CN115992209B - 一种高体鰤piRNAs性别标签及试剂盒与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高体鰤piRNAs性别标签及试剂盒与应用，涉及鱼类生物技术领域。上述高体鰤piRNAs性别标签，其特征在于：上述高体鰤piRNAs性别标签的核酸序列包括Seq ID No.1和Seq ID No.2中的至少一种。核酸序列Seq ID No.1对应的性别标签，在雄鱼样本中的表达量较高，而在雌鱼样本中的表达量较低。核酸序列Seq ID No.2对应的性别标签，在雄鱼样本中的表达量较低，而在雌鱼样本中的表达量较高。依据piRNAs定量分析结果，进行雌鱼和雄鱼的判定。

Description

一种高体鰤piRNAs性别标签及试剂盒与应用
技术领域
本发明涉及鱼类生物技术领域，尤其是涉及一种高体鰤piRNAs性别标签及试剂盒与应用。
背景技术
高体鰤(Seriola dumerili)主要分布于地中海、东大西洋和我国东南海等亚热带地区的暖水性中上层，是一种生长速度快、肉质好、价值高的世界性深远海经济鱼类。高体鰤是雌雄异体、无表型性别二态性的雌性异配型鱼类，因此难以从鱼体外表直接判断鱼的性别。而且在人工养殖条件下，高体鰤表现出严重的生殖功能障碍，具有性腺发育停滞、性别鉴定困难、催产和孵化的成功率低等问题，严重制约了高体鰤的工厂化养殖。
外泌体(exosomes)是一种直径在30-150nm之间，具有脂质双分子层结构的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，其广泛分布于动物体液内。外泌体内含有一类长为26-32个核苷酸、可与PIWI亚家族蛋白质结合形成核糖体蛋白复合体的PIWI interactingRNA(piRNA)，其可以参与免疫反应和性别鉴定等多种生理功能，成为诊断和生理过程监测的潜在生物标志物，在生物分子标记应用中发挥重要作用。
然而，在海水鱼类中外泌体来源的piRNAs作为生物标志物的研究相对较少，且高体鰤雌鱼和雄鱼血清外泌体的生物标记物差异识别的问题，还亟需得到解决。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是：
提供一种高体鰤piRNAs性别标签。
本发明所要解决的第二个技术问题是：
提供一种所述高体鰤piRNAs性别标签相关的生物材料。
本发明所要解决的第三个技术问题是：
提供一种用于高体鰤性别检测的特异性引物组。
本发明所要解决的第四个技术问题是：
提供一种高体鰤性别检测试剂盒。
本发明所要解决的第五个技术问题是：
提供一种用于高体鰤性别检测的miRNA的筛选方法。
为了解决所述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种高体鰤piRNAs性别标签，所述高体鰤piRNAs性别标签的核酸序列包括Seq IDNo.1和Seq ID No.2中的至少一种。
Seq ID No.1序列为TGAGGTCCTCGGATCGGCCCCGCCG；
Seq ID No.2序列为AGGCGGCCCGGGTTCGACTCCCGGTATGGGA。
根据本发明的实施方式，所述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：
1.核酸序列Seq ID No.1对应的性别标签，命名为piR-dre-32793，该标签在雄鱼样本中的表达量较高(表达量高于或等于2.64)，而在雌鱼样本中的表达量较低(表达量低于2.64)。核酸序列Seq ID No.2对应的性别标签，命名为piR-dre-332，该标签在雄鱼样本中的表达量较低(表达量低于1.93)，而在雌鱼样本中的表达量较高(表达量高于或等于1.93)。依据piRNAs定量分析结果，进行雌鱼和雄鱼的判定。
2.将高体鰤piRNAs性别标签应用于高体鰤雌鱼和雄鱼的判定，在已经验证的样品中准确率为100％，且鉴定结果可靠，不会对鱼体造成创伤。
根据本发明的实施方式，所述高体鰤piRNAs性别标签可以只包括Seq ID No.1，也可以只包括Seq ID No.2，也可以同时包括Seq ID No.1和Seq ID No.2。
为了解决所述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：
与所述的高体鰤piRNAs性别标签相关的生物材料，所述生物材料为1)～4)中任一种：
1)所述的piRNAs前体；
2)所述的piRNAs模拟物；
3)编码所述的piRNAs或1)中所述的piRNAs前体的DNA分子；
4)含有3)中所述的DNA分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。
为了解决所述第三个技术问题，本发明采用的技术方案为：
用于扩增如所述的高体鰤piRNAs性别标签的引物组。
所述引物组包括：
第一正向引物、第一反向引物和第二正向引物、第二反向引物；
其中：
第一正向引物序列如Seq ID No.3所示；
第一反向引物序列如Seq ID No.4所示；
其中：
第二正向引物序列如Seq ID No.5所示；
第二反向引物序列如Seq ID No.6所示。
根据本发明的一种实施方式，第一正向引物序列如Seq ID No.3所示；
具体为：TGAGGTCCTCGGATCGGCC。
