CN114921566B - 用于鉴别彭泽鲫自交子代与鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的分子标记及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴别彭泽鲫自交子代与鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的分子标记及其试剂盒，本发明基于基因组、转录组数据的比较研究，通过序列相似性，同源基因组比较，鉴定开发出了具有鳡与兴国红鲤的分子标记和特异性引物，可有效用于彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的鉴别；该试剂盒具有操作简便，实验步骤少、成本低，且对鱼体伤害最小的特点，能广泛应用在生产实践中，该试剂盒能有效鉴别彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代。

Description

用于鉴别彭泽鲫自交子代与鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育 子代的分子标记及其试剂盒
技术领域
本发明涉及水产动物繁殖育种技术领域，具体涉及一种用于鉴别彭泽鲫自交子代与鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的分子标记及其试剂盒。
背景技术
彭泽鲫(Carassius auratus var.pengze)属鲤科，鲤亚科，鲫属，是一种三倍体雌核发育生殖的鱼类。鳡(Elopichthys Bambusa)属鲤科，雅罗鱼亚科，鳡属，是一种二倍体两性生殖的鱼类。
彭泽鲫是农业部向全国重点推广的五种淡水鱼之一，肉味鲜美，肉质嫩爽，营养丰富，含人体所必需的八种氨基酸；鳡是一种大型的淡水经济鱼类，生长快、个体大、肉味鲜美，一向被视为高档淡水鱼类。二者亲缘关系较远，形态结构、生长特性差异较大。兴国红鲤(Cyprinus carpiou var.singuonensis)产于江西省兴国县，属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鲤属(Cyprinus)，其背宽肉厚、肉质鲜美、生长快、食性广且抗逆性强，同时兴国红鲤杂交亲和力强，是重要的杂交亲本。雌性彭泽鲫与雄性兴国红鲤间的人工繁殖可以产出两类正常的后代，一类是异精雌核发育子代，另一类是杂交子代，即异源四倍体鲫鲤。杂交子代在生长速度与鱼肉品质方面均优于彭泽鲫原种与异精雌核发育子代，在养殖适应性、耐低氧、抗病力等方面优于鳡，在相同养殖条件下，杂交子代生长快，养殖周期短，可降低养殖成本及减少养殖过程中因病害所造成的损失。
异源四倍体鲫鲤具有易繁殖、养殖适应性广、耐低氧、抗病力强等优良性状；鳡的养殖适应性与低氧耐受力较彭泽鲫低，养殖成本较高，但在生长速度、个体大小与鱼肉品质方面更具优势。有研究表明，利用异源精子诱导彭泽鲫卵子所获得的雌核发育子代在生长性能方面显著优于彭泽鲫自交。因此，培育异源四倍体鲫鲤与鳡的雌核发育后代并获得性状更优良的鱼种具有重要意义。
鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代与彭泽鲫自交子代形态特征相似且难以区分。现有的鉴定方法主要是依据外观形态区分或利用流式细胞仪分析血细胞中DNA的含量。前一种基于形态学鉴定的方法简单直观，如测量体长、体高、头长、吻长、眼间距、尾柄长与体长比等可量性状，但是由于两种鱼的可量性状差异较小，这种检验方式对专业知识的要求较高，同时还需要对被检测鱼的来源背景与生活环境有一定的了解，鉴定结果才能具有较高的准确性。
近些年流式细胞仪的改良与应用进入了一个快速发展时期，流式细胞仪可以分析血细胞内的DNA含量从而对鱼类进行染色体倍性鉴定，但是由于设备价格与单个样品检测成本昂贵，并不适用于大批量鱼种的检测。到目前为止，现有的技术还没有能低成本且高效的解决这一问题。
物种特有的DNA序列片段将可以作为分子标记运用到物种间的鉴别上。通过基因组测序、转录组测序等手段获得该物种的序列信息。如何获得物种特有的DNA序列片段成为了目前研究的热点问题。
目前有关鉴别彭泽鲫自交子代与鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的分子标记尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种用于鉴别彭泽鲫自交子代与鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的分子标记及其引物和试剂盒，本发明基于基因组、转录组数据的比较研究，通过序列相似性，同源基因组比较，鉴定开发出了具有鳡与兴国红鲤的分子标记和特异性引物，可有效用于彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的鉴别；该试剂盒具有操作简便，实验步骤少、成本低，且对鱼体伤害最小的特点，能广泛应用在生产实践中，该试剂盒能有效鉴别彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代。
