JP5026771B2 - 冷水病耐性形質を有するアユの判別法、及び、これに用いるポリメラーゼ連鎖反応用プライマーセット - Google Patents
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Description
本発明は、アユの遺伝マーカーおよびその利用方法に関するものであり、詳細には、冷水病耐性形質を有するアユの判別法、及び、これに用いるポリメラーゼ連鎖反応用プライマーセットに関する。
アユPlecoglossus altiveliesは、釣りや食用で高い商品価値があり、内水面において重要な魚である。そのため古くから種苗生産、養殖技術が確立されている。
しかし、１９８７年徳島県でアユの冷水病が確認されて以来、アユの冷水病は全国各地に広がり、多くの養殖場や河川で大きい被害を及ぼし続けている。
アユの冷水病は、冷水病菌であるフラボバクテリウム サイクロフィラム（Flavobacterium psychrophilum）によって引き起こされる疾病で、死亡率が高く、また死亡しなくても体表に潰瘍などの後遺症が残り商品価値がなくなる。このため、本病対策が緊急の課題になっており、各種研究機関で有効な予防・治療策の研究が進められている。
しかし、１９８７年徳島県でアユの冷水病が確認されて以来、アユの冷水病は全国各地に広がり、多くの養殖場や河川で大きい被害を及ぼし続けている。
アユの冷水病は、冷水病菌であるフラボバクテリウム サイクロフィラム（Flavobacterium psychrophilum）によって引き起こされる疾病で、死亡率が高く、また死亡しなくても体表に潰瘍などの後遺症が残り商品価値がなくなる。このため、本病対策が緊急の課題になっており、各種研究機関で有効な予防・治療策の研究が進められている。
例えば、冷水病菌であるフラボバクテリウム サイクロフィラム（Flavobacterium psychrophilum）の対数増殖期の不活性菌体又はその成分からワクチンを調製し、このワクチンをアユに接種してアユの冷水病を予防する方法が開発されている（特許文献１）。
しかし、この方法は、ワクチンの調製に時間と費用がかかり、また調製したワクチンの接種に労力を要するという問題がある。
しかし、この方法は、ワクチンの調製に時間と費用がかかり、また調製したワクチンの接種に労力を要するという問題がある。
また、アユの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びそれをコードする遺伝子を用いて、アユの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を活性化する新規なタンパク質を調製し、このタンパク質を用いてアユの冷水病を予防、治療する方法が開発されている（特許文献２）。
しかし、この方法も同様に、新規タンパク質の調製に時間と費用がかかり、また調製した新規タンパク質の投与に労力を要するという問題がある。
しかし、この方法も同様に、新規タンパク質の調製に時間と費用がかかり、また調製した新規タンパク質の投与に労力を要するという問題がある。
一方、広島県立水産海洋技術センターでは、長年、アユの人工種苗の開発および提供を行っている。この人工種苗の開発過程で、ある特定の系統（Ｎａｇａｉ．ｅｔ ａｌ２００４）のアユは冷水病に罹りにくい傾向にあることが見出されている。
この傾向が遺伝性に基づくものである可能性が示唆された（Ｎａｇａｉ．ｅｔ ａｌ２００６）。
さらに、既に知られている冷水病に罹りにくい系統のみを養殖すれば、冷水病被害を低減できるとも考えられるが、このような系統内で交配を繰り返すと近親交配による弊害が発生し易い。
この傾向が遺伝性に基づくものである可能性が示唆された（Ｎａｇａｉ．ｅｔ ａｌ２００６）。
さらに、既に知られている冷水病に罹りにくい系統のみを養殖すれば、冷水病被害を低減できるとも考えられるが、このような系統内で交配を繰り返すと近親交配による弊害が発生し易い。
また、発明者らは、価値ある魚資源の養殖を効果的に行うため主要魚類の遺伝子解析を進めており、すでにアユの遺伝子連鎖地図を作成している（大河内、２００３：越尾、２００５）。
しかし、そこには冷水病耐性形質を発現する遺伝子に関する情報は開示されていない。
しかし、そこには冷水病耐性形質を発現する遺伝子に関する情報は開示されていない。
本発明が解決しようとする課題は、全国的な規模で甚大な被害を及ぼしているアユの冷水病対策として、アユ冷水病耐性形質に関連する遺伝マーカーを用い、遺伝的に冷水病に罹りにくいアユを選別して効率的に養殖可能にする、冷水病耐性形質を有するアユを判別する判別法、及び、この判別法に用いるポリメラーゼ連鎖反応用プライマーセットを提供することにある。
