JP5452047B2 - ブリ類の遺伝的性に連鎖する遺伝子マーカー、ブリ類の性判別法、及び、性判別法に用いるプライマー - Google Patents

Description

本発明は、ブリ類の遺伝的性に連鎖する遺伝子マーカー、この遺伝子マーカーを利用したブリ類の性判別法、及び、性判別法に用いるプライマーに関する。

ブリ属は世界に９種であり、日本には４種（ブリ、ヒラマサ、カンパチ、ヒレナガカンパチ）が分布している。それらのほとんどが水産物として重要種であるとともにフィッシング対象種としても重要な位置にある。
食用魚としての価値が高いブリは、出世魚であり、日本では天然魚の漁獲（約7万t/年）とともに、養殖(約15万t/年)が行われている。ブリの養殖は、特に、西日本で行われており、その生産額は約1200億円と、海面魚類養殖の生産額の半分以上を占める。また海外においても、韓国などで養殖されている(約57t・年)。

ブリ養殖では、モジャコ（1.5〜15cm）と称する天然稚魚を採捕し、養殖種苗とする畜養が主流である。そのため、天然資源であるモジャコの資源管理のため、各県での採捕量は厳しく制限され、また、放流のための種苗生産が行われている。
しかし、今後の養殖業を発展させていくためには、天然資源に頼らず、かつ天然魚に優る病気に強い、味が良いなどの有用(優良経済)形質を持つブリを生産する必要がある。そこで、有用形質を持つブリの家系を保有し、親のもつ有用性質にかかる遺伝情報を利用する育種という観点が重要になる。

魚類の育種においては、効率的に交配を実施していくために、親となる魚の雄と雌の数をバランスよく育てる必要がある。ブリにおいては、成熟期に目的の交配を行うために、ある特定の雌親魚から良質な卵を採取することは、その個体から良質な卵を採取できる期間が短いために、困難とされている。一方、雄親魚からの精子の採取は、どの個体も成熟期は常に排精することが多く、比較的容易である。そのため、ブリにおける育種のために親魚を養成する際には、雌を雄よりも多く養成する必要がある。
また、ブリの雄と雌は、外見上、二次性徴(成熟)を判断できる特徴をもたず、産卵期に生殖口よりチューブを差し込み、体内の卵あるいは精子を確認するしか、雌雄判別の方法はない。産卵期に、卵あるいは精子を作る成熟個体になるまでには、1-2年かかる。そのため、雌雄の数のバランスを調整できないまま、大量の稚魚を育てる必要があり、多くのコストが必要であった。

また、ブリは性決定機構が判明されていないため、魚類の多くで確認されている、ストレス、温度等の環境によって性が変わる（性転換）現象が起こる可能性があり、雌雄のバランス調整は難しかった。
そのため、ブリの人工種苗生産および養殖漁業においては、ブリの性について、稚魚の段階で、親となる雄と雌とを生きたまま判別できることが重要課題であり、さらには、性決定機構の解明が必要である。それゆえ、その解決のために性の管理技術の開発が急がれている。

従来、発現に性差のある遺伝子のｍＲＮＡの発現パターンを調べることにより魚の性を判別する方法が知られている（特許文献１参照）。
しかし、この方法は、カレイ目を対象としており、ブリ類の性を判定する方法ではない。また、性分化時期以降の魚に適用し、遺伝的には同一でも発現が異なる遺伝子を利用しているので、性分化期である約６０日を過ぎないと性を判別することができず、発現した性を判別できるのみで、遺伝的な性の判別を行なうことはできない。さらに、一定量以上のＲＮＡを抽出する必要があるため、成魚でない場合は魚を殺してしまう虞がある。

特開２０００−６０５６９号公報

本発明が解決しようとする課題は、成熟前のブリ類の遺伝的性を、ブリ類を殺すことなく確実に判別するのに利用できるブリ類の遺伝的性に連鎖する遺伝子マーカー、この遺伝子マーカーを用いたブリ類の性判別法、及び、性判別法に用いるプライマーを提供することにある。