为实现上述目的，本发明所设计一种用于鉴别彭泽鲫自交子代与鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的分子标记，所述分子标记OG-10的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种鳡与鲤共有的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供了一种用于鉴别彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的引物对，所述引物对为：
正向引物F：5’-ACAGTAATCAACAGGACCAATGGA-3’；
反向引物R：5’-TTCTTTGTTTTCTGGTCCAAGCTC-3’。
本发明还提供了一种用于彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对。
进一步地，所述试剂盒还包括细胞裂解液、蛋白酶K、7.5M醋酸铵、异丙醇、70％乙醇、无水乙醇、2×Premix Taq、ddH2O，其中，2×Premix Taq的主要成分为0.05U/μL TaqDNA聚合酶、3mM Mg2+、0.4mM dNTPs
再进一步地，所述细胞裂解液的成分为：Tris-HCL 100mM，pH 8.0；EDTA50mM，pH8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl 125mM。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒鉴别彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的方法，包括以下步骤：
1)待检测样品提取DNA
2)以提取DNA为模板，采用引物对进行PCR；得到PCR产物；
3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测：
若电泳条带中含有327bp的条带时，该待检测样品为鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代；
若电泳条带中无条带时，该待检测样品为彭泽鲫自交子代。
作为优选方案，所述步骤1)中，DNA提取方法如下：
取0.02g脱酒精后的待检测样品的组织，置于2mL EP管中，加入600μL组织裂解液，将样品剪碎处理并加入15μL 10mg/mL的蛋白酶K混匀，65℃水浴2-4h，定时摇匀，置于冰上冷却至室温，每管加200μL醋酸铵(7.5mol/L)混匀，冰上放置5min，4℃12000r/m离心10min后，取上清至EP管(1.5mL)中，重复该过程一次，加入600μL异丙醇，冰上静置1-2min，4℃12000r/m离心10min，弃上清，加入1mL 70％乙醇洗涤DNA，4℃12000r/m离心2min，弃上清，加入1mL无水乙醇洗涤DNA，4℃12000r/m离心2min，弃上清；自然干燥15min，加入适量TE溶解DNA沉淀。
作为优选方案，所述步骤2)中，PCR扩增体系为
PreMix PCR buffer 5μL
正向引物F 0.5μL
反向引物R 0.5μL
DNA模板 0.5μL
灭菌水 3.5μL
总体积 10μL
PCR扩增程序为：94℃持续3min；94℃持续45s，56℃持续35s，72℃持续30s，30个循环；72℃持续10min；冷却至4℃。
本发明的有益效果：
1.本发明所得分子标记为显性标记，操作简便，成本低，实验周期短，可应用于彭泽鲫与鳡间杂交后代的规模化鉴别，在稚鱼期至成鱼期均可高效应用。
2.本发明基于鲫的基因组数据、鲤的基因组数据、鳡的转录组数据与生信分析相关知识，在基因层面上提供了一种鉴别彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的方法，有效的避免了外观形态难以区分、背景来源不明确及加工形态破坏等造成的难以鉴别的问题，并且具有简便、快速、高效、准确和低成本的优点。
3.本发明的一对引物，基于鳡与兴国红鲤特有的DNA分子片段，在PCR扩增过程中，引物具有特异性强、扩增效率高、不会产生引物二聚体等特点，PCR产物只需琼脂糖凝胶电泳检测便可直观的进行区分，一次PCR最多同时可鉴别96个待测样本，具有简便、快速、高效、准确和低成本的特点。
附图说明
图1为彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代分子标记的琼脂糖凝胶电泳图；
图中，P×P为彭泽鲫自交子代，PX-G为鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代，G为鳡，X为兴国红鲤。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
鳡与鲤共有的DNA片段的筛选方法，包括以下步骤：
1.鲫与鲤的基因组数据与鳡转录组数据的获取
从NCBI(National Center for Biotechnology Information)官方网站上分别搜索鲫的基因组数据(GenBank accession no.ASM336829v1)、鲤的基因组数据(GenBankaccession no.ASM1834038v1)与鳡的转录组数据(GenBank accession no.SRX288503)，分别下载至本地服务器中，下载数据格式为Ref Seq；
2.鳡转录组数据的组装
1)使用fastq-dump软件将从NCBI上下载的鳡转录组数据SRR886276.sra文件拆分为SRR886276.sra_1.fastq与SRR886276.sra_2.fastq文件；
