CN108841945A - 一种快速鉴定中华鳖遗传性别的pcr扩增引物、方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

林本发明公开了一种快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物，包括一对性别特异性分子标记引物和一对内参基因引物，还公开了一种快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR方法，以及快速鉴定中华鳖遗传性别的试剂盒。该扩增引物可在中华鳖早期鉴定出其遗传性别。该方法成本低、操作简便、可进行大批量快速鉴定，结果直观准确。

Description

一种快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物、方法及试剂盒

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物、方法及试剂盒。

背景技术

中华鳖(Pelodiscus sinensis)隶属的龟鳖目(Chelonia)是四足动物中最古老的一类，是产无羊膜卵两栖动物演变成产羊膜卵爬行动物的联结点。在研究物种形态演化、生殖方式进化等领域具有独特的科研价值。随着龟鳖养殖业的迅速发展，更增添了其举足轻重的经济价值。2016年，中华鳖的全国总产量达34余万吨，属于经济价值较高的名特优水产养殖品种，是淡水养殖中的重要组成部分。

一直以来，水产养殖业选取效益较高的性别进行单性养殖，是很多学者研究的目标，中华鳖养殖业也具有高效全雄繁育的需求。目前，在中华鳖养殖过程中存在一个普遍的现象：养殖周期内，经过2～3次筛选分塘，“去雌留雄”，最终实现单养雄鳖的养殖模式。在其生长期，雄鳖比雌鳖生长快，且高密度下性成熟鳖雌雄混养易引发个体激烈间争斗，导致皮肤破损，爆发疾病感染，降低鳖的成活率和上市的品质。然而，中华鳖养殖周期长、性成熟晚，雌雄要到1冬龄以上才能够通过外形鉴别，且鉴别效率低。如果能在中华鳖出壳后就对其遗传性别进行鉴定，可以在鳖苗早期就实现单性分塘养殖，养殖成本可以相应降低，其产量和效益也会显著提高。

一般来说，脊椎动物性别决定机制大致可以分为遗传性别决定(genetic sexdetermination,GSD)和环境性别决定(environmental sex determination,ESD)。不同于哺乳动物、鸟类等高等脊椎动物的体性别决定依赖于遗传物质，龟鳖类处于动物性别决定方式由环境决定型到基因决定型的过渡环节，为中华鳖性别决定机制的阐明带来了困难。目前，对中华鳖性染色体及性别决定方式的研究已开展了一些，但尚无统一的答案。随着生物技术的发展，对中华鳖性别决定方式的认定由开始的温度依赖型(TSD)机制逐渐发展为基因决定型(GSD)机制的(ZZ/ZW型)。此外，有学者揭示出中华鳖的W性染色体的18S rRNA拷贝数比Z大很多，并设计了利用qPCR检验18S rRNA扩增的重复拷贝数的方法来鉴别雌雄，成功率为90％，但该方法成本昂贵、操作繁琐，且有10％的错误率。

随着测序成本的下降及生物信息分析技术的发展，全基因组测序方法的使用成为水产类性别研究的新趋势。2013年以来，中华鳖和绿海龟(Chelonia mydas)等龟鳖动物的全基因组序列陆续发布，为挖掘龟鳖动物性别特异标记及揭示其性别决定机理带来新的契机及信息技术平台。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物，该扩增引物可在中华鳖早期鉴定出其遗传性别。

本发明的第二个目的在于提供一种快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR方法，该方法成本低、操作简便、可进行大批量快速鉴定，结果直观准确。

本发明的第三个目的在于提供一种快速鉴定中华鳖遗传性别的试剂盒。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物，包括一对性别特异性分子标记引物和一对内参基因引物，其中：

所述性别特异性分子标记引物的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示；

所述性别特异性分子标记引物的下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；

所述内参基因引物的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示；

所述内参基因引物的下游引物的序列如SEQ ID NO：3所示。

具体的：

性别特异性分子标记引物的上游引物的序列为：

GTGGAAACAATATCATCGCCGAG。

性别特异性分子标记引物的下游引物的序列为：

TGTGTGCCGTGCCTGCGAAGC。

内参基因引物的上游引物的序列为：TTGTGGAATGCTGCTCTTGG。

内参基因引物的下游引物的序列为：CCTGGAACTCTGGGTCTTGT。

本方法以雌雄中华鳖深度全基因组测序对比分析获得的性别特异性分子数据库为基础，发掘并验证了1对中华鳖遗传性别特异性分子标记引物，结合一对内参基因(ccr6)引物，可在中华鳖早期鉴定出其遗传性别。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR方法，包括以下步骤：提取中华鳖的基因组DNA，先采用上述的一对内参基因引物进行PCR扩增，将PCR产物进行电泳检测，在600-750bp之间显示出一条单一的亮带，说明该基因组DNA能用来对中华鳖做性别特异性PCR检测，然后再采用上述的一对性别特异性分子标记引物进行PCR扩增，将PCR产物进行电泳检测，在500-600bp之间显示出一条单一的亮带，判定为雌性，反之则判定为雄性。

