CN109652563A

CN109652563A - 中华鳖zw性染色体型微创快速鉴定pcr引物组、位点、方法及试剂盒

Info

Publication number: CN109652563A
Application number: CN201910091887.2A
Authority: CN
Inventors: 许晓军; 张海琪; 朱凝瑜; 孟庆辉
Original assignee: ZHEJIANG PROVINCE AQUATIC PRODUCT TECHNOLOGY PROMOTION STATION
Current assignee: ZHEJIANG PROVINCE AQUATIC PRODUCT TECHNOLOGY PROMOTION STATION
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2019-04-19
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: CN109652563B

Abstract

本发明公开中华鳖ZW性染色体型微创快速鉴定PCR引物组、位点、方法及试剂盒。该引物组序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。本发明可以微量(0.5‑1uL)中华鳖血液为起始模板，利用前述引物组进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现2031bp大小条带时，中华鳖为ZZ性染色体型；当扩增产物出现2031bp和1624bp大小的条带时，则中华鳖为ZW性染色体型。本发明以微创采集的微量血液为起始材料，快速检测中华鳖性染色体型，并且检测对受检个体损伤极小，可以确保各生长发育阶段的中华鳖取样后均可健康存活，为中华鳖单性养殖技术与性控育种中性染色体型鉴定提供重要工具。

Description

中华鳖ZW性染色体型微创快速鉴定PCR引物组、位点、方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学鉴定技术领域，涉及中华鳖ZZ/ZW性染色体型鉴定领域，特别涉及一种可以省去基因组提取操作的微创快速鉴定中华鳖性染色体型的PCR扩增引物组、位点、方法及试剂盒。

背景技术

中华鳖(Pelodiscus sinensis)隶属于爬行纲龟鳖目鳖科鳖属，俗称甲鱼、团鱼、王八等，其在我国分布于除新疆、西藏和青海以外的各个省份。目前，中华鳖养殖业已经发展成为了大规模、有影响的特种水产养殖产业，2017年中华鳖全国总产量达32.21万吨，居世界首位。

中华鳖作为我国重要的名贵水产品之一，其养殖生产性能存在显著的性别二态性，雄鳖生长速度较雌鳖快25％-30％。国内外市场对商品中华鳖存在性别偏好，国内市场偏爱雄鳖，雄鳖价格较雌鳖高20％左右；日本出口市场偏好雌鳖，通常要求商品鳖雌雄配比为4：1。因此，中华鳖产业对单性养殖和性控育种有强烈需求，但依靠现有的技术手段尚无法实现。首先，就单性养殖而言，核心问题在于如何在早期准确鉴定稚鳖性别。因为中华鳖养殖周期长，生态养殖情况下需要1冬龄才能通过外观进行鉴别。如可以在初孵稚鳖期就准确鉴定性别，即可在稚鳖期实现单性分塘养殖，可降低成本、提高效益。另外，采用性控育种技术实现中华鳖全雄育苗，需要采取伪雌亲本(即生理雌性，性染色体ZZ型)与雄性亲本(即生理雄性，性染色体型ZZ型)的技术路线，其核心技术之一就是如何鉴别性染色体型为ZZ的伪雌个体。尽可能越早、越准确地鉴别出伪雌个体，才可以使该技术路线具有实际可操作性。

目前，ZW性染色体型鉴别的方法有性染色体Z/W形态差异观察鉴定(王伟；钱国英；李彩燕等.2014)、性染色体Z/W基因组差异荧光原位杂交鉴定(Badenhorst,D；Stanyon,R；Engstrom,T et al.2013)。然而这些方法操作繁琐，且需牺牲待检个体或对待检个体造成严重创伤，因此不符合实际应用要求。

因此，开发出早期微创ZW性染色体鉴定技术，对中华鳖单性养殖技术和性控育种技术的实现，对中华鳖产业健康可持续发展具有重要推动作用。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的PCR引物组，且仅需一对引物即可实现ZW性染色体型区分鉴别。

