KR20120088400A

KR20120088400A - 녹두에서 바구미 저항성 연관 분자표지 개발 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20120088400A
Application number: KR1020110009732A
Authority: KR
Inventors: 김율호; 박향미; 최만수; 정진교; 문중경; 서민정; 이석기; 윤홍태; 김욱한
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청장)
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2012-08-08
Also published as: KR101219546B1

Abstract

본 발명은 바구미 저항성 녹두를 판별할 수 있는 분자표지에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서열번호 1 내지 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 바구미 저항성 녹두 판별용 프라이머쌍, 이를 이용한 판별 방법 및 판별용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 분자마커를 이용하는 경우, 바구미 저항성 녹두 품종을 정확하게 판별할 수 있으며, 교배 육종 과정에서 쉽게 바구미 저항성 녹두를 판별할 수 있어 효율성이 향상되며, 품종을 개량하는데 있어서 육성세대를 단축하는 효과를 제공할 수 있다.

Description

녹두에서 바구미 저항성 연관 분자표지 개발 및 이의 용도 {Development of grain weevils resistive molecular markers in mung beans and uses thereof}

본 발명은 녹두에서 바구미 저항성을 판별할 수 있는 분자마커, 상기 분자마커를 이용하여 바구미 저항성 녹두를 판별하는 방법 및 상기 분자마커를 포함하는 바구미 저항성 녹두 판별용 키트에 관한 것이다.

녹두는 아시아지역의 중요한 두과작물로서 다양한 작부체계에 활용되고 있다. 녹두 종자는 단백질과 아미노산이 풍부하여 인간에게 필요한 단백질의 주요 공급원이며, 또한 녹두 꼬투리와 숙주나물에는 비타민과 미량 영양소가 다량 함유되어 있어 채소로도 많이 활용되고 있다.

저장 해충인 바구미는 녹두를 포함한 두과작물에 피해를 주어 농민, 상인 그리고 소비자에게 큰 경제적 손실을 주고 있으며, 바구미로 인한 피해액은 중미지역에서 35%, 남미지역 7-13%, 케냐에서는 무려 73%에 이르는 것으로 추정되고 있다(C. Somat 등, 2008).

녹두에 가장 큰 피해를 주는 바구미는 팥바구미(Callosobruchus chinensis)와 동부바구미(C. maculatus) 등이 있으며, 바구미 감염은 포장에서 1차로 이루어지고 저장기간 동안 2차 감염이 일어나 심각한 피해를 주게 된다. 피해를 받은 종자는 상업적 이용이 힘들기 때문에, 현재 바구미 방제를 위해 화학적인 방법이 주로 사용되고 있다. 하지만 경제적 환경적인 부담으로 인해, 저항성 품종을 개발하려는 노력이 꾸준히 진행되어져 왔다.

바구미 저항성 유전자원으로는 야생종(V. radiata spp. sublobata)인 TC1966이 있으며, 팥바구미 등 3종의 바구미에 완전한 저항성을 보이는 것으로 보고되었다(Fujii와 Miyazaki, 1987). 또한, 저항성이 단일 우성유전자(Br)에 의해 발현되는 것으로 밝혀졌다(Kitamura와 Ishimoto, 1988). 지금까지 많은 바구미 저항성 계통이 TC1966을 사용하여 개발되었으나 야생종의 불량형질이 연관되어 유전되는 문제점(Watanasit와 Pichitporn, 1996)과 개발된 저항성 계통을 식이한 실험쥐에서 생체성분 변화가 심하게 일어났다는 보고(Miura 등, 1996) 등으로 인해 재배종에서 바구미 저항성을 찾아야할 필요성이 대두되었다.

Talekar와 Lin(1992)은 1,000 AVRDC 녹두유전자원에서 팥바구미에 저항성을 보이는 V2709(인도 재래종)와 V2802(필리핀 재래종) 등 2개의 재래종(V. radiata spp. radiata) 자원을 선발하여, 저항성이 자엽에 있는 항생성(antibiosis) 물질에 의해 나타남을 보고하였다. 국내육성 품종인 장안녹두는 V2709 유래의 저항성유전자를 도입하여 개발된 바구미저항성 품종이다.