第一反向引物序列如Seq ID No.4所示；
具体为：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
其中，第二正向引物、第二反向引物依次为piR-dre-332-F和piR-dre-332-R。
第二正向引物序列如Seq ID No.5所示；
具体为：GGGTTCGACTCCCGGT。
第二反向引物序列如Seq ID No.6所示；
具体为：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
根据本发明的一种实施方式，所述第一引物命名为piR-dre-32793定量检测引物，其中，第一正向引物piR-dre-32793-F的序列为TGAGGTCCTCGGATCGGCC；其中，第一反向引物piR-dre-32793-R的序列为AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
根据本发明的一种实施方式，所述第一引物piR-dre-32793逆转录引物piR-dre-32793-RT的序列为GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGGCGG。
根据本发明的一种实施方式，所述第二引物命名为piR-dre-332定量检测引物，其中，第二正向引物piR-dre-332-F的序列为GGGTTCGACTCCCGGT；其中，第二反向引物piR-dre-332-R的序列为AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
根据本发明的一种实施方式，所述第二引物piR-dre-332逆转录引物piR-dre-332-RT的序列为GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCCAT。
为了解决所述第四个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的高体鰤piRNAs性别标签、所述的生物材料、所述的引物组或所述的引物组。
根据本发明的实施方式，所述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：
本发明同时利用该鉴别标签设计了针对该标签的扩增引物，开发了检测的试剂盒，方便快捷，简单高效。
根据本发明的一种实施方式，所述试剂盒，包括所述的高体鰤piRNAs性别标签，而所述高体鰤piRNAs性别标签可以只包括Seq ID No.1，也可以只包括Seq ID No.2，也可以同时包括Seq ID No.1和Seq ID No.2。因此，所述试剂盒，可以只包括一种性别标签，也可以同时包括两种性别标签。当所述试剂盒同时包括两种性别标签时，在测定高体鰤性别的时候，两种性别标签的表达量都会高于单一性别标签时的表达量，并且，具有两种性别标签的试剂盒，相对于只包含单一性别标签的试剂盒，在测定高体鰤性别时，具有更佳的准确性。
根据本发明的一种实施方式，所述试剂盒中还包括内参基因oni-let-7a的定量检测引物、内参基因逆转录引物和PCR荧光定量试剂。
根据本发明的一种实施方式，所述oni-let-7a的引物包括正向引物和反向引物，其中：
正向引物序列如Seq ID No.7所示；
反向引物序列如Seq ID No.8所示。
根据本发明的一种实施方式，内参基因oni-let-7a定量检测引物的正向引物oni-let-7a-F的序列为GCGCGTGAGGTAGTAGGTTGT。
根据本发明的一种实施方式，内参基因oni-let-7a定量检测引物的反向引物oni-let-7a-R的序列为AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
根据本发明的一种实施方式，oni-let-7a逆转录引物oni-let-7a-RT的序列为GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTAT。
为了解决所述第五个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种用于高体鰤性别检测的piRNAs的筛选方法，包括以下步骤：
对高体鰤血清外泌体small RNA进行测序、过滤与分析，筛选出所述的高体鰤piRNAs性别标签。
根据本发明的实施方式，所述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：
所述piRNAs的核酸序列是根据高体鰤血清外泌体中small RNA设计的，扩展了血清外泌体的应用，取高体鰤的血清不会对高体鰤鱼体造成不可恢复的创伤，可以减少高体鰤的损失。所述用于高体鰤性别检测的microRNA，鉴定准确度高，具有生产价值和市场价值。
根据本发明的一种实施方式，一种用于高体鰤性别检测的piRNAs的筛选方法，包括以下步骤：
