CN110317882B

CN110317882B - 中华鳖微卫星标记、其引物及应用

Info

Publication number: CN110317882B
Application number: CN201910657363.5A
Authority: CN
Inventors: 管越强; 刘文婷; 乔艳珍; 张耀红; 康现江; 孟改青
Original assignee: Hebei University
Current assignee: Hebei University
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: CN110317882A

Abstract

本发明提供了一种中华鳖微卫星标记、其引物及应用，包括6个微卫星标记，分别为sp601、sp603、sp604、sp610、sp316、mitf；其中，sp601为SEQ ID NO.1所示的DNA序列或其互补序列；sp603为SEQ ID NO.2所示的DNA序列或其互补序列；sp604为SEQ ID NO.3所示的DNA序列或其互补序列；sp610为SEQ ID NO.4所示的DNA序列或其互补序列；sp316为SEQ ID NO.5所示的DNA序列或其互补序列；mitf为SEQ ID NO.6所示的DNA序列或其互补序列。发明提供的微卫星引物具有PCR扩增结果稳定、多态性高等特点，可用这些分子标记进行遗传多样性分析、群体遗传结构分析、遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定等，具有很好的应用价值。

Description

中华鳖微卫星标记、其引物及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学DNA标记领域，具体涉及一种中华鳖微卫星标记、其引物及应用。

背景技术

生物遗传多样性的研究经历过形态学水平、细胞学水平、生化水平再到当今的分子水平。与前三者相比，分子水平遗传多样性标记优点在于：1)多态性丰富；2)数量大；3)不受外界环境等因素限制，同时也可在不同组织的不同发育阶段中检测到。

分子标记直接反映遗传变异形式，且所反映的遗传变异种类丰富，受环境影响较少，且分子标记检测有着良好的重复性。继形态学标记、细胞标记、生化标记和免疫学标记之后，得到了迅速发展。因此，被广泛应用在基因定位和遗传育种等方面。

微卫星标记技术(microsatellite)，又称为简单序列重复(Simple SequenceRepeats,SSR)，是以重复单位(1-6bp的核苷酸)首尾相连，均匀分布在整个生物基因组中^[19]。其原理是SSR位点两端侧翼序列保守性高，因微卫星本身基序和重复次数都不同，进行PCR扩增时形成微卫星位点多态性，可用于遗传学分析。微卫星标记的优点是基因组上SSR片段分布广泛、对模板质量要求低、共显性遗传；且较保守，容易检测。

中华鳖(Pelodiscus sinensis)隶属爬行纲(Reptilia)、龟鳖目(Testudinata)、鳖科(Trionychidae)、鳖属(Pelodiscus)，自然分布于中国、日本、越南北部、韩国、俄罗斯东部，也被引入泰国、马来西亚、美国夏威夷等地。在我国，除新疆、西藏和青海外其余各省均产中华鳖。由于其独特的食用价值和药用价值，成为我国重要的特种水产经济动物。目前我国中华鳖的养殖品系较多，不同品系的稚鳖形态差异不大，鳖卵更是难以区分，但不同品系的养殖特性差异较大，因此市面上经常出现以次充好的现象，造成严重的种质混杂，导致性状退化，此外人为引种导致病害频发，品质下降。因此，保护中华鳖种质的工作迫在眉睫，遗传多样性的评价在中华鳖种质的保护工作中占有重要地位。

发明内容

本发明的目的就是提供一种中华鳖微卫星标记、其引物及应用，以为中华鳖分子标记辅助育种提供有效的工具。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种中华鳖微卫星标记，包括6个微卫星标记，分别为sp601、sp603、sp604、sp610、sp316、mitf；其中，