바구미저항성 유전자(Br)는 Young 등(1992)에 의해 녹두연관군 지도 9번에 위치하고 RFLP marker pR26과 sgA882간 13cM의 거리에 있음을 보고하였다. 또한 Kaga와 Ishimoto(1998)는 고밀도 지도 작성을 통해 Br 유전자와 0.6cM에 분자표지를 선발하였다. Sun lei 등(2008)은 V2709의 바구미저항성 유전자는 단일우성유전자(Br2)이며 11.0, 5.8cM에 위치한 2종의 분자표지를 선발하였다.

이에, 본 발명자들은 정확하면서도 간편하게 바구미 저항성 녹두를 판별할 수 있는 분자마커를 개발하고자 연구, 노력한 결과, V2709 유래의 바구미 저항성 품종인 장안녹두(Vigna radiata (L) Wilczeck var Jangannogdu)를 대상으로 유전자 지도를 작성하고 8종의 근접 분자표지를 작성함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 바구미 저항성 녹두 판별용 분자마커를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 상기 분자마커의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 바구미 저항성 식물체의 검출 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

또한 본 발명은 상기 분자마커를 이용한 DNA 증폭을 통해 바구미 저항성 녹두를 판별하는 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

마지막으로 본 발명은 상기 분자마커를 이용한 바구미 저항성 녹두 판별용 키트를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 바구미 저항성 녹두 판별용 프라이머쌍을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 프라이머쌍의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 바구미 저항성 식물체의 검출 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 판별하고자 하는 녹두 시료의 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 DNA를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 산물을 전기영동에 의해 분석하는 단계를 포함하는 바구미 저항성 녹두 판별 방법을 제공한다.

마지막으로 본 발명은 상기 분자마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 바구미 저항성 녹두 판별용 키트를 제공한다.

본 발명에 따라 개발된 분자표지를 적용하여 바구미 저항성 계통을 선발하는 경우 선발 효율이 매우 우수하며, 우수 품종에 바구미 저항성 유전자를 신속, 정확하게 도입할 수 있어 육종에 소요되는 비용과 기간을 획기적으로 단축할 수 있다. 또한 바구미 생물 검정에 소요되는 노력 및 비용을 절감할 수 있을 것으로 예측된다.

도 1은 장안녹두(JA)와 선화녹두(SH)의 팥바구미 피해 정도를 나타낸 사진이다(접종 전(a), 접종 후(b), 장안녹두에서 유충이 성장하지 못하고 죽은 모습(C) 및 피해율(d)).
도 2는 장안녹두에서 바구미저항성 유전자 근접 고밀도 유전자 지도를 나타낸 그림이다.
도 3은 선화녹두/장안녹두 분리 집단에서 저항성 계통 9개(a)와 이병성 9계통(b)을 대상으로 팥바구미 생물검정 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 선화녹두/장안녹두 분리 집단에서 저항성 계통 9개와 이병성 9계통을 대상으로 분자표지를 적용한 결과이다(분자표지 RP-cm(A), 분자표지 BM#105-1(B), 분자표지 OPW02a-m(C). 모본(P1), 부본(P2)).
도 5는 국내 녹두 9개 품종의 팥바구미 생물 검정 결과이다.
도 6은 국내 녹두 9개 품종을 대상으로 분자표지를 적용한 결과이다(분자표지 RP-cm(A), 분자표지 BM#105-1(B), 분자표지 OPW02a-m(C)).
도 7은 팥바구미 저항성인 3종의 유전자원에 개발된 분자표지를 적용하고 이용 가능성을 평가한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 녹두에서 바구미 저항성을 판별할 수 있는 분자표지를 제공하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 녹두에서 바구미 저항성을 판별할 수 있는 서열번호 1 내지 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 프라이머쌍을 제공한다. 본 발명의 상기 프라이머쌍은 녹두의 바구미 저항성 유전자(Br)와 상당히 근접하여 위치하므로, 상기 프라이머쌍을 이용함으로써 녹두의 바구미 저항성 유무를 파악할 수 있다.

바람직하게 본 발명은 상기 서열번호 중에서 선택되는 일련의 염기서열을 포함하는 바구미 저항성 녹두 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 프라이머쌍은 SCAR#8(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), SCAR#14(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), RP-cm(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), BM#105-1(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), OPW02a-m(서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), 6H21-22(서열번호 11과 13 및 서열변호 12와 13로 표시되는 프라이머쌍), SCAR#12(서열번호 14와 15로 표시되는 프라이머쌍) 및 SCAR#4(서열번호 16과 17로 표시되는 프라이머쌍)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 조합을 포함한다. 바람직하게는 상기 조합을 3개 이상, 보다 바람직하게는 6개 이상, 가장 바람직하게는 8개 이상 포함하는 것이 보다 정확한 판별을 위해 좋다.