個々のアユが冷水病に対して耐性を有するか否かは、その外観から識別することはできないが、冷水病耐性形質を発現する特定の遺伝マーカーを見出し、この特定の遺伝マーカーにより、予め冷水病耐性があるアユを選別することができれば、アユ冷水病耐性形質を有するアユを効率的に生産でき、冷水病の予防が可能となる。
そこで、本発明者らは、アユの冷水病耐性には遺伝性があると考え、既に広島県立水産海洋技術センターで見出されている冷水病に罹りにくい傾向があるアユ系統（Ｎａｇａｉ．ｅｔ ａｌ２００４）と冷水病に罹り易い系統（感受性系統）とを交配し、この交配によって作出された集団に戻し交配を行った。
そして、作出した戻し交配の集団、その両親に対してＤＮＡマーカーを用いた解析を行った。マーカー座と耐病性との関連性を確認するために、各マーカー座毎にその全部を網羅するようなプライマー設計を行い、マーカー座と多型性との関連をデータによって判断した。
この結果、上記したアユの遺伝子連鎖地図における遺伝子連鎖群（ＬＧ）１４のマーカー座ＰａｌＡｙｕ１７９ＴＵＦ、ＬＧ１８のマーカー座ＰａｌＡｙｕ５９ＴＵＦに、冷水病耐性形質に関連する遺伝子が存在していることが分かった。
この結果、上記したアユの遺伝子連鎖地図における遺伝子連鎖群（ＬＧ）１４のマーカー座ＰａｌＡｙｕ１７９ＴＵＦ、ＬＧ１８のマーカー座ＰａｌＡｙｕ５９ＴＵＦに、冷水病耐性形質に関連する遺伝子が存在していることが分かった。
そして、遺伝子連鎖群（ＬＧ）１４のマーカー座ＰａｌＡｙｕ１７９ＴＵＦ、及びＬＧ１８のマーカー座ＰａｌＡｙｕ５９ＴＵＦに存在する冷水病耐性形質に関連する各遺伝マーカーを増幅するプライマーセットを合成し、これらプライマーセットを用いてアユのゲノムＤＮＡにＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）を施し、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動を施すことによりアユ冷水病に耐性のある個体を判別できることが分かった。
すなわち、以上の目的を達成するため、
請求項１に係る発明は、配列番号１に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを用いて、アユのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を施し、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１７０ｂｐのバンドがあることを確認する、冷水病耐性形質を有するアユの判別法を特徴とする。
請求項２に係る発明は、配列番号３に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを用いて、アユのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を施し、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１４３ｂｐのバンドがあることを確認する、冷水病耐性形質を有するアユの判別法を特徴とする。
請求項１に係る発明は、配列番号１に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを用いて、アユのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を施し、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１７０ｂｐのバンドがあることを確認する、冷水病耐性形質を有するアユの判別法を特徴とする。
請求項２に係る発明は、配列番号３に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを用いて、アユのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を施し、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１４３ｂｐのバンドがあることを確認する、冷水病耐性形質を有するアユの判別法を特徴とする。
請求項３に係る発明は、配列番号１に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを用いて、アユのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を施し、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１７０ｂｐのバンドがあること、並びに、配列番号３に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを用いて、アユのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を施し、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１４３ｂｐのバンドがあることを確認する、冷水病耐性形質を有するアユの判別法を特徴とする。
