CN113699263B

CN113699263B - 槭属园艺品种的ssr引物序列对、分子指纹图谱的构建方法、鉴别方法及应用

Info

Publication number: CN113699263B
Application number: CN202110856092.3A
Authority: CN
Inventors: 林立; 祝志勇; 林乐静
Original assignee: Ningbo City College of Vocational Technology
Current assignee: Ningbo City College of Vocational Technology
Priority date: 2021-07-28
Filing date: 2021-07-28
Publication date: 2023-12-22
Anticipated expiration: 2041-07-28
Also published as: CN113699263A9; CN113699263A

Abstract

本发明公开了一种槭属园艺品种的SSR引物序列对，属于涉及分子生物学领域，它包括15对引物序列，每对引物序列由上游引物和下游引物组成，本发明还具体公开了该SSR引物序列对的具体序列，以及分子指纹图谱的构建方法、鉴别方法及应用。本发明利用SSR标记对供试槭树品种资源进行遗传多样性研究和指纹图谱绘制，揭示不同槭树品种的遗传差异和亲缘关系，为槭树品种资源的鉴定、开发、保护与利用提供参考依据。

Description

槭属园艺品种的SSR引物序列对、分子指纹图谱的构建方法、鉴别方法及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及槭属园艺品种的SSR引物序列对、分子指纹图谱的构建方法、鉴别方法及应用。

背景技术

槭属(AcerL.)植物常被称为槭树(Maple)，习惯上又称“枫树”(尹燕雷等，2009)。该属广泛分布于北半球温带地区，具有重要的药用、生态和经济价值，许多类群还具有极高的观赏价值，如鸡爪槭、三角槭、红花槭、元宝槭和秀丽槭等(方文培，1986)。鸡爪槭为槭属中园林绿化应用最广的树种之一，因其错落的树姿、多变的叶形以及丰富的叶色，在世界各地公园、绿地和庭院广泛种植。目前，全世界培育的鸡爪槭园艺品种已超过1000 个，包含了观叶、观果、观杆等不同观赏特点的众多类型，林乐静等(2017)根据表型特征将槭树品种划分为红紫叶类、绿叶类、羽毛类等10个品种类群。日本为最早开展鸡爪槭种植和品种选育的国家，至今已培育鸡爪槭园艺品种数百个，并且大量出口欧美等国(吕运舟，2014)。因此，鸡爪槭及其园艺品种在国际上也被称为日本枫树(Japanese maple) (Vertrees&Gregory，2009)。

我国槭属种质资源丰富，为槭属现代分布中心，60％以上原种在我国有分布(Xuet al.， 2012)。但是，由于我国在槭属资源开发及新品种选育方面起步较晚，自主选育的新品种还很少，因此栽种的槭树品种以国外引进为主(林乐静等，2015)。近年来，随着我国社会经济快速发展，人们园林绿化、美化的要求不断提高，对槭树新品种的需求也极速增加。因此，大量槭树品种尤其是鸡爪槭品种被引进国内。据统计，目前我国引种栽培的鸡爪槭品种达500多个，极大地丰富了我国的槭树品种资源。然而，大量引种也导致了品种混杂、种源不清、名称混乱以及种质间亲缘关系不明等现象，给槭属种质资源归类保存、杂交亲本选配、新品种创制以及优良品种推广与保护等方面带来了困难。因此，开展槭树种质资源的遗传多样性分析，揭示不同来源的槭树种质资源的亲缘关系和群体遗传结构，并在此基础上构建槭树种质资源指纹图谱，对于我国槭树品种鉴定、新品种选育及资源高效利用与保护都具有重要意义。

