CN113265455B - 一种美国鹧鸪性别快速鉴定方法及引物组 - Google Patents

一种美国鹧鸪性别快速鉴定方法及引物组 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效的美国鹧鸪性别快速鉴定方法，取美国鹧鸪样品，置于裂解液中裂解后，提取基因组DNA，PCR扩增，电泳，当扩增产物只出现一条514bp特异性扩增条带时判定为雄性；当扩增产物同时出现514bp和360bp两条特异性扩增条带时判定为雌性；若此条带未出现514bp条，则不能判定检测样品的性别。本发明步骤简单且能快速且有效地区分美国鹧鸪的性别，解决了目前的禽类性别鉴定方法存在对美国鹧鸪无法有效区分性别、步骤繁琐、时间长的问题。

Description

一种美国鹧鸪性别快速鉴定方法及引物组
技术领域
本发明涉及动物鉴定方法，具体涉及一种美国鹧鸪性别快速鉴定方法。本发明还涉及美国鹧鸪性别快速鉴定引物组。
背景技术
美国鹧鸪，学名为石鸡(Alectoris chukar)，是一种饲养价值极高的珍禽。我国早在上世纪八十年度就开始从美国引进饲养，已被国家畜禽遗传资源委员会列为特禽，在禽类市场已占有一席之地。美国鹧鸪幼雏个体小，难以通过翻肛等传统方法鉴定性别。通过外形、叫声等特征鉴定性别的方法需等到8个月性成熟进入产蛋前期才能够进行。因此，不管是肉鸪还是在种鸪配对前期，通常是不分性别混合饲养。然而，不同性别的饲料转化率存在差异，公鸪留种数量也显著少于母鸪。如果能在幼雏阶段进行性别鉴定，分性别饲养，并且及早淘汰不必要的公鸪，则可以显著提高配对成功率，提高生长齐整性，从而有效增加经济效益，因此进行早期性别鉴定具有重要的意义。
目前，禽类性别鉴定的分子方法通常是从性别决定基因CHD设计特异引物，通过采取血液提取基因组DNA，进而扩增、电源来区别性别特异条带来实现，步骤繁琐，耗时长。现有的方法无法有效区分美国鹧鸪性别，如只扩增出一条带、或扩增效果不稳定，亟需设计新的特异引物以及优化后续操作方法对美国鹧鸪进行性别鉴定。并且，美国鹧鸪易受惊吓，采血进行性别鉴定的方法容易对美国鹧鸪产生应激伤害。
发明内容
针对目前的禽类性别鉴定方法存在对美国鹧鸪无法有效区分性别、步骤繁琐、时间长的问题，本发明提供一种高效的美国鹧鸪性别快速鉴定方法。
实现本发明发明目的的其中的一个技术方案为：一种高效的美国鹧鸪性别快速鉴定方法，取美国鹧鸪样品，置于裂解液中裂解后，提取基因组DNA，PCR扩增，电泳；当电泳结果中，扩增产物只出现一条514bp特异性扩增条带时判定为雄性(ZZ型)；当扩增产物同时出现514bp和360bp两条特异性扩增条带时判定为雌性(ZW型)；514bp条带为雌、雄个体共有片段，若此条带未出现，则不能判定检测样品的性别；所述PCR扩增采用的引物如下：
上游引物5’-CTGATTTTCTCTCAGATGGTGAG-3’
下游引物5’-GATCCATCAAGTCTCTAAAGAG-3’。
所述美国鹧鸪样品包括含羽髓的羽毛、口腔擦拭物和血液样品。本发明优选采用含羽髓的羽毛和口腔擦拭物，这样可以实现美国鹧鸪的无损性别鉴定。
本发明另一个目的在于提供一组用于有效进行美国鹧鸪性别鉴定的引物组。
具体地，所述引物组是根据美国鹧鸪的性别决定基因CHD设计特异性引物，其序列如下：
上游引物5’-CTGATTTTCTCTCAGATGGTGAG-3’
下游引物5’-GATCCATCAAGTCTCTAAAGAG-3’。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的方法，使用特异性引物组对性别决定基因CHD进行PCR扩增，扩增效果稳定，而且能够出现514bp和360bp两条特异性条带，有效地区分美国鹧鸪性别，配合翅号使用可以用于选育工作。
2.本发明提供的特异性引物组对美国鹧鸪性别决定基因CHD的特异性较强，使得性别鉴定结果的检出率高达98.3％。
3.本发明不使用传统的复杂的DNA提取步骤，即可快速准确地进行性别鉴定。可联合96孔PCR板和12联排移液器大批量地开展性别鉴定工作。
4.本发明的美国鹧鸪样品采用含羽髓的羽毛和口腔擦拭物时，对鹧鸪个体损害几乎可以忽略不计。而且采完样后，最快4个小时可出性别鉴定结果。
附图说明
图1为本发明以含羽髓的羽毛为样品的性别鉴定结果；
泳道1-8为雄性，9-16为雌性，M为DNA marker DL 2000。
图2为四个常见鸟类/禽类的性别分子鉴定引物组合对鹧鸪血液样品的性别鉴定电泳图；
泳道1-12为雄性，泳道13-24为雌性，M为DNA marker DL 2000。
图3-1为口腔擦拭物直接PCR扩增产物电泳鉴定结果；
泳道1-12为样品，M为DNA marker DL 2000。
图3-2为口腔擦拭物直接PCR扩增产物电泳鉴定结果；
泳道1-12为样品，M为DNA marker DL 2000。
图3-3为口腔擦拭物直接PCR扩增产物电泳鉴定结果；
泳道1-12为样品，M为DNA marker DL 2000。
具体实施方式
下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
一、可行性验证
运用本发明建立的方法对通过解剖观察性腺鉴定性别的200日龄美国鹧鸪雌雄各15只进行性别鉴定。对每个个体采取了含羽髓的羽毛、口腔擦拭物和血液样品，通过本发明提供的鉴定性别的结果与解剖性腺鉴定的结果完全吻合。具体方法参见下述第三部分的实施例。
Figure BDA0003074010070000031
Figure BDA0003074010070000041
二、引物组的特异性
随机选取经过性腺解剖鉴别，以及本发明对相应个体的血液、含羽髓羽毛和口腔擦拭物鉴别的雌雄个体各12只的血液样品，选用4对常用的鸟类/禽类性别鉴定的引物组合进行实验。结果如图2所示，引物组合gCHD、2550F/2718R和P/P8无论雌雄均只能扩增出一条带，而CHD1F/CHD1R虽然雌性个体可以扩增出两条带，但CHD1-Z条带弱，难以识别。因此，这些引物组合均不能对鹧鸪的性别准确进行有效的鉴定。
以下是具体的实施方法：
1.引物组合1
来自刘宏祥，等.快速鉴定主要禽类性别的一对新的通用引物.农业生物技术学报,2014,22(12):1567–1574。
1F：5'-TGCAGAAGCAATATTACAAGT-3'；
1R：5'-AATTCATTATCATCTGGTGG-3'。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
2.引物组合2
来自Fridolfsson et al.A simple and universal method for molecularsexing of non-ratite birds.Journal of Avian Biology,1999,30:116–121。
2550F：5'-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3'；
2718R：5'-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3'。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min。
3.引物组合3