さらに、請求項４に係る発明は、配列番号１に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るポリメラーゼ連鎖反応用プライマーセットを特徴とする。
請求項５に係る発明は、配列番号３に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るポリメラーゼ連鎖反応用プライマーセットを特徴とする。
請求項５に係る発明は、配列番号３に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るポリメラーゼ連鎖反応用プライマーセットを特徴とする。
請求項１〜５に係る発明によると、遺伝的に冷水病に罹りにくいアユを事前に判別することができるので、養殖や釣り魚としての冷水病による被害を抑えることができる。また冷水病に罹りにくい親魚を選別して交配し、冷水病に罹りにくい稚魚だけ生産し養殖できるので、経済的であり養殖効率が向上する。更に冷水病に罹りやすい系統の種苗を排除することで、冷水病対策が行えるため、従来のワクチンの接種等と比べ迅速であり、かつ少ない労力で実施できるため経済的であり作業効率が向上する。
本発明のアユの冷水病耐性形質に関連するＤＮＡマーカーは、アユの遺伝子連鎖群（ＬＧ）１４のマーカー座ＰａｌＡｙｕ１７９ＴＵＦ、及びＬＧ１８のマーカー座ＰａｌＡｙｕ５９ＴＵＦに存在する。
これらのＤＮＡマーカーはＰＣＲ法で増幅することができる。ＰＣＲ法に用いるプライマーセットは、例えば、配列番号１から４で示す塩基配列から成るオリゴヌクレオチドをかかげることができる。この場合、増幅する対象となる塩基配列１つに対し、５’側、及び３’側の二つのプライマーを用いる。
上記プライマーセットを用いて、ＰＣＲ法によりアユのゲノムＤＮＡを増幅し、増幅ゲノムの視覚検出を行うことで、当該アユの冷水病耐性形質の有無を判別する。増幅ゲノムの視覚検出法としてはゲル電気泳動法を用いることができる。
これらのＤＮＡマーカーはＰＣＲ法で増幅することができる。ＰＣＲ法に用いるプライマーセットは、例えば、配列番号１から４で示す塩基配列から成るオリゴヌクレオチドをかかげることができる。この場合、増幅する対象となる塩基配列１つに対し、５’側、及び３’側の二つのプライマーを用いる。
上記プライマーセットを用いて、ＰＣＲ法によりアユのゲノムＤＮＡを増幅し、増幅ゲノムの視覚検出を行うことで、当該アユの冷水病耐性形質の有無を判別する。増幅ゲノムの視覚検出法としてはゲル電気泳動法を用いることができる。
本発明で規定するＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）は、ＤＮＡの熱変性による一本鎖化、アニーリングによるプライマーの結合、ポリメラーゼによる相補的ＤＮＡの合成からなるＤＮＡ複製サイクルを繰り返して行う反応を利用して特定のＤＮＡを増幅させる方法であり、従来公知の技術である。また、本発明に用いられるゲノムＤＮＡはアユの尾鰭近傍の組織片から常法にしたがって入手することができる。
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、これらは１例を示したものであって、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、これらは１例を示したものであって、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
（解析家系）
解析家系として、冷水病に対して耐性を有する耐病性系統（海産交配系）と、冷水病に対する抵抗力の弱い感受性系統（累代系）を用いた。
累代系アユは約３０年前に大田川で捕獲されたアユを毎年繰り返し継代した系統であり、海産交配系は、累代系アユの雌に鹿児島県産の海産アユの雄を交配して作製された系統である。
また、耐病性系統の雄と感受性系統の雌を交配して交配系統（Ｆ１）を作出した。
さらに、Ｆ１集団で冷水病耐性の雄と感受性系統の雌を交配し、戻し交配集団を得た。
解析家系として、冷水病に対して耐性を有する耐病性系統（海産交配系）と、冷水病に対する抵抗力の弱い感受性系統（累代系）を用いた。
累代系アユは約３０年前に大田川で捕獲されたアユを毎年繰り返し継代した系統であり、海産交配系は、累代系アユの雌に鹿児島県産の海産アユの雄を交配して作製された系統である。
また、耐病性系統の雄と感受性系統の雌を交配して交配系統（Ｆ１）を作出した。
さらに、Ｆ１集団で冷水病耐性の雄と感受性系統の雌を交配し、戻し交配集団を得た。
（Ｆ１及び戻し交配集団の飼育方法）