DNA分子标记常被用于种质资源遗传多样性研究，常用标记有RAPD(陈秋夏等，2020； Naznin et al.,2020)、AFLP(贾腾飞，2019；邵雪花，2020)、SSR(程玮哲等，2021；王琰琰等，2021)、ISSR(林乐静等，2015；林立等，2016)、SRAP(刘晓宏等，2009；杨小红和侯娜，2021)和SNP等(Salazar et al.,2020；樊晓静等，2021)。其中，SSR 标记技术因其覆盖度广、共显性、易检测、多态性高等特点而被广泛应用于种质资源保存、图谱构建、亲缘关系分析及辅助育种等(韩志强等，2019；王琰琰等，2021)。目前，关于槭属SSR标记开发和遗传多样性研究还较少。张玉瑶(2011)应用10对SSR引物对五角枫(Acer mono)辐射群体的遗传变异进行了研究，发现部分辐射个体与对照群体的遗传差异达1.7％。孙圣(2014)从血皮槭中筛选出27对多态性引物并利用所开发引物对血皮槭11个种群的遗传多样性和遗传结构进行了分析。张翠琴(2015)从Li等(2001)报道的芸薹属(Brassica)SSR引物中筛选出15对多态性引物，平均每对引物扩增17条带，多态性比率达98.44％。李娟娟(2018)对血皮槭27条引物在五种槭树(元宝枫、五角枫、三角枫、鸡爪槭和复叶槭)中的扩增效果进行了研究，发现其中2条引物适用于五种槭树。鄂思彤(2020)从前人开发的SSR引物中筛选出7对引物，并利用其中3对引物构建了元宝槭和色木槭的指纹图谱。燕丽萍等(2021)从59条血皮槭SSR引物中筛选出了14对适用于元宝枫(Acer truncatum)的引物。此外，RAPD、AFLP、ISSR等标记也在槭属的分类和遗传多样性研究中得到了应用(Zhao et al.，1999；Iddrisuet al.，2004；章建红等，2008；程小毛等，2011；林乐静等，2015)。然而，利用SSR标记对槭属园艺品种资源进行遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱，国内外尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：解决目前槭属园艺品种资源进行遗传多样性分析不完善的问题，提供一种槭属园艺品种的SSR引物序列对。

提供一种槭属园艺品种的SSR引物序列对，包含15对引物序列，每对引物序列由上游引物和下游引物组成，所述引物序列对的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1-30所示。

本发明的槭属园艺品种的SSR引物序列对能够有效地对不同的槭属园艺品种进行鉴别。

作为优选的方案，所述32对分子标记引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列如下：

(1)P5引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2；

(2)P8引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.3，下游引物序列为SEQ ID NO.4；

(3)P13引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.5，下游引物序列为SEQ ID NO.6；

(4)P21引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.7，下游引物序列为SEQ ID NO.8；

(5)P23引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10；

(6)P34引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.11，下游引物序列为SEQ ID NO.12；

(7)P40引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.13，下游引物序列为SEQ ID NO.14；

(8)P41引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.15，下游引物序列为SEQ ID NO.16；

(9)P44引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.17，下游引物序列为SEQ ID NO.18；

(10)P45引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.19，下游引物序列为SEQ ID NO.20；

(11)P58引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.21，下游引物序列为SEQ ID NO.22；

(12)P77引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.23，下游引物序列为SEQ ID NO.24；

(13)P78引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.25，下游引物序列为SEQ ID NO.26；

(14)P87引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.27，下游引物序列为SEQ ID NO.28；

(15)P99引物对：上游引物序列为SEQ ID NO.29，下游引物序列为SEQ ID NO.30。

本发明还提供了一种槭属园艺品种的SSR分子指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

S1：提取槭属园艺品种的DNA；

S2：以步骤S1提取获得的DNA为模板，利用权利要求1所述的15对槭属园艺品种的SSR引物序列对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