本发明的第二个目的是提供一种快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的PCR方法，且该方法较常规PCR方法具有以下2个明显优点：一是该PCR方法无需上游基因组提取步骤，节省时间、试剂耗材成本；二是该PCR方法样本可以从初孵稚鳖至成鳖期采用无创或微创法获得。检测只需采集微量血液(微升级)即可满足检测样品需求，且省去基因组提取步骤，直接将微量全血(0.5-1μL)加入PCR体系即可。既节省基因组提取的时间、经济成本，又可将对待检中华鳖损伤降到最低，保证各生长发育阶段中华鳖性染色体型检测后的样本存活，创伤最低。

本发明的第三个目的是提供一种快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的试剂盒。

本发明的上述第四个目的是提供一种用于鉴定中华鳖ZW性染色体型的位点。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案实现：一种快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的PCR引物组，该引物组序列如下：

ZW性染色体型鉴别正向引物序列为：

5’-TGGTGCTGTRAAGAAGGMRRCT-3’，见SEQ ID No.1。

ZW性染色体型鉴别反向引物序列为：

5’-TTCTTCATCTTCCTCCTCRGGT-3’，见SEQ ID No.2。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案实现：

方案一：首先，取将待检测中华鳖提取基因组DNA。以上述基因组DNA为模板，用SEQID No.1、SEQ ID No.2所示引物序列进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现2031bp(见SEQ ID No.3)大小的条带时，中华鳖性染色体型为ZZ型(即遗传学雄性)；当扩增产物出现2031bp(见SEQ ID No.3)和1624bp(见SEQ ID No.4)大小的条带时，中华鳖性染色体型为ZW型(即遗传学雌性)。

上述提及的PCR扩增反应体系为：

PCR扩增条件是：94℃预变性5min,94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸100s，变性到延伸过程35个循环，最后72℃延伸5min。待扩增完成后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离并凝胶成像，根据条带差异进行ZW性染色体型鉴别。

方案二：以初孵稚鳖未脱落卵黄囊内存留微量血液或稚鳖、成鳖后肢皮肤针刺微创采集微量血液为起始样本，进行了微创ZW性染色体型鉴别。采用PicoPure^TM DNAExtraction Kit的蛋白酶K进行样本裂解，再进行PCR扩增。具体为：

步骤1：

样本裂解体系配置为

中华鳖全血0.5至1μL

蛋白酶k溶液(1ug/μL) 10至10.5μL

裂解体系总体积11μL

裂解条件为65℃裂解30min，95℃灭活10min；

步骤2：

ZW性染色体特异片段PCR扩增体系配置为

PCR扩增条件是：94℃预变性5min,94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸100s，变性到延伸过程35个循环，最后72℃延伸5min。

待扩增完成后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离并凝胶成像，根据条带差异进行ZW性染色体型鉴别。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：一种中华鳖ZW性染色体型微创快速鉴定试剂盒，包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示引物。

本发明的上述第四个目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于鉴定中华鳖ZW性染色体型的位点，包括Z性染色体特异连锁片段2031bp，序列见SEQ ID No.3；W性染色体特异连锁片段1624bp，序列见SEQ ID No.4。

本发明的有益效果是：

(1)本发明中的中华鳖ZW性染色体型鉴定PCR引物组，该引物组可在中华鳖各发育生长时期鉴定其ZW性染色体型；

(2)本发明中的中华鳖ZW性染色体型微创快速PCR鉴定方法，该方法不受中华鳖发育时期限制，操作简便，结果准确直观，采用微量血液样本直接检测的技术路线，避免了常规PCR检测取样需要牺牲待检样本，或采样损伤严重影响养殖存活和商品性状的弊端。该方法为中华鳖单性养殖技术建立和性控育种相关工作开展提供重要技术支持，对中华鳖产业健康可持续发展具有重要推动作用。