sp601为SEQ ID NO.1所示的DNA序列或其互补序列，其微卫星重复序列为(CTTTTC)8；

sp603为SEQ ID NO.2所示的DNA序列或其互补序列，其微卫星重复序列为(TATCTC)7；

sp604为SEQ ID NO.3所示的DNA序列或其互补序列，其微卫星重复序列为(TTTCTT)9；

sp610为SEQ ID NO.4所示的DNA序列或其互补序列，其微卫星重复序列为(TTTCCT)10；

sp316为SEQ ID NO.5所示的DNA序列或其互补序列，其微卫星重复序列为(CTT)15；

mitf为SEQ ID NO.6所示的DNA序列或其互补序列，其微卫星重复序列为(ACAA)12。

一种中华鳖微卫星标记的引物，包括6对引物，分别为：

sp601F：序列如SEQ ID NO.7所示，sp601R：序列如SEQ ID NO.8所示；

sp603F：序列如SEQ ID NO.9所示，sp603R：序列如SEQ ID NO.10所示；

sp604F：序列如SEQ ID NO.11所示，sp604R：序列如SEQ ID NO.12所示；

sp610F：序列如SEQ ID NO.13所示，sp610R：序列如SEQ ID NO.14所示；

sp316F：序列如SEQ ID NO.15所示，sp316R：序列如SEQ ID NO.16所示；

mitf F：序列如SEQ ID NO.17所示，mitf R：序列如SEQ ID NO.18所示。

一种上述的微卫星标记或引物在中华鳖的群体遗传结构分析中的应用。

本发明提供的微卫星引物具有PCR扩增结果稳定、多态性高等特点，可用这些分子标记进行遗传多样性分析、群体遗传结构分析、遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等，具有很好的应用价值。

本申请中的SSR是基于中华鳖基因组数据，采用生物信息学技术手段获得的。首先是基于Linux系统下使用MISA 软件识别出转录组中所有的SSR,再采用Primer3批量设计引物，经过实验验证获得的特异性强的SSR引物。通过挖掘基因组数据可以得到中华鳖基因组数据中全部SSR。

附图说明

图1为基因组SSR二核苷酸分布情况。

图2为基因组SSR三核苷酸分布情况。

图3为所提取的中华鳖基因组DNA的琼脂糖电泳图。

图4为引物sp316温度梯度PCR扩增结果图。

图5为3个群体中引物sp316扩增的电泳图谱；其中，M：分子量标准；1-30：30个个体样本，分别取自3个群体。

图6为sp316引物在3种不同群体中PCR扩增毛细管电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。本发明选取河北阜平县正常体色中华鳖(FBP)、河北阜平县“永章黄金鳖”(FAP)、河北唐山县正常体色中华鳖(TBP)各30只鲜活样品。本发明实施例中未提到的试验条件和操作均按本领域常规方法进行。

实施例1微卫星引物的获取

(1)微卫星序列分析与获取

下载Ensembl数据库中中华鳖基因组数据(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-92/fasta/pelodiscus_sinensis/dna/)，采用MISA软件进行微卫星识别分析(misa.plgenome.fasta)，该软件指定特定参数，即1碱基重复10次及10次以上；即2碱基重复6次及6次以上；即3碱基重复3次及3次以上；即4碱基重复5次及5次以上；即5碱基重复5次及5次以上；即6碱基重复6次及6次以上，该重复类型的序列为微卫星序列。同时，两个微卫星之间的距离小于100bp时，两个微卫星组成一个复合微卫星。生成.misa和.statistics两个文件。.misa文件列出微卫星的类型和位点；.statistics文件统计微卫星的类型和频数。

在下载的中华鳖基因组中，序列总数为19904条，序列总长度为2.20×10⁹bp。按照查找标准，从其中共查找出4785条包含SSR的序列，其中共有3279条序列包含超过1个SSR。4785条序列中共含有497271个SSR。

从SSR数量上看，在所有497271个SSR中，出现最多的是单碱基SSR，有318 331个，占SSR总数的64.02％；其次是二碱基，有135 544个，占SSR总数的27.26％；出现最少的碱基为五碱基和六碱基，五碱基有4 286个，占SSR总数的0.86％，六碱基有1 233个，占SSR总数的0.25％，具体结果见表1所示。

表1：

从SSR基序组成上分析，单碱基SSR中，以多聚T和多聚A占比最多，分别有101 717条和100 755条，占该类SSR的31.95％和31.65％。二碱基SSR中以GT、AC基序最多，分别有21182条和20 412条，占该类SSR的15.63％和15.06％；其次为CA、TG、TC、GA，最少的为GC、CG，分别仅占该类SSR的0.39％和0.15％，具体如图1和图2所示。

(2)批量设计微卫星引物

利用primer3软件批量设计微卫星引物(misa_primer3.pl--CPU 40--p3_setting_filep3_settings_file newPs_genome.fa.misa newPs_genome.fa>SSR_primer3.out)。主要参数设置为：引物长度18-25bp为最适长度，PCR产物片段长度范围100-300bp，最适退火温度50-65℃。GC含量一般在40％-60％之间，尽量避免二级结构出现。在批量设计的微卫星引物中通过perlprimer软件筛选出50对稳定性及特异性强的引物，引物由金唯智有限公司(苏州)合成。