S3：将步骤S2获得的PCR扩增产物进行电泳检测，得到PCR扩增产物的长度信息；

S4:利用步骤S3获得的长度信息构建得到槭属园艺品种的SSR分子指纹图谱。

通过本发明的槭属园艺品种的SSR引物序列构建槭属园艺品种的SSR分子指纹图谱，能够用于比对不同品种的槭属植物，建立SSR分子指纹图谱能够准确检测目标基因。本发明利用SSR标记对供试槭树品种资源进行遗传多样性研究和指纹图谱绘制，揭示不同槭树品种的遗传差异和亲缘关系，为槭树品种资源的鉴定、开发、保护与利用提供参考依据，操作简单、灵敏性强且时效性强，构建的资源指纹图谱，对于我国槭树品种鉴定、新品种选育及资源高效利用与保护都具有重要意义。

作为优选的方案，所述步骤S1中，提取槭属园艺品种的DNA后还包括将DNA通过1.5％琼脂凝胶进行电泳检测的步骤，若大部分样品可见明显主带，则使用该DNA，反之则重复步骤S1。

作为优选的方案，所述步骤S2中PCR扩增的条件为：94℃-96℃预变性5min；94℃ -96℃变性30s；54℃-60℃退火30s；72℃-78℃复性35s；72℃-78℃延伸40s；72℃ -78℃最终延伸5min；最后在10℃-15℃下保存，结束反应。

作为优选的方案，槭属园艺品种的SSR分子指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR扩增体系包括：DNA模板2μl、5U/μl Taq酶0.2μl、10×Taq Buffer 2.0μl、20μM荧光标记引物F 0.3μl、20μM荧光标记引物R 0.3μl、10mmol/L dNTP 0.4 μl以及ddH₂O14.8μl。

本发明还提供了一种利用上述的构建方法对槭属园艺品种进行鉴别的方法，包括以下步骤：

A1:提取需鉴定槭属园艺品种的DNA；

A2:利用步骤A1提取获得的DNA进行PCR扩增；

A3:将步骤A2获得的PCR扩增产物进行电泳检测，得到PCR扩增产物的长度信息；

A4:将步骤A3取得的长度信息与步骤S4构建的槭属园艺品种的SSR分子指纹图谱进行比对，以鉴别槭属园艺品种。

通过本发明的鉴别方法，能够有效地对不同品种的槭属植物通过PCR扩增产物进行比对，最终鉴别槭属园艺品种。

本发明还包括鉴定槭属园艺品种的试剂和/或试剂盒，包括如所述的SSR引物序列对。

附图说明

图1为本发明实施例中部分DNA电泳检测结果图；

图2为本发明实施例中部分PCR产物琼脂糖电泳检测结果图；

图3为本发明实施例中部分引物在6份品种材料中的扩增图；

图4为本发明实施例中P5引物对样品2和11的毛细管电泳结果图；

图5为本发明实施例中93份槭树种质资源的SSR聚类结果图；

图6为本发明实施例中93份槭树种质的主坐标分析图；

图7为本发明实施例中LnP(D)、ΔK值随K值的变化规律图；

图8为本发明实施例中93份槭树种质资源的群体遗传结构图；

图5/6/7中，数字对应表1中的编号；

图5中，从编号30、24、32…逆时针依次至79为类群I，从编号52、53…逆时针依次至72 为类群II，编号74、91、90、92以及93为类群III，编号76、77…逆时针依次至88为类群IV。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中所选用的试剂、药品以及设备仪器及来源如下：

DNA Marker(DL2000)和PCR试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)、硼酸、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)、氯化钠(NaCl)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

其它试剂及来源如下：

核糖核酸酶A(RNase A)：北京沃凯生物科技有限公司；无水乙醇(C2H5OH，99.5％)：上海易恩化学技术有限公司；Tris碱(Tris base)：北京盛科博源生物科技有限公司；尿素(Urea)：国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸(CH3COOH)：分析纯，四川西陇化工有限公司；硝酸银(AgNO3)：分析纯，上海钰博生物科技有限公司；琼脂糖胶(Agarose)：北京百奥泰康生物技术有限公司；6×DNA Loading Buffer：北京百奥莱博科技有限公司；核酸染色剂(GoldView)：北京富百科生物技术有限公司；引物合成：通用生物系统(安徽)有限公司合成。

