CN108432671B

CN108432671B - 一种利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法

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Publication number: CN108432671B
Application number: CN201810257378.8A
Authority: CN
Inventors: 尹绍武; 张佳佳; 张国松; 王涛
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2018-03-27
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2038-03-27
Also published as: CN108432671A

Abstract

本发明公开了一种利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法，包括以下步骤：(1)以黄颡鱼为母本，瓦氏黄颡鱼为父本，经过种间杂交获得杂交黄颡鱼F₁代；(2)F₁代进行饲养和培育，筛选获得可育的二倍体F₁代雄性个体；(3)以可育的二倍体F₁代雄性个体为父本，黄颡鱼为母本，获得杂交黄颡鱼的回交后代，即回交黄颡鱼，即为所述黄颡鱼新品系；(4)利用微卫星标记法及形态判别函数方法鉴定回交黄颡鱼和杂交黄颡鱼。该方法获得的回交黄颡鱼生长速度与父本杂交黄颡鱼相当，比母本黄颡鱼快20％以上，且在耐低氧能力方面较父本杂交黄颡鱼强。可以快速、准确的鉴定杂交黄颡鱼及回交黄颡鱼，操作过程中不会造成鱼体的死亡，判定后的样本还可继续用于养殖或研究。

Description

一种利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法

技术领域

本发明涉及一种利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法，属于黄颡鱼遗传育种领域。

背景技术

回交育种是杂交育种的重要手段之一，旨在通过杂交种与双亲之一再次杂交，使后代加强轮回亲本的某些优良性状，减少杂种后代的分离，并保留非轮回亲本的少数优良性状，从而创造优良重组类型。目前，关于回交育种主要广泛运用于花生、水稻、马铃薯等农作物品种。在水产动物品系中，主要集中在罗非鱼、鲤鲫、翘嘴鳊等鱼类中。且回交后代都表现出较好的遗传改良效果。

黄颡鱼是黄颡鱼属(Pelteobagrus)鱼类的总称，隶属于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)。目前我国报道的黄颡鱼属鱼类有5种，分别为黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)、瓦氏黄颡鱼(P.vachelli)、长须黄颡鱼(P.eupogon)、中间黄颡鱼(P.intermedius)、光泽黄颡鱼(P.nitidus)。黄颡鱼由于肉味鲜美、肉质细嫩、蛋白含量高、肌间刺少，而成为我国尤其沿海地区的重要养殖主导品种之一，2015年全国黄颡鱼的产量高达35.6万吨，鱼种的需求量达142.3亿尾，且呈上升趋势。杂交黄颡鱼是以黄颡鱼为母本和瓦氏黄颡鱼为父本杂交所获得的杂交子代，杂交黄颡鱼具有较强的生长优势，生长速度比未经选育的黄颡鱼群体高22.42％～35.64％，并具有抗病性强、当年苗种可养成上市规格、耐低氧能力较瓦氏黄颡鱼强、条型好等优势，得到了大多数养殖户的认可，是具有很大发展潜力的新品种；但是大多数个体不育，雌性个体的卵巢退化，雄性个体精巢退化，仅有很少量雄性个体的精母细胞可以转化为精子；此外，与黄颡鱼相比，杂交黄颡鱼仍存在耐低氧能力较差的缺陷。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明目的在于提供一种利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法，所得黄颡鱼新品系有较高的耐低氧能力，并且提供鉴别杂交黄颡鱼及回交后代的微卫星引物及形态判别函数方法，旨在为水产养殖中黄颡鱼的鉴别提供便利。

技术方案：本发明公开了一种利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法，包括以下步骤：

(1)以黄颡鱼为母本，瓦氏黄颡鱼为父本，经过种间杂交获得杂交黄颡鱼F1代；

(2)对上述F₁代进行饲养和培育，经过筛选获得可育的二倍体F1代雄性个体；

(3)以上述可育的二倍体F₁代雄性个体为父本，黄颡鱼为母本，获得杂交黄颡鱼的回交后代，即回交黄颡鱼，即为所述黄颡鱼新品系；

(4)利用微卫星标记法及形态判别函数方法鉴定回交黄颡鱼和杂交黄颡鱼。

所述步骤(1)中母本黄颡鱼选择体重大于200克、2龄及以上、健康无病害的黄颡鱼，父本瓦氏黄颡鱼选择体重大于400克、3龄及以上、健康无病害的瓦氏黄颡鱼。

所述步骤(3)中父本F₁代雄性个体选择体重大于450克、3龄及以上、健康无病害、可育的F₁代雄性个体，母本黄颡鱼选择体重大于200克、2龄及以上、健康无病害的黄颡鱼。