因此，本发明方法包括受检个体的组织取材、基因组DNA提取、性别特异DNA片段及内参基因片段的PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、紫外光检测、受检个体遗传性别判定等步骤。

在上述快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR方法中：

优选的，PCR扩增时，反应体系为25μL，包括：dNTP(2.5mM)2μL，模板DNA 1μL，上、下游引物(10μmol)各0.5μL，Taq聚合酶0.5μL，10×Buffer2.5μL，加水至25μL。

此处采用内参基因引物进行PCR扩增时，上、下游引物指内参基因引物的上、下游引物。

此处采用性别特异性分子标记引物进行PCR扩增时，上、下游引物指性别特异性分子标记引物的上、下游引物。

优选的，PCR扩增时，PCR反应条件为：95℃变性2min后，进行30个循环，程序为：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃继续延伸10min。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：一种快速鉴定中华鳖遗传性别的试剂盒，包括上述的快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物。

本发明的有益效果是：

(1)本发明中的快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物，该扩增引物可在中华鳖早期鉴定出其遗传性别；

(2)本发明中的快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR方法，该方法不受年龄、样本限制，成本低、操作简便、可进行大批量鉴定，鉴别快速、结果直观准确，避免了采用传统方法耗时长、成本高、易出错等缺点，为中华鳖单性繁育及性控育种提供技术支持，可缩短育种时间、大幅提高产量、降低饲养成本，具有深远的经济和科研价值。

附图说明

图1是实施例2中中华鳖提取DNA后采用内参基因引物进行PCR性别鉴定的部分个体的电泳检测结果，Maker为DL2000，条带依次为100、250、500、750、1000、2000bp；

图2是实施例2中中华鳖提取DNA后采用性别特异性分子标记引物进行PCR性别鉴定的部分个体的电泳检测结果，Maker为DL2000，条带依次为100、250、500、750、1000、2000bp。

具体实施方式

下面通过以下具体实施方式对本发明做进一步阐述，但是本发明的内容完全不局限于此。

实施例1

本实施例提供的快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物，包括一对性别特异性分子标记引物和一对内参基因引物，其中：

所述性别特异性分子标记引物的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示；

所述性别特异性分子标记引物的下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；

所述内参基因引物的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示；

所述内参基因引物的下游引物的序列如SEQ ID NO：3所示。

具体的：

性别特异性分子标记引物的上游引物的序列为：

GTGGAAACAATATCATCGCCGAG。

性别特异性分子标记引物的下游引物的序列为：

TGTGTGCCGTGCCTGCGAAGC。

内参基因引物的上游引物的序列为：TTGTGGAATGCTGCTCTTGG。

内参基因引物的下游引物的序列为：CCTGGAACTCTGGGTCTTGT。

本方法以雌雄中华鳖深度全基因组测序对比分析获得的性别特异性分子数据库为基础，根据两性差异片段设计并验证了1对中华鳖遗传性别特异性分子标记引物，结合一对内参基因(ccr6)引物，可在中华鳖早期鉴定出其遗传性别。

实施例2

本实施例提供的快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR方法，包括以下步骤

(1)受检个体的组织取材

随机选取中华鳖共200只，经性腺解剖学和组织学检测性别后，剪取各个个体的组织，无水乙醇浸泡保存于-20℃，待用；

(2)基因组DNA的提取

提取DNA前，趾甲用1×PBS缓冲液4℃浸泡过夜，期间换洗2～3次。取样本趾甲各约5～20mg，用MicroElute Genomic DNA Kit(OMEGA，USA)试剂盒按照说明书提取DNA，并把提取获得的DNA保存于-20℃，待用；

