CN113151492B - 一种与卵形鲳鲹耐低氧性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种与卵形鲳鲹耐低氧性状相关的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与卵形鲳鲹耐低氧性状相关的SNP分子标记，该SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端开始第121位碱基是C或G，当SEQ ID NO.1上第121为核苷酸为G时，卵形鲳鲹在低氧胁迫下有更长的存活时间，还公开了用于检测所述的SNP分子标记的引物对和包括所述引物对的试剂盒，以及对低氧处理后的卵形鲳鲹进行全基因组重测序分型，通过全基因组关联分析得到一个SNP分子标记，本发明可以对卵形鲳鲹育种材料进行早期选择，有效提高了选育具有耐低氧性状的卵形鲳鲹的效率和准确性。本发明为卵形鲳鲹耐低氧性状的分子标记辅助选择提供了一个新的SNP分子标记。

Description

一种与卵形鲳鲹耐低氧性状相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于水产动物分子标记的筛选及辅助育种技术领域，具体涉及一种与卵形鲳鲹耐低氧性状相关的SNP分子标记及应用。
背景技术
卵形鲳鲹，俗称金鲳，广泛分布在印度洋、地中海和东海等地区的热带、亚热带海域。是我国南方最具商业化养殖价值的海洋鱼类之一。众多因素影响着卵形鲳鲹养殖产业的发展，例如环境、饲料、苗种品质等。溶解氧是重要的环境因子，在养殖过程中，卵形鲳鲹因缺氧死亡为养殖者造成了巨大的经济损失。鱼类通过带有氧气的水，流过鳃组织来获得氧气。充足溶氧的水体和健康的鳃组织是鱼类在水中存活的前提。由于过高的养殖密度，水环境恶化导致的赤潮或水华的发生，寄生虫寄生在鳃组织上导致鳃组织结构破坏不能进行气体交换等因素造成的水体缺氧，从而影响卵形鲳鲹的生长、摄食、免疫力下降、基因损伤，甚至直接导致卵形鲳鲹因缺氧窒息死亡。所以，利用分子标记辅助育种技术选育耐低氧的卵形鲳鲹新品种是解决以上问题的有效办法。
全基因组关联分析(GWAS)是在全基因组范围内获得大量分子标记与目的性状表型数据相结合进行统计分析，以此挖掘与目的性状相关联的遗传位点做为分子标记进行辅助育种。从而在基因水平揭示物种表型多样性的遗传基础，为分子育种提供新的途径。全基因组关联分析具有检测范围广、分辨率高、材料来源多等优势，在水产动物选择优良生长性状、抗病性状、耐胁迫性状上得到广泛的应用。GWAS不但可以筛选与性状显著关联的SNPs，还可以获得与性状关联的功能基因。众多学者利用SNP分子标记技术与卵形鲳鲹重要经济性状进行相关性分析，已有学者通过GWAS发掘了23个与卵形鲳鲹体长、体重、体高三种生长性状显著关联的QTL；还有学者研究了卵形鲳鲹GILT基因的多态性对卵形鲳鲹抗病性状有显著影响。先前的研究集中在卵形鲳鲹生长性状、抗病性状等SNP分子标记的开发，但对卵形鲳鲹耐低氧性状标记的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与卵形鲳鲹耐低氧性状相关的SNP分子标记。
本发明的目的还在于提供用于检测上述SNP分子标记的引物对、试剂盒以及上述SNP分子标记、引物对、试剂盒在卵形鲳鲹耐低氧性状的选择育种方面的用途。
本发明的最后一个目的在于提供一种与卵形鲳鲹耐低氧性状关联的SNP分子标记的筛选方法，以及一种卵形鲳鲹耐低氧性的检测方法。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种与卵形鲳鲹耐低氧性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1所示序列自5’端开始第121位碱基是C或G。
具体的，本申请发明人通过全基因组关联分析(GWAS)发现了一个与卵形鲳鲹耐低氧性状关联的SNP分子标记，该分子标记位于卵形鲳鲹的10号染色体上，即SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第121个碱基。
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列如下：