또한 본 발명의 프라이머는 바구미 저항성 형질에 연관된 다형성 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 부가, 결실 또는 치환될 수 있다.

본 발명의 분자표지는 바구미 저항성 식물체의 검출에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 프라이머의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 바구미 저항성 식물체의 검출 방법을 제공한다.

상기 방법은 제한되는 않으나, RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같은 당업계에 공지된 다양한 DNA 다형성 분석 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 프라이머쌍을 이용하여 바구미 저항성 녹두를 판별하는 방법을 제공한다. 구체적으로 상기 바구미 저항성 녹두 판별 방법은 하기의 단계를 포함하여 수행될 수 있다:

(a) 판별하고자 하는 녹두 시료의 DNA를 추출하는 단계;

(b) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 DNA를 증폭하는 단계; 및

(c) 상기 증폭된 산물을 전기영동에 의해 분석하는 단계.

본 발명에 따른 바구미 저항성 녹두 판별 방법에서, 상기 (a)의 녹두 시료로부터 DNA를 추출하는 단계는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있다.

상기 (b)단계에서 사용되는 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 염기서열을 사용할 수 있으며, 또는 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 13, 서열변호 12와 13, 서열번호 14와 15 및 서열번호 16과 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 조합을 사용할 수 있고, 상기 프라이머쌍을 사용하여 나타난 결과를 조합하면 보다 정확하게 바구미 저항성 녹두를 판별할 수 있다.

상기 (b)단계에서 DNA의 증폭은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, PCR(Polymerase Chain Reaction), 리가아제 체인 반응, 중합효소 리가아제 체인 반응, Gap-LCR, 리페어체인 반응, 3SR, NASBA 등을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 PCR을 이용한다.

상기 PCR을 이용하여 증폭하는 경우, 당업계에서 PCR 반응에 필요한 것으로 공지된 성분들을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액은 녹두에서 추출된 DNA와 본 발명에 따른 프라이머쌍, DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물 등을 포함하고, 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl₂, KCl 등을 포함할 수 있다.

상기 (c)단계는 증폭된 DNA 산물을 전기영동에 의해 분석하는 단계이다. 상기 전기영동에 의한 분석 단계에서 증폭된 DNA 산물을 아가로오스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하고, EtBr 등으로 염색한 후 밴드를 확인할 수 있다. 증폭된 DNA 산물을 확인하기 위한 전기영동 및 밴드의 확인은 당업계에서 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 바구미 저항성 녹두 판별용 키트를 제공하며, 상기 키트는 DNA 중합효소 및 PCR 반응용 완충용액을 추가적으로 포함할 수 있다. 각각의 프라이머쌍을 이용하여 나타난 결과를 조합하면 보다 정확하게 바구미 저항성 녹두를 판별할 수 있어 바람직하다.

본 발명에 따른 바구미 저항성 녹두 판별용 키트에서 상기 DNA 중합효소는 예를 들어, Taq DNA 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소가 사용될 수 있으며, 상기 PCR 반응용 완충용액은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 공지된 조성을 가지며, 예를 들어, Tris-HCl, MgCl₂, KCl 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 바구미 저항성 녹두 판별용 키트는 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동에 필요한 성분들을 추가로 더 포함할 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 선화녹두와 장안녹두의 팥바구미 저항성 평가

이병성 품종인 선화녹두와 저항성 품종인 장안녹두를 대상으로 팥바구미에 대한 피해 양상을 조사하였을 때, 종자당 평균 산란수는 선화녹두에서 5.43 개, 장안녹두에서는 2.33 개로 이병성 품종인 선화녹두에서 산란수가 많았으며, 선화녹두에서 평균 피해 구멍수는 2.83 개, 우화수는 28.33 개, 우화율은 52.7 %이었으나 장안녹두에서는 피해가 전혀 없는 것으로 조사되었다(표 2).

또한, 선화녹두에서는 모든 종자에서 피해 구멍이 관찰되어 피해율이 100 %였으나, 장안녹두에는 피해 구멍이 없고, 종자를 절단하여 보았을 때 유충이 성장하지 못하고 죽는 것이 관찰되었다. 따라서 장안녹두의 저항성이 항생성에 의해 나타나는 것으로 확인되었다(도 1).