设备与仪器及来源如下：

K960型PCR扩增仪：杭州晶格科学仪器有限公司；3730XL型测序仪：美国应用生物系统公司(ABI)；JY-SPFT水平电泳槽：北京君意东方电泳设备有限公司；JY300C水平电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司；K8160型凝胶成像系统：北京科创锐新生物科技有限公司；CF16RXII高速冷冻离心机：日立(中国)有限公司；Milli-Q Direct 8纯水系统：美国密理博(Millipore)公司；JXFSTPRP-24L全自动快速研磨仪：上海净信实业发展有限公司；Nano Drop2000超微量分光光度计：赛默飞世尔科技公司。

也可用功能相似的试剂、药品以及设备仪器进行等同的替换，都属于本发明保护的范围。

本发明的SSR分子指纹图谱的构建方法，主要包括以下步骤：

S1：提取槭属园艺品种的DNA；

A1:提取需鉴定槭属园艺品种的DNA；

A2:利用步骤A1提取获得的DNA进行PCR扩增；

以下提供具体的实施例来说明上述的构建方法与鉴别方法

实施例：

本实施例所选用的供试材料采自宁波城市职业技术学院槭属种质资源保存基地，根据林乐静等(2017)划分的10个表型特征选取93份槭树种质，于2020年5月采集无病害嫩叶，置于硅胶干燥保存(如下表1)。

表1：93份槭树种质资源及其编号、来源

一、实验方法

1.DNA的提取与检测

(1)溶液配制

2×CTAB提取液，含：2％(W/V)CTAB；0.1mol/L Tris-HCl(PH＝8.0)；20mmol/LEDTA； 1.4mol/L NaCl；1％(W/V)PVP；0.2％(V/V)巯基乙醇(灭菌后加入)。

酚:氯仿:异戊醇混合液，体积比为25:24:1。

(2)提取步骤

采用改良CTAB法(Doyle，1987)提取槭属植物的基因组DNA，步骤如下：

第1步：取1g干燥叶片或1.5g新鲜叶片于预冷研钵中，加液氮多次研磨至粉末状；

第2步：将粉末装入1.5mL EP管，加0.75mL 60℃预热的2×CTAB溶液和1μl RNaseA；

第3步：将EP管置于65℃水浴中45min，每15min摇晃1次；

第4步：将EP管取出，加0.75mL酚:氯仿:异戊醇混合液，颠倒混匀；

第5步：12000g离心10min；

第6步：吸取上清液700μl至新1.5mL EP管，加等体积酚:氯仿:异戊醇混合液，颠倒混匀；

第7步：12000g离心10min；

第8步：吸取上清液转入加有0.8倍体积异丙醇的新1.5mL EP管中，水平轻晃混匀后冰浴30min；

第9步：4℃条件下12000g离心10min，弃上清液；

第10步：加1mL预冷的70％乙醇于EP管中，用移液枪缓慢吹洗沉淀；

第11步：4℃条件下12000g离心4min，弃上清后加入1mL预冷的95％乙醇，用移液枪缓慢吹洗沉淀；

第12步：4℃条件下12000g离心5min，尽弃残液，置于室温下干燥；

第13步：加20μl ddH₂O溶解DNA后置于-20℃条件下保存备用。

(3)电泳检测：

提取DNA用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，大部分样品可见明显主带，如图1所示。若样品无主带，则重新提取一次。

2.SSR引物设计

以前期实验得到的红枫转录组测序数据为基础，委托上海美吉生物医药科技有限公司对RNA-seq数据进行组装，共得到106787条Unigenes，总长83606988bp。利用MISAv1.0 查寻Unigene文库中的SSR数据，查寻要求：单核苷酸至六核苷酸的最小重复次数分别达到10次、6次、5次、5次、5次和5次；不同位点间隔距离≥100bp。

