CN104131010A - 一种中华鳖微卫星分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
一种中华鳖微卫星分子标记及应用，该分子标记包括17个中华鳖的微卫星位点，其核苷酸序列分别如SEQ ID：1至SEQ ID：17所示，同时提供该17个微卫星位点的引物序列。本发明从中华鳖转录组EST序列中筛选17个微卫星位点，并在微卫星重复序列两端的侧翼序列涉及特异性引物进行扩增，获得的产物具有高度的多态性和稳定性，可用于中华鳖群体遗传学多样性分析、亲缘关系分析、分子标记辅助育种等领域。
Description
技术领域
本发明属于水产动物遗传育种技术领域，具体涉及一种中华鳖微卫星DNA分子标记位点及其应用。
背景技术
中华鳖(Pelodiscus sinensis)，又称甲鱼、团鱼、水鱼，隶属爬行龟鳖目(Testudinata)，鳖科(Tironychidae)，中华鳖属(Pelodiscus)，是我国淡水特种水产养殖产品之一，广泛分布于我国除西藏、青海和新疆外的其他地区，国外主要在朝鲜、日本和越南有分布(黄雪贞等，2012)。20世纪90年代至今，中华鳖养殖业发展过程中存在养殖场相互引种及外来鳖种涌入的问题，致使当前中华鳖种质混杂。为保障中华鳖养殖业的健康发展，在湖南长沙、安徽蚌埠、山东广饶、江西鄱阳湖等地相继建立了中华鳖原种场、良种场。
微卫星(SSR)标记，其特点是含1～6个碱基的核心单元串联重复的核心序列，核心序列侧翼序列是相对保守的单拷贝。SSR的优点包括：数量丰富，分布均匀；各SSR位点有特异性引物，扩增结果重复性好。微卫星在不同物种间的含量和分布不同，存在差异(Toth et al.，2000)，并且主要分布在非编码区。其序列长度与核心序列重复次数相关，变异与核心序列的重复次数呈正比。微卫星两端的序列多为保守的单拷贝序列，可据此设计特异性引物，通过PCR技术扩增获得相应序列，经PAGE分析，获得不同基因型个体的多态性。选用微卫星标记对中华鳖种质资源进行保护和合理开发、分子标记辅助育种等具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种中华鳖微卫星分子标记及应用，从中华鳖EST序列中筛选出17个具多态性的中华鳖的微卫星位点，以及相应的引物，为中华鳖的种群遗传学多样性分析及分子标记辅助育种技术提供有效的工具。
为达上述目的，本发明采用的技术方案是：一种中华鳖微卫星分子标记，所述分子标记选自如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
本发明还提供上述17个微卫星分子标记位点上设计的引物对以用于PCR扩增，其中：
序列为SEQ ID NO:1的微卫星位点设计的引物对PS-1，其序列为：
PS-1 F：5’-TTCCCAGGCTTTAACCAAGAGG-3’，SEQ ID NO：18；
PS-1 R：5’-GCAACAATATGACAGCGACACT-3’，SEQ ID NO：19；
序列为SEQ ID NO：2的微卫星位点设计的引物对PS-2，其序列为：
PS-2 F：5’-CCTCTCAGGTTTGTAATTTGCCATT-3’，SEQ ID NO：20；
PS-2 R：5’-AACACATTGCCATCTCCTCAGT-3’，SEQ ID NO：21；
序列为SEQ ID NO：3的微卫星位点设计的引物对PS-3，其序列为：
PS-3 F：5’-AGCATGTGGTACTGATGTGTAG-3’，SEQ ID NO：22；
PS-3 R：5’-ACTGTCATACATTCGCTAGTGA-3’，SEQ ID NO：23；
序列为SEQ ID NO：4的微卫星位点设计的引物对PS-4，其序列为：
PS-4 F：5’-GCTCTACACCTTCCACCTTGTT-3’，SEQ ID NO：24；
PS-4 R：5’-GGGTGAAGACTCTGATGGGTAG-3’，SEQ ID NO：25；
序列为SEQ ID NO：5的微卫星位点设计的引物对PS-5，其序列为：
PS-5 F：5’-TGTATCATTCCTGTGCTGTA-3’，SEQ ID NO：26；
PS-5 R：5’-GCAATTCTGTCGTGTGAG-3’，SEQ ID NO：27；
序列为SEQ ID NO：6的微卫星位点设计的引物对PS-6，其序列为：
PS-6 F：5’-TCCGCCATGATCGAGAAGAAT-3’，SEQ ID NO：28；
PS-6 R：5’-CCTGTCCATCAATCACACTGAG-3’，SEQ ID NO：29；
序列为SEQ ID NO：7的微卫星位点设计的引物对PS-7，其序列为：
PS-7 F：5’-CGTGATGATGGTGACTGGTATC-3’，SEQ ID NO：30；
PS-7 R：5’-GAGGGTGAGACTTCGGAGAC-3’，SEQ ID NO：31；
序列为SEQ ID NO：8的微卫星位点设计的引物对PS-8，其序列为：
PS-8 F：5’-GCCCAGCAGGAACAAAGCATTA-3’，SEQ ID NO：32；
PS-8 R：5’-CCTCATCAGCCTCGTCCATCT-3’，SEQ ID NO：33；
序列为SEQ ID NO：9的微卫星位点设计的引物对PS-9，其序列为：
PS-9 F：5’-AACGGCTCAGAACTGTCACTT-3’，SEQ ID NO：34；
PS-9 R：5’-GCTGCTACCAAGGAGGTGTT-3’，SEQ ID NO：35；