９〜１１月に採卵を行い人工授精の後、受精卵を水カビ防止剤により消毒した。水温１４〜１７℃にておよそ２週間で孵化した。孵化後、７〜１０日間かけて海水馴致を行い、出荷サイズ２〜３ｇ前後になるまで海水で飼育した。飼育水温は２０℃以下とし、孵化直後からシオミズツボワムシ、６日目からアルテミア幼生、９日目からアユ配合飼料の投与をそれぞれ行った。集荷サイズまで成長したアユは、淡水馴致した後、実験に用いた。尚、実験に用いたアユは使用前に冷水病保菌検査を行い、陰性であることを確認した。
実験期間中はアユを１５〜１８℃に調整した紫外線処理脱塩素水道水を用い、循環ろ過で飼育した。
９〜１１月に採卵を行い人工授精の後、受精卵を水カビ防止剤により消毒した。水温１４〜１７℃にておよそ２週間で孵化した。孵化後、７〜１０日間かけて海水馴致を行い、出荷サイズ２〜３ｇ前後になるまで海水で飼育した。飼育水温は２０℃以下とし、孵化直後からシオミズツボワムシ、６日目からアルテミア幼生、９日目からアユ配合飼料の投与をそれぞれ行った。集荷サイズまで成長したアユは、淡水馴致した後、実験に用いた。尚、実験に用いたアユは使用前に冷水病保菌検査を行い、陰性であることを確認した。
実験期間中はアユを１５〜１８℃に調整した紫外線処理脱塩素水道水を用い、循環ろ過で飼育した。
（冷水病人為感染死亡率の算出）
冷水病の罹患アユから分離されたＦ.Psychrophilum ＰＨ-0215株を感染実験に用いた。
改変サイトフィーガ寒天培地（Ｗakabayashi and Ｅgusa,1974）を用い１８℃で２４時間培養したＰＨ-0215株を生理食塩水（0.8％食塩水）に懸濁後、ＦＡ１００（田辺製薬）で麻酔したアユの腹鰭基部後方から腹腔内に0.1ｍＬ接種した。接種後のアユは水温16.5℃から18.2℃の紫外線処理脱塩素水道水を用いて流水飼育し、１４日間の観察を行った。
冷水病による死亡の確認は、死亡魚の腎臓から改変サイトフィーガ寒天培地を用い、Ｆ.Psychrophilumを再分離することとし、死亡率を算出した。
この結果、耐病性系統の死亡率は０％、感受性系統の死亡率は８５％、Ｆ１集団の死亡率は４５％であって、冷水病に対する耐性には遺伝性のあることがはっきりした。
冷水病の罹患アユから分離されたＦ.Psychrophilum ＰＨ-0215株を感染実験に用いた。
改変サイトフィーガ寒天培地（Ｗakabayashi and Ｅgusa,1974）を用い１８℃で２４時間培養したＰＨ-0215株を生理食塩水（0.8％食塩水）に懸濁後、ＦＡ１００（田辺製薬）で麻酔したアユの腹鰭基部後方から腹腔内に0.1ｍＬ接種した。接種後のアユは水温16.5℃から18.2℃の紫外線処理脱塩素水道水を用いて流水飼育し、１４日間の観察を行った。
冷水病による死亡の確認は、死亡魚の腎臓から改変サイトフィーガ寒天培地を用い、Ｆ.Psychrophilumを再分離することとし、死亡率を算出した。
この結果、耐病性系統の死亡率は０％、感受性系統の死亡率は８５％、Ｆ１集団の死亡率は４５％であって、冷水病に対する耐性には遺伝性のあることがはっきりした。
９０匹の戻し交配集団に対し、同様にして冷水病感染実験を行った結果、４４尾が冷水病で死亡し、４６尾が生存し、死亡率は４９％であった。
また、親魚及び戻し交配集団の全てに対して、次のようにしてＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲ法を行い、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を施し、その遺伝子型を確認した。
また、親魚及び戻し交配集団の全てに対して、次のようにしてＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲ法を行い、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を施し、その遺伝子型を確認した。
まず、親魚及び戻し交配集団からのＤＮＡ抽出は、以下の手順で行った。
尾鰭を１ｃｍ角の大きさで採取し、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔris−ＨＣｌ（pH８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ Proteinase Ｋを含む消化溶液を６００μＬ加え、３７℃で一晩静置した。
さらに、フェノール／クロロホルム（１：１）抽出を１回行った後、エタノール沈殿にて染色体ＤＮＡを析出させた。回収したＤＮＡは７０％エタノールで洗浄、乾燥後、ＴＥ溶液（０．０１Ｍ Ｔris−ＨＣｌ pH７．４、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ pH８．０）５０μＬに溶解した。
