CN109055520B - 一种半滑舌鳎外泌体性别差异表达标签及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种半滑舌鳎外泌体性别差异表达标签及试剂盒,属于鱼类生物技术领域,所述microRNA性别标签为dre‑miR‑10d‑5p,序列为TACCCTGTAGAACCGAATGTGTG;以解决半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼在生殖遗传差异的区分问题。本标志miRNAs具有在雄鱼和伪雄鱼中显著差异表达的特点,是特异的分子识别标记。
Description
技术领域
本发明属于鱼类生物技术领域,特别是海水鱼精液外泌体标志物应用领域,具体地为一种半滑舌鳎外泌体性别差异表达标签及试剂盒。
背景技术
半滑舌鳎雌、雄鱼生长速度差异巨大,无论是自然界还是养殖环境都不同程度的存在着伪雄鱼。伪雄鱼的染色体是ZW型,而它的生殖器官则和雄鱼一样,也可以产生精子且繁育后代。伪雄鱼还可通过遗传逐代积累,就导致了半滑舌鳎雌雄比例的失衡。因此开发鉴别半滑舌鳎伪雄鱼的方法不仅具有理论意义,而且也具有生产价值和市场价值。
鱼类性别鉴定有多种方法:生理解剖观察、性腺切片、性腺细胞观察、雌性特异分子标记等。有些方法虽然简单易行,但是结果可能不准确,有些方法则需要剖杀鱼。外泌体内含物microRNAs,其在进化上高度保守,性质稳定,易于定量检测,具有生物标签的特性,对于鱼类性别鉴定的具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是针对半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼识别问题,提出一种半滑舌鳎精液来源的外泌体microRNAs作为生物标记物识别雄鱼及伪雄鱼的方法。
本发明是采取以下技术方案实现的:
半滑舌鳎精浆外泌体microRNA在性别鉴定中的应用,microRNA性别标签为dre-miR-10d-5p,其序列为TACCCTGTAGAACCGAATGTGTG。
本发明还提供一种所述microRNA性别标签的筛选方法如下:
1)精浆外泌体分离鉴定后,对精浆外泌体smallRNA进行测序分析,将clean reads依次和Rfam数据库、cDNA序列、物种重复序列库、miRBase数据库对测序结果中的smallRNA进行分类注释;将分类注释后的序列和miRBase数据库比对,进行已知microRNA的统计;使用未注释上的序列进行新的microRNA预测,microRNA差异表达分析,差异表达miRNA靶基因的通路富集分析和功能富集分析,最后与样品进行相关性匹配,筛选出一种或者多种,对两种样品具有指示作用的microRNA作为候选microRNAs生物标记物;
2)将候选标签microRNAs按照以下四个标准进行过滤:(1)在两种样品中表达有极显著差异,即p值小于0.01;(2)与已知数据库进行比对确认存在的microRNAs;(3)两样品中至少有一个的TPM值大于10;(4)foldChange值大于4,所述foldChange值=TPMSample_ZZ./TPMSample_ZW;最终筛到了23个micro RNA作为候选标签进行验证。
3)提取两组验证样本:经外周血染色体鉴定后的雄鱼及伪雄鱼精浆来源外泌体总RNA,利用Micro RNA定量分析试剂盒定量检测步骤2)过滤后的microRNAs的差异表达情况,筛选出最具标签指示作用的miRNAs作为最终的标签microRNAs;根据统计学分析原理,P值小于0.05为显著差异,最终筛选到dre-miR-10d-5p,序列为TACCCTGTAGAACCGAATGTGTG,此种标签在雄鱼样本中有高表达,而在伪雄鱼样本中表达量极低。依据MicroRNA定量分析结果,进行雄鱼和伪雄鱼的判定。
本发明还提供了一种半滑舌鳎性别鉴定试剂盒,所述试剂盒包括dre-miR-10d-5p定量检测引物,所述引物序列为F1:CGGTTACCCTGTAGAACCG;反向引物R1:TCGTATCCAGTGCAGGGTC,逆转录引物dre-miR-10d-5p-RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACATT;内参基因为U6,以及其它逆转录试剂和PCR荧光定量试剂。
