罗非鱼碱胁迫的实验表明，Prkaca基因中1227bp处的SNP位点与莫桑比克罗非鱼耐碱性状有明显的相关性，该位点对应基因型为GG基因型的个体耐碱性能上显著强于GA基因型或AA基因型的个体。

一种检测上述与莫桑比克罗非鱼耐碱性相关的SNP标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列如下所示：

引物1：5’-ACCTGCCAATCGTTACTCA-3’(SEQ ID NO：2)；

引物2：5’-ACTGATTGGCTCTTCGCAA-3’(SEQ ID NO：3)。

本发明的引物对，可以用于扩增SNP标记或含有该标记的序列，或用于检测是否具有上述SNP标记的莫桑比克罗非鱼，从而进一步地筛选和/或检测耐碱莫桑比克罗非鱼，或进一步地用于鉴定和/或筛选耐碱莫桑比克罗非鱼亲本。

一种检测上述与莫桑比克罗非鱼耐碱性相关的SNP标记的试剂盒，包括上述引物对。

所述试剂盒包括检测具有上述的SNP标记的试剂，这样的试剂可以包括例如包括引物对在内的PCR扩增试剂、样本DNA提取试剂等，这样的试剂还可以考虑为实现上述筛选和/或检测耐碱罗非鱼或亲本的方法的任何试剂及其组合。

上述试剂盒在耐碱莫桑比克罗非鱼亲本筛选或检测中的应用。

通过检测莫桑比克罗非鱼上述SNP标记对应的基因型，可有效筛选和/或检测得到耐碱的莫桑比克罗非鱼个体，检测得到上述SEQ ID NO.1的序列的1227bp处碱基多态位点对应基因型为GG基因型的罗非鱼为耐碱的罗非鱼或罗非鱼亲本。

另外，SNP是可以从亲代遗传给子代的分子标记，可以通过选择含有目的性状相关的SNP标记的亲本，进行繁殖，以期获得含有这一性状的子代，加快选育的进程。

本发明中优选的GG基因型为纯合体，在后代个体遗传中不会发生分离。因此，通过筛选/检测本发明的SNP标记，能够用于选育耐碱莫桑比克罗非鱼新品种的育种之中，可根据候选亲本在该SNP标记位点上的基因型对罗非鱼亲本进行选择，挑选含有GG基因型的莫桑比克罗非鱼亲本进行配对繁殖，可以获得耐碱能力较强的后代鱼苗，加快培育适合咸水或海水养殖的罗非鱼新品种，既能降低养殖成本，又能节约育种时间。

进一步地，所述应用方法为：

提取莫桑比克罗非鱼DNA，采用SEQ ID NO：2序列和SEQ ID NO：3序列的引物对进行PCR扩增，选择具有SEQ ID NO：1序列的1227bp处碱基多态位点对应基因型为GG基因型或SEQ ID NO.4序列的120bp处碱基多态位点对应基因型为GG基因型的莫桑比克罗非鱼作为耐碱罗非鱼或亲本。

具体地，例如检测出莫桑比克罗非鱼个体的SNP位点碱基多态位点只有G时，即标记位点对应基因型为GG基因型，则判定该检测样本为耐碱罗非鱼，可选作为耐碱罗非鱼繁殖亲本。

进一步地，所述PCR扩增反应体系为25μL的反应体系，具体如下：

进一步地，所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30秒，56℃退火20秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明创造性地提供了一种与莫桑比克罗非鱼耐碱性状相关的SNP标记，并证实了不同的基因型与莫桑比克罗非鱼耐碱性状的相关性，在此基础上，利用该SNP标记开发了相应的引物对、方法及相应试剂盒，可以进行莫桑比克罗非鱼的筛选或检测，或耐碱莫桑比克罗非鱼或其亲本的筛选或检测，在罗非鱼的养殖或选育领域，都具有积极的效果，为罗非鱼耐碱分子标记辅助选择育种提供基础，为筛选和建立耐碱罗非鱼新品系提供可靠的遗传数据，具有很大的科学价值和商业价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例SNP标记的作用研究：