序列为SEQ ID NO：10的微卫星位点设计的引物对PS-10，其序列为：
PS-10 F：5’-CCTTCACAGATACTGACAGACT-3’，SEQ ID NO：36；
PS-10 R：5’-GTCGGAGGCATGGTAATAGG-3’，SEQ ID NO：37；
序列为SEQ ID NO：11的微卫星位点设计的引物对PS-11，其序列为：
PS-11 F：5’-GAGGAGGAGGACGAAGAAGAG-3’，SEQ ID NO：38；
PS-11 R：5’-GAGGCAATCAGCATCGGATG-3’，SEQ ID NO：39；
序列为SEQ ID NO：12的微卫星位点设计的引物对PS-12，其序列为：
PS-12 F：5’-TTGCTGCGAGTCATAATGATCC-3’，SEQ ID NO：40；
PS-12 R：5’-CAACTCCTGCCAGCCAATG-3’，SEQ ID NO：41；
序列为SEQ ID NO：13的微卫星位点设计的引物对PS-13，其序列为：
PS-13 F：5’-CCTCAGTGGAGTGGAACATTG-3’，SEQ ID NO：42；
PS-13 R：5’-TGAGCACCAAGAGTAGATGAAC-3’，SEQ ID NO：43；
序列为SEQ ID NO：14的微卫星位点设计的引物对PS-14，其序列为：
PS-14 F：5’-TTCAGCAAAGCAGCACCCAGAG-3’，SEQ ID NO：44；
PS-14 R：5’-CTCCACGCTCGTTGACAGAAGG-3’，SEQ ID NO：45；
序列为SEQ ID NO：15的微卫星位点设计的引物对PS-15，其序列为：
PS-15 F：5’-GAGACCAACACCAATCACCAT-3’，SEQ ID NO：46；
PS-15 R：5’-CTAGAGCCACTTCCTGAGGT-3’，SEQ ID NO：47；
序列为SEQ ID NO：16的微卫星位点设计的引物对PS-16，其序列为：
PS-16 F：5’-GTCAGTCGCCAGGAAGTAATGT-3’，SEQ ID NO：48；
PS-16 R：5’-TCTAGTCTGTGCCAGCCAATAC-3’，SEQ ID NO：49；
序列为SEQ ID NO：17的微卫星位点设计的引物对PS-17，其序列为：
PS-17 F：5’-TCTCGCCTCGTTATGTGGTCA-3’，SEQ ID NO：50；
PS-17 R：5’-GGTCAGATTGCTTCCAGTGTCT-3’，SEQ ID NO：51；
本发明实现上述方案的步骤如下：
1)微卫星PCR引物设计及合成：从转录组EST文库中筛选出含有微卫星序列的片段，并设计引物进行合成；
2)基因组DNA的获取：采用天根DNA试剂盒提取中华鳖裙边组织基因组DNA；
3)电泳检测PCR扩增产物：采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法检测微卫星扩增产物；
4)遗传参数评估：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP 4.2计算遗传多样性参数。
本发明从中华鳖基因组DNA中筛选17个微卫星位点，并在微卫星重复序列两端的侧翼区设计特异性引物进行扩增，获得的产物具有高度多态性和稳定性，可用于中华鳖的群体遗传学、亲缘关系分析、分子标记辅助育种等领域。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明的微卫星位点应用进行详细地描述。
1.微卫星位点的筛选：
从中华鳖转录组EST文库中筛选还有微卫星的序列，进行微卫星序列的查找；参数设置为含有二碱基、三碱基重复5次以上的序列。共筛选出60个含有微卫星重复的位点，并从中设计引物进行多态性检测。
2.微卫星引物设计
从含有微卫星的基因序列中，选取符合引物设计的序列使用PrimerPremier5.0进行引物设计。主要参数设置为：引物长度18—25bp，PCR产物片段长度为100—300bp，退火温度为50—70℃。GC含量一般在40—60％之间，尽量避免错配及发卡结构出现。
3.引物多态性检测
1)基因组DNA提取：
采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化：DP324)提取40个中华鳖裙边组织DNA。
2)微卫星PCR扩增
采用设计的微卫星引物序列进行PCR扩增，PCR程序为95℃5min，95℃30s，Ta(据引物定)30s，72℃45s，反应进行27个循环，4℃保存；反应体系为15μl，其中含正反引物0.2μM、dNTP各200μM、1×PCR buffer、1.2mMMg2+、1U Taq酶。
3)电泳检测扩增产物：
采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，350W恒电压预电泳30min后电压5h。电泳完成后进行染色显影处理，胶板在10％的冰醋酸溶液浸泡30min，蒸馏水洗涤2次，各1min，0.1％硝酸银染色10min,10％硫代硫酸钠染色90s，两次，1％氢氧化钠显色至条带清晰。采用20bp DNA ladder做为marker检测等位基因位置。
4.遗传参数评估：
根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP计算遗传多样性参数，从而筛选出具有多态性的微卫星引物及对应的位点。