实施例2应用微卫星标记对中华鳖遗传结构进行分析

(1)DNA提取

实验用的中华鳖全部够买于河北省保定市阜平县中华鳖养殖场和河北省唐山县中华鳖养殖场。颈部放血处死，解剖其肌肉。参照《分子克隆实验指南》(Sambrook&Russell,2001)提供的酚-氯仿法抽提3个群体的中华鳖基因组总DNA。DNA的质量检测：取5μL基因组DNA用1％琼脂糖凝胶进行电泳，经GoldView染色、紫外凝胶成像系统成像后观察DNA是否降解及是否有蛋白质残留，。另外，将提取的DNA样品用NanoDrop 2000分光光度计测定其浓度，并以测得DNA浓度为参考，将DNA工作液统一稀释为50ng/μL。

本发明提取3个群体的中华鳖肌肉组织基因组DNA，采用琼脂糖电泳检测的质量，结果如图3所示。从图3可以看出，所提取的条带完整，可用于后续实验。

(2)PCR反应

选择10只中华鳖样品作为扩增模板，采用梯度PCR的方法(50-60℃；间隔1℃为一个梯度)确定PCR扩增的最佳扩增温度。然后对全部90个样品进行PCR分型检测。

PCR扩增产物一部分用8％的聚丙烯酰胺凝胶分离，经银染染色，并记录扩增结果。通过与pBR322DNA/Msp I marker分子量标准对比估算扩增片段大小范围。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率低，挑选出条带清晰、多态性丰富、稳定性和特异性强的引物，在不同引物上游5’端加FAM荧光标记，送金唯智公司重新合成，进行PCR扩增。PCR产物送公司(生工，上海)进行毛细管电泳检测。

PCR扩增体系如下：

PCR反应程序如下：

①琼脂糖电泳分析

以其中一对引物sp316为例，首先进行梯度PCR扩增，选取该微卫星的最佳扩增温度。sp316引物梯度扩增结果如图4所示。

②非变性聚丙烯酰胺电泳分析

图5显示了引物sp316在3个群体90个个体样本中8％非变性聚丙烯酰胺电泳图，从图中我们可以知道sp316引物多态性比例较高。

③毛细管电泳分析

将筛选的微卫星引物加上FAM荧光标记，再进行PCR扩增，之后将扩增产物送到生物公司，甲酰胺变性，ROX-500作参照分子量，使用ABI-3730XL测序仪进行分析检测。GeneMaper-3.2扫描峰图如图6所示，结果数据导入excel中，接着进行后续数据分析。

(3)遗传学分析

根据公司上机的结果确定基因型，利用Popgen32进行群体遗传分析，计算平均等位基因数(Number of Allele，Na)、平均观测杂合度(Observed Heterozygosity，Ho)和平均期望杂合度(Expected Heterozygosity，He)，用PIC-CALC软件对各微卫星位点的多态信息含量进行计算。

扩增后各个位点等位位点数及座位多态信息含量如表2所示，从6个引物扩增获得60个等位位点，平均等位基因(N_a)位点数9.3个，位点数介于6.667～13.667个，平均观察杂合度(H_o)为0.644～0.856，平均期望杂合度(H_e)为0.759～0.887，平均多态信息含量(PIC)为0.709～0.863，这些遗传参数表明中华鳖存在丰富的可供选育用的遗传多样性基础。

表2：

三个中华鳖群体的的遗传多样性统计如下表3所示，由表3我们可以看到3个群体的Ho、He和PIC数值上均符合FAP群体>FBP群体>TBP群体，且FBP群体和FAP群体等位基因数相等，但是比TBP群体要高。

表3：

群体	Na	Ho	He	PIC
					FBP	13	0.833	0.902	0.877
FAP	13	0.912	0.933	0.888
					TBP	11	0.7667	0.845	0.813
Mean	12.3	0.837	0.893	0.859

利用popgen3.2软件计算3个群体之间的遗传相似系数和无偏遗传距离，结果如表4所示，群体之间的遗传距离介于0.134-0.1955之间，其中TBP与FAP间的遗传距离最大，FBP和FAP之间的遗传距离最小。

表4：

注：对角线以下为遗传距离，对角线以上为相似性系数。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北大学