具体步骤如下：

①.将趾甲样本加入到1.5mL离心管中，加入210～220μL的TL Buffer；

②.将趾甲样本尽量剪碎，加入20μL的OB溶液；

③.置于温度为转速为60～70rpm/min的摇床气浴，56～60℃消化3～5小时；

④.20,000xg离心2min，取上清；

⑤.加入220μL的BL Buffer，混合后70℃水浴10min；

⑥.加入220μL无水乙醇，混合15秒后过结合柱，8,000xg离心1min，倒掉废液；

⑦.加入500μL的HB Buffer，8,000xg离心1min，倒掉废液；

⑧.加入650μL的DNA Wash Buffer，8,000xg离心1min，倒掉废液，重复两次；

⑨.空柱36,000xg离心2min，空气中室温干燥3min；

⑩.无菌蒸馏水25～50μL，洗脱液DNA，可重复洗脱2次。

(3)PCR扩增

利用实施例1中的一对中华鳖遗传性别特异性分子标记引物(根据已获得的雌雄中华鳖深度全基因组测序对比分析构建的性别特异性分子数据库，在性别特异的DNA序列片段上设计并验证获得的性别标记引物)，结合实施例1中的一对内参基因(ccr6)引物，对上述DNA进行PCR扩增。

具体过程为：

以提取的各个个体的DNA为模板，以内参基因(ccr6)为引物，进行PCR扩增。

再以同样的DNA为模板，以性别特异性标记为引物，进行PCR扩增。

PCR反应体系为25μL：dNTP(2.5mM)2μL，模板DNA 1μL，引物(10μmol)各0.5μL，Taq聚合酶0.5μL，10×Buffer 2.5μL，加水至25μL。

PCR反应条件为：95℃变性2min后，进行30个循环，程序为：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃继续延伸10min。

表1用于PCR扩增的引物

(4)琼脂糖凝胶电泳检测

PCR反应产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测(样本DNA5uL，marker5uL)，并把电泳后的胶块用紫外光检测拍照，可根据结果判断受检个体的遗传性别。

(5)结果

以提取的各个个体的DNA为模板，以内参基因(ccr6)为引物，PCR扩增的电泳检测结果如图1所示，图1结果显示：F1-F5、M1-M5均在600-750bp之间显示出一条单一的亮带，符合内参基因扩增的长度，这说明各个个体提取的DNA质量良好，可以用来做性别特异性PCR检测。

以同样的DNA为模板，以性别特异性标记为引物，PCR扩增的电泳检测结果如图2所示，图2中的结果显示：F1-F5均在500-600bp之间显示出一条单一的亮带，符合性别特异性标记引物增的长度，说明其为雌性，而M1-M5则没有扩增出任何明显的单一亮带，说明其为雄性。

因此，F1-F5为雌性、M1-M5为雄性。

实施例3

本实施例根据随机选取的200只中华鳖，分别提取DNA，分别利用内参基因引物以及性别特异性分子标记引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳及紫外光检测后，获得的受检个体遗传性别数据(雌性：雄性为105：95)与性腺解剖学及组织学检测的性别数据相一致(雌性：雄性为105：95)，鉴定准确率为100％。

因此，本发明中的快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物可以进一步开发为试剂盒，用于快速鉴定中华鳖的遗传性别。

本发明首次采用PCR技术作为中华鳖(尤其是幼鳖)遗传性别快速鉴定的方法手段，以1对中华鳖遗传性别特异性分子标记并结合1对内参基因(ccl20)为引物，进行PCR扩增，PCR反应产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，并利用紫外光观察电泳结果，可根据结果判断受检个体的遗传性别。

通过本发明的上述试验可以发现，该方法可以快速鉴定中华鳖(尤其是幼鳖)的遗传性别，且具有以下优点：

(1)不受年龄限制，即使刚出壳的稚鳖也可以进行鉴定；

(2)不受样本限制，活体、标本、组织块甚至是相关制品，只要能够提取出DNA，均可进行鉴定；

(3)方法简单、操作简便、可进行大批量鉴定；

(4)成本低廉、鉴别快速、结果准确；

(5)避免了采用传统方法耗时长、成本高、易出错等缺点，为中华鳖单性繁育及性控育种提供技术支持，可缩短育种时间、大幅提高产量、降低饲养成本，具有深远的经济和社会价值。

本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物、方法及试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatgacaac gcctccatga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacgggttta ctcgggtcag 20

<210> 3

<211> 136

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida)

<400> 3

ggatgacaac gcctccatga tggatgtttt catgaacacc gatctcagtt ctttctgggt 60

tacgccgccg cagccgcagc cgcagcaact tcctcaccca ccctattcga cgtcaactga 120

cccgagtaaa cccgtc 136

<210> 4

<211> 142

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida)

<400> 4

ggatgacaac gcctccatga tggatgtttt catgaacacc gatctcagtt ctttctgggt 60

tacgccgccg cagccgcagc cgcagccgca gcaacttcct cacccaccct attcgacgtc 120

aactgacccg agtaaacccg tc 142

<210> 5

<211> 2043

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida)

