CN114015785B - 渤海三疣梭子蟹原种的微卫星标记、其引物及应用 - Google Patents

渤海三疣梭子蟹原种的微卫星标记、其引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种渤海三疣梭子蟹原种的微卫星标记、其引物及应用，包括微卫星标记ZL05，其序列如SEQ ID NO.1所示；微卫星标记PrMa01，其序列如SEQ ID NO.2所示；微卫星标记PrMa03，其序列如SEQ ID NO.3所示；微卫星标记PrMa04，其序列如SEQ ID NO.4所示。所述微卫星标记ZL05与三疣梭子蟹的全甲宽性状相关联；所述微卫星标记PrMa01、PrMa03、PrMa04均与三疣梭子蟹的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重性状相关联。本发明提供微卫星标记，其多态性高，PCR扩增稳定，可用于对渤海三疣梭子蟹原种进行标记。

Description

渤海三疣梭子蟹原种的微卫星标记、其引物及应用
技术领域
本发明涉及三疣梭子蟹生物学遗传育种领域，具体地说是涉及一种渤海三疣梭子蟹原种的微卫星标记、其引物及应用。
背景技术
SSR(Simple Sequence Repeat)即简单序列重复，又称为微卫星DNA(microsatellite DNA)，广泛分布于真核生物基因组中，它以少数几个(1-6bp)短核苷酸为基本单位，首尾相连组成串联重复的DNA序列，即核心序列。核心序列重复次数越多，其等位基因数量就越多，多态性也就越丰富。位于核心序列两端的侧翼序列是相对保守的单拷贝序列，可根据其特性设计特异性引物，用于扩增微卫星序列。
与其它分子标记如扩增片段长度多态性(Amplified Fragment LengthPolymorphism,AFLP)、随机扩增多态性(Randomly Amplified Polymorphic DNA,RAPD)等分子标记技术相比较，SSR标记具有以下特点：①广泛分布于真核生物基因组中，大约每隔10-15kb就存在一个微卫星位点；②数量多，多态性丰富；③具有多等位基因的特性，信息含量大；④呈共显性遗传，即能区分纯合子和杂合子；⑤等位基因的分离遵循孟德尔规律；⑥实验操作简单、结果稳定可靠；⑦基于PCR技术，可实现自动化检测；⑧具有连锁不平衡现象；⑨重复性较好。SSR标记技术已广泛地应用于生物遗传连锁图谱构建、遗传多样性分析，QTL定位、分子标记辅助育种和种质资源鉴定等方面。
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隶属甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹属，是我国水产养殖的重要经济蟹类，主要分布在中国的辽宁、河北、山东、江苏、福建，日本以及韩国等海域。其生长迅速、肉味鲜美、营养丰富，具有较高的商业价值。近年来，过度捕捞和环境污染使渤海三疣梭子蟹野生资源减少，跨区域引种和育苗使渤海三疣梭子蟹种质混杂。渤海三疣梭子蟹野生资源的减少使原种数量下降，加大了原种保育难度。因此，利用三疣梭子蟹SSR标记与重要生长性状进行关联分析，并通过与黄海、东海数据对比，从中筛选出渤海三疣梭子蟹原种标记，这对渤海三疣梭子蟹的原种保育非常重要，对渤海三疣梭子蟹原种资源的保护和可持续利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的就是提供一种渤海三疣梭子蟹原种的微卫星标记、其引物及应用，以提供一套渤海三疣梭子蟹的原种标记，为渤海三疣梭子蟹种质资源现状的调查研究以及对原种进行标记和保护提供科学依据。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种渤海三疣梭子蟹原种的微卫星标记，包括：
微卫星标记ZL05，其序列如SEQ ID NO.1所示；
微卫星标记PrMa01，其序列如SEQ ID NO.2所示；
微卫星标记PrMa03，其序列如SEQ ID NO.3所示；
微卫星标记PrMa04，其序列如SEQ ID NO.4所示。
所述微卫星标记ZL05与三疣梭子蟹的全甲宽性状相关联；所述微卫星标记PrMa01、PrMa03、PrMa04均与三疣梭子蟹的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重性状相关联。
一种渤海三疣梭子蟹原种微卫星标记的引物，包括4对引物，分别为：
ZL05F：序列如SEQ ID NO.5所示，ZL05R：序列如SEQ ID NO.6所示；
PrMa01F：序列如SEQ ID NO.7所示，PrMa01R：序列如SEQ ID NO.8所示；
PrMa03F：序列如SEQ ID NO.9所示，PrMa03R：序列如SEQ ID NO.10所示；
PrMa04F：序列如SEQ ID NO.11所示，PrMa04R：序列如SEQ ID NO.12所示。
一种上述的微卫星标记在三疣梭子蟹生长性状关联分析中的应用。
一种上述的引物在三疣梭子蟹生长性状关联分析中的应用。