附图说明

图1是实施实例2中20只中华鳖个体肌肉样本提取基因组DNA后进行ZW性染色体型PCR鉴定的电泳结果；其中M：DL2000marker；1-5号样本为中华鳖日本品系雌鳖扩增产物；6-10号样本为清溪乌鳖雌鳖扩增产物；11-15号样本为中华鳖日本品系雄鳖扩增产物；16-20号样本为清溪乌鳖雄鳖扩增产物。

图2是实施实例3中10只中华鳖稚鳖个体血液样本进行ZW性染色体型PCR鉴定的电泳结果；其中M：DL2000marker；1-5号样本为清溪乌鳖稚鳖卵黄囊微量血液扩增产物；6-10号样本为清溪乌鳖稚鳖后肢微量取血扩增产物。

具体实施方式

下面通过以下具体实施方式对本发明做进一步阐述，但是本发明的内容完全不局限于此。

实施例1

本实施例提供的快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的引物，包括1条正向引物和1条反向引物，其中：

中华鳖ZW性染色体型鉴定正向引物如SEQ ID No.1所示；

中华鳖ZW性染色体型鉴定反向引物如SEQ ID No.2所示。

具体的：

正向引物序列为：5’-TGGTGCTGTRAAGAAGGMRRCT-3’，

反向引物序列为：5’-TTCTTCATCTTCCTCCTCRGGT-3’

本方法以NCBI中华鳖基因组(Pelsin-1.0)中对比分析获得的ZW性染色体连锁基因序列数据库为基础，根据差异片段设计并验证了1对中华鳖ZW性染色型鉴别引物。

实施例2

本实施例提供的快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的PCR方法，包括以下步骤：

(1)待检中华鳖组织取样

随机选取通过外观判别的雌雄中华鳖成体各10个(1-5号样本为中华鳖日本品系雌鳖；6-10号样本为清溪乌鳖雌鳖；11-15号样本为中华鳖日本品系雄鳖；16-20号样本为清溪乌鳖雄鳖)，经解剖性腺验证生理性别后，剪取后肢肌肉组织样本，于液氮闪冻后保存于-80℃，待用；

(2)基因组DNA提取

a)采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根DP304)。取30mg肌肉组织，加入200μLGA溶液，用眼科剪刀将肌肉组织剪碎，后加入20μL蛋白酶K裂解液(天根RT403)、4μLRNaseA溶液(天根RT405-12)震荡混匀，55℃裂解2小时。

b)加入200μLGB缓冲液，充分混匀颠倒，70℃放置10min，简短离心。

c)加入200μL无水乙醇，充分混匀震荡15s，简短离心。

d)将上述混合液加入吸附柱CB3中并置于收集管内，12000rpm离心30s，弃滤液。

e)加入500μLGD缓冲液，12000rpm离心30s，弃滤液。

f)加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃滤液。

g)重复步骤f。

h)将吸附柱CB3和收集管于12000rpm离心2min。

i)将吸附柱CB3置于干净的离心管中，开盖放置5min。

j)在吸附柱CB3膜上加TE洗脱液60μL，静置5min，12000rpm离心2min，收集滤液即为基因组DNA。

(3)PCR扩增

采用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示正反向引物配置PCR扩增反应体系如下：

(4)电泳检测

PCR产物使用TAE缓冲液配制的1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，采用DL2000分子量MARKER，样品上样量5μL，电压设置5V/cm，电泳至10X loading buffer指示剂泳动至胶板三分之二处停止电泳，凝胶成像拍照。

(5)结果判定

电泳结果如图1所示，1-10号样品扩增产物出现2031bp和1624bp大小的2条条带，判定中华鳖性染色体型为ZW型(即遗传学雌性)；11-20号样品扩增产物出现2031bp大小的1条条带，判定中华鳖性染色体型为ZZ型(即遗传学雄性)。结合解剖学性别鉴定记录，判别正确率100％。