本出願人は、五島栽培センターにて飼育されている成熟親魚（天然漁獲魚を飼育しているもの）より、雄と雌とを交配し、Ｆ１集団を作出した。
作出したＦ１集団及びその両親に対してＤＮＡマーカーを用いた連鎖解析を行った結果、発明者らが既に見出していたブリの遺伝子連鎖地図（Ohara et al., 2005）と照らし合わせると、このブリ遺伝子連鎖地図における遺伝子連鎖群（ＬＧ）１２の配列表の配列番号１に示す塩基配列から成る遺伝子マーカーが性決定遺伝子座と連鎖していることがわかった。本出願人は、この遺伝子マーカーをＳｅｑｕ２１と名づけた。
さらに、ブリの性決定要因が、遺伝的要因により決定され、かつ雌由来の遺伝子により雌雄が決定するＺＷ型であることがわかった。

本発明の遺伝子マーカーは、ブリ類の遺伝的性に連鎖する配列表の配列番号１に示す塩基配列から成る。ブリ類は、ブリ、ヒラマサ、カンパチ、ヒレナガカンパチのいずれか一つから成る。
ブリ類の性判別法は、配列表の配列番号１に示す塩基配列より成る遺伝子マーカーから作成したプライマーを用いて、ブリ由来の核酸を鋳型とした核酸増幅反応法を行い、得られた増幅産物を解析することにより、ブリ類の遺伝的性を判別する。核酸増幅反応法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などがある。その中でもＰＣＲ法は最も一般的な方法であり、ＰＣＲ法により得られた産物にゲル電気泳動法を施して解析することにより、ブリ類の遺伝的性を判別する。

本発明のブリ類の性判別法に用いるプライマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列より成る遺伝子マーカーから作成した、１０〜５０塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有するプライマーが好ましい。例えば、５’−ＴＴＴＣＡＴＴＧＴＧＧＣＧＣＴＣＡＧ−３’（配列表の配列番号２）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、５’−ＧＧＴＴＧＴＡＡＴＧＴＧＴＣＣＣＡＧ−３’（配列表の配列番号３）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分より成る。

本発明によれば、成熟前に生かした状態でブリ類の遺伝的性を判別できるので、親魚として飼育するための稚魚の雌雄を早い時期に調整することが可能になる。

実施例１においてプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動像を示す。 実施例１においてプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動の模式図を示す。 実施例２においてプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動像を示す。 実施例２においてプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動の模式図を示す。

遺伝子連鎖群ＬＧ１２上の配列表の配列番号１に示す塩基配列から成る遺伝子マーカーを用いて、ブリ類の遺伝的性を判別する。
以下、本発明の実施例について詳細に説明する。
本実施例で用いたのは、標準和名「ブリ」であり、学名はＳｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａである。

（解析家系１）
五島栽培センターで飼育している成熟親魚（稚魚サイズを漁獲したものを、養殖業者が２年間畜養したものを五島栽培漁業センターで１年間飼育したもの）より雄と雌とを交配し、得られたＦ１集団の受精卵を１００Ｌ水槽に収容し、１００Ｌの海水で水温２０℃に維持してふ化まで飼育した。ふ化１日後（日齢１）に５００Ｌ水槽２面に移し、２２℃で流水飼育した。日齢３より日齢３０までは、餌料としてワムシを与え、日齢２１から日齢３９までは、アルテミアを加え、日齢３２以降は市販の配合飼料を与えた。

日齢４１以降は、陸上６０トン水槽及び水槽に設営した小割網を使用し日齢１０７まで飼育した。日齢１０８以降は、海上筏において飼育した。
その結果、６４匹のＦ１集団を得た。
飼育開始半年後に、Ｆ１集団６４個体を開腹し、生殖腺を確認することで雌雄の判別を行った。
６４個体の性比は、雄が２８個体、雌が３６個体であった。

（解析家系２）
解析家系１で用いた同一の雄と、別の雌とを交配して５５匹のＦ１集団を得た。なお、飼育方法は、解析家系１と同様である。
解析家系１と同様に、飼育開始半年後に、Ｆ１集団５５個体を開腹し、生殖腺を確認することで雌雄の判別を行った。
５５個体の性比は、雄が２４個体、雌が３１個体であった。