来自Griffiths,et al.Sex of the last wild Spix’s macaw.Nature,1995,375(6531):454。Griffiths&Korn.A CHD1 gene is Z chromosome linked in the chickenGallus domesticus.Gene,1997,197,225–229。
P2：5‘-TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3’，
P8：5’-CTCCCAAGGATGATRAAYTG-3’。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min。
4.引物组合4
来自Lee et al.Molecular and Cellular Probes,2010,24:27–31。
CHD1F：5‘-TATCGTCAGTTTCCTTTTCAGGT-3’，
CHD1R：5‘-CCTTTTATTGATCCATCAAGCCT-3’。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火45s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min。
5.引物组合5
本发明提供的引物组合。
ACF：CTGATTTTCTCTCAGATGGTGAG，
ACR：GATCCATCAAGTCTCTAAAGAG。
PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，36个循环；72℃延伸5min。
三、实施例
1.以含羽髓的羽毛为样品进行的性别鉴定
准备样品：准备16只美国鹧鸪雏鸟，从每个鹧鸪雏鸟拔取两根飞羽，放入预装有50μL裂解液的0.2mL 96孔PCR板中，每孔放置一个个体样品。样品在冷冻环境下运输，-20℃保存备用。
准备基因组DNA：剪取少许羽毛根部，加入预装有50μL裂解液的0.2mL 96孔PCR管板中，加入2μL蛋白酶K，轻微涡旋混匀数秒。在PCR仪中65℃孵育10min，然后95℃处理5min，最后降至8℃。样品经过直接裂解后，4℃或-20℃放置备用或直接用于PCR扩增的模板DNA。
裂解液：成都福际生物的动物组织直接PCR试剂盒(65℃裂解)，货号TP-0111T。
PCR扩增：
反应体系为：在200μL的PCR薄壁管中，加入1μL上述制备的模板DNA、12.5μL扩增缓冲液、1μL混合引物(10μmol/L)和10.5μL灭菌水，PCR的反应体系为25μL，充分混匀后短暂离心。
PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，36个循环；72℃延伸5min。
扩增缓冲液：成都福际生物的动物组织直接PCR试剂盒(65℃裂解)，货号TP-0111T。
琼脂糖凝胶电泳：将2％琼脂糖凝胶置(预混GelRed染料)于1×TAE电泳液中。取4μL反应产物点样于凝胶孔中。室温下，合适的电压(按照电泳槽宽度×6-8V)电泳20-30分钟。在凝胶成像系统中成像并拍摄照片。
结果判断：如图1所示，当扩增产物只出现一条特异性扩增条带时判定为雄性(ZZ型，514bp)；当扩增产物同时出现两条特异性扩增条带时判定为雌性(ZW型，514bp、360bp)；514bp条带为雌、雄个体共有片段，若此条带未出现，则不能判定检测样品的性别。
2.以口腔上皮细胞擦拭物为样品进行的性别鉴定
准备样品：使用细小棉签涂抹每只鹧鸪口腔得口腔上皮细胞擦拭物，在预装有50μL裂解液的0.2mL 96孔PCR板划动数次，丢弃棉签，每孔放置一个个体样品。样品在冷冻环境下运输，-20℃保存备用。在采集样品的同时，戴上翅号。样品数为180个，样品类型为口腔擦拭物(鹧鸪口腔上皮细胞组织样品)。
准备基因组DNA：直接加1μL蛋白酶K至装有口腔上皮细胞擦拭物的PCR管中。在PCR仪中65℃孵育10min，然后95℃处理5min，最后降至8℃。样品经过直接裂解后，4℃或-20℃放置备用或直接用于PCR扩增的模板DNA。
裂解液：来自成都福际生物的动物组织直接PCR试剂盒(65℃裂解)，货号TP-0111T。
PCR扩增：
反应体系为：在200μL的PCR薄壁管中，加入1μL上述制备的模板DNA、12.5μL扩增缓冲液、1μL混合引物(10μmol/L)和10.5μL灭菌水，PCR的反应体系为25μL，充分混匀后短暂离心。
PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，36个循环；72℃延伸5min。
扩增缓冲液：来自成都福际生物的动物组织直接PCR试剂盒(65℃裂解)，货号TP-0111T。
琼脂糖凝胶电泳：将2％琼脂糖凝胶置(预混GelRed染料)于1×TAE电泳液中。取4μL反应产物点样于凝胶孔中。室温下，合适的电压(按照电泳槽宽度×6-8V)电泳20-30分钟。在凝胶成像系统中成像并拍摄照片。
结果判断：当扩增产物只出现一条特异性扩增条带时判定为雄性(ZZ型，514bp)；当扩增产物同时出现两条特异性扩增条带时判定为雌性(ZW型，514bp、360bp)；514bp条带为雌、雄个体共有片段，若此条带未出现，则不能判定检测样品的性别。图3-1至3-3所示，扩增成功样品数为177个，扩增成功率为98.3％，其中雌性鹧鸪90个，雄性鹧鸪87个。
序列表
<110> 嘉应学院
<120> 一种美国鹧鸪性别快速鉴定方法及引物组
<140> 202110546960.8
<141> 2021-05-19
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgattttct ctcagatggt gag 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatccatcaa gtctctaaag ag 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcagaagca atattacaag t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattcattat catctggtgg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttactgatt cgtctacgag a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
attgaaatga tccagtgctt g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctgcatcgc taaatccttt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcccaagga tgatraaytg 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tatcgtcagt ttccttttca ggt 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccttttattg atccatcaag cct 23