对上述方法获得的回交黄颡鱼、及其亲本杂交黄颡鱼和黄颡鱼进行基因遗传检测，回交黄颡鱼与黄颡鱼、杂交黄颡鱼的遗传相似度分别为0.3901、0.2921。通过上述方法获得的回交黄颡鱼在体色和生长速度方面与杂交黄颡鱼相当，比母本黄颡鱼快20％以上，在耐低氧能力方面比杂交黄颡鱼强，回交黄颡鱼的浮头点为0.56-0.58mg/L，杂交黄颡鱼的浮头点为0.64-0.66mg/L，显著高于杂交黄颡鱼。

所述微卫星标记法中，所用引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

所述微卫星标记法包括以下步骤：

(1)剪取待测样品鱼的少量尾鳍，提取待鉴定黄颡鱼的DNA样品；

(2)利用30对微卫星引物分析回交黄颡鱼及亲本的遗传关系；

(3)设计可以鉴别杂交黄颡鱼及回交黄颡鱼的微卫星引物，其序列为如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；

(4)利用上述引物对待鉴定样本DNA进行PCR扩增，获得PCR产物；

(5)PCR产物在ABI 3500xl分析仪上进行毛细管电泳并进行图谱分析，与DL600Marker标准图谱进行对比，在245bp位置扩增出1条特异性DNA条带的，则鉴定为回交黄颡鱼；在245bp和248bp位置各扩增出1条特异性DNA条带的，则鉴定为杂交黄颡鱼。

所述形态判别函数法包括以下步骤：

(1)获取待测样本黄颡鱼形态学参数，其中包括：全长、体长、体高、头长、吻长、尾柄长、眼间距、眼径、及体重；

(2)对上述获取的参数进行初步处理，获得以下特征参数值：肥满度、全长/体长、体长/体高、体长/头长、体长/尾柄长、头长/吻长、头长/眼径、眼间距/眼径；

(3)将以上步骤(2)获得的8个数据依次用X1～X8代替，并分别代入下列判定模型：

Y1＝32.867X1+1458.972X2+28.439X3+180.052X4+42.540X5+31.660X6+64.770X7-80.980X8-1563.772；

Y2＝45.608X1+1418.370X2+26.896X3+184.215X4+41.267X5+35.969X6+66.264X7-85.483X8-1546.608；

根据所得最大的Y值来判别该样本所属类别，其中Y1代表杂交黄颡鱼、Y2代表回交黄颡鱼。

技术效果：相对于现有技术，本发明建立的利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法为黄颡鱼的种质资源创新提供了宝贵材料和新的路径。通过此种方法获得的回交黄颡鱼与父本杂交黄颡鱼经过同等条件喂养，生长速度与父本杂交黄颡鱼相当，比母本黄颡鱼快20％以上，且在耐低氧能力方面较父本杂交黄颡鱼强。另外本发明提供的鱼种鉴定方法，只需要对待测鱼种的传统形态进行测量，并剪取少量尾鳍，操作方法简单，可以快速、准确的鉴定杂交黄颡鱼及回交黄颡鱼，操作过程中不会造成鱼体的死亡，判定后的样本还可继续用于养殖或研究。

附图说明

图1：回交黄颡鱼及双亲的遗传距离分析。

图2：微卫星引物在杂交黄颡(A)及回交黄颡鱼(B)的微卫星扩增结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。

实施例

一种利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法，包括以下步骤：

1、杂交黄颡鱼的制备及筛选

以黄颡鱼为母本，瓦氏黄颡鱼为父本，经远缘杂交后获得杂交黄颡鱼，对该杂交F1进行饲养，通过对杂交黄颡鱼F1的倍性、育性进行检测，筛选获得两性可育的二倍体杂交黄颡鱼F1；杂交黄颡鱼的获取方法可参见CN106577388A号中国专利文献。从10月龄开始，每年5-9月份定时取材，每次取10条鱼，等其到达3年龄时停止取材，通过观察精巢是否有精液判断其是否可育。