通过用Primer3.0软件设计SSR引物，设置参数：引物长度20～25bp；退火温度54～60℃； GC含量在40％～60％；产物预期长度100～300bp。

3.SSR引物筛选

从设计引物中选取100对进行最优引物筛选。选择39、40、45、56、63和66号品种作为DNA模板。

(1)PCR扩增

SSR-PCR扩增体系包括：

DNA模板2μl、5U/μl Taq酶0.2μl、10×Taq Buffer 2.0μl、20μM荧光标记引物 F0.3μl、20μM荧光标记引物R 0.3μl、10mmol/L dNTP 0.4μl、ddH₂O 14.8μl。

PCR扩增利用K960型序列扩增仪(杭州晶格科学仪器有限公司)，程序为：

(2)琼脂糖电泳检测

PCR产物先用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，部分引物电泳初检结果如图2所示。

(3)PAGE电泳检测

1)配制6％聚丙烯酰胺母液

Acr-Bis(30％，29:1)：丙烯酰胺29g，甲叉丙烯酰胺1g，加水定容成100mL；

10％APS溶液：1g过硫酸铵溶于水至10ml；

5×TBE：Tris 27g，硼酸13.75g，0.5M EDTA(pH＝8.0)10mL，加水定容至500mL；

6％聚丙烯酰胺母液：Acr-Bis(30％，29:1)80ml，5×TBE 80mL，尿素168g，加水定容至400mL。

2)制胶

将电泳玻璃板固定，取6％聚丙烯酰胺母液50ml，加入APS(10％)200ul以及TEMED20ul，混匀后插入梳子备用。

3)电泳

点样后进行电泳。电压设为200V，电流为60mA，电泳时间3小时。

4)银染

取下凝胶，放入10％冰醋酸溶液固定30min，后用去离子水快速冲洗10s左右，置于1‰AgNO₃溶液中染色25min，再用去离子水冲洗后即可放入显影液中显色，最后用去离子水冲洗干净，拍照记录。部分引物PAGE电泳结果见图3。

4.毛细管电泳

将甲酰胺与分子量内标按100:1(V/V)混匀，取15μL于上样板，再加入1μL稀释 10倍的PCR产物。利用3730XL测序仪(Applied Biosystems，美国)进行毛细管电泳，电压设置为170V，电流为140mA，电泳时长50min。电泳后通过Genemarker v3.0软件对原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标位置与样品峰值位置进行比较，得到扩增片段的长度信息。测试结果如图4所示，图4为引物P5对2个样品的毛细管电泳结果图。

5.数据处理

将DNA多态性信息处理为数据矩阵。运用GenAlEx v6.503软件(Peakall&Smouse，2012)计算供试群体的等位基因数(Number of alleles，Na)、有效等位基因数(Effectivenumber of alleles，Ne)、Shannon’s信息指数(Shannon’s information index，I)、观察杂合度(Observed heterozygosity，Ho)、期望杂合度(Expected heterozygosity， He)和Nei’s基因多样性指数(Nei’s gene diversity index，H)，并且进行主坐标分析(Principal Coordinates Analysis，PCoA)。参考赵旗峰等(2001)方法统计每对引物在93份槭树材料中的等位基因组成，包括稀有等位基因(占比≤1％)、共有等位基因(占比1％～≤20％)和常见等位基因(占比>20％)。利用PIC-CALC v0.6软件(中国水产科学研究院黄海水产研究所)计算位多点态性信息含量(polymorphism information content， PIC)。利用Popgene v1.32(Yeh et al.，2000)计算93份槭树样品间的Nei’s遗传距离和遗传相似系数，并通过MEGA 6.0软件(Tamura et al.，2013)构建槭属园艺品种的 NJ(Neighbor-Joining)聚类树。利用Structure v2.3.4软件(Pritchard etal.，2000) 对群体遗传结构进行分析，群体数(K)设置2～9，每个K值模拟运算10次，将MCMC(Markor Chain MonteCarlo)开始时的不作数迭代和不作数迭代后的MCMC迭代分别设为100000 次和1000000次。将Structure运算结果导入到Structure Harvester网站 (http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/)，根据最大似然值选取最佳K值，当K值持续增大时则参考Evanno等(2005)方法选择最佳K值。