尾鰭を１ｃｍ角の大きさで採取し、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔris−ＨＣｌ（pH８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ Proteinase Ｋを含む消化溶液を６００μＬ加え、３７℃で一晩静置した。
さらに、フェノール／クロロホルム（１：１）抽出を１回行った後、エタノール沈殿にて染色体ＤＮＡを析出させた。回収したＤＮＡは７０％エタノールで洗浄、乾燥後、ＴＥ溶液（０．０１Ｍ Ｔris−ＨＣｌ pH７．４、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ pH８．０）５０μＬに溶解した。
次に、ＰａｌＡｙｕ１７９ＴＵＦに関し、
Ｆ：５’−ＡＡＧＡＴＧＣＧＴＣＡＣＡＣＧＡＡＣＡＧ−３’（配列番号１）
Ｒ：５’−ＧＡＡＧＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＴＴＴＡＡＣＣ−３’（配列番号２）
の一組のプライマーを合成し、２．５ｐｍｏｌ Ｆプライマーと［γ-33Ｐ］ＡＴＰ、Ｔ４ polynucleotide kinaseによって標識した０．１７ｐｍｏｌ Ｒプライマー、０．１７５ｍＭ each ｄＮＴＰ、２０ｍＭ Ｔris−ＨＣｌ（pH８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１％ＢＳＡ、０．２５ Ｕ Ｔaq ＤＮＡ polymerase（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）、５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを含む１１μｌの溶液で、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、ＰＣＲ法を行った。
Ｆ：５’−ＡＡＧＡＴＧＣＧＴＣＡＣＡＣＧＡＡＣＡＧ−３’（配列番号１）
Ｒ：５’−ＧＡＡＧＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＴＴＴＡＡＣＣ−３’（配列番号２）
の一組のプライマーを合成し、２．５ｐｍｏｌ Ｆプライマーと［γ-33Ｐ］ＡＴＰ、Ｔ４ polynucleotide kinaseによって標識した０．１７ｐｍｏｌ Ｒプライマー、０．１７５ｍＭ each ｄＮＴＰ、２０ｍＭ Ｔris−ＨＣｌ（pH８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１％ＢＳＡ、０．２５ Ｕ Ｔaq ＤＮＡ polymerase（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）、５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを含む１１μｌの溶液で、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、ＰＣＲ法を行った。
なお、このプライマーセットを用いたＰＣＲ反応組成（１サンプル分）を表１に示し、ＲプライマーのＲＩ標識用液組成（４９サンプル分）を表２に示す。
ＰＣＲ条件は、９５℃、３分−（９５℃、３０秒−５８℃、１分−７２℃、１分）×３５サイクル−７２℃、５分−４℃、∞とした。
反応後、等量のLoading dye（９５％ formamide,１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ bromophenol blue and xylene cyanol）とよく攪拌し、ＰＣＲ産物を熱変性によって１本鎖にし、６％変性ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。
その後、１時間乾燥させたゲルを、Imaging Plate(ＩＰ)に３〜１２時間感光させ、放射線の感光像が記憶されたＩＰをBio-imaging Analyzer（ＢＡＳ１０００，Fuji Photo Films）で読み取り、コンピュータで映像化した。
その結果を図１及び図２に示す。
反応後、等量のLoading dye（９５％ formamide,１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ bromophenol blue and xylene cyanol）とよく攪拌し、ＰＣＲ産物を熱変性によって１本鎖にし、６％変性ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。