AGGTCATGCTGTCAGGAAACACCAAACGCTGAGATGGCTGTCGAGTCGAGGAACAGGTCCACACACTGTGCGTCCTCCCTCTCCAGCTTTGACGGAGGCTGAAGTCAGAGATGTGACTCTR(C/G)TGCAAGTCATTTCAAAGCAGTGCACGTCTAATCTGTGTCCTGACCAAAGCAGGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGGGAGGGAGGGAGGGAGAAGGAGAAAGCAAACAGAAAGGAGAGAGGGA。
上述序列的第121位碱基处的R为C或G，该突变使上述序列，即SEQ ID NO.1所示的序列产生了多态性。
该位点的基因型与卵形鲳鲹耐低氧性状显著相关。
通过相关性和显著性检验证明，GG和GC基因型样本对应的卵形鲳鲹耐低氧能力与CC基因型样本相比具有显著性差异。从统计学上判断，当基因型为GG和GC时，卵形鲳鲹的耐低氧能力大概率强于基因型为CC的卵形鲳鲹，且基因型为GG的卵形鲳鲹的耐低氧能力最强。
即所述SNP分子标记的GG基因型个体卵形鲳鲹低于窒息点溶解氧水体中存活时间显著高于GC或CC基因型个体。
本发明所述卵形鲳鲹耐低氧性状具体指水体溶氧在窒息点以下时，卵形鲳鲹的存活时间。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于检测上述的SNP分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2～4所示。
本发明根据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列针对SNP分子标记设计特异性引物SNP24144184FC、SNP24144184FG和SNP24144184R，进行PCR特异性扩增，扩增产物使用酶标仪读取荧光信号，然后解析转换荧光信号，获得待测卵形鲳鲹该SNP分子标记位点的基因型。
本发明所述SNP分子标记的检测引物如SEQ ID NO.2～4所述，用于对本发明所述SNP分子标记所在核酸序列的特异性扩增，扩增产物通过酶标仪分析荧光信号，以获得待测卵形鲳鲹该SNP标记位点的基因型。
本发明所述的引物是以该标记上下游120bp的基因组序列为模板，利用SNPprimer软件设计所得。
具体的：所述引物对的核苷酸序列如下所示：
SNP24144184FC(SEQ ID NO.2)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCTGAAGTCAGAGATGTGACTCTC；
SNP24144184FG(SEQ ID NO.3)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGAAGTCAGAGATGTGACTCTG；
SNP24144184R(SEQ ID NO.4)：
TTGGTCAGGACACAGATTAGACG。
本发明还提供了用于检测上述的SNP分子标记的试剂盒，包括上述的引物对。
本发明还提供了上述SNP分子标记、引物对或试剂盒在卵形鲳鲹耐低氧性状的选择育种方面的用途。
因此，本发明上述SNP分子标记、引物以及试剂盒在评价卵形鲳鲹耐低氧能力的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明所述的SNP分子标记应用在卵形鲳鲹耐低氧性状的选育过程时，具体是在卵形鲳鲹选育过程中，对卵形鲳鲹育种的候选群体进行该SNP位点的基因型检测，再结合其他与生长性状、抗病、抗逆性状相关的位点的基因型，优先选择本发明所述SNP基因型为GG的个体作为选育耐低氧性状的卵形鲳鲹亲本。
本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：一种与卵形鲳鲹耐低氧性状关联的SNP分子标记的筛选方法，包括以下步骤：
(1)选取经过低于窒息点的溶氧处理的卵形鲳鲹的鳍条，提取DNA进行全基组重测序；
(2)将步骤(1)获得的测序结果与卵形鲳鲹的参考基因组文件进行比对，获得全基因组范围的SNP分子标记；
(3)采用全基因组关联分析的方法，分析卵形鲳鲹耐低氧性状与基因型间的相关性，得到上述与卵形鲳鲹耐低氧性状显著相关的SNP标记。
进一步的，上述与卵形鲳鲹耐低氧性状关联的SNP分子标记的筛选方法，包括以下步骤：