선화녹두와 장안녹두 종자의 팥바구미 피해 양상
품종	반복	종자당 평균산란수 (개)	종자당 평균피해 구멍수 (개)	우화수 (개)	우화율 (%)
선화녹두 (이병성)	A	5.20±1.62	2.30±1.16	24	46.2
	B	6.50±2.46	3.70±1.06	35	53.8
	C	4.60±0.97	2.50±1.18	26	56.5
	평균	5.43±0.97	2.83±0.76	28.33±5.86	52.17±5.38
장안녹두 (저항성)	A	1.90±0.74	0	0	0
	B	2.80±1.23	0	0	0
	C	2.30±0.48	0	0	0
	평균	2.33±0.45	0	0	0

실시예 2: 선화녹두 / 장안녹두 집단을 이용한 유전양상 구명

선화녹두/장안녹두를 교배하여 교배된 F1종자를 파종하여 자가수분시켜 F2 집단을 만들고, 상기 F2집단을 대상으로 팥바구미 저항성유전자의 분리비를 조사하였을 때, 장안녹두 유전형 개체가 115 개, 헤테로(hetero)인 이형접한 개체가 179 개, 선화녹두 유전형 개체가 112 개인 것으로 조사되었다. 분리비는 1 : 2 : 1로 단일우성 유전자에 의해 저항성이 발현되는 것으로 확인되었다.

선화녹두 / 장안녹두 F2 집단에서 바구미저항성유전자(Br)의 분리
유전자좌	장안녹두 유전형 개체 ( RR )	이형접합 개체 ( Rr )	선화녹두 유전형개체 ( rr )	총 개체수	분리비	X ²	P
바구미저항성 (Br)	115	179	112	406	1:2:1	5.72	0.057

실시예 3: 바구미저항성 근접 고밀도 유전자지도 작성

바구미저항성 유전자와 연관된 근접 고밀도 유전자 지도를 작성하기 위해, BM#105-1 등 새로운 분자표지 8종(표 1 및 도 2)을 하기 방법을 통해 개발하였다.

(1) 식물체로부터의 DNA 분리

전체 유전자를 분리하기 위해서 1.5㎖ 마이크로튜브(microtube)에 손톱 크기 정도의 샘플(약 0.5g)과 텅스텐 비드(tungsten bead), DNA 추출 버퍼(0.5M NaCl, 0.5% SDS, 50mM EDTA, 0.1M Tris-Cl) 400㎕와 2-머캅토에탄올 4 ㎕를 넣고, 퀴아젠(Qiagen)사의 분쇄기계(grinding machine)를 이용하여 곱게 갈아준 후, 10분에 한번씩 샘플을 흔들어 주면서 65℃에서 1시간동안 식물세포를 용해시켰다. 자석을 이용해 튜브에서 텅스텐 비드를 제거한 후, 5M 초산칼륨(KOAc) 130㎕를 넣고 가볍게 섞어준 다음 4℃에 10분간 방치하였다. 클로로포름:아이소아밀알콜 (Chloroform:isoamylalchol=24:1)용액을 400㎕ 첨가한 다음 실온에서 10분 동안 흔들어 준 뒤, 13,000rpm으로 10분간 원심분리 후, 상층액 100㎕를 새로운 마이크로튜브(microtube)로 옮겼다. 이소프로판올(isopropanol) 100㎕를 넣고 섞어주고 실온에 10분 정도 방치한 후, 13,000rpm에서 2분 원심분리 하였다. 침전물만 남기고 상층액을 모두 버린 후 70% 에탄올(ethanol) 1㎖를 넣고 잘 흔들어준 후, 에탄올을 제거하고 침전물을 건조시켰다. 이렇게 분리한 DNA는 리보핵산분해효소(RNase)가 들어있는 3차 증류수 200㎕에 잘 녹인 후, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 주형 DNA로 이용하였다.