1)取三尾高体鰤雌鱼(Sample_雌鱼)和三尾高体鰤雄鱼(Sample_雄鱼)的血清样品，分离血清中的外泌体，一部分外泌体样品用于鉴定，鉴定为外泌体后，另一部分外泌体样品用于提取RNA进行small RNA测序分析，然后将raw reads进行过滤，得到clean reads，将clean reads依次与Rfam数据库、cDNA序列进行比对注释；将比对到的reads再与miRBase数据库比对，没比对上的18-34nt的reads与piRBase数据库进行比对，比对上的为已知piRNAs；对已知piRNA进行差异表达分析，对差异表达piRNA的靶基因进行Gene Ontology(GO)富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析，最后与样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对两种性别样品具有指示作用的piRNA作为候选piRNAs生物标记物；
2)将候选标签microRNAs按照以下五个标准进行过滤：
(1)与已知数据库进行比对确认存在的piRNAs；
(2)在两种样品中表达有显著差异的piRNAs，即P值小于0.05和log2 fold Change值大于的piRNAs，所述fold Change值＝TPMSample_雄鱼/TPMSample_雌鱼；
(3)性别相关的piRNAs；
(4)两种样品中雄鱼组三个样本的表达量均高于或低于雄鱼组三个样本的表达量；
(5)两样品中至少有一个的TPM值大于100。
3)提取两组验证样本：雌鱼和雄鱼血清来源外泌体总RNA，利用Micro RNA定量分析试剂盒定量检测步骤2)过滤后的piRNAs的差异表达情况，筛选出具有标签指示作用的piRNAs作为最终的标签piRNAs；根据统计学分析原理，P值小于0.05为显著差异，最终筛选到piR-dre-32793和piR-dre-332。
其中，标签piR-dre-32793在雄鱼样本中的表达量较高，而在雌鱼样本中的表达量较低。标签piR-dre-332在雄鱼样本中的表达量较低，而在雌鱼样本中的表达量较高。依据piRNAs定量分析结果，进行雌鱼和雄鱼的判定。
根据本发明的一种实施方式，在高体鰤性别鉴定时，可以通过以下步骤进行鉴定：收集高体鰤的血清样品，提取其外泌体RNA，通过特异性的piRNA逆转录引物或所述试剂盒进行RT-PCR获得cDNA模板，采用所述特异性的piRNA正反向引物或所述试剂盒进行qPCR获得piRNA的表达情况(优选SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行piRNA定量反应)，根据性别标签piR-dre-32793和piR-dre-332在雌、雄鱼中的表达量来鉴定高体鰤的性别，其中piR-dre-32793在雄鱼样本中的表达量较高(表达量高于或等于2.64)，而在雌鱼样本中的表达量较低(表达量低于2.64)；piR-dre-332在雄鱼样本中的表达量较低(表达量低于1.93)，而在雌鱼样本中的表达量较高(表达量高于或等于1.93)。
根据本发明的一种实施方式，利用RT-PCR时，采用两步法进行。第一步去除基因组DNA，反应体系为10μL体系，包括4μL ddH2O、2μL gDNA Wiper Mix和4μL RNA，反应程序为：42℃2min；第二步合成cDNA，反应体系为20μL体系，包括2μL ddH2O，10μL第一步中的混合液、4μL 10×逆转录引物、2μL10×RT Mix和2μL HiScriptⅡEnzyme Mix，反应程序为：25℃5min，50℃15min，85℃5min。
根据本发明的一种实施方式，利用qPCR(优选SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行piRNA定量反应)时，反应体系为10μL体系，包括0.5μL 10×F引物、0.5μL 10×R引物、5μL 2×miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix、3μL ddH2O、1μL cDNA模板。
根据本发明的一种实施方式，利用qPCR(优选SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行piRNA定量反应)时，反应程序为：95℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 20s，72℃ 20s，循环40次；95℃15s，65℃ 1min，97℃；37℃ 30s。
本发明的另一个方面，还涉及所述试剂盒在制备高体鰤性别检测试剂中的应用。包括如上述第4方面实施例所述的试剂盒。由于该应用采用了上述试剂盒的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
本发明的另一个方面，还涉及所述试剂盒在高体鰤养殖中的应用。包括如上述第4方面实施例所述的试剂盒。由于该应用采用了上述试剂盒的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为实施例1筛选到的18个的microRNA的表达水平测试图。
图2为实施例1中的高体鰤piRNAs性别标签的qRT-PCR表达量数据图。
图3为标签piR-dre-32793在14个样品中的qRT-PCR表达量数据图。
图4为标签piR-dre-332在14个样品中的qRT-PCR表达量数据图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的范围。
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例中，Micro RNA定量分析试剂盒为vazyme公司的试剂盒；
