CN112877445B - 一种用于哲罗鲑遗传性别鉴定的微卫星标记、引物及鉴定方法和应用 - Google Patents
一种用于哲罗鲑遗传性别鉴定的微卫星标记、引物及鉴定方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于哲罗鲑遗传性别鉴定的微卫星标记、引物及鉴定方法和应用。该微卫星标记的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。鉴定哲罗鲑遗传性别的方法包括采集哲罗鲑雌鱼、雄鱼鳍条样本；提取鳍条样本基因组DNA，进行PCR扩增；电泳检测所得PCR扩增产物；当电泳显示1条208bp条带时为哲罗鲑雌鱼，显示208bp和331bp2条带时为哲罗鲑雄鱼。本发明的微卫星标记及鉴定方法能够准确、高效地鉴别哲罗鲑性别，不需要杀鱼，简单、快速，省去繁琐的测序步骤，提高鉴定的准确性，还可用于哲罗鲑早期性别鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及哲罗鲑遗传性别的鉴定，具体涉及一种准确鉴定哲罗鲑遗传性别的微卫星标记及引物和应用。
背景技术
哲罗鲑Hucho taimen(pallas)隶属鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)，哲罗鱼属(Hucho)，是我国珍稀名贵的冷水性鱼类，肉质细嫩、味道鲜美。哲罗鲑是鲑科鱼类中个体最大的鱼类，生长迅速，性成熟时无第二性征，野生状态下雌鱼5～6龄性成熟，雄鱼4～5龄性成熟。性成熟的哲罗鲑只有在繁殖季节有婚姻色，鱼体尾部发红，且部分亲鱼婚姻色不明显，不同水域的哲罗鲑婚姻色也存在差异，难以通过婚姻色鉴定性别。
哲罗鲑属于珍稀名贵冷水性鱼类，资源匮乏，野生鱼鉴定性别时，需要杀鱼，取性腺，石蜡切片才能鉴别雌、雄，不但过程繁琐，而且不能全面了解性比，性腺未发育的幼鱼没法鉴定。养殖过程中虽然哲罗鲑雌、雄生长差异较小，但哲罗鲑的鱼卵营养丰富，可以用来做鱼子酱，商品价格远远超过雄鱼；且人工授精时1尾雄鱼的精液能与2～4尾的哲罗鲑雌鱼配组，因此在后备亲鱼培育过长中，需要早期进行性别筛选，避免饲养过多的雄鱼，造成不必要的浪费。鉴于以上原因亟需一种简单、准确的方法对哲罗鲑进行雌、雄鉴别。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于哲罗鲑遗传性别鉴定的微卫星标记、引物及鉴定方法和应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种用于哲罗鲑遗传性别鉴定的微卫星标记，所述微卫星标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
一种用于哲罗鲑遗传性别鉴定的微卫星标记的引物，所述微卫星标记的上游引物为：
1F 5’-CACTGGGGTACAAAAGAGCAA-3’；
下游引物为：1R 5’-ACGGGCCTTTTTAAAGCACT-3’。
一种利用所述的微卫星标记鉴定哲罗鲑遗传性别的方法，包括以下步骤：
(1)采集哲罗鲑雌鱼、雄鱼样本，剪取鳍条样本放于体积含量95％的乙醇中保存，24h后更换1次乙醇，-20℃保存，备用；
(2)提取哲罗鲑雌鱼、雄鱼鳍条样本基因组DNA，用紫外分光光度计测定DNA浓度，将DNA浓度稀释至50ng/L，备用；
(3)以步骤(2)所得基因组DNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增时采用所述的微卫星标记的引物；
(4)利用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测步骤(3)所得PCR扩增产物，凝胶成像仪照相，记录结果；
当电泳显示一条208bp条带时为哲罗鲑雌鱼，显示208bp和331bp两条带时为哲罗鲑雄鱼。
PCR扩增的反应体系为25μL，包括2×PCR mix 12.5μL、DNA2μL、5μmol/L的微卫星标记的上下游引物各2μL、1μmol/L的18s参照上下游引物各2μL，加无酶水补足25μL，混匀。
18s参照的上游引物为：
18s F 5’-CCCCTCGATGCTCTTAACTG-3’；
下游引物为：18s R 5’-ACCTCTAGCGGCACAATACG-3’。
PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸7min；10℃保存。
所述的微卫星标记在鉴定哲罗鲑遗传性别中的应用。
所述的微卫星标记的引物在鉴定哲罗鲑遗传性别中的应用。
本发明有益效果：
本发明的微卫星标记可用于哲罗鲑遗传性别的鉴定，能够准确、高效地鉴定哲罗鲑的性别。采用本发明的微卫星标记，鉴定性别时不需要杀鱼，仅需要鳍条样本提取DNA，进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，通过比较雌鱼、雄鱼扩增产物的条带，即可显示鉴别结果，简单、快速，省去了繁琐的测序步骤，该方法还可用于哲罗鲑早期的性别鉴定。