(2) 바구미 저항성 연관 프라이머의 선발

저항성과 연관된 표지를 선발하기 위해, 오페론 테크놀러지(Operon Technology)사에서 구입한 10-mer 랜덤 프라이머(random primer) 720 조합, 다범위핵산 프라이머(universal rice primer, URP) 12 조합을 이용하여 BSARAPD 방법으로 실험을 수행하였다. RAPD 분석을 위한 중합효소 연쇄반응 조건은 제넷바이오사의 DNA 중합효소 Prime Taq Polymerase 0.5U에 10ng의 DNA를 주형, 25pmol 프라이머를 첨가하여 최종 부피를 20㎕로 하였다. 이 반응용액을 94℃에서 5분간 가열하여 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 37℃에서 30초, 72℃에서 2분간 45회 반복 수행한 후, 72℃에서 10분간 최종 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 증폭된 산물을 1.5% 아가로오스 겔(agarose gel)에 전기영동하여 반응산물을 확인하였다.

다범위핵산 프라이머 조합을 이용한 반응의 경우, 모든 조건은 RAPD 분석 조건과 동일하지만, PCR 반응의 온도 조건만 변형하여 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분으로 35회 반복 수행하였다.

실험 결과 PCR 증폭산물 중에 저항성 bulk DNA와 이병성 bulk DNA에서 차이를 보이는 9개의 프라이머 조합을 선발하였고, 이들 프라이머가 재현성 있게 차이를 나타내는지를 확인하기 위해 국내 품종 7개를 통해 2차적으로 확인한 결과 재현성이 있는 것으로 나타났다.

(3) 저항성과 연관된 것으로 추정되는 DNA 단편의 SCAR 혹은 CAPS 표지로 전환

병 저항성과 연관된 것으로 판명된 상기 RAPD 표지는 PCR 조건에 따라 안정적으로 나타나지 않을 수 있어 품종 육성을 위한 선발표지로 바로 이용하는데 있어 어려움이 발생한다. 이를 극복하기 위해 분석이 간편한 DNA 표지로 전환하고자 저항성 혹은 이병성과 연관된 것으로 추정되는 DNA 단편을 클로닝하여 염기서열을 분석한 후, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성하여 분석이 간편하고 재현성과 신뢰도가 높은 SCAR(sequence characterized amplified region) 표지 혹은 CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 표지로 전환하고자 하였다. 저항성 유전자와 비교적 가까이 연관된 것으로 추정되는 분자표지인 RP-cm, BM#105-1 및 OPW02a-m에 의해 증폭된 DNA 단편을 아가로오스 겔에서 회수하여 TOPO-TA 벡터(Invitrogen사)에 라이게이션(ligation) 하였고, 대장균(DH5α)에 형질전환 하였다. 형질전환된 대장균을 카나마이신(kanamycin), X-gal 각각 50㎍/㎖ 함유된 배지에서 12시간 배양하여 형질전환체를 선발하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드를 EcoRI으로 절단하고 1.5% 아가로오스 겔에서 전기영동을 실시하여 예상되는 크기의 DNA단편이 클로닝된 재조합 클론을 확보하였고, 이들의 염기서열을 분석하여 바구미 저항성과 연관된 것으로 추정되는 DNA 단편의 염기서열을 구하였으며, 상기 서열을 기초로 작성한 프라이머는 상기한 표 1과 같다.

이중에서 공우성 분자표지가 7개, 우성 분자표지가 1개이며, 공우성 분자표지는 호모(homo)와 헤테로 유전자형을 구분하기가 용이하여 저항성 계통선발에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 바구미저항성 유전자와 1cM 거리에 있는 분자표지는 모두 4종으로 특히 RP-cm, BM#105-1, OPW02a-m 등의 분자표지는 저항성 유전자와 매우 가깝게 연관되어 있어 선화녹두/장안녹두 집단에 적용하였을 때, 저항성 표현형과 거의 일치하는 것으로 조사되었다(표 4). 따라서 이들 분자표지는 바구미저항성 품종 개발에 매우 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 평가되었다.

선화녹두 / 장안녹두 분리 집단에서 분자표지 적용결과
분자표지	장안녹두 유전형 개체 ( RR )	이형접합 개체 ( Rr )	선화녹두 유전형개체 ( rr )	총 개체수
SCAR#8	109	180	117	406
SCAR#14	113	180	113	406
RP-cm	116	178	112	406
BM#105-1	292(RR, Rr)		114	406
OPW02a-m	116	176	114	406
6H21-22	113	178	115	406
SCAR#12	115	177	114	406
SCAR#4	114	178	114	406

실시예 4: 개발된 3종의 분자표지의 이용가능성 평가

선화녹두/장안녹두 집단에서 저항성 계통 9개와 이병성 9계통을 대상(도 3)으로 개발된 RP-cm, BM#105-1, OPW02a-m 등 3종의 분자표지를 적용하였을 때, 모든 분자표지에서 저항성과 이병성 표현형을 정확히 구별하여 개발된 분자표지가 매우 효과적으로 사용될 수 있음이 확인되었다(도 4).