2)使用trimmomatic软件分别除去SRR886276.sra_1.fastq与SRR886276.sra_2.fastq文件中质量较差的测序数据，并产出SRR886276.sra_1.paired.fastq与SRR886276.sra_2.paired.fastq文件；
3)使用Trinity软件对SRR886276.sra_1.paired.fastq与SRR886276.sra_2.paired.fastq文件进行组装，组装完成后生成Trinity.fasta文件；
4)最后使用TransDecoder.LongOrfs与TransDecoder.Predict软件提取Trinity.fasta中最长的开放阅读框序列，并生成Trinity.fasta.transdecoder.cds、Trinity.fasta.transdecoder.pep文件；
5)使用OrthoFinder软件对ASM336829v1_protein.faa、ASM1834038v1_protein.faa与Trinity.fasta.transdecoder.pep文件进行比较分析，并生成Orthogroups.GeneCount.tsv与Orthogroups.tsv文件；
6)从Orthogroups.GeneCount.tsv文件中筛选出鳡与鲤特有的Orthogroup，根据Orthogroup的编号从Orthogroups.tsv文件中获取鳡与鲤特有的转录本编号，最后根据转录本的编号从Trinity.fasta.transdecoder.cds文件中提取出对应的转录本至新建的Candidate.fasta文件中，Candidate.fasta文件中所包含的序列片段即为候选的特有分子序列；
3.选取鳡与鲤共有的DNA片段
从上述候选的特有分子序列中选取鳡与鲤共有的DNA片段，该DNA片段总长为624bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示：
CCGAATACAGTAATCAACAGGACCAATGGAGCCGCCAGTAGACATCCAGCCAACAGACATTCCCAAATACAAAACAGTGGTACCACTCAAGTGGGCCCAAACATCAGTCAGCATGGAAAAGGAAACTCTGATAGCTCTTTTTCCACAGACCATCTAACGGAAAACGATAATAAGACTCGGGAATATGTGTTGATCGAAACAGATGGATCCATTGAGCATGTGGGGGTCAACAATGCCACGTCAACAGGGTTTGTACTAACATGGGCTGCACCGAAAGAAAAGTTCAAACACTTCGTAATCACTCAAACTGAGCTTGGACCAGAAAACAAAGAAAAGGATGAGATGGAAAAACACGGAGAGACGAACGGCGAGGAAAAAGTCGATGATGGGATGGGACTTAAGACAACAGCAGCAAAGAAAAATAGTTTGAGCAAAGGAAAAGCTGAACTTGAACCCAATGTACAGAGAACAAAGATGAACAAGAGTGGAGGAAACTTGACTACAGTTCTCCCTGGATCGGCCCGTTCACACCAAATGACGAATCTCAGCCCACAGACCAGGTATTCTGTGTCCATCTTTGGGAAGGGACCTGCGTTTCGCTCCAAAACTCACAACCTCGTCATT。
实施例2
用于鉴别彭泽鲫自交子代与鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的分子标记及其引物设计
1.利用Primer3Web，基于上述鳡与鲤共有的DNA序列区内进行引物对设计，即引物对为：
正向引物F：5’-ACAGTAATCAACAGGACCAATGGA-3’，SEQ ID NO:2所示；
反向引物R：5’-TTCTTTGTTTTCTGGTCCAAGCTC-3’，SEQ ID NO:3所示；
2.上述引物鉴定鉴别彭泽鲫自交子代与鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代方法如下：
2.1利用上述引物进行PCR扩增；其中，
PCR扩增体系为10μL，各组分为：PreMix PCR buffer，5μL；引物(SEQ ID:1/2)各0.5μL；DNA模板，0.5μL；灭菌水，3.5μL；
PCR扩增程序为：94℃持续3min；94℃持续45s，56℃持续35s，72℃持续30s，30个循环；72℃持续10min。冷却至4℃。
2.2采用琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，选出符合要求的引物，筛选标准如下：
a.鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育后代DNA的PCR产物中均出现明亮条带，且片段大小一致；该片段即用于鉴别彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的分子标记，总长为327bp，并且该分子标记命名为OG-10；其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