<400> 5

atgactgact accgtttacc ccccaccatg aatctctggg cggatgacaa cgcctccatg 60

atggatgttt tcatgaacac cgatctcagt tctttctggg ttacgccgcc gcagccgcag 120

caacttcctc acccacccta ttcgacgtca actgacccga gtaaacccgt cggtcaagca 180

ccaccaccgt cggtttttaa ccaagagact cttatgcagc gtctccaaac gttgattgaa 240

ggtgctcatg agaactggac ttacgctatt ttctggcagt cttcgtatga ttattccggc 300

ggtacggtgt tggggtgggg agatggatat tataaagggg aggaagataa agggaaagag 360

aaagcgaaat cgagcacttc gaaagcagag caagagcacc ggaagaaggt acttcgtgag 420

cttaattctc tcatttctgg ttctcctacc tctgaaggtg acgccgtcga tgaggttgtc 480

accgacaccg agtggttcta cttggtgtcg atgactcaat cgtttatatc cggtattgga 540

ttgcccggtc aggcgttttt cgattcgaac cctatttggg ttgctggttc ggatcggctt 600

gcgagttcgt tctgtgagcg agctcgtcag ggtcaggttt tcgggttgca gactatggtt 660

tgtatcccgt cggcgaacgg agttgttgaa ttgggatcga gtgatttgat ttttcaaaac 720

tccgatctga tgaataaggt tagggttttg tttaatttca ataatctgga ggttgagact 780

tggccaatta gtggggttga ccaaggggaa aatgatcctt cttcgctttg gattagcgaa 840

ccatcttcaa acgccgccat tgaaattact aatcctgttg cttcagcttc agttccaact 900

ccaagcacaa caaacagcca accgatttcc aaaattacaa cagagtcgat cgagaaccaa 960

cctaaatcta gtgttgtgat tgaaactcca agctctgcta cccctcctcc ttctcaaaaa 1020

actcaccgac tgtcacagcc gattcagaca cagagcttct tcaacaacag ggaattgaat 1080

ttctctgaat ttgggtatga gaatggccgg ttgaaggatg ggaattcgac atcgttgaag 1140

ccggaatctg gtgagattct gaattttggg gagagtaaga ggaattctta ccccaacaca 1200

gataacaact tgccttctgg aaattcttta tttggtgggg atgagaacaa gaagaagagg 1260

tctcccactt cacgtgggag taatgaagag gggatgcttt cttttacttc tggtgtgatt 1320

cttccttctt ctgggggtgt gaaatcgggt gtttgtgctg gcgattctga tcactctgat 1380

cttgaagctt cggtgattcg tgaggtggag agtagtagag tggtggaacc ggagaaacgg 1440

cctcgaaaaa gagggcgaaa gccagcaaat ggtagagaag aaccattgaa tcacgttgaa 1500

gcagaaaggc agagaagaga aaagcttaac caaagattct atgctcttcg agctgttgtt 1560

ccgaatgtat cgaaaatgga caaagcttca ctccttggtg atgctatctc ttacatcaat 1620

gaactcagag ggaagcttca aactgcagaa tcagataaag aggatttgca gaagcaattg 1680

gattcagtga agaagttaat gatatcttct agtaaagatc cgtgcatatc aagctcaaat 1740

caacccccac cagatcaaga cataaaatca tcaaatataa accataacga tatcgaaacc 1800

gatatcgacg tgaagataat cagttgggat gctatgatcc gaatccaatc tagtaagaaa 1860

aaccatcctg ctgcacgact gatggtggct ttggaagaac ttgacttgga tatcaaccac 1920

gcgagcatct cagttgtcaa tgatctcatg atccaacaag caactgtgaa gatgggtagt 1980

cggttataca ctcaagacca gctaaggata gcattatcgt cgaaaattgg cacaactcgg 2040

tag 2043

<210> 6

<211> 2049

<212> DNA

<213> 冬瓜(Benincasa hispida)