その後、１時間乾燥させたゲルを、Imaging Plate(ＩＰ)に３〜１２時間感光させ、放射線の感光像が記憶されたＩＰをBio-imaging Analyzer（ＢＡＳ１０００，Fuji Photo Films）で読み取り、コンピュータで映像化した。
その結果を図１及び図２に示す。
図１及び図２からわかるように、生存しているアユでは、死亡したアユに比べて１７０ｂｐにバンドを持つ頻度が非常に高いことがわかる。
また、アユの生死と１７０ｂｐバンドの有無との関係を表３に示す。
また、アユの生死と１７０ｂｐバンドの有無との関係を表３に示す。
表３に示すように、生存し１７０ｂｐにバンドを持つものは３４匹、死亡し１７０ｂｐにバンドを持たないものは３０匹、生存し１７０ｂｐにバンドを持たないものは１２匹、死亡し１７０ｂｐにバンドを持つものは１４匹であった。
この結果から、１７０ｂｐにバンドを持つアユは、１７０ｂｐにバンドを持たないアユに比べて明らかに冷水病に対する耐性が高いことがわかる。
この結果から、１７０ｂｐにバンドを持つアユは、１７０ｂｐにバンドを持たないアユに比べて明らかに冷水病に対する耐性が高いことがわかる。
冷水病耐性とこのバンドとの連鎖関係の確かさはＬｏｄ Ｓｃｏｒｅ（Lathrop et al１９８４）で示される。
１７０ｂｐにバンドがある死亡個体と、１７０ｂｐにバンドの無い生存個体の合計は２６匹であり、Ｌｏｄ Ｓｃｏｒｅ＝２６ｌｏｇ（２６／９０）＋（９０−２６）ｌｏｇ（１−２６／９０）＋９０ｌｏｇ０．５＝３．６０となる。
即ち、１７０ｂｐバンドと冷水病耐性との間に連鎖関係があることは、１／１０3.60の危険率で確実であり、本実施例のプライマーセットを用いたＰＣＲ産物に１７０ｂｐのバンドがあるアユは、冷水病に耐性があるアユであるといえる。
１７０ｂｐにバンドがある死亡個体と、１７０ｂｐにバンドの無い生存個体の合計は２６匹であり、Ｌｏｄ Ｓｃｏｒｅ＝２６ｌｏｇ（２６／９０）＋（９０−２６）ｌｏｇ（１−２６／９０）＋９０ｌｏｇ０．５＝３．６０となる。
即ち、１７０ｂｐバンドと冷水病耐性との間に連鎖関係があることは、１／１０3.60の危険率で確実であり、本実施例のプライマーセットを用いたＰＣＲ産物に１７０ｂｐのバンドがあるアユは、冷水病に耐性があるアユであるといえる。
また、ＰａｌＡｙｕ５９ＴＵＦに関し、
Ｆ：５’−ＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＡＴＣ−３’（配列番号３）
Ｒ：５’−ＣＴＣＡＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号４）
の一組のプライマーを合成し、このプライマーセットを用いてＰＣＲ法を行った。
Ｆ：５’−ＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＡＴＣ−３’（配列番号３）
Ｒ：５’−ＣＴＣＡＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号４）
の一組のプライマーを合成し、このプライマーセットを用いてＰＣＲ法を行った。
ＰＣＲ条件は、９５℃、３分−（９５℃、３０秒−５５℃、１分−７２℃、１分）×３５サイクル−７２℃、５分−４℃、∞とする。
その他の条件は配列番号１及び配列番号２のプライマーセットを用いた場合と同様にして、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を行い、そのコンピュータ解析像を図３及び図４に示す。
図３及び図４に示すように、生存しているアユは、死亡したアユに比べて１４３ｂｐにバンドを持つ傾向にあることがわかる。
また、アユの生死と１４３ｂｐバンドの有無との関係を表４に示す。
その他の条件は配列番号１及び配列番号２のプライマーセットを用いた場合と同様にして、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を行い、そのコンピュータ解析像を図３及び図４に示す。
図３及び図４に示すように、生存しているアユは、死亡したアユに比べて１４３ｂｐにバンドを持つ傾向にあることがわかる。
また、アユの生死と１４３ｂｐバンドの有無との関係を表４に示す。
表４から、生存し１４３ｂｐにバンドを持つものは３５匹、死亡し１４３ｂｐにバンドを持たないものは２６匹、生存し１４３ｂｐにバンドを持たないものは１１匹、死亡し１４３ｂｐにバンドを持つものは１８匹であった。
この結果について、Ｌｏｄ Ｓｃｏｒｅを算出すると、Ｌｏｄ Ｓｃｏｒｅ＝２９ｌｏｇ（２９／９０）＋（９０−２９）ｌｏｇ（１−２９／９０）＋９０ｌｏｇ０．５＝２．５３となる。
これは、ＰａｌＡｙｕ５９ＴＵＦの１４３ｂｐバンドと冷水病耐性との間の連鎖関係が、ＰａｌＡｙｕ１７９ＴＵＦの１７０ｂｐバンドと冷水病との連鎖関係よりも低いが、１／１０2.53の危険率で確実であるということを示す。