解析家系１のＦ１集団６４尾全てのブリに対し、次のようにしてＳｅｑｕ２１に関連するＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を施し、そのマーカー型を確認した。

まず、全てのブリからのＤＮＡ抽出は、以下の手順で行った。
尾鰭を１ｃｍ角の大きさで採取し、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔris−ＨＣｌ（pH８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ Proteinase Ｋを含む消化溶液を６００μＬ加え、３７℃で一晩静置した。
さらに、フェノール／クロロホルム（１：１）抽出を１回行った後、エタノール沈殿にて染色体ＤＮＡを析出させた。回収したＤＮＡは７０％エタノールで洗浄、乾燥後、ＴＥ溶液（０．０１Ｍ Ｔris−ＨＣｌ pH７．４、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ pH８．０）５０μＬに溶解した。

次に、
Ｆ；５’−ＴＴＴＣＡＴＴＧＴＧＧＣＧＣＴＣＡＧ−３’（配列表の配列番号２）
Ｒ；５’−ＧＧＴＴＧＴＡＡＴＧＴＧＴＣＣＣＡＧ−３’（配列表の配列番号３）
の一組のプライマーを合成し、０．２ｐｍｏｌ Ｆプライマーと［γ-³³Ｐ］ＡＴＰ、Ｔ４polynucleotide kinaseによって標識した０．３２ｐｍｏｌ Ｒプライマー、０．２ｍＭ each ｄＮＴＰ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１％ＢＳＡ、０．０２ Ｕ Ex Ｔaq ＤＮＡ polymerase（ＴａｋａｒａＢｉｏ）、５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを含む１３μｌの溶液で、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）にて、ＰＣＲ法を行った。

なお、このプライマーを用いたＰＣＲ反応組成（１サンプル分）を表１に示し、Ｒプラ
イマーのＲＩ標識用液組成（１００サンプル分）を表２に示す。

ＰＣＲ条件は、９５℃、２分−（９５℃、３０秒−５２℃、１分−７２℃、１分）×３５サイクル−（７２℃、３分）×１サイクルとした。
反応後、等量のLoading dye（９５％ formamide,１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ bromophenol blue and xylene cyanol）とよく攪拌し、ＰＣＲ産物を熱変性によって１本鎖にし、６％変性ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。
その後、１時間乾燥させたゲルを、Imaging Plate(ＩＰ)に３〜１２時間感光させ、放射線の感光像が記憶されたＩＰをBio-imaging Analyzer（BAS1000，Fuji Photo Films）で読み取り、コンピュータで映像化した。
その結果を図１及び図２に示す。

図１及び図２からわかるように、雌親は１６８ｂｐと１５２ｂｐのバンドを保持している。子孫の雌は３６個体中３５個体が雌親由来の１６８ｂｐのバンドを持ち、雄の２８個体中２７個体が雌親由来の１５２ｂｐのバンドを持っていた。
即ち、本家系では、本プライマーにより増幅される雌由来のバンドの種類を調べることで、雌雄を判別することができる。
性決定形質（雌性）とこのバンドとの連鎖関係の確かさはLod scoreで示される。ここで、Lod score３以上というのは、1/10³以下の危険率であることを意味している。この危険率が1/10³以下である状態のことを、連鎖しているという（Lathropet al., 1984）。
１６８ｂｐ/１５２ｂｐのバンドと性決定形質（雌性）との矛盾は６４個体中２個体であり、Lod score ＝ 2log(2/64)+(64-2)log(1-2/64)-64log0.5となり、この連鎖関係は、1/10^15.40の危険率で確実である。よって、配列表の配列番号１のマーカーは、ブリの遺伝的性に連鎖している。
従って、実施例１においては、ＰＣＲ産物に雌親由来の１５２ｂｐのバンドを持つブリは雄のブリ、雌親由来の１６８ｂｐのバンドを持つブリは雌のブリであるといえる。