本实施例所用的莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)(500尾)均来自于中国水产科学研究院珠江水产研究所高要水产种质基地。碱度胁迫实验在320cm×200cm×150cm的鱼池中进行。实验前暂养7天，期间溶解氧为8.7±0.6mg/L，水温为28.5±1℃，pH值为8.4±0.5。挑选健康无伤、活泼的罗非鱼进行实验，实验开始后，每20分钟加入预配好的碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液增加池水的碳酸盐碱度，每次提高碱度1g/L，以酸碱滴定法测定水体实际碳酸盐碱度，用1mol/L盐酸溶液(HCl)滴定，并以甲基橙为指示剂检测池水的实际碳酸盐碱度。期间持续充气，不投喂饲料。2小时后开始有罗非鱼死亡，记录每尾罗非鱼的死亡时间、水体碱度、体质量等指标，并取鱼鳍保存于无水乙醇中。碱胁迫条件下，先死亡的100个个体认为是碱敏感组，耐碱性能低，最后死亡的100个个体认为是碱耐受组，耐碱能力强。提取基因组DNA，检测SEQ ID NO.1的1227bp处的SNP位点的等位基因和基因型频率见表1。

表1莫桑比克罗非鱼Prkaca-G1227A SNP位点的等位基因和基因型频率

由以上结果可以看出，Prkaca-G1227A SNP位点基因型GG在碱耐受组的基因型频率占86％，而早期死亡的碱敏感组个体中AA基因型占83％，因此可认为该SNP位点与莫桑比克罗非鱼碱耐性状关系密切，该位点对应的基因型GG为碱耐受基因型。

因此，本发明获得的Prkaca-G1227A SNP(SEQ ID NO.1的1227bp)分子标记可用来辅助选育莫桑比克罗非鱼耐碱品种，当待测试个体在该位点上的仅检测出G时，也就是其对应的基因型为GG基因型时，则测试个体为耐碱个体，可选择作为罗非鱼耐碱品种的亲本，而Prkaca-G1227A SNP(SEQ ID NO.1的1227bp)位点不止为G，还包括A，或者只有A时，也就是说其对应基因型为GA、AA基因型时，为碱敏感莫桑比克罗非鱼个体。

实施例2

本实施例对莫桑比克罗非鱼的SNP标记进行筛选/检测：

(一)样品DNA的提取

(1)取待检测样本莫桑比克罗非鱼的鳍条组织3mg，剪碎后，加入0.5mL的裂解液(10mmol/L Tris-HCl；0.1mol/L EDTA；0.5％SDS；30mg/L RNase；100mg/L蛋白酶K，pH8.0)，55℃消化1小时；

(2)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)混合物，混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

(3)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟，得到沉淀；

(4)将沉淀用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE(10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解，得到DNA液，可4℃贮存备用。

(二)引物的设计与合成

根据莫桑比克罗非鱼Prkaca基因序列(SEQ ID NO.1)设计并合成一对引物，用于扩增SEQ ID NO.1的1227bp或SEQ ID NO.4的120bp位置的SNP位点，引物序列如下：

引物1：5’-ACCTGCCAATCGTTACTCA-3’(SEQ ID NO：2)；

引物2：5’-ACTGATTGGCTCTTCGCAA-3’(SEQ ID NO：3)。

(三)PCR反应：

反应体系(25μL体系)

PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30秒，56℃退火20秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7min。

(四)莫桑比克罗非鱼的基因型分析(筛选/检测)

测序步骤(三)得到的PCR扩增产物(即SEQ ID NO.4序列)，查看测序峰图，分析每尾莫桑比克罗非鱼的基因型，根据SEQ ID NO.1序列或SEQ ID NO.4与测得序列的比较结果，在SEQ ID NO.1序列的1227pb为G单峰的个体是GG基因型个体，GA双峰的个体是GA基因型个体，A单峰的个体是AA基因型个体。其中GG基因型个体筛选/检测为耐碱的罗非鱼或罗非鱼亲本，GA或AA基因型个体筛选/检测为碱敏感罗非鱼个体。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种莫桑比克罗非鱼耐碱性SNP标记及其应用