또한, 국내에서 개발된 녹두 9개 품종을 대상으로 바구미 저항성을 평가하였을 때, 모든 품종에서 바구미로 인한 피해 구멍이 관찰되어 국내에서 육성된 저항성 품종은 장안녹두가 유일한 것으로 조사되었다(도 5). 개발된 RP-cm, BM#105-1, OPW02a-m 등 3종의 분자표지를 적용하였을 때, 국내육성 9개 품종은 선화녹두와 같은 이병성 분자표지형을 나타내어 생물검정에서의 표현형과 정확히 일치하였다. 이러한 결과는 개발된 분자표지가 저항성 품종 개발에 효과적으로 적용될 수 있음을 나타낸다(도 6).

실시예 5: 3종의 다른 저항성 유전자원에 개발된 분자표지의 적용 가능성 평가

V2709(V. radiata spp . radiata, 인도 재래종), V2802(V. radiata spp . radiata, 필리핀 재래종), TC1966(V. radiata spp . sublobata) 등 3종의 저항성 유전자원에 본 발명에서 개발된 8종의 분자표지를 적용하였을 때, V2709 품종(장안녹두에 사용된 품종)의 경우, 장안녹두와 일치하는 결과를 나타내었다(도 7). 또한 V2802의 경우, SCAR#8, SCAR#14, RP-cm 등 3종의 분자표지에서 적용 가능성을 보였으며, TC1966의 경우, SCAR#8, SCAR#14, RP-cm, BM#105-1, 6H21-22, SCAR#12 및 SCAR#4 등 7종의 분자표지에서 이병성 품종인 선화녹두와 차별성을 보여 저항성 품종 개발에 사용 가능한 것으로 나타났다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Development of grain weevils resistive molecular markers in mung beans and uses thereof <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of SCAR#8 <400> 1 gcggtcagca cagaatttac tcatt 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of SCAR#8 <400> 2 cagcacacta acgatacatt tgaca 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of SCAR#14 <400> 3 tggcacaatg ataatgcata gaagg 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of SCAR#14 <400> 4 ttctgatttg ctttccagta gcac 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of RP-cm <400> 5 ggtgatactg atggctgctc agg 23 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of RP-cm <400> 6 gtgacaaagt ctaccatgga ttctactga 29 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of BM#105-1 <400> 7 tgtattgttt ctatgcgggt c 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of BM#105-1 <400> 8 ctgagcagcc atcagtatca cc 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of OPW02a-m <400> 9 aggcagaagc aatagaggca tacc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of OPW02a-m <400> 10 gcaccatcca cctttcaagc taac 24 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of 6H21-22 <400> 11 caccatagca ttgatcattt tttga 25 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of 6H21-22 <400> 12 cattgggaat tacagtttcc tt 22 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of 6H21-22 <400> 13 tcacataact cgaggaggga ttag 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of SCAR#12 <400> 14 cctttgcggc attttgaagg taat 24 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of SCAR#12 <400> 15 gatacttggt ggtggtgatc tcg 23 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of SCAR#4 <400> 16 tccgtgtgtt cacagcactg atag 24 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of SCAR#4 <400> 17 gctgggacca aggaccacaa 20

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 바구미 저항성 녹두 판별용 프라이머쌍.
서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 13, 서열변호 12와 13, 서열번호 14와 15 및 서열번호 16과 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 조합으로 이루어진 것을 특징으로 하는 바구미 저항성 녹두 판별용 프라이머쌍.
제 1 항 또는 제 2 항의 프라이머쌍의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 바구미 저항성 식물체의 검출 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 분석은 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 및 PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 바구미 저항성 식물체의 검출 방법.
(a) 판별하고자 하는 녹두 시료의 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 제 1 항 또는 제 2 항의 프라이머쌍을 이용하여 DNA를 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 산물을 전기영동에 의해 분석하는 단계
를 포함하는 바구미 저항성 녹두 판별 방법.
청구항 제 1 항 또는 제 2 항의 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 바구미 저항성 녹두 판별용 키트.