本发明的鉴定方法中加入18s基因作为参照，18s和性别特异性微卫星标记均是基因组DNA上的标记。当存在基因组DNA降解、加样生物失误等外部原因造成PCR扩增失败时，18s基因参照也无条带，说明试验存在问题；当18s基因有条带，性别特异性微卫星无条带时，说明条带差异是由于基因组DNA差异造成的。本申请选用18s基因为参照，18s是qPCR的内参基因，稳定存在于基因组中，可以避免线粒体DNA完整、基因组DNA降解时造成的误判。当微卫星引物浓度和18s参照浓度比为5:1时二者均能扩增出较为清晰的条带，因此18s基因的加入可以提高本发明鉴定的准确性，减少误判。
附图说明
图1为本发明应用例中选取的1条雌鱼和1条雄鱼的凝胶电泳鉴别图。
其中：雌鱼为208bp、雄鱼为331bp和208bp，M为DNAmarker。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1一种准确鉴定哲罗鲑遗传性别的微卫星标记及引物
一种准确鉴定哲罗鲑遗传性别的微卫星标记，所述微卫星标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其中重复单元为GGGTTA，核心序列为(GGGTTA)16GGTTA(GGGTTA)5GGTTA(GGGTTA)7。
一种准确鉴定哲罗鲑遗传性别的微卫星标记引物，所述微卫星标记的上游引物为：1F 5’-CACTGGGGTACAAAAGAGCAA-3’(SEQ ID NO：2)；
下游引物为：1R 5’-ACGGGCCTTTTTAAAGCACT-3’(SEQ ID NO：3)。
实施例2利用微卫星标记鉴定哲罗鲑遗传性别的方法
一种准确鉴定哲罗鲑遗传性别的方法，包括以下步骤：
(1)采集哲罗鲑雌鱼、雄鱼样本，剪取鳍条样本放于体积含量95％的乙醇中保存，每24h更换1次乙醇，-20℃保存，备用；
(2)提取哲罗鲑雌鱼、雄鱼鳍条样本基因组DNA，用紫外分光光度计测定DNA浓度，将DNA浓度稀释至50ng/L，备用；
(3)以步骤(2)所得基因组DNA为模板进行PCR扩增；
PCR扩增的反应体系为25μL，18s参照引物设置4个浓度梯度(1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L和10μmol/L)分别进行PCR扩增；25μL扩增体系包括2×PCR mix 12.5μL、DNA2μL、5μmol/L的微卫星标记的上下游引物各2μL、18s参照引物的上下游引物各2μL，加无酶水补足25μL，混匀。
所述微卫星标记的上游引物为：1F 5’-CACTGGGGTACAAAAGAGCAA-3’(SEQ ID NO：2)；下游引物为：1R 5’-ACGGGCCTTTTTAAAGCACT-3’(SEQ ID NO：3)。
所述18s参照标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
18s参照上游引物为：18s F 5’-CCCCTCGATGCTCTTAACTG-3’(SEQ ID NO：5)；
下游引物为：18s R 5’-ACCTCTAGCGGCACAATACG-3’(SEQ ID NO：6)。
PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸7min；10℃保存。
(4)利用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测步骤(3)所得PCR扩增产物，凝胶成像仪照相，记录结果；随着18s参照引物浓度的增加，18s参照引物扩增条带亮度呈先下降后上升趋势，微卫星引物扩增条带亮度呈现递减趋势。当18s参照引物浓度为10μmol/L时，仅有18s参照引物扩增条带，微卫星引物无扩增条带。当18s参照引物浓度为1μmol/L，微卫星引物浓度为5μmol/L时，二者条带均比较清晰。在此比例下电泳显示1条208bp条带时为哲罗鲑雌鱼，显示208bp和331bp 2条带时为哲罗鲑雄鱼。
应用例
1、已知性别的群体获得：春季4～5月哲罗鲑繁殖季节鉴定雌、雄，采集哲罗鲑雌鱼、雄鱼样本各50尾，剪取鳍条样本放在体积含量为95％乙醇中保存，24h后更换1次95％乙醇，保存在-20℃冰箱备用。
2、基因组DNA提取：将鳍条样本用蒸馏水清洗3次，并用滤纸吸干水分，将鳍条剪碎，用血液/组织基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)提取哲罗鲑雌鱼和雄鱼鳍条基因组DNA，用紫外分光光度计测定DNA浓度，将DNA浓度稀释至50ng/μL，备用。
3、以所得基因组DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系为25μL，包括2×PCRmix12.5μL、DNA 2μL、5μM的微卫星标记的上下游引物各2μL、1μM的18s参照上下游引物各2μL，加无酶水补足25μL，混匀。将反应体系混匀后进行PCR扩增，PCR扩增程序如下：95℃预变性5min，(95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s)×32个循环，72℃延伸7min，10℃保存。
其中特异性微卫星引物和18s参照引物，在此条件下均能够达到有效的扩增，得到较为清晰的条带。
4、电泳分析：取8μLPCR扩增产物，用2.0％琼脂糖凝胶电泳分析条带，凝胶成像仪照相，记录结果。当电泳显示1条带(208bp)时为雌鱼，显示2条带(208bp和331bp)时为雄鱼。
结果显示，用于分析的50条雌鱼均扩增出1条带，为208bp；50条雄鱼均扩增出2条带，分别为208bp和331bp，鉴定结果与采样相符(如图1所示)。