实施例3

本实施例提供的快速微创鉴定中华鳖ZW性染色体型的PCR方法，包括以下步骤：(1)初孵稚鳖血样采集

随机选取刚出壳清溪乌鳖稚鳖10只，对其中1-5号稚鳖采取注射器针在卵黄囊开孔后使用10μL移液器采集卵黄囊内血液样品1μL，转移至PCR管内；6-10号只采用注射器针刺破后肢皮肤，用10μL移液器采集末梢血1μL，转移至PCR管内。采血后每个稚鳖单独水盆放置，用10ppm高锰酸钾处理5min，暂养观察五日，无伤口感染溃烂和死亡现象，解剖鉴定稚鳖性别并记录。

(2)PCR扩增

步骤1：

样本裂解体系配置为

中华鳖全血0.5-1μL

PicoPure^TM DNA Extraction Kit

蛋白酶k溶液(1μg/μL) 10-10.5μL

裂解体系总体积11μL

裂解条件为65℃裂解30min，95℃灭活10min；

步骤2：

ZW染色体特异片段PCR扩增体系配置为

(3)电泳检测

(4)结果判定

电泳结果如图2所示，1、2、4、7、8、10号样品扩增产物出现2031bp和1624bp大小的2条条带，判定中华鳖性染色体型为ZW型(即遗传学雌性)；3、5、6、9号样品扩增产物出现2031bp大小的1条条带，判定中华鳖性染色体型为ZZ型(即遗传学雄性)。结合解剖学性别鉴定记录，判别正确率100％。

因此，本发明中的快速微创鉴定中华鳖ZW性染色体型的PCR引物组和方法可以进一步开发为试剂盒，用于各生长发育期中华鳖ZW性染色体型鉴定。

从本发明的上述试验可以发现，本发明可以快速微创鉴定中华鳖(尤其初孵稚鳖)的ZW性染色体型，且具有以下优点：

(1)不受中华鳖生长发育时期限制，初孵稚鳖也可以进行鉴定；

(2)检测根据扩增产物片段大小和条带多少进行判别，无需增扩内参基因，仅需一对引物组，一次PCR反应即可完成；

(3)检测采用血液直接检测，避免了常规分子检测基因组DNA提取步骤，节省时间和试剂成本；

(4)检测采用了微创取样，避免了相关检测方法常规组织取样造成待检中华鳖(尤其是稚鳖)的死亡和严重伤残，从而失去实际生产应用可能性。本方法检测对稚鳖生长和商品性能无不良影响。

本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细的说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江省水产技术推广总站

<120> 中华鳖ZW性染色体型微创快速鉴定PCR引物组、位点、方法及试剂盒

<130> 1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

tggtgctgtr aagaaggmrr ct 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

ttcttcatct tcctcctcrg gt 22

<210> 3

<211> 2031

<212> DNA

<213> 中华鳖(Pelodiscus)