<130> 2021-3-21

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4975

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

cagagagact cagcacgttg gcttgctcct cgccctccca tctctggctc ctttctgttt 60

tccgatttca ttcataaaat gcagcaccac cattttcact ctagcctcat gttgctaggc 120

aactactgca caaaaggaaa ggggggcctg tctgtgttct cttgcccatt ttatcttagt 180

tgaagggacc aactccccca tccatccatc tgttacctct gtccacttct tacatgtctg 240

cacatttgac cagtgtattt tcatatattc atatttagcg gtaaaaccca tatgcagctt 300

caattgtcct ttaacagcag cctgtagcag cgctcaaatg attcgtaggt tttaggggtc 360

atgtagattt aaatcttaaa ttttatttaa tttttttttt ttataaatgt ctgccattaa 420

cttgtgaagc atttgacatc attgttctca tcatcatgtc ttttgtggtg agactgtgat 480

atgtaagtta caaccatgta taagcagaat tagtgatttg gttgtttgag tccgttttac 540

ataaccgtgg tggtgtcgtg tgagcccaaa tgatggtgtc aaaccctgca gcagctgaga 600

gatctcgtat tcatagaatg gatgtttttt cataccatga gttttttttc ttttttttaa 660

attaccatca caaggtgaaa ttgtcattga aattagatat tcagatgcaa atccatgtga 720

aaccgagcct tttgaaggtc ctggtaataa aaggactctc ggtcatatgc taggctaagc 780

ctgcaggtga tccaggtgct ggggtggttg tgctgtgttg aaggaggcag ttggagggtt 840

gactgtaaaa cattcagaaa gacggtatct cttcgagtgt ttagaacgac cgtcttgttt 900

cctattattc tcactaaata cactcatcat ttaacgcacg gcggtctgcg aaatgtttag 960

aagtcctgcc agcccgaccg cgccgcgcgt gcgttaaatt ctgaccaaca tttctaaaaa 1020

tagctcgcgg ttgacgtcac ttggccaaac gtgtatcagt cgcttggcgg cggtgggagt 1080

ggggggctga agaggggttt tttttctacc tgccaatcgt tactcacagc caatagacaa 1140

cttcacattc gccgagattc ccacggttcg cctgcatcga gccaatggag gacggaaacc 1200

aggaaaagtg ggcgggtatg tcgtcgrgag gaaaataatc ggtgacgttc ctctcactcg 1260

ctttgtgtag ggcggtagga tggtgccgct cttgatggat tgcgaagagc caatcagtgc 1320

cttccgtggg ataccggcat acataggttg ccaatccgcg ggttggttgc agctgtcaat 1380

caaaacccgg ttctggctag tgggcgggac gttcagtcga ctgtagttcc gtcatctcgc 1440

tcgtctccga ggctacgggg ggccaatgtt gatttgggtg aattcccgtc gtcgtcggac 1500

cccgccgagg tttaattttt aaaagctggg tttagtaacg aaaagtggcg gctcttgggc 1560

tgagaatatc gcgtccccgc ctctggtgtc gtttttcttt aggctgggga gaggtgggga 1620

gccggggggg ctcgttcggc gggggctgca aggagggaca ggcgaagact ggatcctccg 1680

tgttcaggcc atctgcgccg agctcggcct tacggtccag tgaagcccca acgaccgaga 1740

tacctcaaag gtatcctccc cgtggatttg agctatatat cggtcgcccg ttgctgatga 1800

ctgagtgagt gagcccgctt taccatctcg tctcgccctg gcaccgcatc agcatctgcc 1860

aggctattaa agaccaagac ctcggagtta acgcttggtg cttttggatt tagaaaatac 1920

cgatcagacc taatcgagat tagaccggct tgagaaggct gcagggcggc caaaaagcca 1980

cggatctccc gttgacaggt tgtcatcatg ggcaacgcgc ccacggccag gaagggcagc 2040