この結果について、Ｌｏｄ Ｓｃｏｒｅを算出すると、Ｌｏｄ Ｓｃｏｒｅ＝２９ｌｏｇ（２９／９０）＋（９０−２９）ｌｏｇ（１−２９／９０）＋９０ｌｏｇ０．５＝２．５３となる。
これは、ＰａｌＡｙｕ５９ＴＵＦの１４３ｂｐバンドと冷水病耐性との間の連鎖関係が、ＰａｌＡｙｕ１７９ＴＵＦの１７０ｂｐバンドと冷水病との連鎖関係よりも低いが、１／１０2.53の危険率で確実であるということを示す。
また、ＰａｌＡｙｕ１７９ＴＵＦで冷水病耐性と連鎖している１７０ｂｐと、ＰａｌＡｙｕ５９ＴＵＦで冷水病耐性と連鎖している１４３ｂｐについて、両方のバンドを共に持つ個体と両方のバンドを共に持たない個体の生死を調べ、その結果を表５に示す。
表５から明らかなように、１７０ｂｐ及び１４３ｂｐの両バンドを持つ個体のうち８５．７％が生存個体であり、両バンドを持たない個体の内８８．９％が死亡固体であった。
また、生存個体の９２．３％は両バンドを持ち、死亡個体で両バンドを持つものは２０％にすぎなかった。
この結果、ＰａｌＡｙｕ１７９ＴＵＦの１７０ｂｐバンドと、ＰａｌＡｙｕ５９ＴＵＦの１４３ｂｐバンドを持つことが冷水病耐性にとって重要であることがわかった。
χ2検定（Ｃhi-square test）の結果、Ｐ値は6.31319e−07となり、非常に有意であるといえる。
また、生存個体の９２．３％は両バンドを持ち、死亡個体で両バンドを持つものは２０％にすぎなかった。
この結果、ＰａｌＡｙｕ１７９ＴＵＦの１７０ｂｐバンドと、ＰａｌＡｙｕ５９ＴＵＦの１４３ｂｐバンドを持つことが冷水病耐性にとって重要であることがわかった。
χ2検定（Ｃhi-square test）の結果、Ｐ値は6.31319e−07となり、非常に有意であるといえる。
即ち、ＰａｌＡｙｕ１７９ＴＵＦで冷水病耐性と連鎖している１７０ｂｐにバンドを持っているか否か、或いは、ＰａｌＡｙｕ５９ＴＵＦで１４３ｂｐにバンドが有るか否かを単独で調べても、冷水病耐性の有無をある程度判別できるが、ＰａｌＡｙｕ１７９ＴＵＦの１７０ｂｐ、及び、ＰａｌＡｙｕ５９ＴＵＦの１４３ｂｐに共にバンドがあることを確認すれば、非常に高い確率で冷水病耐性のあるアユを選別できる。
なお、上記実施例では、冷水病耐性と連鎖するバンドとして１７０ｂｐ、１４３ｂｐを示したが、当然のことではあるが、冷水病耐性と連鎖するバンドには幅がある。
Claims (5)
- 配列番号１に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを用いて、アユのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を施し、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１７０ｂｐのバンドがあることを確認する、冷水病耐性形質を有するアユの判別法。
- 配列番号３に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを用いて、アユのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を施し、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１４３ｂｐのバンドがあることを確認する、冷水病耐性形質を有するアユの判別法。
- 配列番号１に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを用いて、アユのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を施し、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１７０ｂｐのバンドがあること、並びに、配列番号３に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成るプライマーセットを用いて、アユのゲノムＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応法を施し、得られた産物にゲル電気泳動法を施して１４３ｂｐのバンドがあることを確認する、冷水病耐性形質を有するアユの判別法。
- 配列番号１に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成る、冷水病耐性形質を有するアユの判別法に用いるポリメラーゼ連鎖反応用プライマーセット。
- 配列番号３に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示される塩基で構成されるオリゴヌクレオチドから成る、冷水病耐性形質を有するアユの判別法に用いるポリメラーゼ連鎖反応用プライマーセット。
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