经过多样性检测，本发明共筛选出17对具有多态性的微卫星位点，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:17，其设计的多态性引物信息如表1所示。
表1：17对微卫星位点的退火温度、片段长度、多态性相关信息
注：其中Na代表等位基因数目，Ho代表观测杂合度，HE代表期望杂合度。
由上表可知，用本发明的引物对40个中华鳖基因组DNA进行扩增，遗传多样性分析结果表明美国微卫星位点的等位基因数目从2—11个不等，平均等位基因数目为4.6个。观测杂合度(HO)的范围从0.103到0.750，期望杂合度(HE)的范围从0.222到0.883，说明本发明筛选的微卫星位点和设计的引物具有遗传多态性，可用于中华鳖的遗传多样性、亲缘关系分析及分子标记辅助育种等领域研究。
Claims (5)
1.一种中华鳖微卫星分子标记，其特征在于，所述分子标记选自如SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的中华鳖微卫星分子标记，其特征在于，扩增所述分子标记的引物选自如下引物对：
PS-1 F：5’-TTCCCAGGCTTTAACCAAGAGG-3’，
PS-1 R：5’-GCAACAATATGACAGCGACACT-3’；
PS-2 F：5’-CCTCTCAGGTTTGTAATTTGCCATT-3’，
PS-2 R：5’-AACACATTGCCATCTCCTCAGT-3’；
PS-3 F：5’-AGCATGTGGTACTGATGTGTAG-3’，
PS-3 R：5’-ACTGTCATACATTCGCTAGTGA-3’；
PS-4 F：5’-GCTCTACACCTTCCACCTTGTT-3’，
PS-4 R：5’-GGGTGAAGACTCTGATGGGTAG-3’；
PS-5 F：5’-TGTATCATTCCTGTGCTGTA-3’，
PS-5 R：5’-GCAATTCTGTCGTGTGAG-3’；
PS-6 F：5’-TCCGCCATGATCGAGAAGAAT-3’，
PS-6 R：5’-CCTGTCCATCAATCACACTGAG-3’；
PS-7 F：5’-CGTGATGATGGTGACTGGTATC-3’，
PS-7 R：5’-GAGGGTGAGACTTCGGAGAC-3’；
PS-8 F：5’-GCCCAGCAGGAACAAAGCATTA-3’，
PS-8 R：5’-CCTCATCAGCCTCGTCCATCT-3’；
PS-9 F：5’-AACGGCTCAGAACTGTCACTT-3’，
PS-9 R：5’-GCTGCTACCAAGGAGGTGTT-3’；
PS-10 F：5’-CCTTCACAGATACTGACAGACT-3’，
PS-10 R：5’-GTCGGAGGCATGGTAATAGG-3’；
PS-11 F：5’-GAGGAGGAGGACGAAGAAGAG-3’，
PS-11 R：5’-GAGGCAATCAGCATCGGATG-3’；
PS-12 F：5’-TTGCTGCGAGTCATAATGATCC-3’，
PS-12 R：5’-CAACTCCTGCCAGCCAATG-3’；
PS-13 F：5’-CCTCAGTGGAGTGGAACATTG-3’，
PS-13 R：5’-TGAGCACCAAGAGTAGATGAAC-3’；
PS-14 F：5’-TTCAGCAAAGCAGCACCCAGAG-3’，
PS-14 R：5’-CTCCACGCTCGTTGACAGAAGG-3’；
PS-15 F：5’-GAGACCAACACCAATCACCAT-3’，
PS-15 R：5’-CTAGAGCCACTTCCTGAGGT-3’；
PS-16 F：5’-GTCAGTCGCCAGGAAGTAATGT-3’，
PS-16 R：5’-TCTAGTCTGTGCCAGCCAATAC-3’；
PS-17 F：5’-TCTCGCCTCGTTATGTGGTCA-3’，
PS-17 R：5’-GGTCAGATTGCTTCCAGTGTCT-3’。
3.权利要求1或2所述的中华鳖微卫星分子标记在中华鳖群体遗传学多样性分析中的应用。
4.权利要求1或2所述的中华鳖微卫星分子标记在中华鳖亲缘关系分析中的应用。
5.权利要求1或2所述的中华鳖微卫星分子标记在中华鳖辅助育种中的应用。
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|---|---|
| CN (1) | CN104131010A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105331706A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-02-17 | 浙江万里学院 | 一种抗嗜水气单胞菌相关的中华鳖微卫星序列及其应用 |
| CN105331705A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-02-17 | 浙江万里学院 | 一种对嗜水气单胞菌易感性相关的中华鳖微卫星序列及其应用 |
| CN105349671A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-02-24 | 浙江万里学院 | 适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列及筛选方法 |