gagatggaaa gcgtcaagga attccttgct aaagccaaag aggacttcct caaaaagtgg 2100

gagaatcctg cacagaacac tgcttgcctg gagcagtttg agaggttgaa aaccctgggc 2160

acgggctcat ttggtcgtgt tatgctggtg aagcacagag aaacgggaca acattatgcg 2220

atgaagatcc tcaacaagca gaaggtggtc aagctcaagc agatagagca cactctaaat 2280

gagaagagga ttcttcaggc tgtcagcttc ccttttctgg tgcggttaga gtactcattc 2340

aaggacaaca ctaacctcta catggtgatg gagtatgtgc caggtggcga gatgttttcc 2400

catctacgga gaattggcag atttagtgag cctcacgctc ggttctacgc tgctcaaatc 2460

gttctgacct ttgagtatct ccatgctttg gacctgatct acagagacct gaaacctgaa 2520

aacctgctca tagaccaaca gggctacata caggttacag attttggctt tgccaaacgt 2580

gtgaagggcc ggacctggac actgtgtggc accccagaat atctggctcc agagatcatt 2640

ctcagcaagg ggtataacaa agcagtagac tggtgggcac tgggtgtact cgtctatgag 2700

atggcagcag ggtacccacc tttctttgct gatcagccca ttcagatcta tgaaaagatt 2760

gtttcaggga aggttcgttt cccatctcac ttcagttcag acctgaaaga cctcctaagg 2820

aacctgttac aggtggatct cacaaaacgt tatggaaacc tcaaaaatgg ggtcaatgat 2880

atcaagggac acaagtggtt tgcaacaact gactggattg ccatttacca gaaaaaggtg 2940

gaagctccct tcatccccaa gttcaaagga ccaggcgaca ccagcaactt cgatgactac 3000

gaggaggagg agattcgcgt ctccttcact gagaaatgtg ccaaggagtt tgctgagttc 3060

tagagttaga gagcaagaga ggaagaaaga aggaaatagg gagagtcaaa ggtaggctgg 3120

tcaagtggga gacgtaagga gaaagtactg tctcctgtcc aatcacaagc accagctaca 3180

aagaggaaaa atcggataga gaagggaaaa agagcaagga gactgataac cagcagtgtt 3240

gccttttctg ttgtgttttt gttgtgtttt atttattatt ctgtcttatt tatggatccc 3300

tttataatga aggtgtgctt catgggtgtt gagaatccaa ctaatttgga gttgcctcta 3360

cacattttca cccgagatct tcccttttcc ttttttttaa tccatctttt agtcatattc 3420

gcaccgcagc aaagagaaat cagtctgtct gtgctgatct agtccagtct cttagtcatt 3480

acatgaagac taatgagttt tgtgcaagtt taggtctcag tctggacaaa agtttcttaa 3540

attttaaccg acaactggct aacatgctct ttgttttttt taagcaggaa gggcatgtaa 3600

gtagcaggtt taataaatct tgcacacata tgtactttca cctcagatga ctttacattt 3660

tgcagtttta tctcaatttt tccttcagaa tttaaacttt taccctttca tatcatagac 3720

acactacata acttaaggct tgatgggcca acaaaaaaaa aaatggatac attgtgtgtg 3780

caaaataaat ttcagcgaga gacagatgat gttttaaggg aaaaaaagtc agttacgttt 3840

actgtgtaac tatccatcta ccgttcttat cattgttaga attagtgcat atctacggta 3900

ctccatttta aatgttatta gatactagtg gctccaatga tatcatgtca cgctaacaaa 3960

caaggaaata tgagtaaagg gatggaatta actcagtttt taagggcgtt ttaaagaaac 4020

accgtaacgt aatggtatct caggtttgaa catatcactt aatagacatt ttattaacat 4080

acagcgttag gatcggcagg taaatctgtg atatggattt gggaatttaa agttctggtt 4140

caaattaaaa gtaacaaaag ggaatattca gacttttggt tagcgtcttc cacagtttgc 4200