进一步,U6的引物为:U6-F:CTCGCTTCGGCAGCACATATACT;U6-R:ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC。
进一步,引物探针序列的5’端标记了荧光基团,3’端标记淬灭基团,以适合Taqmanprobe-based qRT-PCR方法检测。
本发明与现有技术相比的有益效果:
本发明运用精液外泌体microRNAs进行半滑舌鳎雄鱼和伪雄鱼的判定,准确率达90%以上,且鉴定结果可靠,不会对鱼体造成创伤。
本发明同时利用该鉴别标签开发了检测的试剂盒,设计了针对该标签的扩增引物,方便快捷,简单高效。
附图说明
图1是本发明提出的标志microRNA经20个验证样本验证后的qRT-PCR表达量;
图2本发明20个验证样本验证后在两组样本的qRT-PCR表达量均值。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明做进一步详述,以下实施例只是描述性的,不是限定性的,不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1
一种半滑舌鳎精浆外泌体miRNAs作为生物标记物的筛选确定
1、精液样本的收集收集半滑舌鳎性成熟雄鱼及伪雄鱼精液各50尾,每尾取0.5ml精液于离心管中用于外泌体分离鉴定。
2、外泌体的提取
(1)精液样本取0.5ml转移1.5mlEP管,放置于4℃,1200g离心15min去除精子细胞,4℃,15000g离心20min去除小细胞杂质和碎片,用PBS稀释1倍后,使用0.45um滤膜进行预过滤,过滤液再经0.22um滤膜过滤。
(2)样品用SBI ExoQuick-TC for Tissue Culture Media and Urine试剂盒提取外泌体。
(3)离心后去上清,收集溶解样并完全转移至一个无RNA酶的2ml管中。
3、外泌体的鉴定:日立H600IV型透射电镜观察,透射电镜分析鉴定后,剩余样品用于RNA提取和测序分析。
4、外泌体的microRNA测序分析
TRizol法提取外泌体的RNA,质检后构建小RNA文库并基于illumina平台测序,完成测序后进行数据过滤分析,将clean reads依次和Rfam数据库、cDNA序列、物种重复序列库、miRBase数据库进行比对注释。将注释后的序列和miRBase数据库比对,进行已知microRNA的统计。使用未注释上的序列进行新的microRNA预测,microRNA差异表达分析,差异表达miRNA靶基因的通路富集分析和功能富集分析,最后与雄鱼、伪雄鱼两个样品进行相关性匹配,筛选出一种或者多种,对雄鱼、伪雄鱼两种样品具有指示作用的miRNA作为候选标签micro RNAs。
5、将候选标签micro RNAs按照以下四个标准进行过滤:(1)在两种样品中表达有极显著差异,即p值小于0.01;(2)与已知数据库进行比对确认存在的microRNAs;(3)两样品中至少有一个的TPM值大于10;(4)foldChange值大于4,所述foldChange值=TPMSample_ZZ./TPMSample_ZW;最终获得23个候选的microRNA进行验证。
6、提取两组验证样本:经外周血染色体鉴定后的雄鱼及伪雄鱼精浆来源外泌体总RNA,利用Micro RNA定量分析试剂盒定量检测步骤5)过滤后的micro RNAs差异表达情况,选取2-ΔΔCt进行计算分析,筛选出最具标签指示作用的microRNAs作为最终的标签microRNAs;根据统计学分析原理,P值小于0.05为显著差异,最终筛选到dre-miR-10d-5p,序列为TACCCTGTAGAACCGAATGTGTG,此种标签在雄鱼样本中有高表达,而在伪雄鱼样本中表达量极低。
实施例2
利用半滑舌鳎精浆外泌体microRNA标志物鉴定雄鱼和伪雄鱼
基于精液外泌体microRNA标志物dre-miR-10d-5p的鉴定试剂盒包括dre-miR-10d-5p的检测引物;所述引物序列为F1:CGGTTACCCTGTAGAACCG;反向引物R1:TCGTATCCAGTGCAGGGTC,引物包含逆转引物dre-miR-10d-5p-RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACATT;内参基因为U6,U6的引物为:U6-F:CTCGCTTCGGCAGCACATATACT;U6-R:ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC,此外试剂盒包含定量PCR反映的其它常规试剂:逆转录酶,Taq酶,dNTP,缓冲液,Mgcl2,DEPC水及对照品。引物探针序列的5’端标记了荧光基团,3’端标记淬灭基团,以适合Taqman probe-based qRT-PCR方法检测。