Claims (4)

1.一种高效的美国鹧鸪Alectoris chukar性别快速鉴定方法，其特征是，取美国鹧鸪样品，置于裂解液中裂解后，提取基因组DNA，PCR扩增，电泳，当扩增产物只出现一条514 bp特异性扩增条带时判定为雄性；当扩增产物同时出现514 bp和360 bp两条特异性扩增条带时判定为雌性；若此条带未出现514 bp条，则不能判定检测样品的性别；所述PCR扩增采用的引物如下：
上游引物5’-CTGATTTTCTCTCAGATGGTGAG-3’
下游引物5’-GATCCATCAAGTCTCTAAAGAG-3’。
2.根据权利要求1所述的高效的美国鹧鸪Alectoris chukar性别快速鉴定方法，其特征是，所述美国鹧鸪样品包括含羽髓的羽毛、口腔擦拭物和血液样品中的一种。
3.根据权利要求1所述的高效的美国鹧鸪Alectoris chukar性别快速鉴定方法，其特征是，所述美国鹧鸪样品为含羽髓的羽毛或口腔擦拭物。
4.用于美国鹧鸪Alectoris chukar性别鉴定的引物组，其特征是，所述引物组的序列如下：
上游引物5’-CTGATTTTCTCTCAGATGGTGAG-3’
下游引物5’-GATCCATCAAGTCTCTAAAGAG-3’。
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