ccttccagaa gatttgattt tactaactga ctcaacaact ttgttttcat gaaagcactt 4260

cctgtctcgg ctcagagttt acttaatggt cacagtgatt ctgcttactg aatcaagcct 4320

ttggcccttg attactccaa ctgaaagaga ccgcttgagg caaactacct cgaactgctt 4380

ccggctggtg gccttcagag cattttgacc agtcactgat ggcagtttgg atagtgcgct 4440

tttatggtct tcaatggaaa tatgtattca tgttcacctc atcttattac ccatcccttt 4500

cttcttatca cttgtaaagt aggaccacac tccatgtgac agtcttatat gtgacagcag 4560

ctctgttact gtttatgtgt tttaaacatg cacagttttt ttgtttcgtt ttgttttttg 4620

tgtgttggtg atgatgtaaa gatgactggc actccattta acaagttagt gaaagctaga 4680

gcgcctggcg gtgaatcgag ctaataccga gaagagagaa aaataatcat agcgcacggt 4740

atacaacctg ctgatttgaa gaatacaaca aatagcactt ttggtattca gtgtctcctt 4800

ggctcctgag ctatggtgac agaatatttc aacaatggcc agagagggtc gttactgtag 4860

gatttgttca ttcacaattt atgagataaa acaaagtgac actgatgttc gtttcagaca 4920

tcaaaatgcc ttctttattg ctgtaattta atgtgccaca ataatgatga tttcc 4975

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

acctgccaat cgttactca 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

actgattggc tcttcgcaa 19

<210> 4

<211> 211

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

acctgccaat cgttactcac agccaataga caacttcaca ttcgccgaga ttcccacggt 60

tcgcctgcat cgagccaatg gaggacggaa accaggaaaa gtgggcgggt atgtcgtcgr 120

gaggaaaata atcggtgacg ttcctctcac tcgctttgtg tagggcggta ggatggtgcc 180

gctcttgatg gattgcgaag agccaatcag t 211

Claims (5)

1.一种与莫桑比克罗非鱼耐碱性相关的SNP标记，其特征在于：所述SNP标记的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示，所述SEQ ID NO：1序列1227bp处或SEQ ID NO：4序列120bp处的SNP位点碱基为G或A，上述SEQ ID NO.1序列1227bp处或SEQ ID NO：4序列120bp处碱基多态位点对应基因型为GG基因型的罗非鱼为耐碱的莫桑比克罗非鱼。

2.一种检测权利要求1所述的与莫桑比克罗非鱼耐碱性相关的SNP标记的引物对或包含该引物对的试剂盒在耐碱莫桑比克罗非鱼亲本筛选或检测中的应用，其特征在于：

所述引物对的核苷酸序列如下所示：

引物1 ：5’- ACCTGCCAATCGTTACTCA -3’，SEQ ID NO：2；

引物2 ：5’- ACTGATTGGCTCTTCGCAA -3’，SEQ ID NO：3；

所述应用方法为：通过检测莫桑比克罗非鱼SNP标记对应的基因型，检测得到SEQ IDNO.1的序列1227bp处或SEQ ID NO：4序列120bp处碱基多态位点对应基因型为GG基因型的罗非鱼为耐碱的莫桑比克罗非鱼亲本。

3.根据权利要求2所述的引物对或试剂盒在耐碱莫桑比克罗非鱼亲本筛选或检测中的应用，其特征在于所述应用方法为：

提取莫桑比克罗非鱼DNA，采用SEQ ID NO：2序列和SEQ ID NO：3序列的引物对进行PCR扩增，选择具有SEQ ID NO：1序列的1227bp处碱基多态位点对应基因型为GG基因型或SEQID NO.4序列的120bp处碱基多态位点对应基因型为GG基因型的莫桑比克罗非鱼作为耐碱罗非鱼亲本。

4.根据权利要求3所述的引物对或试剂盒在耐碱莫桑比克罗非鱼亲本筛选或检测中的应用，其特征在于所述PCR扩增反应体系为25 µL的反应体系，具体如下：

H₂O 19.8µL；

10×PCR Buffer 2.5µL；

4×dNTP，10mmol/L 0.5µL；

Taq酶，5U/µL 0.2µL；

引物1 ，10µmol/L 0.5µL；

引物2 ，10µmol/L 0.5µL；

样本DNA 1.0µL。

5.根据权利要求4所述的引物对或试剂盒在耐碱莫桑比克罗非鱼亲本筛选或检测中的应用，其特征在于所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性 2 min；94℃变性30 秒，56℃退火20 秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7 min。