实施例中，cDNA合成的试剂盒为microRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(bystem-loop)，货号为MR101-02；
实施例中，qPCR的试剂盒为microRNA Universal SYBR qPCR Master Mix，货号为MQ101-02。
实施例中，总外泌体分离试剂为Total Exosome Isolation Reagent，购自Thermofisher Scientific(4478360)。
实施例中，GO富集分析为采用GO数据库进行分析。GO(Gene Ontology)是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表(controlledvocabulary)来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。
实施例中，KEGG富集分析为采用KEGG数据库进行分析。KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes)数据库是系统分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物功能的数据库，富集结果可以体现由于实验设置变量的作用使得实验个体或组发生了较大的基因表达变化，导致通路有较大改变。
实施例1
一种高体鰤piRNAs性别标签，上述高体鰤piRNAs性别标签的核酸序列包括Seq IDNo.1和Seq ID No.2。
一种用于高体鰤性别检测的piRNAs的筛选方法，包括以下步骤：
1、血清样本的收集
收集高体鰤性别分化的雌鱼和雄鱼血清0.5ml于离心管中用于外泌体分离鉴定。
2、外泌体的提取
(1)血清样本取0.5ml转移1.5ml EP管，加入1ml外泌体提取试剂,充分混合，4℃放置过夜；
(2)在4℃、10000rpm/min的条件下离心1h，丢弃上清液，将离心管倒置在滤纸上2min；
(3)用50μm PBS重悬沉淀，于-20℃保存。
3、外泌体的鉴定：利用马尔文Nanosight NS300进行纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)；利用抗体CD63、CD9和HSP70进行蛋白免疫印迹(WB)分析；利用Tecnai G2 Spirit型透射电子显微镜(TEM)进行透射电镜分析。对外泌体进行分析鉴定后，剩余样品用于RNA提取和测序分析。
4、外泌体的piRNA测序分析
TRizol法提取外泌体的RNA，质检后构建小RNA文库并基于illumina平台测序，完成测序后将raw reads进行过滤，得到clean reads，将clean reads依次与Rfam数据库、cDNA序列进行比对注释；将比对到的reads再与miRBase数据库比对，没比对上的18-34nt的reads与piRBase数据库进行比对，比对上的为已知piRNAs；对已知piRNA进行差异表达分析，对差异表达piRNA的靶基因进行GO富集分析和KEGG富集分析，最后与样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对两种性别样品具有指示作用的piRNA作为候选piRNAs生物标记物。
5、将候选标签micro RNAs按照以下五个标准进行过滤：
(1)与已知数据库进行比对确认存在的piRNAs；
(2)在两种样品中表达有显著差异的piRNAs，即P值小于0.05和log2 fold Change值大于的piRNAs，上述fold Change值＝TPM Sample_雄鱼/TPM Sample_雌鱼；
(3)性别相关的piRNAs；
(4)两种样品中雄鱼组三个样本的表达量均高于或低于雄鱼组三个样本的表达量；
(5)两样品中至少有一个的TPM值大于100。
最终筛选到11个候选的piRNAs作为下一步验证的备选，见图1。
6、提取随机两组验证样本：雌鱼和雄鱼血清来源外泌体总RNA，利用piRNA定量分析试剂盒定量检测步骤5)过滤后的piRNAs差异表达情况，选取2-ΔΔCt进行计算分析，筛选出具有标签指示作用的piRNAs作为最终的标签piRNAs；
根据统计学分析原理，P值小于0.05为显著差异，最终筛选到piR-dre-32793(SeqID No.1)和piR-dre-332(Seq ID No.2)；
piR-dre-32793的序列为TGAGGTCCTCGGATCGGCCCCGCCG；
piR-dre-332的序列为AGGCGGCCCGGGTTCGACTCCCGGTATGGGA。
标签piR-dre-32793在雄鱼样本中的表达量较高(表达量高于或等于2.64)，而在雌鱼样本中的表达量较低(表达量低于2.64)；标签piR-dre-332在雄鱼样本中的表达量较低(表达量低于1.93)，而在雌鱼样本中的表达量较高(表达量高于或等于1.93)，如图2所示。
实施例2
一种试剂盒，包括实施例1上述的高体鰤piRNAs、高体鰤piRNAs性别标签相关的生物材料和高体鰤piRNAs性别标签相关的引物组。
其中，高体鰤piRNAs性别标签相关的引物组包括第一正向引物、第一反向引物和第二正向引物、第二反向引物。
其中，第一正向引物、第一反向引物依次为piR-dre-32793-F和piR-dre-32793-R。
第一正向引物序列如Seq ID No.3所示；