解析家系２より得たＦ１集団５５尾についても、実施例１と同様にＰＣＲ法をおこなった。実施例２におけるＰＣＲ産物のゲル電気泳動像を図３及び図４に示す。
図３及び図４からわかるように、雌親は１７４ｂｐと１６２ｂｐのバンドを保持している。子孫の雌は３１個体中３０個体が雌親由来の１６２ｂｐのバンドを持ち、雄の２４個体すべての個体が雌親由来の１７４ｂｐのバンドを持っていた。この場合のLod scoreは、14.39であった。この連鎖関係は、1/10^14.39の危険率で確実である。よって、配列表の配列番号１のマーカーは、ブリの遺伝的性に連鎖している。
従って、実施例２においては、ＰＣＲ産物に雌親由来の１７４ｂｐのバンドを持つブリは雄のブリ、雌親由来の１６２ｂｐのバンドを持つブリは雌のブリであるといえる。

本発明においては、親から子孫への遺伝情報の伝達についてＤＮＡマーカーを用いて解析している。ブリ類の性判別においては、本発明で提案しているようにＳｅｑｕ２１に関するＰＣＲプライマーを用いて遺伝情報の伝達を解析することによって、全てのブリ家系で性判別を可能にする。親から子孫への遺伝情報の伝達を解析でき、それにより性判別が可能であることがポイントと言える。

なお、上記実施例１、２では、親から子孫への遺伝情報の伝達を解析した際に、性決定形質（雌性）と連鎖するバンドはそれぞれ異なる数値ではあるが、これは本開発に用いたＤＮＡマーカーの特性である。なぜならば、配列表の配列番号２と配列番号３のプライマーは、ＣＡ繰り返し配列（マイクロサテライト）を含む形でＰＣＲプライマーが設計されている。マイクロサテライトを含むＰＣＲプライマーは、遺伝情報の伝達を解析することによって１つの遺伝子座を位置付けることができると共に、同種内のその多型性により各個体間では多くのバンドを検出する（ＤＮＡＭａｋｅｒｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，ＧＵＳＴＡＶＯ ＣＡＥＴＡＮＯ−ＡＮＯＬＬＥＳ ＰＥＴＥＲ Ｍ．ＧＲＥＳＳＨＯＦＦ）ものであり、解析家系により異なるためである。Ｓｅｑｕ２１で位置づけられるマーカー座が性決定遺伝子の存在する場所であり、それによって性判別が可能になっている。
よって、この実施例で示されるバンドのサイズは、家系によりこれに限定されるものではない。

Claims (6)

1. ブリ類の遺伝的性に連鎖する配列表の配列番号１に示す塩基配列から成る遺伝子マーカー。
2. ブリ類は、ブリ、ヒラマサ、カンパチ、ヒレナガカンパチのいずれか一つから成る請求項１に記載の遺伝子マーカー。
3. 請求項１に記載の遺伝子マーカーから作成したプライマーを用いて、ブリ由来の核酸を鋳型とした核酸増幅反応法を行い、得られた増幅産物を解析することにより、ブリ類の遺伝的性を判別することを特徴とするブリ類の性判別法。
4. 請求項１に記載の遺伝子マーカーから作成したプライマーを用いて、ブリ類のゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法(ＰＣＲ法)を行い、得られた産物にゲル電気泳動法を施して解析することにより、ブリ類の遺伝的性を判別することを特徴とするブリ類の性判別法。
5. 請求項１に記載の遺伝子マーカーから作成した、５’−ＴＴＴＣＡＴＴＧＴＧＧＣＧＣＴＣＡＧ−３’（配列表の配列番号２）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、５’−ＧＧＴＴＧＴＡＡＴＧＴＧＴＣＣＣＡＧ−３’（配列表の配列番号３）の内、少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分より成ることを特徴としたブリ類の性判別法に用いるプライマー。
6. 請求項５に記載のプライマーを用いて、ブリ類のゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法(ＰＣＲ法)を行い、得られた産物にゲル電気泳動法を施して解析することにより、ブリ類の遺伝的性を判別することを特徴とするブリ類の性判別法。