一种上述的微卫星标记或引物在渤海三疣梭子蟹的原种鉴别、保育中的应用。
本发明采用的分析方法具体步骤包括：(a)提取待分析群体基因组DNA；(b)以所述DNA为模板，采用所述的SSR标记引物进行基因分型；(c)进行生长性状关联分析。
在扩增待测样品时，若采用原种标记ZL05能够扩增AB(156bp，160bp)、AC(156bp，168bp)、BB(160bp，160bp)、BC(160bp，168bp)、CC(168bp，168bp)和CD(168bp，174bp)基因型，表明待测样品为与基因型AB、AC、BB、BC、CC和CD相关联的全甲宽较优的三疣梭子蟹原种。
若采用原种标记PrMa01能够扩增AA(118bp，118bp)、AB(118bp，126bp)、BC(126bp、134bp)、CC(134bp，134bp)、CE(134bp，150bp)和EE(150bp，150bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB、BC、CC、CE和EE相关联的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹原种。
若采用原种标记PrMa03能够扩增出AA(126bp，126bp)、CC(152bp，152bp)、CE(152bp，160bp)、CF(152bp，172bp)、CG(152bp，190bp)、EE(160bp，160bp)、EF(160bp，172bp)、EG(160bp，190bp)、FF(172bp，172bp)、FG(172bp，190bp)和GG(190bp，190bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、CC、CE、CF、CG、EE、EF、EG、FF、FG和GG相关联的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹原种。
若采用原种标记PrMa04能够扩增出AB(113bp，119bp)、AC(113bp，131bp)、BB(119bp，119bp)、BC(119bp，131bp)、CC(131bp，131bp)、DD(153bp，153bp)、DE(153bp，177bp)、DF(153bp，189bp)和EE(177bp，177bp)基因型，表明待测样品为与基因型AB、AC、BB、BC、CC、DD、DE、DF和EE相关联的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹原种。
本发明提供的SSR标记具有PCR扩增结果稳定的特点，可用于三疣梭子蟹生长性状关联分析，并可以用于对渤海三疣梭子蟹原种进行标记。
附图说明
图1是本发明三疣梭子蟹形态参数测量部位示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，在下述实施例中未详细描述的过程和方法是本领域公知的常规方法，实施例中所用原料或试剂除另有说明外均为市售品，可通过商业渠道购得。
实施例1三疣梭子蟹的来源以及生长性状的测量
采集渤海三疣梭子蟹6个野生群体(大连、葫芦岛、秦皇岛、黄骅、东营和蓬莱)，黄海1个野生群体(连云港)，东海1个野生群体(宁波)，每群体取60只。对所有采集的三疣梭子蟹进行生长性状的测量，测量指标包括全甲宽(full carapace width,FCW)、背甲底宽(carapace width,CW)、背甲长(carapace length,CL)、螯肢掌节长(fixed length of theclaw,FLC)、螯肢长节长(meropodit length of the claw,MLC)、体高(body height,BH)和体重(body weight,BW)7个可量性状。三疣梭子蟹形态参数测量部位示意图如图1所示。
实施例2三疣梭子蟹样本肌肉总DNA的提取
采用海洋动物基因组提取试剂盒提取肌肉总DNA，具体步骤如下：
(1)切取不多于30mg的组织材料，放入装有200μL GA缓冲液的离心管中，涡旋振荡15s。
(2)加入20μL Proteinase K(20mg/mL)溶液，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。56℃放置，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
(3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置l0 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(4)加人200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，
12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)重复操作步骤7。