(1)选取约500尾卵形鲳鲹经过低于窒息点的溶氧处理，剪取死亡顺序的约前50尾和约后50尾卵形鲳鲹的鳍条，提取DNA进行全基组重测序；
(2)将步骤(1)获得的测序结果与卵形鲳鲹的参考基因组文件进行比对，获得全基因组范围的SNP；
(3)采用全基因组关联分析(GWAS)的方法，分析卵形鲳鲹耐低氧性状与基因型间的相关性，得到与卵形鲳鲹耐低氧性状显著相关的SNP标记。
本发明丰富了卵形鲳鲹选择育种的分子标记，利用全基因组重测序的方法对SNP进行分型，并通过全基因组关联分析(GWAS)筛选与卵形鲳鲹耐低氧性状相关的SNP，筛选到的SNP分子标记可应用于卵形鲳鲹耐低氧性状的选择育种。本发明为卵形鲳鲹的选择育种提供了新的分子标记资源。
本发明还提供了一种卵形鲳鲹耐低氧性的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测卵形鲳鲹基因组DNA；
(2)采用上述引物对，将待测卵形鲳鲹基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)采用分析PCR扩增产物荧光信号的方法获取基因型，根据基因型，确定所述待测卵形鲳鲹的耐低氧性能。
优选的，步骤(1)中剪取卵形鲳鲹部分鳍条提取总DNA，并确保DNA样品的质量，即A260/A280的比值在1.8～2.0间，DNA浓度大于100μg/μL。
优选的，步骤(2)中PCR扩增时，PCR体系如下：
Figure BDA0002990163920000041
PCR扩增程序如下：
Figure BDA0002990163920000042
Figure BDA0002990163920000051
步骤(3)中基因分型时，PCR完成后，使用酶标仪读取荧光信号，然后利用在线软件snpdecoder解析转换荧光信号，并根据不同的荧光颜色，输出对应的基因型。
步骤(3)中采用分析PCR产物荧光信号的方法获取基因型，相比较测序等方法成本低。
步骤(3)中当基因型为GG时卵形鲳鲹低于窒息点溶解氧水体中存活时间显著高于基因型为GC或CC的个体。
因此，优选的，选择SNP位点为GG基因型的个体作为耐低氧卵形鲳鲹选育的亲本，避免选择SNP位点为GC或CC基因型的卵形鲳鲹个体作为亲本。
综上，本发明公开了一种与卵形鲳鲹耐受低氧性状的SNP分析标记，属于水产动物分子标记的筛选及辅助育种技术领域，还公开了筛选SNP的方法及应用后基因型的鉴定，本发明可以对卵形鲳鲹育种材料进行早期选择，有效提高了选育具有耐低氧性状的卵形鲳鲹的效率和准确性，本发明为卵形鲳鲹耐低氧性状的分子标记辅助选择提供了一个新的SNP分子标记。
本发明的有益效果是：
(1)本发明实施例中的统计分析表明，本发明所述的SNP标记基因型为GG时卵形鲳鲹的耐低氧能力显著高于基因型为GC或CC的卵形鲳鲹，因此通过对本发明所述的SNP分子标记进行检测，可以预测其耐低氧的能力，本发明的SNP分子标记与卵形鲳鲹的耐低氧性状关联，可以作为一种有效的分子标记辅助卵形鲳鲹耐低氧性状的选育；
(2)采用本发明中的技术方案可对卵形鲳鲹育种材料进行早期选择，缩短了育种周期同时提高了选育的准确性，提高卵形鲳鲹繁殖群体的遗传水平，丰富卵形鲳鲹的分子标记的资源，最终能够精准、高效的选育出具有众多优良性状的卵形鲳鲹新品种。
附图标记
图1是本发明实施例1中的曼哈顿图，用箭头指向的点为本发明筛选的分子标记，该标记位于卵形鲳鲹第10号染色体上。
具体实施方式
下面通过实例对本发明做进一步详细说明，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
SNP标记的筛选：
(1)随机选取500尾卵形鲳鲹经过低于窒息点的水体溶氧处理后，记录每条鱼的死亡时间作为其耐低氧能力的判定依据；
(2)剪取最先死亡和最后死亡的各50尾卵形鲳鲹的鳍条，采用磁珠法DNA提取试剂盒提取DNA，取20mg鳍条，依照试剂盒说明书依次添加试剂提取卵形鲳鲹的DNA。提取的DNA保存在150μL Buffer AE中，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样本，并用Nanodrop2000检测DNA浓度和纯度，要求A260/A280的比值在1.8～2.0间，DNA浓度大于100μg/μL。