| CN107475407A (zh) * | 2017-09-19 | 2017-12-15 | 湖南农业大学 | 一种检测中华鳖igfbp1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的试剂盒及应用 |
| CN108841945A (zh) * | 2018-06-28 | 2018-11-20 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种快速鉴定中华鳖遗传性别的pcr扩增引物、方法及试剂盒 |
| CN109182482A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-11 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种中华鳖基因组微卫星多重pcr体系构建方法 |
| CN110317882A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-10-11 | 河北大学 | 中华鳖微卫星标记、其引物及应用 |
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2014
- 2014-08-12 CN CN201410394467.9A patent/CN104131010A/zh active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| XIAO MA ET AL: "Development and characterization of 17 microsatellite markers for Chinese soft-shelled turtle,Pelodiscus sinensis", 《CONSERVATION GENET RESOUR》 * |
| 张群英 等: "中华鳖EST-SSR标记与生长形状相关性分析", 《海洋与湖沼》 * |
| 许晓军 等: "中华鳖表达序列标签资源中的微卫星信息分析", 《经济动物学报》 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105331706A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-02-17 | 浙江万里学院 | 一种抗嗜水气单胞菌相关的中华鳖微卫星序列及其应用 |
| CN105331705A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-02-17 | 浙江万里学院 | 一种对嗜水气单胞菌易感性相关的中华鳖微卫星序列及其应用 |
| CN105331705B (zh) * | 2015-11-17 | 2018-09-28 | 浙江万里学院 | 一种对嗜水气单胞菌易感性相关的中华鳖微卫星序列及其应用 |
| CN105331706B (zh) * | 2015-11-17 | 2018-09-28 | 浙江万里学院 | 一种抗嗜水气单胞菌相关的中华鳖微卫星序列及其应用 |
| CN105349671A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-02-24 | 浙江万里学院 | 适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列及筛选方法 |
| CN105349671B (zh) * | 2015-11-30 | 2018-09-04 | 浙江万里学院 | 适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列及筛选方法 |
| CN107475407A (zh) * | 2017-09-19 | 2017-12-15 | 湖南农业大学 | 一种检测中华鳖igfbp1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的试剂盒及应用 |
| CN107475407B (zh) * | 2017-09-19 | 2020-10-02 | 湖南农业大学 | 一种检测中华鳖igfbp1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的试剂盒及应用 |
| CN108841945A (zh) * | 2018-06-28 | 2018-11-20 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种快速鉴定中华鳖遗传性别的pcr扩增引物、方法及试剂盒 |
| CN109182482A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-11 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种中华鳖基因组微卫星多重pcr体系构建方法 |
| CN110317882A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-10-11 | 河北大学 | 中华鳖微卫星标记、其引物及应用 |
| CN110317882B (zh) * | 2019-07-19 | 2022-08-16 | 河北大学 | 中华鳖微卫星标记、其引物及应用 |
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