序列表
<110> 河南牧业经济学院
<120> 一种用于哲罗鲑遗传性别鉴定的微卫星标记、引物及鉴定方法和应用
<130> PCR扩增
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 331
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cactggggta caaaagagca aaaataaata acaatatggg ttagggttag ggttagggtt 60
agggttaggg ttagggttag ggttagggtt agggttaggg ttagggttag ggttagggtt 120
agggttaggg ttaggttagg gttagggtta gggttagggt tagggttagg ttagggttag 180
ggttagggtt agggttaggg ttagggttag ggtttgaata tcattgtgtt ttgtatcaac 240
tcatttgttt ttcgttgcac aggcctatct cctgtttatc ccccctctta atgatgtgtt 300
gtgttgcatg tagtgcttta aaaaggcccg t 331
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
cactggggta caaaagagca a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
acgggccttt ttaaagcact 20
<210> 4
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cccctcgatg ctcttaactg agtgtcccgc ggggtccgaa gcgtttactt tgaaaaaatt 60
agagtgttca aagcaggccc ggtcgcctga ataccgcagc taggaataat ggaataggac 120
tccggttcta ttttgtgggt ttttcttctg aactggggcc atgattaaga gggacggccg 180
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<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
cccctcgatg ctcttaactg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
acctctagcg gcacaatacg 20
Claims (8)
1.一种用于哲罗鲑遗传性别鉴定的微卫星标记，其特征在于，所述微卫星标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种如权利要求1所述的用于哲罗鲑遗传性别鉴定的微卫星标记的引物，其特征在于，所述微卫星标记的上游引物为：
1F 5’-CACTGGGGTACAAAAGAGCAA-3’；
下游引物为：1R 5’-ACGGGCCTTTTTAAAGCACT-3’。
3.一种利用权利要求1所述的微卫星标记鉴定哲罗鲑遗传性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集哲罗鲑雌鱼、雄鱼样本，剪取鳍条样本放于体积含量95％的乙醇中保存，24h后更换1次乙醇，-20℃保存，备用；
(2)提取哲罗鲑雌鱼、雄鱼鳍条样本基因组DNA，用紫外分光光度计测定DNA浓度，将DNA浓度稀释至50ng/L，备用；
(3)以步骤(2)所得基因组DNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增时采用如权利要求2所述的微卫星标记的引物；
(4)利用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测步骤(3)所得PCR扩增产物，凝胶成像仪照相，记录结果；
当电泳显示一条208bp条带时为哲罗鲑雌鱼，显示208bp和331bp两条带时为哲罗鲑雄鱼。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为25μL，包括2×PCRmix12.5μL、DNA2μL、5μmol/L的微卫星标记的上下游引物各2μL、1μmol/L的18s参照上下游引物各2μL，加无酶水补足25μL，混匀。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，18s参照的上游引物为：
18s F 5’-CCCCTCGATGCTCTTAACTG-3’；
下游引物为：18s R 5’-ACCTCTAGCGGCACAATACG-3’。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸7min；10℃保存。
7.一种如权利要求1所述的微卫星标记在鉴定哲罗鲑遗传性别中的应用。
8.一种如权利要求2所述的微卫星标记的引物在鉴定哲罗鲑遗传性别中的应用。
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