该试剂盒应用的反应体系为10ul体系,即0.5ul 10*microRNA引物探针、5ul 2*Master mix、2.5ul ddH2O、2ulcDNA模版。使用Thermo fisher的Q6实时荧光定量PCR检测,反应的程序为:95℃2min;95℃10s,59℃60s,循环40次。样品检测设3个平行。利用特异引物检测经染色体确认的10尾半滑舌鳎伪雄鱼和10尾半滑舌鳎雄鱼的标签microRNA,即dre-miR-10d-5p的表达情况,结果如表1、图1、图2所示。该标签在两组样本中的表达差异极为显著(p<0.01),验证标签mcroiRNA的检测准确率达90%以上.
对于本领域的技术人员,对本发明针对的构思及技术要点进行变形,相应的改变应属于本发明所请求的权利要求。
表1 20个验证样本qRT-PCR表达数据
序列表
<110> 天津渤海水产研究所
<120> 一种半滑舌鳎外泌体性别差异表达标签及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gunther)
<400> 4
taccctgtag aaccgaatgt gtg 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggttaccct gtagaaccg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgtatccag tgcagggtc 19
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacacat t 51
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcgcttcgg cagcacatat act 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgcttcacg aatttgcgtg tc 22
Claims (2)
1.半滑舌鳎精浆外泌体microRNA在性别鉴定中的应用,其特征在于所述microRNA性别标签为dre-miR-10d-5p,其序列为TACCCTGTAGAACCGAATGTGTG。
2.权利要求1所述microRNA性别标签的筛选方法,如下:
1)精浆外泌体分离鉴定后,对精浆外泌体smallRNA进行测序分析,将 clean reads 依次和 Rfam 数据库、cDNA 序列、物种重复序列库、miRBase 数据库对测序结果中的smallRNA 进行分类注释;将分类注释后的序列和 miRBase 数据库比对,进行已知microRNA 的统计;使用未注释上的序列进行新的 microRNA 预测,microRNA差异表达分析,差异表达miRNA靶基因的通路富集分析和功能富集分析,最后与样品进行相关性匹配,筛选出一种或者多种,对两种样品具有指示作用的microRNA作为候选microRNAs生物标记物;
2)将候选标签microRNAs按照以下四个标准进行过滤:(1)在两种样品中表达有极显著差异,即p值小于0.01;(2)与已知数据库进行比对确认存在的microRNAs;(3)两样品中至少有一个的TPM值大于10;(4)foldChange值大于4,所述foldChange值=TPM Sample_ZZ. / TPMSample_ZW;
3)提取随机两组验证样本:经外周血染色体鉴定后的雄鱼及伪雄鱼精浆来源外泌体总RNA,利用MicroRNA定量分析试剂盒定量检测步骤2)过滤后的microRNAs的差异表达情况,筛选出最具标签指示作用的miRNAs作为最终的标签microRNAs;根据统计学分析原理,P值小于0.05为显著差异,最终筛选到dre-miR-10d-5p,序列为TACCCTGTAGAACCGAATGTGTG,此种标签在雄鱼样本中有高表达,而在伪雄鱼样本中表达量极低。
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