3年龄时，解剖杂交黄颡鱼F1，可看见大多数雄性杂交黄颡鱼F1代两侧精巢为透明状，无精液流出，极少数个体精巢发育正常，呈树枝状，外表乳白色，育性状态良好，剪破精巢可以挤出白色精液。

2、回交黄颡鱼的制备

在繁殖季节，选择腹部膨胀、轻压能挤出卵粒的雌性黄颡鱼作为母本亲鱼，选择生殖乳突膨大，末端呈红色的雄性3龄杂交黄颡鱼作为父本亲鱼，将母、父本亲鱼置于28～30℃的水温环境中，对前述亲鱼注射黄体素释放激素类似物、绒毛膜促性腺激素及地欧酮的混合催产剂进行催产，注射剂量为黄体素释放激素类似物30μg/kg～50μg/kg，绒毛膜促性腺激素的注射剂量为2000IU/kg～2500IU/kg，地欧酮的注射剂量为5mg/kg，待母本注射10小时后再对父本进行催产，父本的注射量为母本的一半。父本注射催产药物10小时后每隔1小时检查母本排卵情况，有90％能顺利挤卵时取父本精巢剪碎放入精子稀释液中(配方参考CN107155959A号中国专利文献)，每次收集100尾母本卵粒与1尾事先准备的父本精液混合完成人工授精。将受精卵均匀的分布在网片上，密度不超过7粒/cm²。将网片置于水温为28℃的微水流孵化池中，孵化48小时后即可得到回交黄颡鱼卵黄苗。出膜70小时以后卵黄消失，鱼体变黑，在缸壁四处游动即可用丰年虫开口。开口后的回交鱼苗和杂交黄颡鱼鱼苗放在同等密度的循环缸中养殖。

3、对获得的回交黄颡鱼及双亲进行遗传分析及鉴别。

(1)将待测鱼体均在115mg/L的MS-222麻醉剂麻醉2分钟，起到舒展鱼体的作用，以获得更真实的数据。

(2)获取待测样本黄颡鱼形态学参数，其中包括：全长、体长、体高、头长、吻长、尾柄长、眼间距、眼径、及体重；并剪取待测样品鱼的少量尾鳍，放入装有95％酒精的1.5mLEP管中。

(3)将测量过后的样本鱼放入清水中，可在32s后复苏。

(4)采用上海捷瑞公司的细胞/组织基因DNA提取试剂盒快速提取采取样本的DNA。

(5)利用30对微卫星引物对回交黄颡鱼及亲本进行的进行PCR扩增。PCR体系为10μL，包括：PCR体系为10μL，包括：2.85μL 2×Taq Mix，0.04μL 10μmol/LM13-taile正向引物，0.16μL反向引物(引物浓度为10μmol/L)，0.16μL带荧光基团(序列为5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)(SEQ ID NO.3)引物(引物浓度为10μmol/L)，1μL 50ng/μL模板DNA，5.79μL ddH₂O。PCR扩增的反应程序：95℃预变性5min；32个循环，每个循环包括94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，将检测到有单一条带的产物上样于ABI 3500xl分析仪进行毛细管电泳，检测产物片段大小。

(6)利用软件GeneMarker 1.97分析微卫星位点的片段长度。利用POPGENE 1.32分析微卫星位点的等位基因数(N_a)、有效等位基因数(N_e)、观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)、Nei氏遗传距离(genetic distances)以及遗传相似度(genetic similarity)。利用PIC_CALC计算多态信息含量值PIC。根据群体间的Nei氏遗传距离，用Mega 5.0软件非加权组平均法构建群体间聚类图。

(7)获得可以鉴别杂交黄颡鱼及回交黄颡鱼的微卫星引物，其序列为：

F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGAGGTAGTGGCAGCAGGAGAA-3’(SEQ ID NO.1)

R：5’-AAGAGGAGGAGGACGGTGTT-3’(SEQ ID NO.2)

(8)上述引物对待鉴定样本DNA进行PCR扩增，获得PCR产物。PCR产物在ABI 3500xl分析仪上进行毛细管电泳并进行图谱分析，与DL600Marker标准图谱进行对比，在245bp位置扩增出1条特异性DNA条带的，则鉴定为回交黄颡鱼；在245bp和248bp位置各扩增出1条特异性DNA条带的，则鉴定为杂交黄颡鱼。