(3)将基因组DNA随机打断成长度为350bp的片段，经末端修复、磷酸化以及加A尾后，片段两端分别连接上接头，制备成DNA文库，然后通过Illumina平台进行PE150测序，本发明采用的全基组重测的方法可以挖掘稀有变异，SNP密度高，可应用于全基因组关联分析；
(4)使用PLINK(V1.07)软件对获得的基因型数据进行质控过滤，过滤条件为检出率＞95％，次等位基因频率(minor allele frequency MAF)＜0.05，Hardy-Weinberg平衡检验P＜10-6，最终有100个个体和3377860个SNP用于GWAS分析；
(5)使用GEMMA软件的混合线性模型(MLM)进行GWAS关联分析。
y＝Wα+Xβ+Zμ+ε
其中，Y是表型值，即卵形鲳鲹低溶氧的存活时间，W为协方差矩阵，α是总体均值。β为SNP标记的效应，X为其指示变量。Z为基于SNP的亲缘关系矩阵，μ为加性遗传效应。ε是随机残差。并对影响表型的因素进行主成分分析，将前5个主成分作为协变量加入到模型中。
通过全基因组关联分析(GWAS)发现了一个与卵形鲳鲹耐低氧性状关联的SNP分子标记，该分子标记位于卵形鲳鲹的10号染色体上，如图1所示，箭头所指的点为该标记，即SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第121个碱基。
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列如下：
AGGTCATGCTGTCAGGAAACACCAAACGCTGAGATGGCTGTCGAGTCGAGGAACAGGTCCACACACTGTGCGTCCTCCCTCTCCAGCTTTGACGGAGGCTGAAGTCAGAGATGTGACTCTR(C/G)TGCAAGTCATTTCAAAGCAGTGCACGTCTAATCTGTGTCCTGACCAAAGCAGGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGGGAGGGAGGGAGGGAGAAGGAGAAAGCAAACAGAAAGGAGAGAGGGA。
上述序列的第121位碱基处的R为C或G，该突变使上述序列，即SEQ ID NO.1所示的序列产生了多态性。
实施例2
SNP基因型的检测：
将本发明上述SNP分子标记在另一含有497尾卵形鲳鲹的种质群体进行验证。
判定卵形鲳鲹耐低氧能力，即低于窒息点溶氧下的存活时间。具体测量方法同实施例1。
(1)剪取卵形鲳鲹部分鳍条提取总DNA，提取保存方法及DNA质量要求同实施例1所述。利用SNP primer软件依据本发明所述SNP标记上下游120bp的碱基序列为模板，设计特异性扩增引物。
(2)PCR扩增
PCR引物：
SNP24144184FC(SEQ ID NO.2)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCTGAAGTCAGAGATGTGACTCTC
SNP24144184FG(SEQ ID NO.3)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGAAGTCAGAGATGTGACTCTG
SNP24144184R(SEQ ID NO.4)：
TTGGTCAGGACACAGATTAGACG
PCR体系如下：
Figure BDA0002990163920000071
PCR扩增程序如下：
Figure BDA0002990163920000072
Figure BDA0002990163920000081
(3)基因分型
PCR完成后，使用酶标仪读取PCR产物的荧光信号，然后利用在线软件snpdecoder解析转换荧光信号，并根据不同的荧光颜色，分析输出对应的基因型。以此获得本发明所述的SNP位点在不同样本中的基因型。
分型结果见下表1。
表1 SNP24144184多态性对卵形鲳鲹耐低氧能力的影响
Figure BDA0002990163920000082
表1说明：P<0.05差异显著；P<0.01差异极显著。
由表1说明，基因型为GG的卵形鲳鲹个体低于窒息点溶解氧水体中存活时间的均值与基因型为GC或CC的卵形鲳鲹个体达到显著性差异。进而证明SEQ ID NO.1所示的分子标记SNP SNP24144184多态性与卵形鲳鲹耐低氧性状显著关联。从统计学上判断，当基因型为GG时卵形鲳鲹低于窒息点溶解氧水体中存活时间大概率高于基因型为GC或CC的个体。