<400> 6

atgactgact accgtttacc ccccaccatg aatctctggg cggatgacaa cgcctccatg 60

atggatgttt tcatgaacac cgatctcagt tctttctggg ttacgccgcc gcagccgcag 120

ccgcagcaac ttcctcaccc accctattcg acgtcaactg acccgagtaa acccgtcggt 180

caagcaccac caccgtcggt ttttaaccaa gagactctta tgcagcgtct ccaaacgttg 240

attgaaggtg ctcatgagaa ctggacttac gctattttct ggcagtcttc gtatgattat 300

tccggcggta cggtgttggg gtggggagat ggatattata aaggggagga agataaaggg 360

aaagagaaag cgaaatcgag cacttcgaaa gcagagcaag agcaccggaa gaaggtactt 420

cgtgagctta attctctcat ttctggttct cctacctctg aaggtgacgc cgtcgatgag 480

gttgtcaccg acaccgagtg gttctacttg gtgtcgatga ctcaatcgtt tatatccggt 540

attggattgc ccggtcaggc gtttttcgat tcgaacccta tttgggttgc tggttcggat 600

cggcttgcga gttcgttctg tgagcgagct cgtcagggtc aggttttcgg gttgcagact 660

atggtttgta tcccgtcggc gaacggagtt gttgaattgg gatcgagtga tttgattttt 720

caaaactccg atctgatgaa taaggttagg gttttgttta atttcaataa tctggaggtt 780

gagacttggc caattagtgg ggttgaccaa ggggaaaatg atccttcttc gctttggatt 840

agcgaaccat cttcaaacgc cgccattgaa attactaatc ctgttgcttc agcttcagtt 900

ccaactccaa gcacaacaaa cagccaaccg atttccaaaa ttacaacaga gtcgatcgag 960

aaccaaccta aatctagtgt tgtgattgaa actccaagct ctgctacccc tcctccttct 1020

caaaaaactc accgactgtc acagccgatt cagacacaga gcttcttcaa caacagggaa 1080

ttgaatttct ctgaatttgg gtatgagaat ggccggttga aggatgggaa ttcgacatcg 1140

ttgaagccgg aatctggtga gattctgaat tttggggaga gtaagaggaa ttcttacccc 1200

aacacagata acaacttgcc ttctggaaat tctttatttg gtggggatga gaacaagaag 1260

aagaggtctc ccacttcacg tgggagtaat gaagagggga tgctttcttt tacttctggt 1320

gtgattcttc cttcttctgg gggtgtgaaa tcgggtgttt gtgctggcga ttctgatcac 1380

tctgatcttg aagcttcggt gattcgtgag gtggagagta gtagagtggt ggaaccggag 1440

aaacggcctc gaaaaagagg gcgaaagcca gcaaatggta gagaagaacc attgaatcac 1500

gttgaagcag aaaggcagag aagagaaaag cttaaccaaa gattctatgc tcttcgagct 1560

gttgttccga atgtatcgaa aatggacaaa gcttcactcc ttggtgatgc tatctcttac 1620

atcaatgaac tcagagggaa gcttcaaact gcagaatcag ataaagagga tttgcagaag 1680

caattggatt cagtgaagaa gttaatgata tcttctagta aagatccgtg catatcaagc 1740

tcaaatcaac ccccaccaga tcaagacata aaatcatcaa atataaacca taacgatatc 1800

gaaaccgata tcgacgtgaa gataatcagt tgggatgcta tgatccgaat ccaatctagt 1860

aagaaaaacc atcctgctgc acgactgatg gtggctttgg aagaacttga cttggatatc 1920

aaccacgcga gcatctcagt tgtcaatgat ctcatgatcc aacaagcaac tgtgaagatg 1980

ggtagtcggt tatacactca agaccagcta aggatagcat tatcgtcgaa aattggcaca 2040

actcggtag 2049

Claims (5)

1.一种快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物，其特征是：包括一对性别特异性分子标记引物和一对内参基因引物，其中：

所述性别特异性分子标记引物的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示；

所述性别特异性分子标记引物的下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；

所述内参基因引物的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示；

所述内参基因引物的下游引物的序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR方法，其特征是包括以下步骤：提取中华鳖的基因组DNA，先采用权利要求1中所述的一对内参基因引物进行PCR扩增，将PCR产物进行电泳检测，在600-750bp之间显示出一条单一的亮带，说明该基因组DNA能用来对中华鳖做性别特异性PCR检测，然后再采用权利要求1中所述的一对性别特异性分子标记引物进行PCR扩增，将PCR产物进行电泳检测，在500-600bp之间显示出一条单一的亮带，判定为雌性，反之则判定为雄性。

3.根据权利要求2所述的快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR方法，其特征是：PCR扩增时，反应体系为25μL，包括：浓度为2.5mM的dNTP 2μL，模板DNA1μL，浓度为10μmol的上、下游引物各0.5μL，Taq聚合酶0.5μL，10×Buffer2.5μL，加水至25μL。

4.根据权利要求2所述的快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR方法，其特征是：PCR扩增时，PCR反应条件为：95℃变性2min后，进行30个循环，程序为：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃继续延伸10min。

5.一种快速鉴定中华鳖遗传性别的试剂盒，其特征是：包括权利要求1中所述的快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物。