DNA指纹图谱构建

参考宋海斌等(2012)和王琰琰等(2021)的方法进行DNA指纹图谱构建。SSR引物依据扩增条带分子量大小进行编号，由从小到大依次编为A、B、C……。记录每份材料对应SSR引物的扩增条带数据，产物为单一条带时只记录条带大小(省去单位bp)，如果扩增产物含有多条带，则以“—”连接数字，无扩增条带则以“0”表示，以此将不同种质编码为字母和数字组成的一系列带型编号。

二、结果分析

1.SSR引物的筛选

利用‘蝴蝶’、‘血红’、‘爪柿’、‘日笠山’、‘青龙’和‘狮子头’6个品种从100对预选引物中筛选出15对多态性好、条带清晰的SSR引物(表3.2)。引物重复基元主要有(AT)、(TC)和(TA)，扩增预期长度为121～278bp。

表2：15对SSR引物序列信息

2.引物多态性分析

将上述15对引物在93份槭树样品中扩增，共检测到263个基因位点，每对引物的等位基因数(Na)为5～26个，平均为17.53个(表3)。所有引物中，P44产生的等位基因数目最多，有24个，P5次之(23个)，等位基因数目最少的为引物P78，仅有5个。分析等位基因组成，发现：稀有等位基因数(≤1％)范围在0～8个之间，平均为4个；共有等位基因数(1％～≤20％)介于2～18个之间，平均为12.27个；常见等位基因数(>20％) 为0～2个之间，平均为1.27个(表3)

表3：15对SSR引物在93份材料中的多态信息

93份槭树种质的有效等位基因数(Ne)在2.2071(引物P78)～9.919(引物P5)之间，平均为6.154。引物的多态性信息含量(PIC)变化范围为0.449～0.891，平均值为0.789。所选15对引物中，14对引物的PIC值＞0.5，属于高度多态性引物，只有引物P78的PIC 值略低于0.5，属于中度多态性引物，表明所选引物多态性普遍较高。槭树群体的平均 Shannon’s信息指数(I)为2.113，最高值为2.585(引物P5)，最低值为0.915(引物 P78)。观察杂合度(Ho)介于0.013～0.892之间，平均为0.543，期望杂合度(He)介于 0.547～0.899，平均为0.812，两者的最大值和最小值都出现于P5和P78。遗传多样性指数(H)变幅在0.550～0.904之间，平均为0.817，表明槭树种质的遗传多样性水平较高。

表4：93样品中15个SSR位点的等位基因组成

3.种质间遗传距离分析

93份槭树种质的遗传相似性系数介于0～1，其中鸡爪槭品种间的平均遗传相

似性系数为0.3002，大于槭树种间的平均遗传相似系数0.1596。鸡爪槭品种间遗传相似性系数变化较大，其中‘猩猩野村’(No.9)、‘艳舞’(No.10)和‘血红’(No.38)3 个品种，‘幕落川’(No.6)和‘博斯科普荣耀’(No.17)2个品种，‘紫锦’(No.16)和‘布加迪’(No.22)2个品种，以及‘羽衣’(No.52)和‘木棉志手’(No.53)2个品种之间的遗传相似系数都为1，推测为相同品种或极近品种；‘三日月’(No.21)和‘羽衣’(No.52)、 ‘红云’(No.42)和‘紫式部’(No.47)，以及‘三日月’(No.21)和‘木棉志手’(No.53) 等品种之间的遗传相似性系数为0，表明鸡爪槭种下类群存在较大遗传变异。