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
(11)DNA的质量检测：取2μL基因组总DNA用质量比浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外凝胶成像系统成像后观察DNA是否降解以及是否有蛋白质残留；另外，将提取的DNA样品用Nano Drop 2000分光光度计测定其浓度，并以测得的DNA浓度为参考，将基因组总DNA样品统一稀释为100ng/μL。
实施例3微卫星DNA引物的开发
(1)三疣梭子蟹来自位于河北省黄骅市的国家级三疣梭子蟹原种场，在无菌条件下取其肌肉组织，提取肌肉组织总RNA，送生物公司进行转录组测序，获得转录组数据；利用MISA软件对组装得到的长度在l kb以上的unigenes进行SSR的鉴定，识别标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的精确SSR标记的最小重复数分别为7、6、5、4次，利用SSR Hunterl.3进行SSR标记的筛选，保证序列的前后侧翼有足够的长度用于设计引物。以筛选到的SSR使用Primer Permier 6进行引物设计；设计的主要参数设置为：引物长度18-25bp为最适长度，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度为55-60℃；GC含量一般在40-60％之间，尽量避免二级结构出现。
(2)对所合成引物进行梯度PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳初步筛选，并确定每对引物的最适退火温度，选取能扩增出清晰条带的引物。
实施例4多态性SSR标记的筛选
(1)随机选取实施例2得到的60个三疣梭子蟹样本统一稀释后的基因组DNA为模板，采用实施例3筛选出的引物对其进行PCR分型检测，其扩增体系和扩增条件如下所示，PCR扩增产物用质量比浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶分离，经银染染色，并记录扩增结果；通过与pBR322DNA/Msp I marker分子量标准对比估算扩增片段大小范围。
PCR扩增体系如下：
PCR反应程序如下：
(2)根据步骤(1)PCR分型检测结果及其位置确定基因型，各标记的序列信息见表1。
表1三疣梭子蟹原种标记的序列信息
实施例5与三疣梭子蟹生长性状显著相关的SSR标记对渤海三疣梭子蟹原种进行标记中的应用
(1)采集渤海三疣梭子蟹6个野生群体(大连、葫芦岛、秦皇岛、黄骅、东营和蓬莱)，黄海1个野生群体(连云港)，东海1个野生群体(宁波)，每个群体取60只。对采集的所有三疣梭子蟹进行生长性状的测量，测量指标包括全甲宽(FCW)、背甲底宽(CW)、背甲长(CL)、螯肢掌节长(FLC)、螯肢长节长(MLC)、体高(BH)和体重(BW)7个可量性状。
(2)基因组DNA的提取：具体步骤同实施例2；
(3)利用SSR标记ZL05，PrMa01，PrMa03和PrMa04对所有三疣梭子蟹个体进行基因分型。
(4)逐个分析标记时，剔除该位点基因型信息不全的样本，样本数少于3的基因型缺少统计意义，一并去除。应用SPSS22软件，采用一般线性模型(General Linear Model，GLM)，以SSR标记在三疣梭子蟹中的基因分型为自变量，7个生长性状为因变量，利用Duncan法进行标记不同基因型间的多重比较，利用筛选的SSR标记对渤海6个群体以及黄海、东海2个群体的三疣梭子蟹不同生长性状分别进行关联分析，结果显示，有4个SSR标记与渤海三疣梭子蟹的生长性状有显著关联，而与黄海、东海三疣梭子蟹的生长性状无显著关联，结果如表2、表3和表4所示。
利用筛选的SSR标记与渤海三疣梭子蟹7个生长性状关联分析中，发现4个SSR标记与生长性状关联(表2)。标记ZL05与三疣梭子蟹的全甲宽性状显著关联；标记PrMa01与三疣梭子蟹的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重性状极显著关联；标记PrMa03与三疣梭子蟹的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重性状极显著关联；标记PrMa04与三疣梭子蟹的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重性状极显著关联。
SSR标记不同基因型在渤海三疣梭子蟹不同表型中的多重比较中(表3)，标记ZL05的BC和CC基因型个体的全甲宽与CD基因型个体全甲宽差异显著，而BC和CC基因型个体全甲宽差异不显著；全甲宽均值大小依次为CC>BC>CD，说明等位基因B和C优于等位基因D，对全甲宽生长性状具有正向效应(即促进性状生长)。
在标记PrMa01中，就甲宽和背甲长2个生长性状而言，CC基因型个体的均值显著大于CE基因型，背甲底宽和背甲长分别相差3.902mm、6.324mm，推测等位基因C对背甲底宽和背甲长的正向效应优于等位基因E。所以标记PrMa01可作为以背甲底宽和背甲长2个生长性状为选育目标的有效分子标记。