本发明还可以进一步开发用于检测上述的SNP分子标记的试剂盒，包括上述的引物对。
本发明所述的SNP分子标记应用在卵形鲳鲹耐低氧性状的选育过程时，具体是在卵形鲳鲹选育过程中，对卵形鲳鲹育种的候选群体进行该SNP位点的基因型检测，再结合其他与生长性状、抗病、抗逆性状相关的位点的基因型，优先选择本发明所述SNP基因型为GG的个体作为选育耐低氧性状的卵形鲳鲹亲本。
因此，本发明中的SNP分子标记、引物对或试剂盒可以在卵形鲳鲹耐低氧性状的选择育种方面应用。
所以，本发明上述SNP分子标记、引物以及试剂盒在评价卵形鲳鲹耐低氧能力的应用，也属于本发明的保护范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的部分种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 一种与卵形鲳鲹耐低氧性状相关的SNP分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 241
<212> DNA
<213> 卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)
<400> 1
aggtcatgct gtcaggaaac accaaacgct gagatggctg tcgagtcgag gaacaggtcc 60
acacactgtg cgtcctccct ctccagcttt gacggaggct gaagtcagag atgtgactct 120
ctgcaagtca tttcaaagca gtgcacgtct aatctgtgtc ctgaccaaag caggtgtgtg 180
agagagagag agagggaggg agggagggag aaggagaaag caaacagaaa ggagagaggg 240
a 241
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc tggctgaagt cagagatgtg actctc 46
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtcgga gtcaacggat tgctgaagtc agagatgtga ctctg 45
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttggtcagga cacagattag acg 23

Claims (5)

1.一种与卵形鲳鲹耐低氧性状相关的SNP分子标记，其特征是：所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1所示序列自5’端开始第121位碱基是C或G，所述SNP分子标记的GG基因型个体卵形鲳鲹低于窒息点溶解氧水体中存活时间显著高于GC或CC基因型个体。
2.一种用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的引物对，其特征是：所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2~4所示。
3.一种用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征是：包括权利要求2所述的引物对。
4.权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在卵形鲳鲹耐低氧性状的选择育种方面的用途。
5.一种卵形鲳鲹耐低氧性的检测方法，其特征是包括以下步骤：
（1）提取待测卵形鲳鲹基因组DNA；
（2）采用权利要求2所述引物对，将待测卵形鲳鲹基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
（3）采用分析PCR扩增产物荧光信号的方法获取基因型，根据基因型，确定所述待测卵形鲳鲹的耐低氧性能；
步骤（3）中当基因型为GG时卵形鲳鲹低于窒息点溶解氧水体中存活时间显著高于基因型为GC或CC的个体。
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