ACAGTAATCAACAGGACCAATGGAGCCGCCAGTAGACATCCAGCCAACAGACATTCCCAAATACAAAACAGTGGTACCACTCAAGTGGGCCCAAACATCAGTCAGCATGGAAAAGGAAACTCTGATAGCTCTTTTTCCACAGACCATCTAACGGAAAACGATAATAAGACTCGGGAATATGTGTTGATCGAAACAGATGGATCCATTGAGCATGTGGGGGTCAACAATGCCACGTCAACAGGGTTTGTACTAACATGGGCTGCACCGAAAGAAAAGTTCAAACACTTCGTAATCACTCAAACTGAGCTTGGACCAGAAAACAAAGAA
b.彭泽鲫自交后代DNA的PCR产物中均未出现条带。
实施例3
用于彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的试剂盒包括上述的引物对和细胞裂解液、蛋白酶K、7.5M醋酸铵、异丙醇、70％乙醇、无水乙醇、2×PremixTaq、ddH2O；其中，2×Premix Taq的主要成分为0.05U/μL Taq DNA聚合酶、3mM Mg2+、0.4mMdNTPs；
上述细胞裂解液的成分为：Tris-HCL 100mM，pH 8.0；EDTA50mM，pH 8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl 125mM。
利用上述试剂盒鉴别彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的方法，包括以下步骤：1)待检测样品提取DNA，DNA提取方法如下：
取0.02g脱酒精后的待检测样品的组织，置于2mL EP管中，加入600μL组织裂解液，将样品剪碎处理并加入15μL 10mg/mL的蛋白酶K混匀，65℃水浴2-4h，定时摇匀，置于冰上冷却至室温，每管加200μL醋酸铵(7.5mol/L)混匀，冰上放置5min，4℃12000r/m离心10min后，取上清至EP管(1.5mL)中，重复该过程一次，加入600μL异丙醇，冰上静置1-2min，4℃12000r/m离心10min，弃上清，加入1mL 70％乙醇洗涤DNA，4℃12000r/m离心2min，弃上清，加入1mL无水乙醇洗涤DNA，4℃12000r/m离心2min，弃上清；自然干燥15min，加入适量TE溶解DNA沉淀；
2)以提取DNA为模板，采用引物对进行PCR；得到PCR产物；
PCR扩增体系为
PreMix PCR buffer 5μL
正向引物F 0.5μL
反向引物R 0.5μL
DNA模板 0.5μL
灭菌水 3.5μL
总体积 10μL
PCR扩增程序为：94℃持续3min；94℃持续45s，56℃持续35s，72℃持续30s，30个循环；72℃持续10min；冷却至4℃。
3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测：
若电泳条带中含有327bp的条带时，该待检测样品为鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代；
若电泳条带中无条带时，该待检测样品为彭泽鲫自交子代。
实施例4
上述试剂盒用于鉴定彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育后代，具体方法如下：
1)待测样本的DNA提取(醋酸铵法)
a.分别剪取1条鳡、1条兴国红鲤、1条彭泽鲫原种鱼、30条彭泽鲫自交子代鱼与22条鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育后代鱼的背鳍末端鳍条，放入装有100％乙醇的2ml EP管中进行脱水，将样品带回实验室，并放入﹣80℃冰箱中保存。
b.取0.02g脱酒精后的鳍条组织，置于2mL EP管中，加入600μL组织裂解液，将样品剪碎处理并加入15μL 10mg/mL的蛋白酶K混匀，65℃水浴2-4h，定时摇匀，置于冰上冷却至室温，每管加200μL醋酸铵(7.5mol/L)混匀，冰上放置5min。4℃12000r/m离心10min后，取上清至EP管(1.5mL)中，重复该过程一次，加入600μL异丙醇，冰上静置1-2min，4℃12000r/m离心10min，弃上清，加入1mL 70％乙醇洗涤DNA，4℃12000r/m离心2min，弃上清，加入1mL无水乙醇洗涤DNA，4℃12000r/m离心2min，弃上清。自然干燥15min，加入适量TE溶解DNA沉淀。
c.检测DNA纯度：使用Thermo NanoDrop 2000分光光度计对1μL DNA上样样品进行浓度、A260/A280及A260/A230测量。
d.琼脂糖凝胶电泳：取2μLDNA样品与1μL上样缓冲液混匀，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA(120V，20min)。在照胶仪下观察DNA条带。比较获得的DNA质量，取合格的DNA样本进行后续的分析。
2)以提取不同待测样本的DNA为模板，采用引物对进行PCR；得到PCR产物；
PCR扩增体系为
PreMix PCR buffer 5μL
正向引物F 0.5μL
反向引物R 0.5μL
DNA模板 0.5μL
灭菌水 3.5μL
总体积 10μL
PCR扩增程序为：94℃持续3min；94℃持续45s，56℃持续35s，72℃持续30s，30个循环；72℃持续10min；冷却至4℃。
3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测：