在标记PrMa03中，就全甲宽、背甲底宽、体高和体重而言，FF基因型个体的均值与EF和FG基因型个体的均值有显著差异，FF基因型个体的全甲宽、背甲底宽、体高和体重均值均小于EF和FG基因型个体，而EF和FG基因型个体间差异不显著，说明等位基因E和G对全甲宽、背甲底宽、体高和体重起促进作用，而等位基因F对全甲宽、背甲底宽、体高和体重有负效应。又由于标记PrMa03与背甲长、螯肢掌节长和螯肢长节长关联显著，所以可将PrMa03作为三疣梭子蟹全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重7个重要生长性状为选育目标的有效分子标记。
在标记PrMa034中，DE基因型个体的全甲宽和体高显著大于DD和DF基因型，而DD和DF基因型个体之间的全甲宽和体高无显著差异，推测等位基因D对全甲宽和体高的正向效应(即促进生长)最大，其次是等位基因D和F，故推测DE基因型个体可能是三疣梭子蟹以全甲宽和体高为可靠选育指标的理想亲本。
利用筛选的SSR标记与黄、东海三疣梭子蟹7个生长性状关联分析中，发现上述4个SSR标记与黄海、东海三疣梭子蟹7个生长性状无显著关联(表4)。因此可将ZL05、PrMa01、PrMa03和PrMa04这4个SSR标记作为渤海三疣梭子蟹的原种标记。
表2 4个SSR标记与渤海三疣梭子蟹各生长性状之间的关联性
标记 全甲宽 背甲底宽 背甲长 螯肢掌节长 螯肢长节长 体高 体重
ZL05 0.027* 0.097 0.172 0.338 0.468 0.082 0.301
PrMa01 0.00** 0.00** 0.00** 0.00** 0.00** 0.00** 0.00**
PrMa03 0.00** 0.00** 0.00** 0.00** 0.00** 0.00** 0.00**
PrMa04 0.00** 0.00** 0.00** 0.00** 0.00** 0.00** 0.00**
*表示标记与性状显著关联(P<0.05)；**表示标记与性状极显著关联(P<0.01)。
表3 4个SSR标记不同基因型在渤海三疣梭子蟹不同表型中的多重比较
表3 4个SSR标记不同基因型在渤海三疣梭子蟹不同表型中的多重比较(续)
注：同一行不同字母表示差异显著(P<0.05)。
表4 4个SSR标记与黄、东海三疣梭子蟹各生长性状之间的关联性
对渤海三疣梭子蟹原种进行标记时，若采用原种标记ZL05能够扩增AB(156bp，160bp)、AC(156bp，168bp)、BB(160bp，160bp)、BC(160bp，168bp)、CC(168bp，168bp)和CD(168bp，174bp)基因型，表明待测样品为与基因型AB、AC、BB、BC、CC和CD相关联的全甲宽较优的三疣梭子蟹原种。
若采用原种标记PrMa01能够扩增AA(118bp，118bp)、AB(118bp，126bp)、BC(126bp、134bp)、CC(134bp，134bp)、CE(134bp，150bp)和EE(150bp，150bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、AB、BC、CC、CE和EE相关联的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹原种。
若采用原种标记PrMa03能够扩增出AA(126bp，126bp)、CC(152bp，152bp)、CE(152bp，160bp)、CF(152bp，172bp)、CG(152bp，190bp)、EE(160bp，160bp)、EF(160bp，172bp)、EG
(160bp，190bp)、FF(172bp，172bp)、FG(172bp，190bp)和GG(190bp，190bp)基因型，表明待测样品为与基因型AA、CC、CE、CF、CG、EE、EF、EG、FF、FG和GG相关联的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹原种。
若采用原种标记PrMa04能够扩增出AB(113bp，119bp)、AC(113bp，131bp)、BB(119bp，119bp)、BC(119bp，131bp)、CC(131bp，131bp)、DD(153bp，153bp)、DE(153bp，177bp)、DF(153bp，189bp)和EE(177bp，177bp)基因型，表明待测样品为与基因型AB、AC、BB、BC、CC、DD、DE、DF和EE相关联的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重均较优的三疣梭子蟹原种。
序列表
<110> 河北大学
<120> 渤海三疣梭子蟹原种的微卫星标记、其引物及应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 163
<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
<400> 1