<120> 中华鳖微卫星标记、其引物及应用

<130> 19.06

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 211

<212> DNA

<213> Pelodiscus sinensis

<400> 1

gaaggaaggg acagagcgat aagacattgt agagaatagt gtgcattcat cttctccttt 60

gggaaccttg caaccaactt tcttttcctt ttccttttcc ttttcctttt ccttttcctt 120

ttccttttcc tttttctccc aaagaggaaa actatttttt tcaaagaatg taccttggaa 180

gattatggaa taatgggcaa tttgggatgg a 211

<210> 2

<211> 117

<212> DNA

<213> Pelodiscus sinensis

<400> 2

gacctagtcc tgccccttta aatctcatga actttagtgg caggatttta tatctctatc 60

tctatctcta tctctatctc tatctctatc tctatctatc acactcatgc tggatca 117

<210> 3

<211> 249

<212> DNA

<213> Pelodiscus sinensis

<400> 3

tgtgctcaat catcaagtta ccatatctag ccttcattca tataaagaca tctacagtgg 60

aaaatgaata gcagtttatc tttgtgggag gtttcttttt ctttttcttt ttctttttct 120

ttttcttttt ctttttcttt tctttatcag tatagttgta ccagtacacg ccatagcttg 180

ctttgcttcc caaactgtga taagatatac cactatgtgc aggtaggttc agaccttcca 240

acagcagag 249

<210> 4

<211> 240

<212> DNA

<213> Pelodiscus sinensis

<400> 4

tgccagacca tcggagtttt actgtacata tatatctctg ccaaactgaa atttccactt 60

catgcatctg atgacgtggg ctccagctca caaaatctta tgcccaaata aaatggttaa 120

tctttaaagt gccacagaac tctttccttt tccttttcct tttccttttc cttttccttt 180

tccttttcct tttccttttc ctttttctga aacagacgtc tttccctctg taattcacct 240

<210> 5

<211> 248

<212> DNA

<213> Pelodiscus sinensis

<400> 5

gttctggcag ctctggtctt aggctgtgtc ttagaggtga gttcttccag gtcttccctt 60

cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttgcttgcag gtcttcttct 120

tggatcccag tttatatagt gaaacttgat ttctgcttag ctatacttta accaattatt 180

ttagtataat tttactaacc aatcataaca tactgtaaca gaattaccta accaatcata 240

ccccacca 248

<210> 6

<211> 200

<212> DNA

<213> Pelodiscus sinensis

<400> 6

gccacattct cgtccagtcc aaattcttgt caatgtacat tccccatcct attttctccc 60

tcttccacca caaacaaaca aacaaacaaa caaacaaaca aacaaacaaa caaacaaaca 120

ccacaacaaa atacaaagac aaccacacta atgaattgtg actatattgc tccttcataa 180

taggtaacac gaggagccac 200

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaaggaaggg acagagcgat aa 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tccatcccaa attgcccatt at 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gacctagtcc tgccccttta aa 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgatccagca tgagtgtgat ag 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtgctcaat catcaagtta cc 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctctgctgtt ggaaggtctg aa 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgccagacca tcggagtttt a 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aggtgaatta cagagggaaa ga 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gttctggcag ctctggtctt ag 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tggtggggta tgattggtta gg 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gccacattct cgtccagtcc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gtggctcctc gtgttaccta 20

Claims

1.一种中华鳖微卫星标记，其特征是，包括6个微卫星标记，分别为sp601、sp603、sp604、sp610、sp316、mitf；其中，

sp316为SEQ ID NO.5所示的DNA序列或其互补序列，其微卫星重复序列为（CTT）15；

mitf 为SEQ ID NO.6所示的DNA序列或其互补序列，其微卫星重复序列为(ACAA)12。

2.一种中华鳖微卫星标记的引物，其特征是，包括6对引物，分别为：

sp601F：序列如SEQ ID NO.7所示，sp601R：序列如SEQ ID NO.8所示；

sp603F：序列如SEQ ID NO.9所示，sp603R：序列如SEQ ID NO.10所示；

sp604F：序列如SEQ ID NO.11所示，sp604R：序列如SEQ ID NO.12所示；

sp610F：序列如SEQ ID NO.13所示，sp610R：序列如SEQ ID NO.14所示；

sp316F：序列如SEQ ID NO.15所示，sp316R：序列如SEQ ID NO.16所示；

mitf F：序列如SEQ ID NO.17所示，mitf R：序列如SEQ ID NO.18所示。

3.一种权利要求1所述的微卫星标记或权利要求2所述的引物在河北阜平县正常体色中华鳖（FBP）、河北阜平县“永章黄金鳖”（FAP）、河北唐山县正常体色中华鳖（TBP）的群体遗传结构分析中的应用。