4.槭树种质的聚类分析

基于93份槭树种质的Nei’s遗传相似系数，利用NJ方法进行聚类分析，结果(图5)表明15对SSR标记可将93份槭树种质分为4个类群，其中：类群I主要由红紫叶类鸡爪槭品种和羽毛类鸡爪槭品种组成，羽扇槭品种‘卡尔姆豪特’(No.79)也包含其中；类群II成分较为复杂，由脉斑纹类、斑叶类、异形叶类、绿叶类及少量红紫叶类品种(No.69～72)组成；类群III由秀丽槭品种(No.89～93)和鸡爪槭品种美峰(No.74)构成；类群IV包含羽扇槭、红花槭、银白槭、青皮槭、糖槭及自由人槭的13个品种，其中白泽槭3个品种(No.76～78)独立成一小支，红花槭2个品种‘壮丽紫红’(No.83)和‘太阳谷’(No.84)以及羽扇槭2个品种‘舞孔雀’(No.81)和‘大泷’(No.82)也分别聚为一小支。从聚类图中可以发现，同种槭树的种下类群优先聚为关系较近的支系，表明SSR标记对于槭树种间分类效果较好。此外，聚类结果与品种表型特征也具有一定的相关性，特征相似品种优先聚为一类，如羽毛类品种‘日落’(No.24)、‘绿雾’(No.30) 和‘黑叶’(No.32)，以及紫叶类品种‘织殿锦’(No.69)、‘千染’(No.70)和 ‘红舞姬’(No.71)。

5.主坐标分析

为了进一步明确槭树种质资源的遗传关系，对93份种质进行主坐标分析(PCoA)(图 6)。分别以PC1(第1主成分)和PC2(第2主成分)为横坐标和纵坐标，得到了93份槭树种质的主坐标分析图。从PCoA图中可以看出，主坐标分析结果与NJ聚类结果基本一致，93份槭树种质被划分为3个类群。其中，类群I含有42份种质，都为鸡爪槭品种。类群II含有35份种质，除鸡爪槭品种外，还含有3个白泽槭品种(No.75～77)。类群 III包含了其余16份非鸡爪槭品种。

6.遗传结构分析

根据15对SSR引物扩增结果对93份槭树种质资源进行群体结构分析。亚群数K值预设为2～9，重复10次。随着K值逐渐增大，LnP(D)也持续增大，无法确定K值(图7A)。因此，参考Evanno等(2005)方法依据△K来确定K值，当K为3时，△K有最大值(图7B，表5)，表明将供试的93份槭树种质划分为3个群体最为合理。

表5：遗传结构分析中估计最佳K值

Structure预测显示了与NJ聚类基本一致的结果。蓝色群体主要聚集于类群I中，主要由红紫叶类和羽毛类鸡爪槭品种构成；红色群体集中分布于类群II，由其它表型特征的鸡爪槭品种组成；绿色群体对应类群III和类群IV，为非鸡爪槭种质材料构成。参考吴承来等(2010)方法判断槭树种质的遗传背景，当种质材料Q值≥0.6时，认为该材料遗传背景较为单一，而当Q值<0.6，则表明该材料遗传背景较为复杂。分析93份槭树种质资源的Q值，发现仅有‘卡尔姆豪特’(No.79)的Q值＜0.6，表明该种质遗传组成较为复杂，不能明确其归属于哪个类群，其余92份槭树种质的Q值≥0.6，表明这些种质遗传结构比较单一，可以划归于某一类群。此外，根据‘美峰’(No.74)的Q值分布，发现鸡爪槭品种‘美峰’更倾向于归入非鸡爪槭种质群体。