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ctcaacactc agtctccacc tcaccaacgc actgatacag ggt 163
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<212> DNA
<213> 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)
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tgtgggattg c 131
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 5
agaatgttgc catggctgga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 6
accctgtatc agtgcgttgg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 7
ccttgcctcg tcagtgtcat 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 8
tggctgtaga caccctccat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 9
cttgattgcc tctcgcttgt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 10
gggggagagg gagagaatgt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 11
tcctggacct tgttcagtcc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial series)
<400> 12
gcaatcccac acacactcct 20

Claims (6)

1.一种渤海三疣梭子蟹原种的微卫星标记，其特征在于，包括：
微卫星标记ZL05，其序列如SEQ ID NO.1所示；
微卫星标记PrMa01，其序列如SEQ ID NO.2所示；
微卫星标记PrMa03，其序列如SEQ ID NO.3所示；
微卫星标记PrMa04，其序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的微卫星标记，其特征在于，所述微卫星标记ZL05与渤海三疣梭子蟹的全甲宽性状相关联；所述微卫星标记PrMa01、PrMa03、PrMa04均与渤海三疣梭子蟹的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重性状相关联。
3.一种权利要求1所述的渤海三疣梭子蟹原种微卫星标记的引物，其特征在于，包括4对引物，分别为：
ZL05F：序列如SEQ ID NO.5所示，ZL05R：序列如SEQ ID NO.6所示；
PrMa01F：序列如SEQ ID NO.7所示，PrMa01R：序列如SEQ ID NO.8所示；
PrMa03F：序列如SEQ ID NO.9所示，PrMa03R：序列如SEQ ID NO.10所示；
PrMa04F：序列如SEQ ID NO.11所示，PrMa04R：序列如SEQ ID NO.12所示。
4.一种权利要求1或2所述的微卫星标记在渤海三疣梭子蟹生长性状关联分析中的应用，其特征在于，所述微卫星标记ZL05与三疣梭子蟹的全甲宽性状相关联；所述微卫星标记PrMa01、PrMa03、PrMa04均与三疣梭子蟹的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重性状相关联。
5.一种权利要求3所述的渤海三疣梭子蟹原种微卫星标记的引物在渤海三疣梭子蟹生长性状关联分析中的应用，其特征在于，所述微卫星标记ZL05与三疣梭子蟹的全甲宽性状相关联；所述微卫星标记PrMa01、PrMa03、PrMa04均与三疣梭子蟹的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重性状相关联。
6.一种权利要求1所述的微卫星标记或权利要求3所述的引物在渤海三疣梭子蟹的原种鉴别、保育中的应用，其特征在于，所述微卫星标记ZL05与三疣梭子蟹的全甲宽性状相关联；所述微卫星标记PrMa01、PrMa03、PrMa04均与三疣梭子蟹的全甲宽、背甲底宽、背甲长、螯肢掌节长、螯肢长节长、体高和体重性状相关联。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110438242A (zh) * 2019-07-31 2019-11-12 河北大学 一种三疣梭子蟹微卫星标记的引物及其应用
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