具体为：TGAGGTCCTCGGATCGGCC。
第一反向引物序列如Seq ID No.4所示；
具体为：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
其中，第二正向引物、第二反向引物依次为piR-dre-332-F和piR-dre-332-R。
第二正向引物序列如Seq ID No.5所示；
具体为：GGGTTCGACTCCCGGT。
第二反向引物序列如Seq ID No.6所示；
具体为：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
其中，上述试剂盒，包括piR-dre-32793定量检测引物piR-dre-32793-F和piR-dre-32793-R和piR-dre-32793逆转录引物piR-dre-32793-RT，内参基因oni-let-7a的定量检测引物oni-let-7a-F和oni-let-7a-R和oni-let-7a逆转录引物oni-let-7a-RT。
其中，piR-dre-32793逆转录引物piR-dre-32793-RT的序列为：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGGCGG。
其中，oni-let-7a-F的序列(如Seq ID No.7所示)为：
GCGCGTGAGGTAGTAGGTTGT。
其中，oni-let-7a-R的序列(Seq ID No.8所示)为：
AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
其中，oni-let-7a逆转录引物oni-let-7a-RT序列为：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTAT。
上述试剂盒，还包括其它逆转录试剂和定量PCR反应的其它常规试剂：RNase-freeddH2O、gDNA Wiper Mix、RT Mix、HiScriptⅡEnzyme Mix、dNTP、miRNA Universal SYBRqPCR Master Mix、RNase inhibitor、Ace Taq DNA polymerase、Mg2+、SYBR GreenⅠ及Specific ROX Reference。
实施例3
一种利用实施例2的试剂盒对高体鰤性别进行检测的方法，包括以下步骤：
(1)：通过实施例2的高体鰤性别检测试剂盒中的逆转录引物及试剂将外泌体RNA进行RT-PCR获得cDNA模板；
(2)：将逆转录得到的cDNA进行qPCR获得microRNA的表达情况；
(3)：根据microRNA的表达情况判断高体鰤性别。
对于(1)：
RT-PCR通过VeritiTM 96孔快速热循环仪采用两步法进行。
具体的，两步法包括以下步骤：
第一步：去除基因组DNA；
其中，反应体系为：10μL体系，包括4μL ddH2O、2μL gDNA Wiper Mix和4μL RNA；反应程序为：42℃ 2min。
第二步：合成cDNA；
其中，反应体系为20μL体系，包括2μL ddH2O，10μL第一步中的混合液、4μL逆转录引物、2μL10×RT Mix和2μL HiScript Ⅱ Enzyme Mix，反应程序为：25℃ 5min，50℃15min，85℃ 5min。其中逆转录引物为piR-dre-32793逆转录引物piR-dre-32793-RT、piR-dre-332逆转录引物piR-dre-332-RT或oni-let-7a逆转录引物oni-let-7a-RT。
对于(2)：
其中，采用实施例3的试剂盒进行qPCR获得microRNA的表达情况中，采用SYBRGreenⅠ嵌合荧光法进行microRNA定量反应。
其中，反应体系为10μL体系，包括0.5μL 10×F引物、0.5μL 10×R引物、5μL 2×miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix、3μL ddH2O、1μL cDNA模板。
其中，F引物为piR-dre-32793-F、piR-dre-332-F或oni-let-7a-F，R引物为piR-dre-32793-R、piR-dre-332-R或oni-let-7a-R。
其中，上述采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行microRNA定量反应，使用仪器为：Roche Applied Science LightCycler 480。仪器中程序设置分为两步：第一步为：95℃5min；94℃ 30s，58℃ 20s，72℃ 20s，循环40次；第二步为：95℃ 15s，65℃ 1min，97℃；37℃ 30s。
对于(3)：
样品检测需设三个平行。
性能测试：
按照实施例3的方法测试高体鰤性别：
测试对象为：随机选取的7尾高体鰤雄鱼和7尾高体鰤雌鱼。
上述14尾高体鰤样本qRT-PCR表达数据如表1-2所示，其中，表1为标签piR-dre-32793在样本中的表达数据；其中，表2为piR-dre-332在样本中的表达数据。
从表1-2中的2-ΔΔCT可以判断高体鰤雌雄。
表1
样本 piR-dre-32793CT oni-let-7a CT 2-ΔCT 2-ΔΔCT
雌鱼-1 23.7 24.88 1.0023132