7.DNA指纹图谱

利用15对SSR引物可以将93槭树种质中的83份完全区分开，部分疑同或极近品种则需进一步筛选SSR引物或结合田间数据进行鉴别和区分。依据此前设计的引物带型编号方案，将15对引物依次编号为字母A～O，每对引物对应的带型编号由该引物的字母和代表扩增条带大小的数字组成，以此建立了93槭树种质的SSR指纹图谱代码(表6)。将每份种质的指纹图谱代码输入在线网站(http://cli.im/)生成特定的二维码。二维码信息包含植物品种名、拉丁名、植物分类和指纹图谱代码。

表6：93份槭树种质资源的SSR指纹图谱代码

注：A～O分别为SSR引物P5、P8、P13、P21、P23、P41、P40、P34、P44、P45、P58、 P77、P78、P87和P99。

以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体结构允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 宁波城市职业技术学院

<120> 槭属园艺品种的SSR引物序列对、分子指纹图谱的构建方法、鉴别方法及应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accaaccaac caacctaacg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataaacacac acgcaaccca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtatggcagc gaatgaggtt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttgaaagtg gcccatgagt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatcacaac cgacaaggca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acccattgag aacttggctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcatatgca gggctgttga 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgcaattgtg cagtgtcatt t 21

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgaaattgaa ggacaataca atcg 24

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccaatggat ttggatggat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caacgatttc ggcaaagatt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtgaatgcat ccgatattgc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aacttgccct cgaagacatc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcgcatcatg aaattgtgct 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttacagcaac tgcacaaccc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgggatgatt tctggggtaa 20

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagatgttag cattgcattt tga 23

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agagcagcaa ggtggatgat 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggcttcgttc tcgagtgaat 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tggtagggtt ttagcttccg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttcacacatg atggtccagg 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttgtttgctt tttggttgtc a 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgagaaaatg atccaccaag c 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ttggcatgac aatctgtggt 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tgtggtatgg tatcggtgga 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tcttgcagtc acccaacagt 20

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

agaaatgcat gattggagga a 21

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atcacaagcc aaccagaacc 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gccaacttcc ttctgaggat t 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttccagggaa tcaatgaacg 20

Claims

1.一种槭属园艺品种的SSR分子指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：提取槭属园艺品种的DNA；

S2：以步骤S1提取获得的DNA为模板，利用15对槭属园艺品种的SSR引物序列对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

S4:利用步骤S3获得的长度信息构建得到槭属园艺品种的SSR分子指纹图谱；

所述槭属园艺品种的SSR引物序列对包含15对引物序列，每对引物序列由上游引物和下游引物组成，所述引物序列对的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1-30所示；

所述15对引物序列的上游引物和下游引物的核苷酸序列如下：

2.根据权利要求1所述槭属园艺品种的SSR分子指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，提取槭属园艺品种的DNA后还包括将DNA通过1.5％琼脂凝胶进行电泳检测的步骤，若样品可见明显主带，则使用该DNA，反之则重复步骤S1。

3.根据权利要求1所述槭属园艺品种的SSR分子指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR扩增的条件为：94℃-96℃预变性5min；94℃-96℃变性30s；54℃-60℃退火30s；72℃-78℃复性35s；72℃-78℃延伸40s；72℃-78℃最终延伸5min；最后在10℃-15℃下保存，结束反应。

4.根据权利要求1所述槭属园艺品种的SSR分子指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR扩增体系包括：DNA模板2μl、5U/μl Taq酶0.2μl、10×Taq Buffer 2.0μl、20μM荧光标记引物F 0.3μl、20μM荧光标记引物R 0.3μl、10mmol/L dNTP 0.4μl以及ddH₂O14.8μl。

5.一种利用如权利要求1所述的构建方法对槭属园艺品种进行鉴别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1:提取需鉴定槭属园艺品种的DNA；

A2:利用步骤A1提取获得的DNA进行PCR扩增；

6.一种鉴定槭属园艺品种的试剂，其特征在于，包括如权利要求1中所述的SSR引物序列对。