<400> 3

tggtgctgtg aagaaggaga cttctacaaa agaagtagca agaatatgga taaatgatgt 60

aaaaatgaga agttattcac ctactatggt gagttttaag aatgaacgga tatagtttct 120

taaatgagtc ttgcatatca atgatcccta ctatctttta attcatttca acagttgccc 180

atggaagctt tgtaggttta cataatctca tagcgcatct gattctgaag gaaaattttt 240

ccctggctgc aagagttacg gggcggttga tccaacagat cacgctgctt tatcttcaaa 300

gcagttttcc tatgagtccg gggggagagt cattgaaagt ccggtatctt tcacaagaac 360

ccatcgtgtg tgctgaaagg tgtcttacct gaccaaagct gatgtgtagc tccctcactt 420

tgctgtagaa aatgtcctct ggataaattt ccctcttatg caaccagata taccactctc 480

catagtttga ggcttctaat atttctgcag aaaattgcac cagccatctg ttgtatgaca 540

gtgtaaactg tttcttggtc ctttgatatg ctggcttttt taagtgaata actagcatga 600

atactattga attaggcact taaatcttat ttcagtgaaa actagattca gatgagtctg 660

ttgtgtggta tggcacctaa aaactgtcta gatcttgaat attaaaaaga gctatctgat 720

gataaagggt cttatcttta agacctggaa aatgtttttc taattaaaaa aaaaatactg 780

cactcatctg ttgcatagta gcatgggcca ttgaaagacg atgagttatt atcatctctt 840

ttgagctaca ggcagtcccc gggttacata caagataggg actgtaggtt tgttaagttg 900

aatttgtatg caagtcggaa ctggtacata ttgtagggga aactctagcc aaacatttct 960

ccagagctca gttttattct cccacacctc acttccctca gtcctctttt ctcaaggtga 1020

gatgtctgct gagaaaagcc gctccgcgtc tccctggtct gctggcggga gaggggacga 1080

gaggggaagc agctagtgcg gggttgcctc accccatttg taagtaggga tccgatgtaa 1140

gtcggatcca tgtaacccag ggactgcctg tatattggat accacagtca tgggtgaatt 1200

acatatgcat actttccaat actttgaagt cacttgaaga tttccattgg ttaaagagtc 1260

aacatgggaa tctgctgcag atttcacaga aatgtttaca taaaggtctt ctcctttcca 1320

aattatttta caggtatagg tgctagagta cactcccaaa tgtgagccta cattttattt 1380

ctggcatgct aactgccgta aaatagaatc atactccttt ctagcatccc tttatttgaa 1440

taaagagttg tccctggttg tgttgtaaac ttaaactcca atgttttgaa ttcatgacaa 1500

ggcatacagc ttcccattgg ttcactacat ttggataatt gaagtttgaa attatgccaa 1560

ctggtacata aagtaaactt gaaaagtgca tattttggac taacagcttt ataaagtttt 1620

ggtctatagg cttggttgca gtgctccatg ctgctttgca gggtgaggtg tttctttagg 1680

gttttttgtt tgctcacatg tcctatgcta ggatggtatc attgcaaaga gttaaacgtg 1740

tatctgagag aatgccacct tcttcaaagg gcatccattt aaaaagagtg tggttgctga 1800

actcttacaa aaccttgtaa ttgaggcttt tattgttctt tggtccaggt gctgcgttat 1860

ggaaatagaa ctgaaattgt catctatact ttagcttcca ctcctcatgc ttgtacgctt 1920

ctgggaagtt gagcatcagc tatgtatcat ttgactaaag ccggtatatt tttgttttag 1980

aaagttccag taataaaaga ggaagaggaa cctgaggagg aagatgaaga a 2031

<210> 4

<211> 1624

<212> DNA

<213> 中华鳖(Pelodiscus)