雌鱼-1 23.72 24.83 0.988514 1.000037328
雌鱼-1 23.69 未知 1.0092848
雌鱼-2 23.71 25 1.0754944
雌鱼-2 23.59 24.99 1.1687772 1.080270634
雌鱼-2 23.82 24.91 0.9965403
雌鱼-3 23.24 25.56 1.8553182
雌鱼-3 23.42 25.2 1.637695 1.746506599
雌鱼-3 未知 25.09
雌鱼-4 22.05 24.96 3.0384453
雌鱼-4 22.49 24.65 2.2397432 2.639094268
雌鱼-4 未知 未知
雌鱼-5 22.97 24.63 1.5837376
雌鱼-5 23.02 24.94 1.5297897 1.556763652
雌鱼-5 未知 未知
雌鱼-6 23.07 24.98 1.5782583
雌鱼-6 22.95 24.64 1.7151483 1.631232188
雌鱼-6 23.05 25.02 1.60029
雌鱼-7 23.53 24.55 1.3487909
雌鱼-7 23.6 25.12 1.2849094 1.315202797
雌鱼-7 23.57 25.67 1.3119081
雄鱼-1 20.57 24.85 8.1869911
雄鱼-1 20.68 24.86 8.1775386 8.396653442
雄鱼-1 20.57 24.88 8.8254306
雄鱼-2 19.63 23.97 11.170847
雄鱼-2 19.52 24.51 12.055893 11.14500389
雄鱼-2 19.76 24.31 10.208271
雄鱼-3 19.74 24.84 13.376851
雄鱼-3 19.96 24.48 11.484902 13.16665256
雄鱼-3 19.61 24.58 14.638204
雄鱼-4 21.94 25.22 5.1396377
雄鱼-4 21.9 25.43 5.2841326 4.99736655
雄鱼-4 22.11 25.71 4.5683294
雄鱼-5 22.15 25.46 3.9677836
雄鱼-5 22.32 25.28 3.5267354 3.550345182
雄鱼-5 22.48 25.13 3.1565166
雄鱼-6 19.68 24.75 15.871134
雄鱼-6 19.69 24.81 15.761504 15.87138846
雄鱼-6 19.67 24.9 15.981527
雄鱼-7 22.72 25.31 2.710076
雄鱼-7 22.79 未知 2.5817214 2.64589873
雄鱼-7 未知 未知
表1中的上述14尾高体鰤样本qRT-PCR表达数据如图3所示。从表1和图3可以看出，标签piR-dre-32793在雄鱼样本中的表达量较高(表达量高于或等于2.64)，而在雌鱼样本中的表达量较低(表达量低于2.64)；而且该标签piRNA在两组样本中的表达有显著差异(P<0.05)。故对于标签piR-dre-32793，将以2.64的表达量作为一个标准，表达量高于或等于2.64的为雄鱼，而表达量低于2.64的为雌鱼。
表2
表2中的上述14尾高体鰤样本qRT-PCR表达数据如图4所示。从表2和图4可以看出，标签piR-dre-332在雄鱼样本中的表达量较低(表达量低于1.93)，而在雌鱼样本中的表达量较高(表达量高于或等于1.93)。
此外，标签piR-dre-332在两组样本中的表达有显著差异(P<0.05)。故对于标签piR-dre-332，将以1.93的表达量作为一个标准，表达量低于1.93的为雄鱼，而表达量高于或等于1.93的为雌鱼。
根据上述标准，利用高体鰤血清外泌体piRNAs标志物鉴定高体鰤雌鱼和雄鱼，piR-dre-32793和piR-dre-332在已经验证的样品中的准确率均为100％。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.用于扩增高体鰤血清外泌体中piRNA性别标签的引物组在制备高体鰤性别检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述高体鰤piRNA性别标签的核酸序列为Seq ID No.1；
所述piRNA性别标签的引物组包括：
第一正向引物、第一反向引物和逆转录引物；
其中：
第一正向引物序列如Seq ID No.3所示；
第一反向引物序列如Seq ID No.4所示；
所述逆转录引物的序列为：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGGCGG。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒中还包括内参基因oni-let-7a的定量检测引物、内参基因逆转录引物和PCR荧光定量试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述oni-let-7a的定量检测引物包括正向引物和反向引物，其中：
正向引物序列如Seq ID No.7所示；
反向引物序列如Seq ID No.8所示。
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