若电泳条带中含有327bp的条带时，该待检测样品为彭泽鲫与鳡间杂交四倍体子代；
若电泳条带中无条带时，该待检测样品为彭泽鲫自交子代。
如图1所示：从左至右，依次为DL2000 DNA marker；30条彭泽鲫自交子代的PCR产物；22条鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育后代的PCR产物；1条鳡的PCR产物；1条兴国红鲤的PCR产物；最右侧为阴性对照。本方法共检测54个DNA样本，其中左侧30个未扩增出条带的为彭泽鲫自交后代，右侧24个扩增出327bp条带的分别为鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育后代、鳡与兴国红鲤。通过该检测方法，说明该分子标记判别率达到100％。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 用于鉴别彭泽鲫自交子代与鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的分子标记及其试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acagtaatca acaggaccaa tggagccgcc agtagacatc cagccaacag acattcccaa 60
atacaaaaca gtggtaccac tcaagtgggc ccaaacatca gtcagcatgg aaaaggaaac 120
tctgatagct ctttttccac agaccatcta acggaaaacg ataataagac tcgggaatat 180
gtgttgatcg aaacagatgg atccattgag catgtggggg tcaacaatgc cacgtcaaca 240
gggtttgtac taacatgggc tgcaccgaaa gaaaagttca aacacttcgt aatcactcaa 300
actgagcttg gaccagaaaa caaagaa 327
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acagtaatca acaggaccaa tgga 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttctttgttt tctggtccaa gctc 24
<210> 4
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgaatacag taatcaacag gaccaatgga gccgccagta gacatccagc caacagacat 60
tcccaaatac aaaacagtgg taccactcaa gtgggcccaa acatcagtca gcatggaaaa 120
ggaaactctg atagctcttt ttccacagac catctaacgg aaaacgataa taagactcgg 180
gaatatgtgt tgatcgaaac agatggatcc attgagcatg tgggggtcaa caatgccacg 240
tcaacagggt ttgtactaac atgggctgca ccgaaagaaa agttcaaaca cttcgtaatc 300
actcaaactg agcttggacc agaaaacaaa gaaaaggatg agatggaaaa acacggagag 360
acgaacggcg aggaaaaagt cgatgatggg atgggactta agacaacagc agcaaagaaa 420
aatagtttga gcaaaggaaa agctgaactt gaacccaatg tacagagaac aaagatgaac 480
aagagtggag gaaacttgac tacagttctc cctggatcgg cccgttcaca ccaaatgacg 540
aatctcagcc cacagaccag gtattctgtg tccatctttg ggaagggacc tgcgtttcgc 600
tccaaaactc acaacctcgt catt 624

Claims (4)

1.一种用于鉴别彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的引物对，其特征在于：所述引物对为：
正向引物F：5’- ACAGTAATCAACAGGACCAATGGA-3’；
反向引物R：5’- TTCTTTGTTTTCTGGTCCAAGCTC-3’。
2.一种用于彭泽鲫自交子代和鳡诱导异源四倍体鲫鲤雌核发育子代的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括细胞裂解液、蛋白酶K、7.5 M 醋酸铵、异丙醇、70%乙醇、无水乙醇、2×Premix Taq、ddH2O。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于：所述细胞裂解液的成分为：Tris-HCL 100mM，pH 8.0；EDTA 50 mM，pH 8.0；SDS 1%，pH 8.0；NaCl 125 mM。
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