(9)对步骤2获取的参数进行初步处理，获得以下特征参数值：肥满度、全长/体长、体长/体高、体长/头长、体长/尾柄长、头长/吻长、头长/眼径、眼间距/眼径；

(10)将以上步骤9获得的8个数据依次用X1～X8代替，并分别代入下列判定模型：

(11)用已知的鱼种对上述方法进行验证实验如下，待测杂交黄颡鱼、回交黄颡鱼均取自江苏省南京市水产科学研究所，样本量及体长体重详见表1。

表1观测样本规格

品种	样本量	体长范围/cm	体长均值/cm	体重范围/g	体重均值/g
						杂交黄颡鱼	50	9～21.3	14.58±3.93	14.0～127.6	51.36±34.44
回交黄颡鱼	38	10.5～24.6	17.53±3.19	24～239.5	112.18±54.25

(12)测定待测样本黄颡鱼全长、体长、体高、头长、吻长、尾柄长、眼间距、眼径8项形态学参数及体重，并剪取少量尾鳍，保存于95％的乙醇中。对参数进行初步处理，获得以下特征参数值：肥满度、全长/体长、体长/体高、体长/头长、体长/尾柄长、头长/吻长、头长/眼径、眼间距/眼径，将数值带入判别函数中计算，详见表2。

表2观测样本参数值及判别Y值

根据以上判别结果，经结果分析，可计算判别正确率，如表3所示。

表3本发明方法结果准确率

综上所述，通过观测样本验证的结果表明本发明方法具备较大实际应用价值，综合判别正确率可达98.7％。

(13)利用步骤5所述的引物对已知的鱼种进行PCR扩增，利用步骤6所述的方法对扩增产物进行分析，结果如图1显示，回交黄颡鱼与黄颡鱼的亲缘关系更近。

(14)利用步骤7获得的引物对已知的鱼种DNA进行扩增，PCR产物上样于ABI3500xl分析仪进行毛细管电泳，检测产物片段大小。结果如图2所显示，回交黄颡鱼在245bp位置扩增出1条特异性DNA条带；杂交黄颡鱼在245bp和248bp位置各扩增出1条特异性DNA条带。

以上所述具体实施案例对本发明进一步的详细说明。所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方案而已，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京师范大学

<120> 一种利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtaaaacga cggccagtga ggtagtggca gcaggagaa 39

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagaggagga ggacggtgtt 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtaaaacga cggccagt 18

Claims

1.一种利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以黄颡鱼为母本，瓦氏黄颡鱼为父本，经过种间杂交获得杂交黄颡鱼F₁代；

(2)对上述F1代进行饲养和培育，经过筛选获得可育的二倍体F₁代雄性个体；

(4)利用微卫星标记法及形态判别函数方法鉴定回交黄颡鱼和杂交黄颡鱼；

所述微卫星标记法包括以下步骤：

(2)利用30对微卫星引物分析回交黄颡鱼及亲本的遗传关系；

(3)设计可以鉴别杂交黄颡鱼及回交黄颡鱼的微卫星引物，其序列为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

(4)利用上述引物对待鉴定样本DNA进行PCR扩增，获得PCR产物；

(5)PCR产物在ABI 3500xl分析仪上进行毛细管电泳并进行图谱分析，与DL600Marker标准图谱进行对比，在245bp位置扩增出1条特异性DNA条带的，则鉴定为回交黄颡鱼；在245bp和248bp位置各扩增出1条特异性DNA条带的，则鉴定为杂交黄颡鱼；

所述形态判别函数方法包括以下步骤：

(1)获取待测样本黄颡鱼形态学参数，其中包括：全长、体长、体高、头长、吻长、尾柄长、眼间距、眼径、体重；

2.根据权利1所述的利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法，其特征在于，所述步骤(1)中母本黄颡鱼选择体重大于200克、2龄及以上、健康无病害的黄颡鱼，父本瓦氏黄颡鱼选择体重大于400克、3龄及以上、健康无病害的瓦氏黄颡鱼。

3.根据权利1所述的利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法，其特征在于，所述步骤(3)中父本F₁代雄性个体选择体重大于450克、3龄及以上、健康无病害、可育的F1代雄性个体，母本黄颡鱼选择体重大于200克、2龄及以上、健康无病害的黄颡鱼。