<400> 4

tggtgctgta aagaaggcag cttctacgaa agtagcaaga atatggataa atgatgtaaa 60

aatgggaagt tattcaccta ccatggtgag tattaagaat gaatggctat agtagtttct 120

taaatgagtc ctacatttgc tcatggaatc ttcctaggtt tgcataatct cacagcacag 180

tagattctga aggagagttt tctctggctg caagagtggt tgatccaagc atcacactgc 240

tttatcttca gagcagtttt cctatgaatt tgggtgggag tcattttaag gtctggtacc 300

tttcacaaga acccattgtg tgtgctgaag ggtgtcctac ctgaccacag ctcatgtgca 360

gttttttcac ttggctgtag aaaatgtccc ccctcaattt ccctgtcatg caacccgata 420

caccactcca tagtttgagg ctgctaatat ttcttcagca aattggacca gccatcagtt 480

gtatgacaac gtaaacggtt tctttgctca ttgatatgct gggtgtttag tgactaacta 540

gcactaataa ctattgaatt gggcacttaa atctatttca atgagaacta gattaaatga 600

gtttgatgcg tgatcttggg tatggcacct agaagctgtc tagatctttg atattaaaaa 660

gagctatatg atgctgaagg gttttatctt taaggcatgg agaacatttt tctaatttaa 720

aaaaatactg caggcatgtg ttgtatagta gcctggacca caggaaaaca ataggttttg 780

tcatctcttt gagttatatt ggataccaca gttgtggtga attacatatg catactttcc 840

aatacttaag tcacttgaat cttcaaccaa tgaaaatctg cagcagattt catagaaata 900

tttacgtaaa ggccctctcc tttccaaatt atttcacagg tatacatgct taggtacact 960

cttaaatgta ggttcacaga tgaacatttg atgcatggca tgctgactgc agtaaaatgg 1020

aatcatactc tttctagcac ccctttatct gaataagagt tgtgtccatg gttatgtact 1080

gcacacttac accctaaggt tttgaattca tgacaaggca aacatccaaa tgtagtgaac 1140

caatgggaag ctaattgaaa ttaaaataaa actaatgcta actggaatgt taaataaact 1200

ttaaaattgc atattgtgga gtaaaagctt tataaaagtg ttggtctact tgcttagttg 1260

cagtgctcca cgctgctttg caggttttct tttttggctc acatgcccta tactagtatg 1320

gttttaattc tttccattgg aatgccacgg tcctcaaagt gcatcccttc gaaaagagta 1380

tggctgctga gcccttctaa aaccttgtaa atgacgcttt tattattctc tggttcaggt 1440

agtacattgt tatggaaaca gaactaaaat gggtgtctgt actttagctt ctgctccaca 1500

tgcctgtacg cttctgggct gttgagcatc agcaatgtat catttgacta atgcaggtat 1560

atttttgttg tagaaagttc cagaaataaa agaagaggag gaacccgagg aggaagatga 1620

agaa 1624

Claims

1.一种中华鳖ZW性染色体型鉴定PCR引物组，其特征在于该引物组序列如下：

正向引物：5’-TGGTGCTGTRAAGAAGGMRRCT-3’，见SEQ ID No.1；

反向引物：5’-TTCTTCATCTTCCTCCTCRGGT-3’，见SEQ ID No.2。

2.一种微创快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的分子方法，其特征在于利用权利要求1所述的引物对待检中华鳖样本进行PCR扩增，然后将扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现2031bp大小的条带时，中华鳖性染色体型为ZZ型(即遗传学雄性)；当扩增产物出现2031bp和1624bp大小的条带时，中华鳖性染色体型为ZW型(即遗传学雌性)。

3.如权利要求2所述的一种微创快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的分子方法，其特征在于PCR扩增反应体系为：

4.一种微创快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的分子方法，其特征在于

步骤(1)、采用PicoPure^TM DNA Extraction Kit的蛋白酶K进行样本裂解：

样本裂解体系包括中华鳖全血0.5-1μL，蛋白酶k溶液(1ug/μL)10-10.5μL；总体积为11μL；

步骤(2)、利用权利要求1所述的引物对步骤1样本裂解混合液进行PCR扩增；

步骤(3)、待扩增完成后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离并凝胶成像，当扩增产物出现2031bp大小的条带时，中华鳖性染色体型为ZZ型(即遗传学雄性)；当扩增产物出现2031bp和1624bp大小的条带时，中华鳖性染色体型为ZW型(即遗传学雌性)。

5.如权利要求4所述的一种微创快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的分子方法，其特征在于步骤(1)中华鳖全血的采样方式包括以下两种：

一是初孵稚鳖未脱落卵黄囊内存留微量血液；

二是稚鳖、成鳖后肢皮肤针刺微创采集微量血液。

6.如权利要求4所述的一种微创快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的分子方法，其特征在于步骤(1)裂解条件为65℃裂解30min，95℃灭活10min。

7.如权利要求4所述的一种微创快速鉴定中华鳖ZW性染色体型的分子方法，其特征在于步骤(2)PCR扩增体系包括如下：

8.一种中华鳖ZW性染色体型微创快速鉴定试剂盒，其特征在于包括SEQ ID No.1、SEQID No.2所示引物。

9.一种用于鉴定中华鳖ZW性染色体型的位点，其特征在于Z性染色体特异连锁片段2031bp，序列见SEQ ID No.3；W性染色体特异连锁片段1624bp，序列见SEQ ID No.4。